KR101760267B1 - Pto 절단 및 연장-의존적 비-혼성화 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출 - Google Patents

Pto 절단 및 연장-의존적 비-혼성화 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PCE-NH(PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화)어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다. 본 발명은 타겟-의존적 연장이합체의 형성에 의한 CTO와 HO 간의 혼성화 억제의 발생을 이용한다. 따라서, 본 발명은 HO가 비절단 되었을 경우에도 타겟 서열을 검출 할 수 있다. 관련하여, PTO의 5’-태깅 부위, CTO 및 HO 서열의 디자인이 수월하고, 반응조건 또한 용이하게 설정할 수 있다. 또한, HO와 CTO 간의 혼성화물의 검출은 CTO의 연장과는 다른 용기에서 실시될 수 있다.

Description

PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출 {Detection of Target Nucleic Acid Sequence by PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization Assay}
본 특허출원은 대한민국 특허청에 2012년 12월 27일에 제출된 대한민국 특허 출원 제 2012-0154834 호, 2013년 1월 25일에 제출된 대한민국 특허 출원 제 2013-0008580 호 및 2013년 3월 29일에 제출된 대한민국 특허 출원 제 2013-0034670 호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다.
DNA 혼성화는 분자 생물학에 기본적인 과정이며, 이온 강도, 염기 구성, 핵산 단편의 길이, 미스매칭(mismatching) 정도, 및 변성제의 존재에 의해 영향을 받는다. DNA 혼성화-기반 기술은 특정 핵산서열 결정에 매우 유용한 도구가 될 것이며, 임상 진단, 유전자 연구 및 법의학적인 실험 분석에 명확하게 도움이 될 것이다. 그러나 대부분의 혼성화에만 의존하는 종래 방법 및 과정에서는 프로브 및 비-타겟 서열 간에 비-특이적인 혼성화로 인해 위양성(false positive) 결과가 생성할 가능성이 매우 높다. 따라서, 종래 방법 및 과정은 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 남아있다.
프로브 혼성화 과정 이외에도 추가적으로 효소적 반응을 이용한 몇몇 접근법들, 예를 들어 TaqManTM 프로브 방법이 제시되었다.
TaqManTM 프로브 방법에서, 타겟 핵산서열에 혼성화된 표지(labeled) 프로브는 업스트림 프라이머(upstream primer)-의존적 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의해 절단되어, 타겟 서열의 존재를 나타내는 시그널을 생성시킨다(미국특허 제5,210,015호, 제5,538,848호 및 제6,326,145호). TaqManTM 프로브 방법은 시그널 생성을 위한 두 가지 접근법을 제시한다: 중합(polymerization)-의존적 절단 및 중합-독립적 절단. 중합-의존적 절단에서, 업스트림 프라이머의 연장은 반드시 핵산 중합효소가 표지 프로브의 5’-말단에 접촉하기 전에 생성되어야 한다. 연장 반응이 진행되면서, 중합효소는 표지 프로브의 5’-말단을 점점 절단한다. 중합-독립적 절단에서, 업스트림 프라이머 및 표지 프로브는 매우 근접하여 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 업스트림 프라이머의 3’-말단과 핵산 중합효소의 결합은 상기 핵산 중합효소가 표지 프로브의 5’-말단에 접촉하도록 하여 표지가 방출된다. 또한, TaqManTM 프로브 방법은 그의 5’-말단 부위에 타겟 서열과 혼성화 되지 않은 5’-테일 구역(tail region)을 갖는 표지 프로브가 절단되어 5’-테일 구역을 포함하는 단편이 형성되는 것을 개시하고 있다.
타겟 서열에 비-상보적인 5’-테일 구역을 갖는 프로브가 5’뉴클레아제에 의하여 절단되어 5’-테일 구역을 포함하는 단편이 방출되는 몇몇 방법들이 보고되었다.
예를 들어, 미국 특허 제5,691,142호는 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되는 절단구조를 개시하고 있다. 주형에 대해 비-상보적인 5’부위 및 주형에 대해 상보적인 3’부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 주형에 혼성화 되고, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 매우 근접하여 주형에 혼성화 되는 절단 구조가 예시되어 있다. 절단구조는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 감소된 합성 활성을 갖는 변이 DNA 중합효소에 의하여 절단되어 주형에 비-상보적인 5’부위가 방출된다. 그 후 방출된 5’부위는 헤어핀 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 절단구조를 형성하고, 이에 의해 점진적인 절단반응이 유도되어 타겟 서열이 검출된다.
미국 특허 제7,381,532호는, 3’-말단이 블록킹된 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 갖는 절단구조가, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제에 의하여 절단되어 비-상보적인 5’플랩(flap)부위가 방출되고, 방출된 5’플랩부위는 크기 분석 또는 상호작용적 이중 표지에 의하여 검출되는 과정을 개시하고 있다. 미국 특허 제6,893,819호는, 검출 가능한 방출된 플랩이 핵산 합성 의존적인, 플랩-매개 연속적 증폭 방법에 의하여 생성되는 것을 개시하고 있다. 이 방법에서, 첫 번째 절단구조로부터 방출된 플랩은, 핵산 합성 의존적인 방식으로 두 번째 절단구조를 절단하여 플랩을 방출시키며, 방출된 플랩들을 검출한다.
미국 특허 제7,309,573호는 핵산 합성에 의해 생성된 방출된 플랩의 생성, 방출된 플랩의 연장, 플랩 연장 동안 올리고뉴클레오타이드의 절단 및 올리고뉴클레오타이드 절단에 의해 생성된 시그널 검출을 포함하는 방법을 개시하고 있다.
액상에서의 형광-표지 프로브의 혼성화에 의하여, 한 종류의 형광 표지를 이용하더라도 멜팅 커브 분석에 의하여 다수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출할 수 있다. 그러나, 상호작용적-이중 표지 프로브의 5’뉴클레아제-매개 절단에 의하여 타겟 서열을 검출하는 종래 기술은, 멀티플렉스 타겟 검출에서 서로 상이한 타겟 서열에 대하여 서로 상이한 종류의 형광 표지를 필요로 하며, 이러한 형광 표지 종류 수의 한계 때문에 검출되는 타겟 서열의 수는 제한된다.
미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 타겟 핵산서열에 비-상보적인 5’부위를 갖는 프로브의 절단 및 캡처(capture) 프로브의 혼성화를 이용한 타겟 검출 방법을 개시하고 있다. 표지는 비-상보적인 5’부위에 위치한다. 타겟 서열에 혼성화된 표지 프로브는 절단되어 단편을 방출하며, 이후 단편은 캡처 프로브에 혼성화되어 타겟 서열의 존재가 검출된다. 이 방법에서, 비절단/온전한(uncleaved/intact) 프로브는 캡처 프로브에 비혼성화 되는 것을 요구한다. 이를 위해서는, 짧은 길이를 갖는 캡처 프로브가 고상 기질 상에 고정화되어야 한다. 그러나, 이러한 제한은 고상 기질 상에서의 혼성화의 효율성을 낮게 하고, 또한 반응 조건의 최적화도 어렵게 한다.
따르면, 보다 편리하고, 신뢰성 및 재현성이 있는 방식으로, 혼성화 뿐만 아니라 5’뉴클레오절단반응(5’nucleolytic reaction)과 같은 효소적 반응에 의하여 액상 및 고상에서 타겟 서열, 보다 바람직하게는 복수의 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 접근법에 대한 개발 요구가 대두되고 있다. 또한, 당업계에서 표지(특히, 형광 표지) 종류의 수에 제한받지 않는 신규한 타겟 검출 방법이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 이러한 특허들 및 문헌들의 공개는 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명 의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
도 1은 PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 이용되는 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO), 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO) 및 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO)의 도식적인 구조를 보여준다. 특히, PTO CTO 및 HO 의 3'-말단은 블로킹되어 연장이 방지된다.
도 2는 멜팅(melting) 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 리포터(repoter) 분자 및 퀀처(quencher) 분자를 갖는다. 연장이합체(extended duplex)의 형성은 HO와 CTO 간의 혼성화 억제(inhibit)에 의하여 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)한다.
도 3은 멜팅 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 연장이합체의 형성은 CTO 간의 혼성화 억제(inhibition)뿐만 아니라 HO의 절단에 의하여 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)한다.
도 4는 멜팅 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 리포터 분자를 갖고 CTO는 퀀처 분자를 갖는다.
도 5는 멜팅 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 단일-가닥 또는 이중-가닥 상에 존재하는 가에 따라 상이한 시그널 강도를 나타내는 단일 형광 표지를 갖는다.
도 6은 멜팅 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. HO는 CTO와 혼성화에 있어서 PTO 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
도 7은 멜팅 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 리포터 분자를 갖고 CTO는 퀀처 분자를 갖는다. HO는 CTO와 혼성화에 있어서 PTO 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
도 8은 고상에서 단일 표지를 이용한 PCE-NH 어세이의 제 2 양태를 도식적으로 나타낸다. CTO는 단일 표지를 갖고 HO는 고상 기질 상에 고정화된다. 연장이합체의 형성은 HO와 CTO 간의 혼성화 억제(inhibit)에 의하여 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)한다.
도 9는 고상에서 단일 표지를 이용한 PCE-NH 어세이의 제 2 양태를 도식적으로 나타낸다. CTO는 단일 표지를 갖고 HO는 고상 기질 상에 고정화된다. 연장이합체의 형성은 HO와 CTO 간의 혼성화 억제(inhibition)뿐만 아니라 HO의 절단 또는 분리(displacement)에 의하여 CTO 및 HO 사이에 혼성화물의 형성을 방지(prevent)한다.
도 10은 고상에서 단일 표지를 이용한 PCE-NH 어세이의 제 2 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 단일 표지를 갖고 CTO는 고상 기질 상에 고정화된다. 연장이합체의 형성은 CTO와 HO 간의 혼성화 억제(inhibit)에 의하여 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)한다.
도 11은 고상에서 단일 표지를 이용한 PCE-NH 어세이의 제 2 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 단일 표지를 갖고 CTO는 고상 기질 상에 고정화된다. 연장이합체의 형성은 HO와 CTO 간의 혼성화 억제(inhibition)뿐만 아니라 HO의 절단 또는 분리(displacement)에 의하여 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)한다.
도 12는 고상에서 단일 표지를 이용한 PCE-NH 어세이의 제 2 양태를 도식적으로 나타낸다. CTO는 단일 표지를 갖고 HO는 고상 기질 상에 고정화된다. HO는 CTO와 혼성화에 있어서 PTO 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
도 13은 고상에서 단일 표지를 이용한 PCE-NH 어세이의 제 2 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 단일 표지를 갖고 CTO는 고상 기질 상에 고정화된다. HO는 CTO와 혼성화에 있어서 PTO 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
도 14는 연장이합체의 형성이 CTO에 HO가 혼성화하는 것을 억제(inhibit)하는 신규한 반응에 기초하는 지정(pre-determined) 온도에서의 검출을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 3 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다.
도 15는 연장이합체의 형성이 CTO에 HO가 혼성화하는 것을 억제하는 신규한 반응에 기초하는 지정 온도에서의 검출을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 3 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 리포터 분자를 갖고 CTO는 퀀처 분자를 갖는다.
도 16은 연장이합체의 형성이 CTO에 HO가 혼성화하는 것을 억제하는 신규한 반응에 기초하는 지정 온도에서의 검출을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 3 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 단일-가닥 또는 이중-가닥 상에 존재하는가에 따라 상이한 시그널 강도를 나타내는 단일 형광 표지를 갖는다.
도 17은 연장이합체의 형성이 CTO에 HO가 혼성화하는 것을 억제하는 신규한 반응에 기초하는 지정 온도에서의 검출을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 3 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. HO는 CTO와 혼성화에 있어서 PTO 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
도 18은 연장이합체의 형성이 CTO에 HO가 혼성화하는 것을 억제하는 신규한 반응에 기초하는 지정 온도에서의 검출을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 3 양태를 도식적으로 나타낸다. HO는 리포터 분자를 갖고 CTO는 퀀처 분자를 갖는다. HO는 CTO와 혼성화에 있어서 PTO 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
도 19a 및 도 19b는 CTO와 HO의 혼성화가 연장이합체에 의하여 억제(inhibit)되는지 여부를 평가한 결과를 나타낸다. Syn-Es는 합성 연장가닥을 의미한다.
도 20a는 지정 온도(혼성화 온도, 55℃)에서 실-시간 PCE-NH 어세이에 의한 타겟 검출 결과를 나타낸다. 이러한 결과는 연장이합체에 의해 억제(inhibit)된 시그널을 이용한 타겟 검출을 나타낸다.
도 20b는 지정 온도(변성 온도, 95℃)에서 실-시간 PCE-NH 어세이에 의한 타겟 검출 결과를 나타낸다. 이 결과는 몇몇 HO가 반응 동안 절단될 수 있음을 보여준다.
도 20c는 멜팅 분석 방식에서 PCE-NH 어세이에 의한 타겟 검출 결과를 나타낸다.
도 21a는 지정 온도(혼성화 온도, 60℃)에서 실-시간 PCE-NH 어세이에 의한 타겟 검출 결과를 나타낸다. HO는 CTO와 혼성화에 있어서 PTO 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 검출된 시그널은 HO와 CTO 간의 혼성화 억제(inhibit)로부터 제공되었다. HO의 절단에 의하여 제공되는 시그널은 배제된다.
도 21b는 지정 온도(변성 온도, 95℃)에서 실-시간 PCE-NH 어세이에 의한 타겟 검출 결과를 나타낸다. HO는 CTO와 혼성화에 있어서 PTO 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이 결과는 반응 동안에 HO가 절단되지 않은 것을 보여준다.
도 21c는 멜팅 분석 방식에서 PCE-NH 어세이에 의한 타겟 검출의 결과를 나타낸다. HO는 CTO와 혼성화에 있어서 PTO 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
도 22는 단일-표지된 CTO 및 고상에 고정화된 HO를 이용하는 PCE-NH 어세이에 의한 타겟 검출의 결과를 나타낸다.
도 23은 연장 단계 및 HO 혼성화 단계를 별도의 튜브에서 실시하여 HO가 절단되지 않도록 하면서 단일-표지된 CTO 및 고상에 고정화된 HO를 이용하는 PCE-NH 어세이에 의한 타겟 검출의 결과를 나타낸다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편리성을 가지고, 특히, 멀티플렉스(mitiplex) 방식에서 타겟 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자는 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이러한 타겟 검출은 프로브 혼성화, 효소적 프로브 절단, 연장 및 HO(혼성화 올리고뉴클레오타이드)를 이용한 연장 산물(extended product)의 검출에 의하여 달성된다. 본 발명의 프로토콜은 고상 반응뿐만 아니라 액상 반응에도 우수하게 적용되며, 보다 개선된 정확성 및 편리성을 가지고 복수의 타겟 서열이 검출되도록 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의한 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 신규한 방법 및 PCE-NH 어세이에 의하여 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명은 프로브 혼성화, 효소적 프로브 절단, 연장 및 HO(혼성화 올리고뉴클레오타이드)를 이용한 연장 산물(extended product)의 검출에 의해 실시된다. 본 발명은 HO를 이용한 연장 산물의 검출을 위한 방식에 의해 세 가지 양태로 분류할 수 있다.
I. PCE-NH 어세이에 의한 타겟 검출 과정의 제 1 양태
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화(hybridizing)시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥(extended strand)을 생성하고 연장이합체(extended duplex)를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고;
(e) 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO)의 존재 하에서, 일정 온도 범위에 걸쳐 상기 단계 (d)의 결과물에 대한 멜팅 분석 또는 혼성화 분석을 실시하는 단계로서; 상기 타겟 핵산서열이 상기 핵산 시료 내에 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO 와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공하며; 상기 타겟 핵산서열이 상기 핵산 시료 내에 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지하고, 이에 의해 상기 시그널이 제공되지 않으며; 상기 시그널은 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 CTO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅(intercalating) 표지에 의해 제공되고 ; 및
(f) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편리성을 가지고, 특히, 멀티플렉스 방식에서 타겟 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이러한 타겟 검출은 프로브 혼성화, 효소적 프로브 절단, 연장 및 HO(혼성화 올리고뉴클레오타이드)를 이용한 멜팅 분석(또는 혼성화 분석)에 의하여 달성된다. 본 발명의 프로토콜은 고상 반응뿐만 아니라 액상 반응에도 훌륭하게 적용되며, 보다 개선된 정확성 및 편리성을 가지고 복수의 타겟 서열이 검출되도록 한다.
본 발명은 프로브 혼성화를 포함하는 연속적인 이벤트를 이용한다; PTO(프로빙 및 태깅 올리고뉴클레오타이드)의 절단 및 연장; 연장이합체의 형성; 및 HO를 사용한 혼성화 분석 또는 멜팅 분석. 멜팅 분석 또는 혼성화 분석에서, HO를 갖는 혼성화물의 비형성은 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이로 명명된다.
상기 타겟 핵산이 존재하는 경우에만, 상기 연장이합체가 형성되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지하므로, CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널의 비존재는 타겟 핵산의 존재를 나타낸다.
상기 연장이합체와 관련된 용어“CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성 방지(prevent)”는 연장이합체에 의한 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물 비-형성과 관련된 모든 이벤트를 의미한다. 예를 들어, 상기 용어는 연장이합체에 의한 HO와 CTO 간의 혼성화 억제(inhibition) 및 혼성화물을 형성하는 HO를 소모시키는 HO의 절단(즉, PTO 단편의 연장 동안에 HO의 절단)을 포함한다.
본 발명은 상기 CTO/HO 혼성화물의 유무 검출을 위한 판별 요인으로서 CTO/HO 혼성화물의 Tm 값을 사용하는 특징을 갖는다. CTO/HO 혼성화물은 CTO 및 HO의 서열 및/또는 길이에 따라 구별 가능한 Tm 값을 갖는다. 멜팅 분석 또는 혼성화 분석에 의한, CTO/HO 혼성화물의 유무는 Tm 값에 기초하여 결정된다.
특히, 본 발명은 상기 HO가 절단되었을 때 뿐만 아니라 HO가 절단되지 않은 경우(즉, HO와 CTO 간의 혼성화가 연장이합체의 형성에 의해 억제됨)에도 타겟 핵산서열 검출을 위하여 적용될 수 있다.
타겟 서열과 혼성화된 후 절단되는 프로브로부터의 시그널 발생을 포함하는 종래 기술은 멜팅 커브를 제공하지 않을 수 있다. 이와는 달리, 본 발명은 타겟 서열과 무관한 서열을 가지는 CTO와 HO 간의 혼성화물이 제공하는 멜팅 시그널의 소멸(또는 감소)을 사용한다. 따라서, 본 발명은 HO가 타겟 서열의 존재에 의존하여 절단되는 경우에도 멜팅 분석에 의하여 타겟 서열을 검출할 수 있다.
멜팅 또는 혼성화 분석을 포함한 PCE-NH 어세이의 제 1 양태를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 타겟 핵산서열과 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO 의 혼성화
본 발명에 따르면, 우선 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산서열” 또는 “타겟 서열”은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프로브 또는 프라이머와 어닐링 또는 혼성화된다.
명세서에서 사용되는 용어 “프로브(probe)"는 타겟 핵산서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변이 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부의 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 타겟 핵산서열의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분 및 이들의 pH 및 이온세기와 같은 조건은 올리고뉴클레오타이드(업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO)의 길이 및 GC 양 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 낮은 엄격조건(stringent condition)을 선택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
용어 “어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO는 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “상보적인”은 소정의 어닐링 조건 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 상보적인(substantially complementary)” 및 “완전히 상보적인(perfectly complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
PTO의 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비-상보적인”은 소정의 어닐링 조건 또는 엄격조건 하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 비상보적인(substantially non-complementary)” 및 “완전히 비-상보적인(perfectly noncomplementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
예를 들어, PTO의 5’-태깅 부위를 언급하면서 사용되는 용어 “비-상보적인”은 소정의 어닐링 조건 또는 엄격조건 하에서 5’-태깅 부위가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 비상보적인(substantially non-complementary)” 및 “완전히 비-상보적인(perfectly noncomplementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
명세서에서 사용되는 용어 “PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)”는 (ⅰ) 프로브로서의 역할을 하는 3’-타겟팅 부위 및 (ⅱ) 타겟 핵산서열과의 혼성화 이후 절단되어 PTO로부터 방출되며 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-태깅 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위는 반드시 5’→3’순서로 위치한다. 도 1에서 PTO를 도식적으로 보여준다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 3’-타겟팅 부위가 타겟 핵산서열에 혼성화되고 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 비혼성화되는 엄격조건 하에서 단계 (a)의 혼성화가 실시된다.
PTO는 어떠한 특정 길이도 요구하지 않는다. 예를 들어, PTO의 길이는 15-150 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-150 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 30-150 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드, 30-50 뉴클레오타이드, 35-100 뉴클레오타이드, 35-80 뉴클레오타이드, 35-60 뉴클레오타이드 또는 35-50 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. PTO의 3’-타겟팅 부위가 타겟 핵산서열에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 3’-타겟팅 부위는 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 5’-태깅 부위는 CTO의 캡쳐링 부위에 특이적으로 혼성화된 후 연장되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 5’-태깅 부위는 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
PTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널(terminal)을 가질 수도 있다. 바람직하게는, PTO의 3’-말단은 "블록킹”되어 그의 연장이 방지된다.
블록킹은 종래 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
택일적으로, PTO가 헤어핀 구조를 갖도록 디자인할 수 있다.
PTO의 5’-태깅 부위 및 타겟 핵산서열 간의 비-혼성화는 특정 혼성화 조건하에서 그들 사이에 안정한 이중-가닥이 비-형성됨을 의미한다. 본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열과의 혼성화에 관여하지 않는 PTO의 5’-태깅 부위는 단일-가닥을 형성한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 업스트림에 위치한다.
또한, 타겟 핵산서열에 혼성화된 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 PTO 절단의 유도는 두 가지 방식으로 달성될 수 있다: (ⅰ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도; 및 (ⅱ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-의존적 절단 유도.
업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도할 정도로 상기 PTO에 근접하게 위치하는 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 결합한 상기 효소는 연장반응 없이 PTO를 절단한다. 반면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO로부터 이격되어 있는 경우, 중합효소 활성을 갖는 효소(예컨대, 주형-의존적 중합효소)는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프라이머)의 연장을 촉진시키고, 연장산물에 결합된 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 PTO를 절단한다.
따라서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 두 가지 방식으로 PTO에 대하여 상대적으로 위치할 수 있다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-독립적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 PTO에 근접한 위치에 위치할 수 있다. 택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO로부터 이격된 위치에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 지점(positions) 또는 위치(locations)를 언급하면서 사용되는 용어“근접(adjacent)”은 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위 바로 가까이에 위치하여 닉(nick)을 형성하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위로부터 1-30 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드 또는 1-15 뉴클레오타이드 이격되어 위치하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 지점 또는 위치를 언급하면서 사용되는 용어“이격(distant)”은 연장반응이 일어나는데 충분할 정도의 어떠한 지점 또는 위치를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 PTO로부터 이격되어 위치할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다. 업스트림 프라이머는 연장-독립적 절단 유도 또는 연장-의존적 절단에 적합하며, 업스트림 프로브는 연장-독립적 절단 유도에 적합하다.
택일적으로, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 가질 수 있다. 바람직하게는, 겹치는 서열은 1-10 뉴클레오타이드 길이, 1-5 뉴클레오타이드 또는 1-3 뉴클레오타이드이다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 갖는 경우, 단계 (b)의 절단반응에서 3’-타겟팅 부위는 5’-태깅 부위와 함께 부분적으로 절단된다. 또한, 겹치는 서열은 3’-타겟팅 부위의 원하는 특정 위치가 절단되도록 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통하여 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO의 절단을 유도하여 PTO의 5’-태깅 부위 또는 PTO의 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편이 방출되는 한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 절단반응 관련 종래 기술들은 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호, 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 본 발명에 응용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하는 것이다. 다운스트림 프라이머는 PTO에 혼성화 되는 타겟 핵산서열을 추가적으로 생성시키며, 타겟 검출의 민감도를 향상시킨다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 이용하는 경우, 프라이머의 연장을 위하여 추가적으로 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브), 다운스트림 프라이머 및/또는 PTO의 5’-태깅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는다. DPO 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 종래 프라이머 및 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이도를 나타낸다(참조 WO 2006/095981; Chun 등, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).
본 발명의 일 구현예에 따르면, PTO의 3’-타겟팅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 변이 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는다. 변이 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조는 종래 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2011/028041).
단계 (b): PTO 절단으로부터 단편의 방출
이어, PTO의 절단을 위한 조건 하에서 단계 (a)의 결과물을 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 접촉시킨다. 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의하여 절단되어 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “PTO의 절단을 위한 조건”은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO가 절단되는데 충분한 조건, 예컨대 온도, pH, 이온세기 및 버퍼, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 효소를 의미한다. 예를 들어, 5’뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, PTO의 절단을 위한 조건은 Tris-HCl 버퍼, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.
PTO가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 그의 3’-타겟팅 부위는 혼성화에 포함되나 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않고 단일-가닥을 형성한다(참조 도 2). 이와 같이, 단일-가닥 및 이중-가닥 구조 모두를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 절단될 수 있다.
PTO의 절단 위치는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프로브 또는 업스트림 프라이머)의 종류, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 위치 및 절단 조건에 따라 다양해진다(참조 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호 및 제7,381,532호 또는 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호).
PTO의 절단반응을 위하여 다수의 종래 기술을 이용할 수 있으며, 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.
종합하면, 단계 (b)의 절단 반응에서 세 가지 절단 위치가 있을 수 있다. 첫 번째 절단 위치는 PTO의 혼성화 부위(3’-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5’-태깅 부위) 간의 정션 위치(junction site)이다. 두 번째 절단 위치는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다. 두 번째 절단 위치는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치할 수 있다. 세 번째 절단 위치는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 5’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머가 연장되면서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소에 의하여 PTO의 절단이 시작되는 위치는 PTO 및 타겟 핵산서열 간의 이중가닥이 시작되는 지점 또는 그 시작 지점으로부터 1-3 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.
따라서, 본 명세서에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 언급하면서 사용되는 용어 “PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 (i) 5’-태깅 부위, (ii) 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 (iii) 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에서 용어 “PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 “PTO 단편”으로 표현된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, PTO는 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 절단에 내성이 있는 블로커를 포함하는 블로커(blocker) 부위를 갖고 블로커 부위는 초기 절단 위치 및/또는 연속적 절단을 조절하는데 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, PTO는 블로커로서 5’뉴클레아제 활성을 가진 효소에 의한 절단에 내성이 있는 최소 하나의 뉴클레오타이드를 포함하는 블로커 부위를 갖는다.
예를 들어, PTO의 혼성화 부위(3’-타켓팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5’-태깅 부위) 간의 정션 위치에 절단을 유도하기 위해, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 블로커로 블로킹될 수 있다.
블로커 부위에 포함되는 블록커의 개수는 제한되지 않으며, 1-10, 2-10, 3-8 또는 3-6 블로커를 포함할 수 있다. PTO에 존재하는 블로커는 연속적 또는불연속적인 방식일 수 있고, 바람직하게는 연속적인 방식이다. 블록커로서의 뉴클레오타이드, 즉 5’→3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 어떠한 것도 포함한다. 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드는 다양한 포스포로티오에이트 연결, 포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결 및 2'-카르보하이드레이트 변형(modification)을 포함한다. 본 명세서의 구현예에 따르면, 5’→ 3’ 엑소뉴클레아제에 내성이 있는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결, 알킬포스포트리에스테르 열결, 아릴 포스포트리에스터 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결, 아릴 포스포로아미데이트 연결, 포스포로셀레네이트 연결, 2'-O-아미노프로필 변형, 2'-O-알킬 변형, 2'-O-알릴 변형, 2'-O-부틸 변형, α-아노머릭 올리고디옥시뉴클레오타이드 및 1-(4'-티오-β-D-리보퓨라노실(ribofuranosyl)) 변형를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 블로커로서 뉴클레오타이드는 LNA(Locked Nucleic Acid)를 포함한다.
본 명세서에서 PTO의 5’-태깅 부위의 일부, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부와 같이 PTO 또는 CTO를 언급하면서 사용되는 용어 “일부(part)”는 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이며 보다 바람직하게는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이다.
본 발명에 적합한 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus( Taq ), Thermus thermophilus ( Tth ), Thermus filiformis, Thermis flavus , Thermococcus literalis , Thermus antranikianii , Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens, Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosipho africanus , Thermococcus litoralis , Thermococcus barossi , Thermococcus gorgonarius , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosiphoafricanus , Pyrococcus woesei , Pyrococcus horikoshii , Pyrococcus abyssi , Pyrodictium occultum , Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함한다. 보다 바람직하게는, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
택일적으로, 본 발명은 중합효소 활성을 덜 갖도록 변형된, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.
사용되는 FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 5’플랩-특이적 뉴클레아제(5’flap-specific nuclease)이다.
본 발명에 적합한 FEN 뉴클레아제는 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 FEN 뉴클레아제를 포함하며, 이는 Sulfolobus solfataricus , Pyrobaculum aerophilum , Thermococcus litoralis , Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus , Acidianus brierlyi , Acidianus ambivalens , Desulfurococcus amylolyticus , Desulfurococcus mobilis , Pyrodictium brockii , Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii , Methanopyrus kandleri , Methanococcus igneus , Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix 및 Archaeaglobus veneficus를 포함한다.
단계 (a)에서 상기 업스트림 프라이머를 이용하는 경우, PTO의 절단을 위한 조건은 업스트림 프라이머의 연장반응을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하며, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소를 이용하고, 상기 주형-의존적 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일한 효소이다.
선택적으로, 단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하며, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소를 이용하고, 상기 주형-의존적 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 상이한 효소이다.
단계 (c): PTO로부터 방출된 단편과 CTO의 혼성화
PTO로부터 방출된 단편은 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)와 혼성화 된다.
CTO는 3’→5’방향으로 (i) PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다.
CTO는 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 주형의 역할을 한다. 프라이머로서의 역할을 하는 상기 단편은 CTO와 혼성화되고, 연장되어 연장이합체를 형성한다.
템플레이팅 부위가 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 서열을 갖는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 또한, 템플레이팅 부위가 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 주형의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, PTO의 5’-태깅 부위를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인할 수 있다. 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인할 수 있다. PTO의 5’-태깅 부위의 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인할 수 있다.
한편, PTO의 절단 위치를 예상함으로써 CTO의 캡처링 부위를 디자인할 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위가 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인하는 경우, 5’-태깅 부위의 일부를 갖는 단편 또는 5’-태깅 부위를 갖는 단편은 캡처링 부위와 혼성화 될 수 있으며 이후 연장된다. 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, 상기 단편은 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인 된 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 될 수 있으며, 상기 단편의 3’-말단 부위에 미스매치 뉴클레오타이드가 존재함에도 불구하고, 성공적으로 연장될 수 있다. 이것은 프라이머의 3’-말단이 일부 미스매치 뉴클레오타이드(예컨대, 1-3 미스매치 뉴클레오타이드)를 포함함에도 불구하고, 프라이머가 반응 조건에 따라 연장될 수 있기 때문이다.
5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부는 상기 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 디자인함으로써 미스매치 뉴클레오타이드와 관련된 문제를 해결할 수 있다(참조 도 1).
본 발명의 일 구현예에서, 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 PTO의 3’-타겟팅 부위 상의 예상되는 절단 위치에 따라 선택될 수 있다. 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 1-10 뉴클레오타이드, 1-5 뉴클레오타이드, 또는 1-3 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
CTO의 3’-말단은 단편과의 혼성화에 포함되지 않는 추가적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, CTO가 상기 단편과 안정되게 혼성화 되는 한, CTO의 캡처링 부위는 상기 단편의 일부(예컨대, 단편의 3’-말단 부위를 포함하는 단편의 일부)에만 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위”는 상술한 바와 같이 CTO의 캡처링 부위의 다양한 디자인 및 구성을 포함하여 설명한다.
CTO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인 할 수 있다.
CTO의 길이는 다양해 질 수 있다. 예를 들어, CTO는 7-1000 뉴클레오타이드, 7-500 뉴클레오타이드, 7-300 뉴클레오타이드, 7-100 뉴클레오타이드, 7-80 뉴클레오타이드, 7-60 뉴클레오타이드, 7-40 뉴클레오타이드, 15-1000 뉴클레오타이드, 15-500 뉴클레오타이드, 15-300 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-1000 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드, 30-1000 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-40 뉴클레오타이드의 길이이다. CTO의 캡처링 부위는 PTO로부터 방출된 단편에 특이적으로 혼성화 되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위는 5-100 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 또한, CTO의 템플레이팅 부위는 PTO로부터 방출된 단편의 연장반응에서 주형의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, CTO의 템플레이팅 부위는 2-900 뉴클레오타이드, 2-400 뉴클레오타이드, 2-300 뉴클레오타이드, 2-100 뉴클레오타이드, 2-80 뉴클레오타이드, 2-60 뉴클레오타이드, 2-40 뉴클레오타이드, 2-20 뉴클레오타이드, 5-900 뉴클레오타이드, 5-400 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 10-900 뉴클레오타이드, 10-400 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 15-900 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
CTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널을 가질 수 있다. 바람직하게는, CTO의 3’-말단은 블로킹되어 연장이 방지된다. CTO의 비-연장 블록킹은 종래 방법들에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 CTO의 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
PTO로부터 방출된 단편은 CTO와 혼성화 되며, 단편의 연장에 적합한 형태를 제공한다. 또한, 비절단 PTO가 그의 5’-태깅 부위를 통하여 CTO의 캡처링 부위와 혼성화 되더라도, PTO의 3’-타겟팅 부위는 CTO와 혼성화 되지 않아, 연장이합체의 형성이 방지된다.
단계 (c)에서의 혼성화는 단계 (a)에서의 혼성화에 대한 설명을 참조하여 상세하게 설명될 수 있다.
단계 (d): 단편의 연장
연장 반응은 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (c)의 결과물을 이용하여 실시한다. CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성한다. 반면, CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 비절단된 PTO는 연장되지 않으며 이에 의해 연장이합체도 형성되지 않는다.
본 명세서에서 단편과 함께 사용된 용어 “연장가닥”은 단편 및 단편의 연장 서열로 구성된 서열을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “연장이합체”는 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 단편이 주형-의존적 핵산 중합 효소와 CTO의 템플레이팅 부위를 주형으로 이용하여 연장되는 연장반응에 의하여 형성된 이합체를 의미한다.
단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 어떠한 핵산 중합효소도 포함되며, 예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우(Klenow)” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소이다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus( Taq ), Thermus thermophilus( Tth ), Thermus filiformis, Thermis flavus , Thermococcus literalis , Thermus antranikianii , Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens, Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosipho africanus , Thermococcus litoralis , Thermococcus barossi , Thermococcus gorgonarius , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosiphoafricanus , Pyrococcus furiosus( Pfu ), Pyrococcus woesei , Pyrococcus horikoshii , Pyrococcus abyssi , Pyrodictium occultum , Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함한다. 보다 바람직하게는, 주형-의존적 핵산 중합효소는 Taq 중합효소이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소와 동일하다. 보다 바람직하게는, 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 업스트림 프라이이머의 연장을 위하여 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 서로 동일하다.
단계 (e): HO을 이용한 멜팅 (Melting) 또는 혼성화 분석
연장 반응에 이어, HO(혼성화 올리고뉴클레오타이드)의 존재하에서, 일정 온도 범위에 걸쳐 단계 (d)의 결과물에 대한 멜팅 분석 또는 혼성화 분석을 실시하여 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널의 발생 여부를 측정하였다.
상기 타겟 핵산서열이 핵산 시료 내에 존재하지 않는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO와 HO는 혼성화물을 형성하고, 이에 의해 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다. 상기 타겟 핵산서열이 핵산 시료에 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지하고, 이에 의해 시그널을 제공하지 않는다.
단계 (e)는 상기 HO를 사용하여 실시된다.
상기 HO는 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 연장이합체가 형성되지 않아서 상기 CTO가 단일 가닥인 경우, 상기 HO는 상기 CTO와 혼성화되어 혼성화물을 형성한다. 상기 혼성화물은 멜팅 또는 혼성화 분석 동안 일정 온도 범위에 걸쳐 형성 및/또는 멜팅되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다. 상기 연장이합체가 형성되어, 상기 CTO가 이중가닥인 경우, 상기 연장이합체는 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물 형성을 방지하고, 이에 의해 멜팅 또는 혼성화 분석 동안에 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널이 제공되지 않는다.
상기 HO의 길이는 광범위하게 변할 수 있다. 예를 들어, HO는 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 5-10 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 15-20 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드에 길이이다.
본 발명에서, 상기 CTO/연장가닥의 연장이합체는 상기 CTO/HO의 혼성화물보다 더 안정한 이합체일 수 있다. 이를 위해, 상기 HO의 Tm 값은 CTO의 Tm 값보다 더 낮을 수 있다. 본 발명의 일 구현에 따르면, CTO/HO 혼성화물의 Tm 값은 상기 CTO/연장가닥의 연장이합체의 Tm 값보다 최소 10℃, 20℃, 30℃, 또는 40℃ 더 낮다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 HO는 HO의 3’-말단이 블로킹되어 HO의 연장을 방지한다.
상기 연장이합체에 의한 CTO와 HO 간의 혼성화물 형성의 방지(prevent)는 CTO 및 HO 사이에 접촉 기회(contact opportunity)의 발생 시점(occurrence time point)에 따라 여러 가지 방식으로 달성될 수 있다.
예를 들어, CTO 및 HO가 단계 (e)에서 서로 처음으로 접촉하는 경우(예컨대, 별도의 반응 용기에서 단계 (a)-(d) 및 (e)-(f) 실시), 본 발명은 도 2에 도시된 바와 같이 실시될 수 있다. 상기 HO는 상기 PTO 단편의 연장 전 상기 CTO와 접촉하지 않지만 연장반응의 결과물과 혼성화에 참여(involve)한다. 멜팅 분석 단계에서, 상기 연장이합체의 형성은 상기 HO와 CTO의 혼성화의 억제(inhibit)로 인해 상기 CTO/HO의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)한다.
상기 CTO와 HO가 단계 (d)에서 서로 접촉하는 경우(예를 들어, 하나의 반응 용기에서 단계 (a)-(f) 실시), 본 발명은 도 3에 도시된 바와 같이 실시될 수 있다. 상기 HO는 연장 전 상기 CTO와 혼성화될 수 있고 연장반응에 관여한다. HO가 단편의 연장 전 CTO와 혼성화되는 경우, 단편의 연장은 CTO로부터 HO를 절단 또는 분리(displaces)시킨다. 특히, HO가 연장반응 동안에 절단되는 경우, 연장이합체의 형성은 절단에 의한 HO의 소모로 인하여 멜팅 분석 단계에서 CTO/HO의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)한다. HO가 단계 (d)에서 CTO와 혼성화되는 경우, 연장이합체의 형성은 CTO로부터 HO를 방출(분리)시킬 수 있다(HO의 가닥 치환). 이러한 경우 분리된 HO는 CTO와 HO의 혼성화의 억제로 인하여 멜팅 또는 혼성화 분석에서 CTO와 혼성화물을 형성하지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, PTO 단편의 연장에 의한 HO의 절단 및/또는 가닥 치환(strand displacement)은 주형-의존적 핵산 중합효소의 종류 또는 반응 조건에 의하여 영향을 받는다.
상기 CTO와 HO가 단계 (d)에서 서로 접촉하는 기회를 가지더라도, 몇몇의 HO는 연장 전 상기 CTO와 혼성화되지 않을 수 있다. 이러한 경우, 상기 HO는 CTO와 HO의 혼성화 억제(inhibit)로 인해 단계 (e)에서 CTO와 혼성화물을 형성할 수 없다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (d)에서 반응 조건(예를 들어, 반응 온도 및 HO 및 PTO 단편의 Tm 값)을 조절함으로써, HO는 연장 전 CTO와 혼성화되지 않고, 연장반응에 관여하지 않는다.
상기 HO가 CTO와 처음으로 접촉하는 단계에 관계없이, 타겟 핵산 서열의 존재하에서, 연장이합체가 형성되어 다음 방식 (i) HO와 CTO의 혼성화의 억제(inhbit) 및/또는 (ii) 절단에 의한 HO의 소모에 의하여 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)한다.
상기 타겟 핵산서열의 비존재 하에서, 상기 연장이합체는 형성되지 않으므로 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 형성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (d)는 HO의 존재 하에서 실시되고 HO는 CTO와 혼성화 및/ 또는 CTO와 비혼성화 된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)는 HO의 존재 하에서 실시되고; (i) 상기 CTO의 캡쳐링 부위와 혼성화된 상기 단편은 상기 HO의 혼성화 이전에 연장되며 및/또는 (ii) 상기 단편의 연장 전에 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화된 경우, 상기 단편의 연장은 상기 CTO로부터 상기 HO를 절단 또는 분리(displace)시키며, 이에 상기 연장이합체의 형성은, 상기 CTO와 HO 간의 혼성화 억제 및/또는 절단에 의한 HO의 소모로 인하여 상기 단계 (e)에서 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CTO에 혼성화된 단편의 연장을 위한 조건에 따라 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화되어 있는 경우가 우세하거나 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화되어 있지 않은 경우가 우세할 수 있다.
상기 HO가 CTO에 상보적인 서열을 포함하고 있을지라도, 상기 연장이합체의 타겟-의존적 형성은 상기 HO가 CTO와 혼성화하는 것을 방지한다. HO가 연장이합체의 형성 전에 CTO와 혼성화 될 때도, HO는 상기 CTO로부터 떨어지고, 방출되거나 또는 제거된다(예를 들어, HO의 절단 또는 분리에 의해).
상기 HO는 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 HO의 뉴클레오타이드 서열은 CTO의 구역 중에서 PTO 단편이 혼성화되는 구역 이외의 구역에 상보적인 서열을 포함하도록 디자인 할 수 있다
이러한 경우에, HO는 CTO와 결합에 PTO 단편(또는 비절단 PTO)과 경쟁하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, HO는 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, HO는 CTO와의 혼성화에 있어서 단편(또는 비절단 PTO)과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인할 수 있다(도 6 및 7 참조). 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 경쟁적 HO(competitive HO)는 상기 단편 또는 그의 연장 산물에 의해 절단되지 않거나 또는 연장반응 동안 분리되지 않는다. 예를 들어, HO는 CTO의 캡처링 부위와 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인할 수 있다.
본 명세서에서 HO의 서열을 언급하면서 사용되는 용어 “ CTO의 캡처링 부위와 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열”은 상기 HO가 CTO와 혼성화 될 때, CTO의 캡처링 부위와 이중 가닥을 형성하는 HO의 부위를 나타낸다. 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화할 수 있는 HO의 뉴클레오타이드 서열은 HO의 전체 서열 또는 일부 서열일 수 있다. 상기 HO에서 CTO의 캡처링 부위와 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 상기 HO의 전체 서열 또는 일부 서열(예를 들어, 10%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)에 해당한다.
HO가 CTO의 캡처링 부위와 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, 상기 HO는 PTO 단편 및/또는 비절단된 PTO의 5’-태깅 부위와 겹치는(overlapping) 서열을 가질 수 있다. 이러한 경우,(i) HO 및 PTO 단편, 또는 (ii) HO 및 비절단 PTO의 5’-태깅 부위는 CTO에 대한 혼성화를 경쟁 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “경쟁적 HO(competitive HO)"는 CTO와 혼성화면에서 PTO 단편 또는 비절단된 PTO와 경쟁하는 서열을 포함하는 HO를 나타낸다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 경쟁적 HO는 CTO와 혼성화면에서 PTO 단편(구체적으로는, PTO 단편의 연장가닥)보다 경쟁력이 낮고, 비절단 PTO의 5’-태깅 부위보다는 경쟁력이 높다.
타겟 핵산서열이 존재하고 경쟁적 HO가 단계 (c) 및/또는 (d)에 존재하는 경우, CTO와 혼성화에 있어서 경쟁적 HO 및 PTO 단편 간의 경쟁은 문제가 될 수 있다. 이러한 경우, 경쟁적 HO 보다 PTO 단편이 CTO와 혼성화되고 연장되어 연장가닥을 생산하는 것이 바람직하다. CTO와 혼성화된 PTO 단편은 연장되므로, PTO 단편은 경쟁적 HO 보다 CTO와 혼성화에 더 유리하다.
본 발명의 특정 구현예에서, 단계 (c)는 상기 HO와 CTO 간의 혼성화 보다 상기 PTO 단편과 CTO 간의 혼성화가 더 유리한 조건 하에서 실시된다. 이러한 유리한 조건은 다양한 방법에 의해 도달할 수 있다. 예를 들어, 유리한 조건을 위해 상기 HO의 3’-말단은 블로킹될 수 있다. 블로킹된 3’-말단을 갖는 HO는 연장되지 않고, 상기 PTO 단편과의 경쟁으로 인한 CTO로부터의 해리 확률이 증가한다. 상기 CTO와 혼성화된 PTO 단편은 연장되어 연장가닥을 형성하고, 더 안정적으로 유지될 수 있다. 그러므로, 상기 단계 (c) 및 (d)를 거친 반응 결과물은 CTO/HO 혼성화물보다 연장이합체가 우세적으로 된다. 결론적으로, CTO/HO 혼성화물의 수(또는 양)는 타겟 핵산서열이 존재하는 경우에는 연장이합체로 인하여, 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우와 비교하여 상대적으로 감소한다.
상기 타겟 핵산서열이 비존재 하는 경우, 상기 PTO의 절단은 일어나지 않고 비절단된 PTO로 남아있는다. 상기 비절단된 PTO 및 경쟁적 HO가 둘 다 존재하는 경우, 비절단된 PTO의 5’-태깅 부위와 경쟁적 HO는 서로 겹치는 서열을 가지기 때문에 CTO에 대한 혼성화에 경쟁한다. 상기 타겟 핵산서열이 비존재 하는 경우, 본 발명의 원리는 CTO와 HO의 혼성화를 필요로 하기 때문에 경쟁적 HO는 비절단 PTO의 5’-태깅 부위보다 CTO와의 혼성화에 더 유리하여야 한다.
상기 PTO 단편의 Tm 값이 경쟁적 HO의 Tm 값보다 높은 경우, PTO 단편이 경쟁적 HO보다 CTO와 혼성화에 있어서 더 유리하다. 상기 비절단된 PTO의 5’-태깅 부위와 경쟁적 HO간의 경쟁을 고려하면, PTO 단편의 높은 Tm 값이 항상 바람직하지는 않다. PTO 단편의 Tm 값이 경쟁적 HO의 Tm 값 보다 더 낮을 때에도, CTO와 혼성화된 PTO 단편의 연장으로 인해 경쟁적 HO보다 CTO와 혼성화에 더 유리할 수 있다. 이러한 경우에는 경쟁적 HO가 비절단된 PTO의 5’-태깅 부위보다 CTO와 혼성화에 더 유리할 수 있다.
상기 기재된 수많은 요인 또는 문제들을 고려하여, 적합한 경쟁적 HO를 디자인하여야 한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CTO/HO 혼성화물 및 상기 PTO 단편/CTO 혼성화물의 Tm 값 간의 차이는 ± 40℃, ± 30℃, ± 20℃, ± 15℃, ± 10℃, ± 5℃ 또는 ± 3℃ 이내이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CTO/HO 혼성화물 및 비절단된 PTO의 5’-태깅 부위/CTO 혼성화물의 Tm 값 간의 차이는 ± 40℃, ± 30℃, ± 20℃, ± 15℃, ± 10℃, ± 5℃ 또는 ± 3℃ 이내이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO 및 상기 비절단된 PTO가 CTO와 경쟁적으로 혼성화되는 경우, 상기 CTO/HO의 Tm 값은 상기 CTO/비절단된 PTO의 Tm 값보다 더 높을 수 있다(예를 들어, 최소 2℃, 4℃, 6℃, 8℃, 10℃, 15℃ 또는 20℃).
상기 비절단된 PTO/CTO 혼성화물의 Tm 값은 CTO와 혼성화되는 PTO 서열의 부위에 의해 결정된다. 예를 들어, 상기 비절단된 PTO의 5’-태깅 부위가 상기 CTO와 혼성화되는 경우, 5’-태깅 부위의 Tm 값은 비절단된 PTO/CTO 혼성화물의 Tm 값에 대한 결정 요인이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “비절단된 PTO의 Tm 값”은 달리 나타내지 않는 한, CTO와 혼성화된 비절단 PTO 서열의 부위에 의해 결정된 Tm 값을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단편의 연장가닥은 HO 보다 더 높은 Tm 값을 가지고, HO는 PTO의 5’-태깅 부위 보다 더 높은 Tm 값을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CTO와의 혼성화를 고려해 볼 때, PTO 단편의 연장가닥의 Tm 값은 상기 HO의 Tm 값보다 더 높고, HO의 Tm 값은 상기 비절단된 PTO의 Tm 값 보다 더 높다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO 및 PTO 단편은 겹쳐진 부위외의 다른 부위를 통해 CTO와 혼성화되지 않도록 디자인하였다. 이러한 경우, 상기 HO와 PTO 단편이 CTO에 동시에 혼성화하는 것을 방지할 수 있다.
Tm 값은 혼성화되는 뉴클레오타이드의 길이 및 G/C 함량에 의해 결정된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, Tm 값은 Wallace rule(R.B. Wallace 등, Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) 및 nearest-neighbor 방법(SantaLucia J. Jr. 등, Biochemistry, 35:35553562(1996)); Sugimoto N. 등, Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996))와 같은 종래 방법에 의하여 계산할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, Tm 값은 실제로 사용하는 반응 조건 하에서의 실제 Tm 값을 나타낸다.
멜팅 분석 또는 혼성화를 포함하는 PCE-NH에서, CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널은 다양한 표지 시스템에 의해 제공될 수 있다: (i) HO에 연결된 표지, (ii) CTO에 연결된 표지, (iii) HO에 연결된 표지 및 CTO에 연결된 표지 및 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물 형성에 관한 시그널이 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물 비형성에 관한 시그널과 상이한 한도 내에서, 다양한 종류의 표지 및 표지 위치가 본 발명에 쓰일 수 있다. 원리 상, 본 발명은 멜팅 또는 혼성화 분석에서 적합한 시그널의 제공을 필요로 한다. 이와 관련하여, 상술한 표현은 예를 들어 다음의 의미를 포함한다: 상기 CTO와 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 제공되는 시그널과 상기 CTO와 HO가 서로 떨어져서 있는 경우에 제공되는 시그널이 상이한 한도 내에서, 다양한 종류의 표지 및 표지 위치가 본 발명에 쓰일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 표현 “CTO와 HO 간의 혼성화물이 형성되는 경우에 시그널과 CTO와 HO 간의 혼성화물이 비형성되는 경우에 시그널이 상이하다.”는 예를 들어, 다음의 의미를 포함한다: “상기 CTO와 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 제공되는 시그널과 상기 CTO와 HO가 서로 떨어져서 있는 경우에 제공되는 시그널이 상이하다.” 하기 상술하는 시그널링을 위한 표지는 다음의 특징을 갖추고 있어야 한다: 상기 CTO와 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 제공되는 시그널과 상기 CTO와 HO가 서로 떨어져서 있는 경우에 제공되는 시그널이 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널의 상이함은 시그널 생성 및 시그널 소멸과 같은 현상에 의해 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널의 상이함은 세기의 변화(시그널 증가 및 시그널 감소)와 같은 현상에 의해 제공된다.
본 발명에 유용한 표지는 예를 들어, 단일 표지, 상호작용적 이중 표지 및 인터컬레이팅 표지를 포함하는 당업계에 알려진 다수의 표지를 포함한다.
본 발명에서 유용한 표지는 상호작용적 이중 표지를 포함한다(도 2-4 및 6-7 참조).
상기 상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 크로모포어(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다. 공여체 분자 및 수용체 분자는 본 발명에서 각각 리포터 분자 및 퀀처 분자로 설명될 수 있다. 상호작용적 이중 표지는 접촉-매개 퀀칭(contact-mediated quenching)에 기반하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 표지 쌍을 포함한다(Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 and Johansson et al., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 본 발명에서, 상호작용적 표지 시스템은 최소 2개 분자(예를 들어, 염료) 간의 상호작용에 의한 시그널 변화를 포함하는 모든 또는 어떠한 케이스를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CTO-HO 혼성화물의 존재 또는 비존재를 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템, 특히 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중 시스템)에 의해 생성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO 또는 상기 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 비형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중표지가 위치한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 갖는다.
상기 HO가 단일 가닥 상태인 경우, HO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 타겟 핵산서열이 비존재 하고 CTO/HO 혼성화물이 형성되는 경우, HO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격되어 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해, 멜팅 또는 혼성화 분석 동안에 시그널 변화를 야기하여 CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다(도 2 및 3 참조). 타겟 핵산서열이 존재하고 CTO/HO 혼성화물이 형성되지 않는 경우, 멜팅 또는 혼성화 분석 동안에 시그널 변화는 발생하지 않고 CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널은 제공되지 않는다(도 2 및 3 참조).
본 명세서에서 사용되는 표현 “리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 근접한”은 HO 또는 CTO의 형태적 구조, 예컨대 랜덤 코일(coli) 및 헤어핀 구조에 의해 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3 차원적으로 서로 인접하게 되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 표현 “리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어”는 이중 가닥의 형성에 의한 CTO 또는 HO의 형태적 구조의 변화에 의하여 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3 차원적으로 이격되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CTO의 템플레이팅 부위는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 갖고, HO는 CTO의 표지-연결 구역에 상보적인 서열을 포함한다. CTO가 단일 가닥 형태인 경우, CTO 상에 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 타겟 핵산서열이 비존재하고 CTO/HO 혼성화물이 형성되는 경우, CTO 상에 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격되어 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해, 멜팅 또는 혼성화 분석 동안에 시그널 변화를 야기하여 CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다. 타겟 핵산서열이 존재하고 CTO/HO 혼성화물이 형성되지 않는 경우, 멜팅 또는 혼성화 분석 동안에 시그널 변화는 발생하지 않고 CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널은 제공되지 않는다.
본 발명에서 상호작용적 이중 표지를 갖는 CTO를 사용하는 경우, CTO/연장가닥의 연장이합체는 멜팅 분석에서 시그널을 제공할 수 있다. 상기 연장이합체의 Tm 값은 CTO/HO 혼성화물의 Tm 값과는 상이하기 때문에, CTO/HO 혼성화물로부터의 시그널은 연장이합체로부터의 시그널과 구별되게 검출될 수 있다. CTO/HO 혼성화물로부터의 시그널을 이용하는 본 발명은 연장이합체로부터의 시그널을 이용하는 발명과는 명백히 다르다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CTO/HO 혼성화물의 멜팅 또는 CTO와 HO의 혼성화에 의존적으로 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되거나 또는 언퀀칭되는 한도 내에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HO 또는 CTO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 5’-말단 또는 그의 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고 나머지 하나는 HO의 형태(conformation)에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하는 위치에 위치한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 3’-말단 또는 그의 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고 나머지 하나는 HO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하는 위치에 위치한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 각각 HO의 양 말단에 위치한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CTO의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 5’-말단 또는 그의 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고 나머지 하나는 CTO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하는 위치에 위치한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, CTO의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 3’-말단 또는 그의 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고 나머지 하나는 CTO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
본 발명에 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 본 명세서에 상술한 형광 표지를 포함할 수 있다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and PHOphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
본 발명에서, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭 할 수 있는 비-형광 블랙 퀀처 분자(또는 블랙 퀀처 분자)가 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 비-형광 블랙 퀀처 분자의 예는 BHQ 및 DABCYL이다. 리포터 및 퀀처로 구성된 시그널링 시스템에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예컨대, 플루오레세인 색소(fluorescein dye)는 리포터로 이용되며, 로다민 색소 (rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 퀀처 분자가 형광인 경우, 시그널 검출은 퀀처 분자로부터의 시그널 변화 또는 퀀처 분자 및 리포터 분자 둘로부터의 시그널 변화를 측정하여 실시된다.
본 발명은 가닥 간-상호작용적 이중 표지 시스템이 사용될 수 있다(도 4 참조).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 하나를 갖고, 상기 CTO는 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 가지며; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 비형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중표지가 위치한다.
가닥 간-상호작용적 이중 표지는 CTO에 연결된 표지(예를 들어, 공여체 분자) 및 HO에 연결된 표지(수용체 분자) 간의 상호작용을 이용한다.
상기 HO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 갖고 CTO는 나머지 하나의 상호작용적 이중 표지를 갖는다. 상기 CTO와 HO 간의 혼성화는 가닥 간-상호작용적 이중 표지로부터의 시그널을 변화시켜 CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타나는 시그널을 제공한다(도 4 참조). 본 발명의 특정 구현예에서, CTO에 표지는 템플레이팅 부위에 연결된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 각각 HO의 3’-말단 및 CTO의 5’-말단에 연결된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HO를 하나 더 추가적으로 사용하여 실시되고 상기 두 개의 HO는 상기 CTO에 서로 근접하여 혼성화되며; 상기 두 개의 HO 중 하나는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 하나를 갖고 상기 두 개의 HO 중 나머지 하나는 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 갖고; 상기 CTO와 상기 두 개의 HO 간의 혼성화물이 형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 상기 두 개의 HO 간의 혼성화물이 비형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중표지가 위치한다.
상기 두 개의 HO가 CTO와 혼성화되지 않는 경우, 상기 두 개의 HO는 서로 떨어져 존재하고 퀀처 분자로부터 리포터 분자가 떨어지며, 이에 의해 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하지 않는다. 두 개의 HO가 CTO에 서로 근접하여 혼성화되는 경우, 혼성화는 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널에 퀀칭을 가능하게 하고, 이에 의해 멜팅 또는 혼성화 분석 동안 시그널 변화를 야기하여, CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다. 타겟 핵산서열이 존재하고 CTO/HO 혼성화물이 형성되지 않는 경우, 시그널 변화는 멜팅 또는 혼성화 분석 동안에 일어나지 않고, CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널은 발생되지 않는다.
단일 표지를 사용하는 경우, 상기 HO 또는 CTO 둘 중 하나에 연결될 수 있다(도 5 참조).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO 또는 상기 CTO는 단일표지를 갖고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 형성된 경우에 상기 단일표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 비형성된 경우에 상기 단일표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 단일표지가 위치한다.
상기 단일 표지는 이중 가닥 또는 단일 가닥 상에 존재하는가에 따라 상이한 시그널을 제공할 수 있어야만 한다. 단일 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함한다. 바람직하게는, 단일 표지는 형광 표지를 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 단일 표지는, 단일 표지를 가진 핵산서열이 단일 가닥 또는 이중 가닥에 있는 지의 여부에 따라 세기가 상이한 시그널을 생성할 수 있는 형광 표지를 포함한다.
도 5는 단일 표지를 이용하여 본 발명을 설명한다. 도 5에서, 상기 HO는 단일 표지를 갖는다. HO가 멜팅 분석 동안 CTO와 혼성화되는 경우, HO에 단일 표지로부터의 시그널은 변화된다. 대조적으로, HO가 CTO와 혼성화 되지 않는 경우, HO에 단일 표지로부터의 시그널은 변화되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 CTO가 단일 표지를 갖는 경우, HO는 CTO의 표지-연결 구역에 상보적인 서열을 포함한다. 상기 HO가 멜팅 분석 동안 CTO와 혼성화되는 경우, CTO의 단일 표지로부터의 시그널이 변화된다. 대조적으로, 상기 HO가 CTO와 혼성화 되지 않는 경우, 상기 CTO의 단일 표지로부터의 시그널은 변화되지 않는다. 이러한 경우, 상기 CTO/연장가닥의 연장이합체는 멜팅 분석에서 시그널을 제공할 수 있다. 상기 연장이합체의 Tm 값은 CTO/HO 혼성화물의 Tm 값과는 상이하기 때문에, 상기 CTO/HO 혼성화물로부터의 시그널은 연장이합체로부터의 시그널과 구별하여 검출될 수 있다. CTO/HO 혼성화물로부터의 시그널을 이용하는 본 발명은 연장이합체로부터의 시그널을 이용하는 발명과는 명백히 다르다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 단일 표지를 갖고 상기 HO는 CTO의 표지-연결 구역에 상보적인 서열을 포함한다.
형광 표지의 종류 및 표지 위치는 미국 특허 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시되어 있다.
본 발명에서 유용한 상기 형광 표지는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다.
예를 들어, 상기 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
표지는 종래의 방법에 의해 HO 또는 CTO 둘 중에 하나와 연결될 수 있다. 예를 들어, 표지는 탄소 원자를 포함하는 스페이서(예컨대, 3-탄소 스페이서, 6-탄소 스페이서, 12-탄소 스페이서)를 통해 HO 또는 CTO에 연결 될 수 있다.
본 발명은 상기 HO와 CTO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는데 인터컬레이팅 표지를 이용할 수 있다. 본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 표지의 예는 SYBRTM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTOTM43, SYTOTM44, SYTOTM45, SYTOXTMBlue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PROTM1, TOPROTM1, SYTOTM11, SYTOTM13, SYTOTM15, SYTOTM16, SYTOTM20, SYTOTM23, TOTO™-3, YOYOTM3, GelStarTM 및 씨아졸 오렌지(thiazole orange)를 포함한다. 인터컬레이팅 염료는 이중-가닥 핵산 분자 내에 특이적으로 끼어들어가서 시그널을 생성시킨다.
본 발명에서 상기 인터컬레이팅 염료를 사용하는 경우, 상기 CTO/연장가닥의 연장이합체는 멜팅 또는 혼성화 분석에서 시그널을 제공할 수 있다. 상기 연장이합체의 Tm 값이 CTO/HO 혼성화물의 Tm 값과 상이하기 때문에, 상기 CTO/HO 혼성화물로부터의 시그널은 연장이합체로부터의 시그널과 구별하여 검출될 수 있다. CTO/HO 혼성화물로부터의 시그널을 이용하는 본 발명은 연장이합체로부터의 시그널을 이용하는 발명과는 명백히 다르다는 것을 알 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 HO는 멜팅 또는 혼성화 분석 동안에 혼성화에 의하여 시그널을 발생시킬 수 있는 한도 내에서, 어떠한 프로브도 포함할 수 있으며, 예컨대, Molecular beaconTM (US 5,925,517), HybeaconsTM (D. J. French, et al., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363374 and US 7,348,141), Dual-labeled, self-quenched probe (US 5,876,930), LUXTM (I. A. Nazarenko, et al. Nucleic Acids Res 2002, 30:2089-2095. and US pat no. 7,537,886, Hybridization probe (Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148 and Deepti Parashar et al., Indian J Med Res 124, review article October 2006 385-398)을 포함한다.
단계 (e)에서 멜팅 또는 혼성화 분석은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “멜팅 분석”은 이합체의 멜팅에 의하여 CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 얻는 방법을 의미하며, 두 가지 상이한 온도에서 시그널을 측정하는 방법, 멜팅 커브 분석, 멜팅 패턴 분석, 및 멜팅 피크 분석을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화 분석”(또는 “어닐링 분석”)은 이합체가 형성하는 동안 CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 얻는 방법을 의미하며, 두 가지 상이한 온도에서 시그널을 측정하는 방법, 혼성화 커브 분석, 혼성화 패턴 분석, 및 혼성화 피크 분석을 포함한다.
일반적으로, 타겟 시그널이 멜팅 분석에 의해 생성되는 경우, 타겟 시그널은 혼성화 분석에 의해서도 얻어질 수 있으며; 및 반대의 경우도 마찬가지이다. 본 명세서에서 달리 업급되지 않는 한, 용어 “멜팅 분석”은 혼성화 분석을 포괄하는 의미를 가진다.
멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 종래의 기술들 예컨대, 미국 특허 제6,174,670호 및 제5,789,167호, Drobyshev 등, Gene 188: 45(1997); Kochinsky and Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); Livehits 등, J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); 및 Howell 등, Nature Biotechnology 17:87(1999)에서 설명하는 바와 같이 얻을 수 있다. 예를 들어, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 혼성화 엄격도(stringency)의 파라미터에 대한 아웃풋 시그널(output signal) 변화의 그래픽 플롯(graphic plot) 또는 디스플레이(display)로 구성될 수 있다. 아웃풋 시그널은 혼성화 파라미터에 대하여 직접적으로 플롯팅을 할 수 있다. 전형적으로, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는, 예를 들어, Y-축에는 이합체 구조의 정도(즉, 혼성화 정도)를 나타내는 형광이, X-축에는 혼성화 파라미터가 플롯팅(plotting) 된 아웃풋 시그널을 갖는다.
단계 (f): C HO /HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널의 검출
멜팅 또는 혼성화 분석에서, CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널이 검출된다. CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 멜팅 분석은 정량 분석을 위해 최소 두 번 실시된다. 멜팅 분석에서 얻어진 멜팅 피크의 면적 또는 높이는 CTO/HO 혼성화물에 의해 영향을 받고, 타겟 핵산서열의 초기 양에 대한 정보를 제공한다. threshold 값 이상의 멜팅 피크 면적 또는 높이가 도달되는 멜팅 분석의 사이클 수를 측정함으로써, 타겟 핵산서열의 양을 결정할 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 (i) 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하는 단계 (a)-(d) 반복하는 단계 (ii) CTO/HO 혼성화물에 대한 멜팅 분석을 실시하는 단계; 및 (iii) 단계 (i) 및 단계 (ii)를 최소 두 번 반복하는 단계에 의해 수행 될 수 있다. 데이터는 최소 두 점의 지정된 반복 간격(predetermined repetition interval) 에서 얻어질 수 있다. 이어서, 멜팅 분석 결과(예를 들어, 멜팅 피크 면적 또는 높이)는 멜팅 분석의 각 사이클 수(또는 누적 사이클 수)에 대해 플롯팅 되고 비교되며, 이에 의해 타겟 핵산서열의 양을 정량화한다. 단계 (a)-(d)의 단계의 반복 수는 선택적으로 조절될 수 있다.
택일적으로, 멜팅 분석 결과(예컨대, 멜팅 분석 면적 또는 높이)는 멜팅 분석의 각 사이클 수(또는 누적 사이클 수)에 대해 플롯팅 되고 비교되며, 이에 의해 타겟 핵산서열의 양을 정량화한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 서열이 존재하는 경우에 시그널은 타겟 서열이 비존재하는 경우에 시그널과 상이하다. 타겟 서열이 멜팅 분석 또는 혼성화 분석에 의해 검출되는 경우, 이러한 시그널의 상이함은 멜팅 피크의 높이 또는 상이함을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 이러한 시그널의 상이함은 최소 10%, 최소 30%, 최소 50%, 최소 70% 또는 최소 90%이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 타겟 핵산서열이 없거나 또는 지정된 함량(predetermined amount)의 타겟 핵산서열을 포함하는 대조군을 사용하여 실시된다. 본 발명은 대조군과 함께 관심있는 핵산 시료에 대해 실시되고, 결과를 비교하여, 핵산 시료 내에 타겟 핵산서열의 존재 또는 양에 대해 보다 정확한 검출을 가능하게 한다.
본 발명은 액상 또는 고상 중 어느 하나에서 실시될 수 있다.
고상에서의 타겟 검출
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 고상에서 실시되며, 상기 CTO 및 HO 중 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단계 (f)에서의 시그널 검출 전에 고상 기질 상에 고정화 되며, 상기 시그널은 상기 고상 기질 상에서 검출된다.
상기 CTO 또는 HO의 고정화는 두 가지 방식으로 수행될 수 있다.
첫 번째 방식으로, 상기 CTO 또는 HO 중 하나를 고상 기질 상에 미리 고정화하여 단계 (c)-(f)에 참여시킨다. 두 번째 방식은 상기 CTO 또는 HO 중 하나를 단계 (c), (d) 또는 (e)에서 비-고정화된 형태로 참여시킨 다음 고상 기질 상에 고정화한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이에서 상기 CTO 및 HO 중 하나는 단계 (d) 및 단계 (e) 사이에 고상 기질 상에 고정화된다.
상기 고상 반응에 대한 표지 시스템은 상술한 표지 시스템과 동일할 수 있다. 더욱이, 고상 반응에 대한 단일 표지는 상술한 것보다 더 다양하게 사용된다. 고상반응에서, 상기 단일 표지는, 단일 표지를 가진 핵산서열이 단일 가닥 또는 이중 가닥에 있는 지의 여부에 따라 세기가 상이한 시그널을 생성하는 능력을 가지고 있어야 할 필요가 없다.
단일 표지는 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소적 표지(예컨대, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제, β-갈락토시다제 및 β-클로토시다제), 방사성 동위원소 표지(예컨대, I125 및 C14), 형광 표지, 발광 표지, 화학 발광 표지 및 금속 표지(예컨대, 금)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
고상 반응을 위하여, 상기 CTO 또는 HO의 고정화는 그의 5’-말단 또는 3’-말단(특히, 3’-말단)을 통하여 고상 기질의 표면에 직접적 또는 간접적으로(특히 간접적) 고정화된다. 또한, CTO 또는 HO는 공유 또는 비공유결합 방식으로 고상 기질 표면 상에 고정화될 수 있다. 고정화된 CTO 또는 HO가 고상 기질 표면에 간접적으로 고정화 되는 경우, 적합한 링커를 이용한다. 본 발명에서 유용한 링커는 고상 기질 표면 상의 프로브 고정화에 이용되는 어떠한 링커도 포함할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물이 고정화를 위한 링커로 이용될 수 있다. 또한, poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일은 링커로써 이용되어 효소 작용(예를 들어, 효소적 절단 반응)에 억제 인자인 공간적 방해(space hindrance)를 감소시켜 혼성화 효율을 증가시킨다. 링커로서 poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일은 프로브의 서열로 여기지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CTO 또는 HO는 결합 파트너(예컨대, 바이오틴/스트렙타비딘)간에 상호작용을 통해 고상 기질 상에 고정화될 수 있다. 예를 들어, 결합 파트너(바이오틴 및 스트렙타비딘) 중 하나를 가진 CTO 또는 HO는 나머지 결합 파트너로 표면이 변형된 고상 기질 상에 고정화될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CTO 또는 HO는 고정화를 위한 뉴클레오타이드 서열에 의해 고상 기질 상에 고정화될 수 있다. 예를 들어, 고정화를 위한 뉴클레오타이드 서열로 표면이 변형된 고상 기질은 CTO 또는 고정화를 위한 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 추가 서열을 갖는 HO를 고정화하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 고상 기질은 마이크로어레이이다. 본 발명에서 반응 환경을 제공하기 위해 마이크로어레이는 당업계에 공지된 어떠한 것도 포함할 수 있다. 본 발명의 모든 과정, 즉, 타겟 핵산서열과의 혼성화, 절단, 연장, 멜팅 및 형광 검출은 마이크로어레이 상에서 실시된다. 마이크로어레이 상에 고정화된 CTO 또는 HO는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 고상 기질은 딥스틱(dipstick), 플레이트, 입자(예컨대, 비드), 친화성 컬럼 및 멤브레인의 형태일 수 있다. 본 발명의 복수의 고정화된 CTO 또는 HO는 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 구역 또는 복수의 어드레서블 구역에 고정화 될 수 있으며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 구역을 포함할 수 있다. 포토리토그래피, 잉크-젯팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사방법과 같은 종래 제작 기술에 의해, 어레이 또는 특정 응용을 위한 어레이를 생산하기 위하여 고정화된 CTO 또는 HO가 제작(fabricate)될 수 있다.
고상에서 실시하는 본 발명은, 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 표지는 물리적으로 이격되어 있기 때문에 한 종류의 표지를 이용하더라도 다수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출할 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명에 의하여 고상에서 검출되는 타겟 핵산서열의 수는 제한되지 않는다.
공초점 검출 장치에 사용하여, 액상 내에 현탁된 표지의 영향 없이 상기 고상 기질 상에 시그널만을 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 사용 없이 실시되고 단계 (b)에 상기 PTO의 절단은 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥의 도움 없이 발생한다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’-뉴클레아제 활성을 사용하는 구현예는 다음과 같이 보다 더 상세하게 설명된다:
업스트림 올리고뉴클레오타이드 -독립적 5’-뉴클레아제 활성에 기반한 PCE -NH 어세이에 의한 타겟 검출
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화(hybridizing)시키는 단계로서; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 타겟 핵산서열에 혼성화된 상기 PTO는 상기 5‘ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 절단되고, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥(extended strand)을 생성하고 연장이합체(extended duplex)를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고;
(e) 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO)의 존재 하에서, 일정 온도 범위에 걸쳐 상기 단계 (d)의 결과물에 대한 멜팅 분석 또는 혼성화 분석을 실시하는 단계로서; 상기 타겟 핵산서열이 상기 핵산 시료 내에 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO 와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공하며; 상기 타겟 핵산서열이 상기 핵산 시료 내에 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)하고, 이에 의해 상기 시그널이 제공되지 않으며; 상기 시그널은 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 CTO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅(intercalating) 표지에 의해 제공되고 ; 및
(f) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 기반으로 하는 본 발명의 방법은 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않는 것을 제외하고 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 상기 PCE-NH 어세이의 제 1 양태와 동일하므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략하였다.
흥미롭게도, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 기반으로 하는 본 발명의 방법은 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않은 PCE-NH 어세이에 의해서도 타겟 시그널을 제공한다.
본 발명의 방법은, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는 종래의 효소들을 사용할 수 있다. 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소 중에는 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는, 예컨대, Taq DNA 중합효소와 같은 여러 효소가 있다.
상기 타겟 핵산서열의 증폭 및 PTO의 절단 효율을 고려할 때, 본 발명의 PCE-NH 어세이는 바람직하게 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실시된다.
타겟 검출을 위한 키트
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하는 키트를 제공한다:
(a) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(b) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의하여 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고; 및
(d) 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO); 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지하고, 이에 의해 시그널이 제공되지 않으며; 상기 키트는 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 TO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅(intercalating) 표지를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 검출 방법을 실시하도록 구성되어 있기 때문에, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 키트는 추가적으로 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 키트는 추가적으로 주형-의존적 핵산 중합효소를 포함한다.
본 발명의 키트의 다른 구현예는 상술한 본 발명의 방법을 참조하여 설명될 수 있다.
본 명세서에서 상술한 본 발명의 모든 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수적인 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 상술한 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
II. PCE -NH 어세이에 의한 타겟 검출 방법의 제 2 양태
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 고상에서 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화(hybridizing)시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고;
(e) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화에 적합한 조건 하에서 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO)와 상기 단계 (d)의 결과물을 혼성화시키는 단계로서; 상기 CTO 및 HO 중 하나는 단일표지로 표지되고, 표지되지 않은 나머지 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단계 (f)에서의 시그널 검출 전에 고상 기질 상에 고정화되며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO 및 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 고상 기질 상에서 상기 단일표지로부터의 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)하고, 이에 의해 고상 기질 상에서 상기 단일표지로부터의 시그널이 제공되지 않으며; 및
(f) 상기 고상 기질 상의 상기 시그널을 검출하여 상기 고상 기질 상에서 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물을 검출하는 단계로서; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 제 2 양태는 본 발명의 제 1 양태에 접근법인 PCE-NH(PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화)을 기반으로 한다. 본 발명의 제 2 양태는 상기 CTO 및 HO 중 하나는 단일 표지로 표지하고, 표지하지 않은 다른 하나는 고상 기질 상에 고정화하거나 또는 단계 (f)에서의 시그널 검출 전 고상 기질 상에 고정화되며, 시그널은 지정된(pre-determined) 온도에서 검출될 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제 2 양태는 고상 기질 및 단일표지를 이용하여 타겟 검출을 효과적으로 달성하기 위한, PCE-NH 접근법의 변형된 버전이라 할 수 있으며, CTO 및 HO, 두 올리고뉴클레오타이드 조합의 사용에 의하여, 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우에 상기 단일 표지로부터의 시그널이 고상 기질 상에서 생성되고, 타겟 핵산서열이 존재하는 경우에 상기 단일표지로부터의 시그널이 고상 기질 상에서 소멸되거나 감소된다. CTO 및 HO 중 하나는 단일 표지로 표지하고, 표지되지 않은 다른 하나는 고체 기질에 고정화되거나 또는 단계 (f)에서의 시그널 검출 전 고상 기질 상에 고정화되며 표지로부터의 시그널은 CTO 및 HO 간에 혼성화를 위한 적합한 온도에서 검출된다.
본 발명의 제 1 양태와 같이, 본 발명의 제 2 양태 또한 HO가 절단되었을 때 뿐만 아니라 HO가 절단되지 않았을 때도(즉, HO와 CTO간에 혼성화가 연장이합체의 형성에 의해 억제됨) 타겟 핵산서열 검출에 적용할 수 있다.
고상에서 PCE-NH의 제 2 양태는 다음과 같이 보다 상세히 설명된다.
단계 (a): 타겟 핵산서열과 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO 의 혼성화
상기 단계 (a)는 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함한 PCE-NH 어세이의 제 1 양태의 단계 (a)를 위한 설명을 참조로 하여 설명될 수 있다.
단계 (b): PTO 절단으로부터 단편의 방출
상기 단계 (b)는 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함한 PCE-NH 어세이의 제 1 양태의 단계 (b)를 위한 설명을 참조로 하여 설명될 수 있다.
단계 (c): PTO로부터 방출된 단편과 CTO의 혼성화
상기 단계 (c)는 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함한 PCE-NH 어세이의 제 1 양태의 단계 (c)를 위한 설명을 참조로 하여 설명될 수 있다.
단계 (d): 단편의 연장
상기 단계 (d)는 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함한 PCE-NH 어세이의 제 1 양태의 단계 (d)를 위한 설명을 참조로 하여 설명될 수 있다.
단계 (e): 연장이합체와 HO 혼성화
연장 반응에 이어, 상기 CTO와 HO 간의 혼성화에 적합한 조건하에서 상기 단계 (d)의 결과물은 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한 HO(혼성화 올리고뉴클레오타이드)와 혼성화된다. CTO 및 HO 중 하나는 단일 표지로 표지되고 표지되지 않은 다른 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 단계 (f)에서의 시그널 검출 전 고상 기질 상에 고정화된다.
본 발명의 제 2 양태는 단일-표지 올리고뉴클레오타이드는 고상 기질 상에 고정화하지 않고, 단지 고상 기질 상에 고정화된 올리고뉴클레오타이드와 혼성화될 때 고상 기질 상에서 시그널을 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기 타겟 핵산서열이 핵산 시료 내에 존재하지 않는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고 CTO와 HO는 혼성화물을 형성하고, 이에 의해 상기 고상 기질 상에서 단일 표지로부터 시그널이 제공된다. 타겟 핵산서열이 핵산 시료 내에 존재하는 경우, 연장이합체가 형성되어 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지하고, 이에 의해 고상 기질 상에서 단일 표지로부터의 시그널이 제공되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 세척 단계는 단계 (d)의 결과물과 HO의 혼성화를 위한 단계 (e) 및 시그널의 검출을 위한 단계 (f) 사이에서 실시된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 세척 전, CTO 또는 HO 중 하나를 기질 상에 고정화하는 것이 필요하다.
택일적으로, 세척 단계가 필요하지 않다. 고상에서 공초점 검출 장치를 사용하여, 반응 용액에 존재하는 표지로부터의 시그널의 영향 없이, 고상 기질 상에 존재하는 시그널을 검출할 수 있다.
상기 HO의 상세한 설명은 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태에 HO에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CTO는 단일 표지를 갖고 상기 HO는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 단계 (f)에서의 시그널 검출 전 고상 기질 상에 고정화된다(예컨대, 도 8-9 및 12). 택일적으로, HO는 단일 표지를 갖고 CTO는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 단계 (f)에서의 시그널 검출 전 고상 기질 상에 고정화된다(예컨대, 도 10-11 및 13).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단일 표지는 어떠한 표지도 될 수 있다.
단일 표지는 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소적 표지(예컨대, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제, β-갈락토시다제 및 β-클로토시다제), 방사성 동위원소 표지(예컨대, I125 및 C14), 형광 표지, 발광 표지, 화학 발광 표지 및 금속 표지(예컨대, 금)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 상기 HO 또는 CTO는 단일 표지를 갖고; 상기 단일 표지는 CTO와 HO 간의 혼성화물을 형성하는 경우에 단일 표지로부터의 시그널과 CTO와 HO 간의 혼성화물을 비형성하는 경우에 단일 표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 위치한다.
도 8은 단일 표지를 갖는 CTO와 고정화된 HO를 사용하는 본 발명의 제 2 양태를 도식적으로 나타낸다. 상기 타겟 핵산서열이 핵산 시료 내에 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지하고, 이에 의해 고상 기질 상에서 CTO의 단일 표지로부터의 시그널이 제공되지 않는다. 상기 타겟 핵산서열이 핵산 시료 내에 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고 상기 CTO와 HO는 혼성화물을 형성하고, 이에 의해 고상에서 CTO의 단일 표지로부터의 시그널이 제공된다.
연장이합체에 의한 CTO와 HO 간의 혼성화물 형성의 방지에 관한 상세한 설명 또한 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태에 혼성화물 형성의 방지에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
예를 들어, 상기 CTO 및 HO가 상기 단계 (e)에서 서로 처음으로 접촉한 경우(예컨대, 별도의 반응 용기에서 단계 (a)-(d) 및 (e)-(f) 실시), 본 발명은 도 8 및 10에 도시된 바와 같이 실시될 수 있다. 상기 HO는 상기 PTO 단편의 연장 전 상기 CTO와 접촉하지 않지만 연장반응의 결과물과 혼성화에 관여한다. 단계 (e)에서, 연장이합체의 형성은 HO와 CTO의 혼성화의 억제로 인해 CTO/HO의 혼성화물의 형성을 방지한다.
상기 CTO 및 HO가 상기 단계 (d)에서 서로 접촉된 경우(예를 들어, 하나의 반응 용기에서 단계 (a)-(f) 실시), 본 발명은 도 9 및 11에 도시된 바와 같이 실시될 수 있다. 상기 HO는 연장 전 CTO와 혼성화될 수 있고 연장반응에 관여한다. HO가 단편의 연장 전 CTO와 혼성화되는 경우, 단편의 연장은 CTO로부터 HO를 절단 또는 분리시킨다. 특히, HO가 연장반응 동안에 절단되는 경우, 연장이합체의 형성은 절단에 의한 HO의 소모로 인하여 단계 (e)에서 CTO/HO의 혼성화물의 형성을 방지한다.
상기 CTO와 HO가 단계 (d)에서 서로 접촉하는 기회를 갖더라도, HO의 일부는 연장 전에 CTO와 혼성화되지 않을 수 있다. 이러한 경우, HO는 HO와 CTO의 혼성화의 억제에 의해 단계 (e)에서 CTO와 혼성화물을 형성하지 않을 수 있다.
상기 HO가 CTO와 처음으로 접촉되는 단계에 관계없이, 타겟 핵산서열이 존재하는 경우에 연장이합체는 형성되고, 다음의 방식 (i) HO와 CTO의 혼성화의 억제 및/또는 (ii) 절단에 의한 HO의 소모에 의하여 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지한다.
타겟 핵산서열의 비존재에서, 연장이합체는 형성되지 않으므로 CTO와 HO 간의 혼성화물은 형성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)는 HO의 존재 하에서 실시되고 상기 HO는 CTO와 혼성화되고 및/또는 CTO와 혼성화 되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (d)는 HO의 존재 하에서 실시되고; (i) CTO의 캡처링 부위와 혼성화된 상기 단편은 HO의 혼성화 이전에 연장되며 및/또는 (ii) 상기 단편의 연장 전에 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화되는 경우, 상기 단편의 연장은 상기 CTO로부터 상기 HO를 절단 또는 분리(displace)시키며, 이에 의해 연장이합체의 형성은 CTO와 HO의 혼성화 억제 및/또는 절단에 의한 HO의 소모에 의해 단계 (f)에서 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지한다.
상기 HO는 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 HO의 뉴클레오타이드 서열은 CTO의 구역 중에서 PTO 단편이 혼성화되는 구역 이외의 구역에 상보적인 서열을 포함하도록 디자인 할 수 있다 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 HO는 CTO와 혼성화에 있어서 단편(또는 비절단된 PTO)와 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열이 포함되도록 디자인될 수 있다(도 12 및 13 참조). 구체적으로는, 상기 경쟁적 HO는 상기 단편 또는 그의 연장 산물에 의해 절단되지 않는다.
상기 경쟁적 HO에 대한 상세한 설명은 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태에 HO에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CTO 및 HO 중 하나는 상기 단계 (d) 및 단계 (e) 사이 또는 단계 (e) 및 단계 (f) 사이에 고상 기질 상에 고정화된다.
단계 (f): CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널의 검출
최종적으로, 고상 기질 상의 CTO와 HO 간의 혼성화물 검출을 위하여 고상 기질 상에서 시그널을 검출한다. CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고, CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 서열이 존재하는 경우에 시그널은 타겟 서열이 비존재하는 경우에 시그널과 상이하다. 상기 타겟 서열이 본 발명의 방법에 의해 검출되는 경우, 상기 시그널의 상이함은 시그널의 세기의 차이를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널 차이는 최소 10%, 최소 30%, 최소 50%, 최소 70% 또는 최소 90%이다.
본 발명은 상기 CTO 및 HO 중 하나가 단일 표지로 표지되고, 표지되지 않는 다른 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단계 (f)에서의 시그널 검출 전 고상 기질 상에 고정화된다. 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우에 상기 단일 표지로부터의 시그널은 고상 기질 상에서 생성되고, 타겟 핵산서열이 존재하는 경우에 상기 단일표지로부터의 시그널은 고상 기질 상에서 소멸되거나 감소되는 본 발명의 접근법은 이러한 두 올리고뉴클레오타이드 조합에 의해 실현가능해진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 고상 기질 상에서 시그널의 검출은 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 이중-가닥 형태를 유지하는 지정 온도에서 고상 기질 상에서 시그널을 측정함으로써 실시된다.
상기 단계 (f)의 검출은 실-시간 방식, 엔드-포인트 방식, 또는 지정 시간 간격(predetermined time interval) 방식으로 실시될 수 있다. 본 발명이 단계 (a)-(f)의 전부 또는 일부를 변성을 포함하여 반복하는 단계를 추가적으로 포함하는 경우, 지정 온도에서의 상기 반복의 각 사이클에서(즉, 실시간 방식), 지정 온도에서의 상기 반복의 종료시점에서(즉, 엔드-포인트 방식) 또는 지정 온도에서의 상기 반복 동안 지정 시간 간격 각각에서 시그널 검출이 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 고상 기질 상에서 시그널의 검출은 일정 온도 범위에 걸쳐 멜팅 또는 혼성화 분석에 의해 실시된다. 상기 멜팅 또는 혼성화 분석의 상세한 설명은 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태에 멜팅 또는 혼성화 분석에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
상기 시그널 검출은 벤치탑(benchtop) 형광미터기, 형광 멀티-웰 플레이트 리더기, 광섬유 형광미터기, 형광 현미경 및 마이크로칩/형광 검출과 결합된 마이크로유체 시스템과 같은 종래의 방법에 따라 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않고 실시되고 상기 단계 (b)에서 PTO의 절단은 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥의 도움 없이 발생한다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적인 5’-뉴클레아제 활성을 사용하는 본 발명의 일 구현예는 다음에서 보다 상세하게 설명된다:
업스트림 올리고뉴클레오타이드 -독립적인 5’-뉴클레아제 활성에 기반하는 PCE -NH 어세이에 의한 타겟 검출
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 고상에서 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출을 위한 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화(hybridizing)시키는 단계로서; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 타겟 핵산서열에 혼성화된 상기 PTO는 상기 5‘ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 절단되고, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고;
(e) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화에 적합한 조건 하에서 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO)와 상기 단계 (d)의 결과물을 혼성화시키는 단계로서; 상기 CTO 및 HO 중 하나는 단일표지로 표지되고, 표지되지 않은 나머지 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단계 (f)에서의 시그널 검출 전에 고상 기질 상에 고정화되며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO 및 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 고상 기질 상에서 상기 단일표지로부터의 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)하고, 이에 의해 고상 기질 상에서 상기 단일표지로부터의 시그널이 제공되지 않으며; 및
(f) 상기 고상 기질 상의 상기 시그널을 검출하여 상기 고상 기질 상에서 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물을 검출하는 단계로서; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 기반으로 하는 본 발명의 방법은 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않은 것을 제외하고 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 상기 PCE-NH 어세이의 제 2 양태와 동일하므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략하였다.
본 발명의 방법을 위해, 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는 종래의 효소들을 사용할 수 있다. 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소 중에, 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는 예컨대, Taq DNA 중합효소와 같은 여러 효소가 있다.
타겟 검출을 위한 키트
본 발명의 다른 양태에서, 다음을 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 고상에서 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하는 키트를 제공한다:
(a) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(b) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의하여 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고; 및
(d) 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO);
상기 CTO 및 상기 HO 중 하나는 단일 표지로 표지되고, 표지되지 않은 나머지 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단일표지로부터의 시그널 검출 바로 전에 고상 기질에 고정화되며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지하고, 이에 의해 고상 기질 상에 단일 표지로부터의 시그널을 제공하지 않으며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 고상 기질 상에서 상기 단일표지로부터의 시그널을 제공한다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 검출 방법을 실시하도록 구성되어 있기 때문에, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략하였다.
III. PCE -NH 어세이에 의한 타겟 검출 방법의 제 3 양태
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출을 위한 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화(hybridizing)시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고;
(e) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화에 적합한 조건 하에서 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO)와 상기 단계 (d)의 결과물을 혼성화시키는 단계로서; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO 와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 제 1 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체는 상기 CTO와 HO의 혼성화를 억제(inhibit)하며, 이에 의해 상기 CTO와 비혼성화된 HO의 존재를 나타내는 제 2 시그널이 제공되며 ; 상기 시그널은 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 CTO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅(intercalating) 표지에 의해 제공되고 ; 및
(f) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 이중-가닥 형태를 유지하는 지정 온도(predetermined temperature) 하에 상기 제 1 시그널 또는 상기 제 2 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내며; 상기 제 1 시그널과 제 2 시그널의 차이는 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재 또는 비존재를 결정할 수 있게 하여 상기 핵산 시료 내의 상기 타겟 핵산서열의 존재 또는 비존재를 나타낸다.
본 발명의 제 3 양태는 본 발명의 제 1 양태로서의 PCE-NH(PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화) 접근법을 기반으로 한다. 그러나, 본 발명의 제 3 양태는 타겟 핵산서열 존재 하에서 연장이합체가 CTO와 HO의 혼성화를 억제(inhibit)하고 시그널이 지정 온도에서 검출되는 현상에 중점을 가지고 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 상기 연장이합체의 형성이 CTO와 HO의 혼성화의 억제(inhibition)를 유도하여 상기 HO가 절단되지 않는 경우에도 상기 CTO/HO 혼성화물이 비형성되고, 이를 타겟 핵산서열의 검출에 성공적으로 적용할 수 있다는 것을 확인하였다. 상기 원리와 함께, 본 발명은 상기 HO가 절단되지 않고 단일 가닥 형태로 유지되는 경우에 시그널과 상기 HO가 CTO/HO 혼성화물을 형성하는 경우에 시그널이 상이해야 한다.
본 발명은 상기 PTO 단편의 연장에서 상기 HO의 절단이 필수적으로 요구되지 않기 때문에, PTO 단편의 연장(즉, 단계 (a)-(d)), HO와 CTO 간의 혼성화 및 검출(즉, 단계 (e)-(f))은 별도로 실시될 수 있다. 상호작용적 이중 표지를 갖는 HO를 사용하고 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, HO의 절단으로부터의 시그널은 CTO와 온전한 HO 혼성화의 억제로부터의 시그널과는 구별되는 상이한 프로파일을 나타낸다.
본 명세서에서 연장이합체를 언급하면서 사용되는 용어 “CTO와 HO의 혼성화 억제(inhibit)”는 연장이합체내에 연장가닥이 CTO와 비절단된 HO(uncleaved HO) 또는 온전한 HO (intact HO)과의 결합(또는 어닐링)을 억제함을 의미한다. 용어 “CTO와 HO의 혼성화 억제(inhibit)”는 용어“CTO와 HO 간에 혼성화물의 형성 방지(prevent)”의 제한된 구현예로 여겨질 수 있다.
따라서, 본 발명의 제 3 양태는 CTO와 HO의 혼성화 억제의 발생을 필수적으로 요구한다. 하기 상술한 바와 같이, 상기 요건은 연장가닥에 의한 HO의 절단 또는 분리에 의한 CTO와 HO 간에 혼성화물의 형성 방지의 발생을 배제하지 않는다.
PCE-NH 어세이의 제 3 양태는 다음과 같이 보다 상세하게 설명된다:
단계 (a): 타겟 핵산서열과 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO 의 혼성화
상기 단계 (a)는 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함한 PCE-NH 어세이의 제 1 양태의 단계 (a)를 위한 설명을 참조로 하여 설명될 수 있다.
단계 (b): PTO 절단으로부터 단편의 방출
상기 단계 (b)는 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함한 PCE-NH 어세이의 제 1 양태의 단계 (b)를 위한 설명을 참조로 하여 설명될 수 있다.
단계 (c): PTO로부터 방출된 단편과 CTO의 혼성화
상기 단계 (c)는 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함한 PCE-NH 어세이의 제 1 양태의 단계 (c)를 위한 설명을 참조로 하여 설명될 수 있다.
단계 (d): 단편의 연장
상기 단계 (d)는 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함한 PCE-NH 어세이의 제 1 양태의 단계 (d)를 위한 설명을 참조로 하여 설명될 수 있다.
단계 (e): 연장이합체와 HO 혼성화
연장 반응에 이어, CTO와 HO 간의 혼성화를 위해 적합한 조건하에 상기 단계 (d)의 결과물은 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한 HO(혼성화 올리고뉴클레오타이드)와 혼성화된다.
상기 타겟 핵산서열이 핵산 시료 내에 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고 상기 CTO와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 제 1 시그널을 제공한다. 상기 타겟 핵산서열이 핵산 시료 내에 존재하는 경우, 상기 연장이합체는 CTO와 HO의 혼성화를 억제하며, 이에 의해 CTO와 비혼성화된 HO의 존재를 나타내는 제 2 시그널을 제공한다.
상기 CTO와 HO 간에 혼성화는 상기 단계 (e)에서 처음으로 발생할 수 있다. 택일적으로 CTO와 HO 간의 혼성화는 단계 (d)에서 처음으로 발생할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 단계 (d)는 HO의 존재 하에서 실시되고; (i) 상기 CTO의 캡쳐링 부위와 혼성화된 상기 단편은 상기 HO의 혼성화 이전에 연장되며 및/ 또는 (ii) 상기 단편의 연장 전에 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화되는 경우, 상기 단편의 연장은 상기 CTO로부터 상기 HO를 절단 또는 분리(displace)시킨다.
타겟 핵산서열의 존재 하에 연장이합체가 형성되고 다음의 방식 (i) CTO와 HO의 혼성화의 억제 및/또는 (ii) 절단에 의한 HO의 소모에 의해 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지한다.
본 발명의 방법은 상기 CTO와 비절단된 또는 온전한 HO와의 혼성화 억제에 의해 제공된 시그널 변화를 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서, CTO와 HO 간의 혼성화에 적합한 지정 온도에서, 상기 HO가 CTO와 혼성화된 경우에 제공되는 시그널은 CTO와 비절단된 또는 온전한 HO와의 혼성화가 연장이합체에 의해 억제된 경우에 제공되는 시그널과 상이하다.
상기 단계 (d)가 HO의 존재하에서 실시되는 경우, 일부 HO는 PTO 단편의 연장 동안 절단될 수 있고 절단으로부터 제공된 시그널이 공존할 수 있다.
상기 HO의 상세한 설명은 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태에 HO에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
상기 HO는 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 HO의 뉴클레오타이드 서열은 CTO의 구역 중에서 PTO 단편이 혼성화되는 구역 이외의 구역에 상보적인 서열을 포함하도록 디자인 할 수 있다.
택일적으로, 상기 HO는 상기 CTO와의 혼성화 측면에서, 상기 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다(도 17 및 18 참조). 구체적으로, 이러한 경쟁적 HO는 상기 단편 또는 그의 연장 산물에 의해 절단되지 않는다.
제 1 및 제 2 시그널은 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 CTO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 CTO에 연결된 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 제공된다.
본 발명의 구현예에 따라서, 상기 CTO와 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 제공되는 시그널과 상기 CTO와 HO가 서로 떨어져 있는 경우에 제공되는 시그널이 상이한 한도 내에서, 다양한 종류의 표지 및 표지 위치가 본 발명에 쓰일 수 있다.
표현“CTO와 HO가 서로 떨어져 있는 (dissociated)”에서 사용되는 용어 “HO”는 비절단된 또는 온전한 HO를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO 또는 상기 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고; 상기 CTO와 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO가 서로 떨어져 있는(dissociated) 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중표지가 위치한다(도 14 및 17 참조).
상기 상호작용적 이중 표지를 갖는 HO가 사용되는 경우, 상기 HO의 절단으로부터의 시그널은 상기 HO와 CTO 간의 혼성화의 억제로부터의 시그널과 구별되는 상이한 패턴을 나타낸다.
상기 HO가 단일 가닥 상태인 경우, HO 상에 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 상기 타겟 핵산서열이 비존재 하고 CTO/HO 혼성화물이 형성되는 경우, HO 상에 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격되어 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭한다.
상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체의 주형-의존적 형성은 CTO와 HO의 혼성화를 억제하고, 이에 의해 HO가 단일 가닥 상태로 있을 수 있도록 하여 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 단일 가닥의 HO의 수는 연장이합체의 수가 증가됨에 따라 증가되고, 결국 최종적으로 검출된 시그널 세기는 감소되는 패턴을 보여준다.
한편, 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 CTO와 혼성화된 HO는 PTO 단편의 연장 동안 절단될 수 있다. 상기 절단은 영구적으로 이격된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 생성시켜 리포터 분자로부터의 시그널을 완전히 언퀀칭시킨다. HO의 절단에 의한 언퀀칭 정도는 CTO와 HO의 혼성화에 의한 언퀀칭 정도보다 크다. 그러므로, HO의 절단에 의해 제공된 시그널이 검출되는 경우, 시그널 세기는 절단된 HO의 수 증가에 따라 증가되는 패턴을 보여준다.
상기 온전한 HO와 CTO 간에 혼성화의 억제 및 HO의 절단을 포함하는 두 상황이 동시에 발생하는 동안, 보다 우세한 상황에 부합되는 시그널 패턴이 제공될 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 갖고 CTO는 상호작용적 이중 표지 중 나머지 하나를 가지며; 상기 CTO와 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO가 서로 떨어져 있는 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중 표지가 위치한다(도 15 및 18 참조).
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 본 방법은 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HO를 하나 더 추가적으로 사용하여 실시되고 상기 두 개의 HO는 상기 CTO에 서로 근접하여 혼성화되며; 상기 두 개의 HO 중 하나는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 갖고 상기 두 개의 HO 중 나머지 하나는 상기 상호작용적 이중 표지 중 나머지 하나를 갖으며; 상기 CTO와 두 개의 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 상기 두 개의 HO가 서로 떨어져 있는 경우에 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중표지가 위치한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 HO 또는 CTO는 단일 표지를 갖고; 상기 CTO와 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 상기 단일표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO가 서로 떨어져 있는 경우에 상기 단일표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 단일표지가 위치한다(도 16 참조).
표지 시스템의 상세한 설명(시그널링 메카니즘 및 표지 위치, 등 포함)은 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태에 표지 시스템에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
단계 (f): 지정 온도에서 제 1 또는 제 2 시그널의 검출
최종적으로, 제 1 시그널 또는 제 2 시그널은 CTO와 HO 간의 혼성화물이 이중-가닥 형태를 유지하는 지정 온도에서 검출된다.
CTO와 HO 간에 혼성화물의 존재는 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다. 제 1 시그널 및 제 2 시그널의 상이함은 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재 또는 비존재를 결정할 수 있게 하여 핵산 시료에서 타겟 핵산서열의 존재 또는 비존재를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제 1 시그널 및 제 2 시그널은 시그널 발생 및 시그널 소멸과 같은 현상에 의해 구별된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제 1 시그널 및 제 2 시그널은 세기의 변화(시그널 증가 및 시그널 감소)와 같은 현상에 의해 구별된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 서열이 존재하는 경우에 시그널과 타겟 서열이 비존재하는 경우에 시그널은 상이하다. 타겟 서열이 본 발명의 방법에 의해 검출되는 경우, 상기 시그널의 상이함은 시그널의 세기의 차이를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 시그널의 차이는 최소 10%, 최소 30%, 최소 50%, 최소 70% 또는 최소 90%이다.
CTO와 HO 간의 혼성화물이 이중-가닥 형태를 유지하는 온도는 CTO와 HO의 Tm 값을 고려하여 일반적으로 결정될 수 있다.
단계 (f)의 검출은 실-시간 방식, 엔드-포인트 방식, 또는 지정 시간 간격 방식으로 실시될 수 있다. 본 발명이 단계 (a)-(f)의 전부 또는 일부 단계를 변성과정을 포함하여 반복하는 단계를 추가적으로 포함하는 경우, 지정 온도에서의 상기 반복의 각 사이클에서(즉, 실시간 방식), 지정 온도에서의 상기 반복의 종료시점에서(즉, 엔드-포인트 방식) 또는 지정 온도에서의 상기 반복 동안 지정 시간 간격 각각에서 시그널 검출이 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 타겟 핵산서열이 없거나 또는 지정된 함량(predetermined amount)의 타겟 핵산서열을 포함하는 대조군을 사용하여 실시된다.
본 발명은 고상 또는 액상 둘 다에서 수행될 수 있다.
고상에서의 타겟 검출
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 고상에서 실시되고 상기 CTO 및 HO 중 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단계 (f)에서의 시그널 검출 전에 고상 기질 상에 고정화 되며, 상기 시그널은 고상 기질 상에서 검출된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CTO 및 HO 중 하나는 단계 (d)와 단계 (e) 사이 또는 단계 (e)와 단계 (f) 사이에 고상 기질 상에 고정화된다.
제 3 양태에 대한 고상에서 타겟 검출의 상세한 설명은 멜팅 또는 혼성화 분석을 포함하는 PCE-NH 어세이의 제 1 양태에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 사용 없이 실시되고 상기 단계 (b)에서 상기 PTO의 절단은 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥의 도움 없이 발생된다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 사용하는 본 발명의 구현예는 다음과 같이 보다 상세하게 설명된다:
업스트림 올리고뉴클레오타이드 -독립적 5’뉴클레아제 활성을 기반으로 하는 PCE -NH 어세이에 의한 타겟 검출
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출을 위한 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화(hybridizing)시키는 단계로서; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 타겟 핵산서열에 혼성화된 상기 PTO는 상기 5‘ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 절단되고, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고;
(e) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화에 적합한 조건 하에서 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO)와 상기 단계 (d)의 결과물을 혼성화시키는 단계로서; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO 와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 제 1 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체는 상기 CTO와 HO의 혼성화를 억제(inhibit)하며, 이에 의해 상기 CTO와 비혼성화된 HO의 존재를 나타내는 제 2 시그널이 제공되며 ; 상기 시그널은 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 CTO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅(intercalating) 표지에 의해 제공되고 ; 및
(f) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 이중-가닥 형태를 유지하는 지정 온도(predetermined temperature) 하에 상기 제 1 시그널 또는 상기 제 2 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내며; 상기 제 1 시그널과 제 2 시그널의 차이는 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재 또는 비존재를 결정할 수 있게 하여 상기 핵산 시료 내의 상기 타겟 핵산서열의 존재 또는 비존재를 나타낸다.
상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 기반으로 하는 본 발명의 방법은 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않은 것을 제외하고 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 상기 PCE-NH 어세이의 제 3 양태와 동일하므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략하였다.
타겟 검출을 위한 키트
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하는 키트를 제공한다:
(a) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(b) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의하여 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고; 및
(d) 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO);
상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 제 1 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체는 상기 CTO와 상기 HO의 혼성화를 억제하며, 이에 의해 상기 CTO와 비혼성화된 HO의 존재를 나타내는 제 2 시그널을 제공하며; 상기 키트는 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 CTO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅(intercalating) 표지를 추가적으로 포함한다.
본 발명에 대한 공통된 내용
본 발명의 제 1, 2 및 3 양태에 대한 공통된 내용은 다음과 같이 설명된다:
프라이머, PTO, CTO 및 HO는 자연(naturally occurring) dNMPs 및/또는 NMPs로 구성될 수 있다. 택일적으로, 프라이머, PTO, CTO 및 HO는 변이 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드, 예컨대, PNA(Peptide Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 92/20702호) 및 LNA(Locked Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 98/22489호, 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호)를 포함할 수 있다. 프라이머, PTO, CTO 및 HO는 데옥시이노신, 이노신, 1-(2’-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함할 수 있다. 용어 “유니버설 염기”는 자연 DNA/RNA 염기들 각각에 대하여 거의 구별 없이 염기 쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
상술한 바와 같이, PTO는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 이격된 한 위치에서 절단될 수 있다. 절단 위치는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치할 수 있다. PTO 단편이 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 혼성화되는 CTO의 위치는 유니버설 염기, 축퇴성 서열(degenerate sequence) 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PTO가 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 하나의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, 상기 뉴클레오타이드와의 혼성화를 위하여 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 만일, PTO가 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 2 개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, CTO의 캡처링 부위의 5’-말단은 축퇴성 서열을 포함하고, 그의 3’-방향으로 인접한 뉴클레오타이드는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 이와 같이, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부의 다양한 위치에서 PTO의 절단이 일어나는 경우, CTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 것이 유용하다. 또한, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, 동일한 5’-태깅 부위를 갖는 PTOs를 복수의 타겟 핵산서열 스크리닝에 이용하는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 서로 다른 PTO 단편들을 생성할 수 있다. 이러한 경우, 유니버설 염기 및 축퇴성 서열은 CTO에 유용하게 사용된다. CTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 전략은 복수의 타겟 핵산서열의 스크리닝을 위해서 한 타입의 CTO 또는 최소한의 타입의 CTO를 사용하도록 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 상기 단계 (a)-(f)의 전부 또는 일부를 반복하는 단계를 추가적으로 포함한다. 이러한 반복은 타겟 핵산서열 및/또는 타겟 시그널을 증폭할 수 있게 한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (e)-(f)는 변성과정을 포함하여 반복될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 반복하는 사이클의 수는 선택적으로 조절될 수 있다. 변성과정은 종래 기술들에 의하여 실시될 수 있으며, 예컨대, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 멜팅은 80-105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다. 이러한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 제공되어 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(f)는 하나의 반응 용기 또는 별도의 반응 용기들에서 실시한다. 예를 들어, 상기 단계 (a)-(b), (c)-(d) 및 (e)-(f)는 개별 반응 용기 또는 별도의 반응 용기들에서 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위와 상기 타겟 핵산서열 간에 혼성화가 상기 PTO 단편과 상기 CTO 간에 혼성화보다 더 엄격한 조건하에서 실시될 수 있도록 PTO 및 CTO의 서열 및 반응 조건을 결정하는 경우, 상기 단계 (a)-(b)는 상기 단계 (c)-(f)의 수행 없이 반복할 수 있다. 단계 (a)-(b)의 반복에 이어, 단계 (c)-(f)를 실시할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 단계 (a)-(d) 및 (e)-(f)는 별도의 반응 용기에서 실시할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(d)는 반복될 수 있다.
특정 단계의 반복, 반복과정에서 변성의 개입(intervention), 특정 단계(들)의 분리 실시 및 검출 시점이 폭넓게 변화될 수 있다는 것은 당업자에게 명확하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 반복이 상기 PTO에 대한 업스트림 프라이머를 사용하여 변성과정과 함께 실시되는 경우, 상기 반복은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되며, 특히 PCR에 따라 실시된다. 상기 PTO에 대한 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 사용은 타겟 핵산서열을 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 반복이 상기 PTO에 대한 업스트림 프로브를 사용하여 변성과정과 함께 실시되는 경우, 상기 반복은 PTO에 대한 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “핵산 시료”는 비-생물학적 시료(예를 들어, 식품, 물, 공기, 토양 및 폐수) 또는 핵산 분자를 포함하는 생물학적 시료를 의미한다. 생물학적 시료는 동물, 식물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스로부터 유래될 수 있다. 생물학적 시료는 세포, 조직 또는 생물학적 원천으로부터의 유체, 혈액, 혈장, 형청, 림프, 우유, 소변, 분변, 안구액, 타액, 정액, 뇌추출물, 척수액, 충수, 비장 및 편도 조직 추출물일 수 있다.
본 발명에서는 검출 및/또는 증폭하고자 하는 타겟 핵산서열이 모든 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포함하여 어떠한 특정 서열 또는 길이를 가지도록 요구하지 않는다. 타겟 핵산서열은 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다.
mRNA를 초기 물질로 이용하는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 반응을 위해서는, 랜덤 헥사머 또는 mRNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용될 수 있다.
본 발명에서 검출 및/또는 증폭할 수 있는 타겟 핵산서열은 어떠한 자연(naturally occurring) 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등 동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산도 모두 포함한다.
본 발명에 의하여 검출된 타겟 핵산서열은 핵산서열의 광범위한 다양성, 예를 들어, 지놈내에 서열, 분리 또는 단편 서열 및 합성 서열(예컨대, cDNA 서열 및 바코드 서열)을 포함한다. 예를 들어, 타겟 핵산서열은 면역-PCR(IPCR)을 위한 핵산 마커 서열을 포함한다. IPCR은 단백질을 포함하는 타겟의 다양한 형태를 검출하기 위해 광범위하게 이용되는 PCR과 함께 핵산 마커 서열과 항체 간에 결합체를 이용한다(see Sano et al., Science 258 pp:120-122(1992), U.S. Pat. No. 5,665,539, Niemeyer et al., Trends in Biotechnology 23 pp:208-216(2005), U.S. Pat. Pub. No. 2005/0239108 and Ye et al., Journal of Environmental Science 22 pp:796-800(2010)).
본 발명의 타겟 핵산 분자는 IPCR 방법에서 사용되는 핵산 마커로서 포함되고 본 발명은 IPCR 방법으로 핵산 마커를 검출하기 위해 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 뉴클레오타이드 변이의 검출에 유용하다. 바람직하게는 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드 변이”는 연속적 DNA 세그먼트들 또는 서열이 유사한 DNA 세그먼트들에서 특정 위치의 DNA 서열에서의 모든 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 세그먼트는 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP (single nucleotide polymorphism), 돌연변이(mutation), 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 암 생성-관련 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 뉴클레오타이드 변이는 핵산서열에서 특정한 위치에 어떠한 변이를 포함한다. 즉, 용어 뉴클레오타이드 변이는 야생형 및 핵산서열에서 특정한 위치에 그것의 어떠한 돌연변이 형을 포함한다.
타겟 핵산서열에서 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위한 본 발명에서, 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열의 상기 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산서열은 본 명세서에서 매칭 주형(matching template)으로 기재된다. 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 비-상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산서열은 본 명세서에서 미스매칭 주형(mismatching template)으로 기재된다.
뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, 업스트림 프라이머의 3’-말단은 타겟 핵산서열에서의 뉴클레오타이드 변이 위치의 맞은편에 위치하도록 디자인할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머의 3’-말단은 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 타겟 핵산서열에서 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는 업스트림 프라이머의 3’-말단은 매칭 주형에 어닐링되고 연장되어 PTO의 절단을 유도한다. 결과물로서 PTO 단편은 CTO에 혼성화되어 연장되고, 타겟 시그널을 제공하는 핵산 분자가 생산된다. 반대로, 업스트림 프라이머의 3’-말단이 미스매칭 주형에서 뉴클레오타이드 변이에 미스매치 되는 경우, 업스트림 프라이머가 미스매칭 주형에 혼성화 되더라도, 연장반응을 위해서 프라이머의 3’-말단의 어닐링이 필수적인 조건하에서는 연장되지 않으며, 이에 의해 타겟 시그널이 생성되지 않는다.
택일적으로, 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 PTO의 혼성화에 의존적인 PTO 절단을 이용할 수 있다. 예를 들어, 조절된 조건 하에서, 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 PTO는 매칭 주형에 혼성화된 후 절단된다. 결과물로서 PTO 단편은 CTO와 혼성화되고 연장되어 CTO와 HO 간의 혼성화의 형성을 방지하는 연장이합체를 형성하고, 이에 의해 CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널은 제공되지 않는다. 반면, 조절된 조건하에서, PTO는 뉴클레오타이드 변이 위치에 비-상보적인 서열을 갖는 미스매칭 주형에는 혼성화되지 않으며, 절단되지 않는다. 이러한 경우, 바람직하게는 PTO의 뉴클레오타이드 변이에 대한 상보적인 서열은 PTO의 3’-타겟팅 부위의 중간에 위치한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 인공적 미스매치 뉴클레오타이드의 사용은 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 구별 가능성을 향상시킨다.
택일적으로, 본 발명은 특정 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 선택성을 위하여 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 뉴클레오타이드 변이 구별 위치(nucleotide variation discrimination site)를 갖는 PTO를 사용한다. 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열에서 뉴클레오타이드 변이에 위치하고 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열에서 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는다.
PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 위치에 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열(즉, 매칭 주형)과 혼성화되는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 매칭 주형과 이중 가닥을 형성한다; 그러나, PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 위치에 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열(즉, 미스매칭 주형)과 혼성화되는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 미스매칭 주형과 이중 가닥을 형성하지 않는다.
본 명세서에서 PTO를 언급하면서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드 변이 구별 위치(nucleotide variation discrimination site)”는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 타겟 핵산서열에 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열이다.
본 발명에서 바람직한 구현예에 따르면, 뉴클레오타이드 변이 구별 위치는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 8 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 6 뉴클레오타이드, 더욱 더 바람직하게는 4 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드 또는 1 뉴클레오타이드 이격된 위치 이내에 위치한다. 바람직하게는, 뉴클레오타이드 변이 구별 위치는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단에 위치한다.
본 발명에서 프로브의 뉴클레오타이드 변이 구별 위치 또는 타겟 서열에 뉴클레오타이드 변이 위치에서 언급되는 용어 “위치”는 하나의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 복수의 뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 사용된다.
이와 같이 관심있는 뉴클레오타이드 변이에 대한 구별되는 혼성화 패턴은 PTO의 초기 절단 위치에서의 차이를 제공하며, 이에 의해 2 종의 PTO 단편이 생성되어 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 존재 여부에 따라 시그널 차이가 발생한다는 것은 주목할 만하다.
상기 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 존재 하에서, 제 1 단편은 PTO와 매칭 주형 간에 혼성화물의 절단에 의해 생성되고, 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 비존재 하에서, 제 2 단편은 PTO와 미스매칭 주형 간에 혼성화물의 절단에 의해 생성된다. 상기 제 2 단편은 1차 단편과는 상이한 2차 단편을 생성하도록 하는 추가적인 3’-말단 부위를 포함한다.
본 발명의 단일 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위한 일 구현예에서, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단은 상기 타겟 핵산서열에서 단일 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는다. 상술된 바와 같이, 매칭 주형과 혼성화된 PTO의 절단은 예컨대, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도하에서, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단에 3’-방향으로 바로 근접한 한 위치에서 유도될 수 있다. PTO 단편의 3’-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. PTO 단편은, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 서열을 포함하는 캡처링 부위를 갖는 CTO와 혼성화된 후 연장되어 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지하는 연장이합체를 형성하고, 이에 의해 CTO/HO 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공하지 않는다. 만일, 동일한 PTO가 단일 뉴클레오타이드 변이를 제외하고는 매칭 주형에 대하여 동일한 서열을 갖는 미스매칭 주형에 혼성화된다면, PTO의 절단이 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 3’-방향으로 2 개의 뉴클레오타이드 만큼 이격된 위치에서 생성될 수 있다. PTO 단편의 3’-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드 이외에 추가적으로 절단되는 뉴클레오타이드를 갖는다. 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드에 혼성화되는 CTO의 위치가 상기 추가적으로 절단되는 뉴클레오타이드에 대하여 비-상보적인 서열을 갖도록 디자인된 경우, PTO 단편의 3’-말단은 CTO에 혼성화 되지 않으며, 조절된 조건에서 PTO 단편이 연장되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 가지는 PTO의 절단 위치는, 매칭 주형 또는 미스매칭 주형과의 혼성화에 의존적으로 상이해지고, 이에 의해 상기 두 혼성화 이벤트로부터 방출되는 PTO 단편들은 상이한 서열을 가지며, 바람직하게는 그의 3’-말단 일부, 보다 바람직하게는 그의 3’-말단에서 상이한 서열을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 PTO 단편의 3’-말단 일부의 상이함을 고려한 CTO의 뉴클레오타이드 서열의 선택으로 매칭 주형과 미스매칭 주형을 구별할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 어느 하나의 PTO 단편의 생성은 CTO 상의 연장 반응에 의하여 명백하게 검출될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제 2 단편이 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되는 경우, CTO가 선별된 서열을 갖고 있어, CTO는 제 2 단편의 추가적인 3’-말단 부위에 혼성화되지 않으며 제 2 단편의 연장을 방지한다.
상술된 바와 같이, 제 1 단편의 연장은 연장이합체의 형성으로 인해 HO와 비-혼성화에 의하여 검출된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 뉴클레오타이드 변이 구별 위치로부터 1-10 뉴클레오타이드(보다 바람직하게는 1-5뉴클레오타이드) 이내로 이격된 위치에 비 염기 쌍 모이어티(non-base pairing moiety)를 포함한다.
변이 구별 위치에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열에 PTO가 혼성화되는 경우, 비-염기 쌍 모이어티는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 타겟 핵산서열과 이중 가닥을 형성하는 것을 방지한다.
비-염기 쌍 모이어티(예컨대, 인위적 미스매치 뉴클레오타이드)의 사용은 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 구별 능력을 향상시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티는 PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 위치에 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열과 혼성화되는 경우 5’-말단 일부와 타겟 핵산서열 간에 이중 가닥의 형성을 억제하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티는 PTO와 매칭 주형의 혼성화물 상에 초기 절단 위치와 PTO와 미스매칭 주형의 혼성화물 상에 초기 절단 위치 사이의 거리를 확대시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티 서열의 도입은, 초기 절단 위치, 특히, PTO와 미스매칭 주형의 혼성화물 상에 초기 절단 위치를 조절할 수 있게 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티는 뉴클레오타이드 변이 구별 위치의 다운스트림에 위치한다.
비-염기 쌍 모이어티는 타겟 핵산서열 사이에 염기쌍을 형성하지 않는 어떠한 모이어티들을 포함한다. 바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 (i) 인공적 미스매치 염기, 염기-쌍을 이루지 못하는 자연적/비자연적 염기, 염기쌍 또는 유니버설 염기를 이루지 못하게 변이된 염기, (ii) 염기쌍을 이루지 못하게 변이된 비-염기쌍 뉴클레오타이드, 또는 (iii) 비-염기 쌍 화학적 화합물이다.
예를 들어, 비-염기 쌍 모이어티는 알칼린 그룹, 리보푸라노실 나프탈렌, 디옥시 리보푸라노실 나프탈렌, 메타포스페이트, 포스포로티오에이트 결합, 알킬 포스포트리에스테르 결합, 아릴 포스포트리에스테르 결합, 알킬 포스포네이트 결합, 아릴 포스포네이트 결합, 하이드로겐 포스포네이트 결합, 알킬 포스포로아미데이트 결합 및 아릴 포스포로아미데이트 결합을 포함한다. 종래의 카본 스페이서 또한 비-염기 쌍 모이어티로 사용된다. 비-염기 쌍 모이어티로서 유니버설 염기는 PTO의 근접한 절단 위치에 유용하다.
데옥시이노신, 이노신, 1-(2’-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함하는 염기쌍은 자연적 염기 사이에서 더 낮은 결합 강도를 가짐에 따라 유니버설 염기는 특정 혼성화 조건 하에 비-염기 쌍 모이어티로 이용될 수 있다.
5’-말단 일부에 도입된 비-염기 쌍 모이어티는 바람직하게는 1-10, 보다 바람직하게는 1-5, 더욱 바람직하게는 1-2 모이어티를 갖는다. 5’-말단 일부에 복수의 비-염기쌍 모이어티는 연속 또는 불연속적으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 2-5개의 연속적인 모이어티를 갖는다.
바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 비-염기쌍 화학적 화합물이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, PTO의 뉴클레오타이드 변이 구별 위치 및 비-염기 쌍 모이어티는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드(보다 바람직하게는 8 뉴클레오타이드, 7 뉴클레오타이드, 6 뉴클레오타이드, 5 뉴클레오타이드, 4 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드, 1 뉴클레오타이드) 이격된 위치 이내에 위치한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, PTO는 블록커(blocker)로서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 절단에 대하여 내성을 갖는 최소 1 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 블록커 부위를 갖고, 상기 블록커 부위는 초기 절단 위치를 조절하거나 특정 위치 또는 특정 위치들에서 절단을 방지하기 위해 위치한다.
뉴클레오타이드 변이들의 개선된 검출 효율을 위하여, 본 발명은 클램핑 방법으로 실시될 수 있다. PNA를 사용한 대표적인 클램핑 방법은 Henrik et al., Nucleic Acid Research 21:5332-5336(1993) and Luo et al., Nucleic Acid Research Vol. 34, No 2 e12 (2006)에 개시되어 있다.
예를 들어, PNA를 사용하는 클램핑 기술은 야생형 뉴클레오타이드 변이를 갖는 핵산서열 증폭뿐만 아니라 돌연변이형 뉴클레오타이드 변이를 갖는 핵산서열을 증폭시키고, 이어서 본 명세서에 기술된 방법에 의해, 뉴클레오타이드 변이의 더 효율적인 검출을 가능하게 한다. 특히, PCR 클램핑 기술은 특이적-타입 뉴클레오타이드 변이를 갖는 핵산서열만을 증폭하도록 하기 때문에 PCR 클램핑 기술과 본 발명의 방법을 결합하면 더욱 효과적인 방식으로 마이너리티-변이체(minority-variant)를 검출할 수 있다.
본 발명에서, 용어 “증폭 블로커”는 클램핑을 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
일반적으로, 클램핑을 위한 증폭 블로커는 단일 미스매치를 갖는 주형과도 혼성화되지 않도록 디자인되어 있으며, 동일 조건하에서, 오직 증폭 블로커와 완전히 상보적인 서열을 갖는 주형에만 혼성화된다. 프라이머 어닐링 또는 체인 연장(elongation)을 억제하는 증폭 블로커와 혼성화된 주형은 증폭되지 않고 증폭 블로커와 혼성화되지 않은 주형만 증폭된다. PNA 및 LNA와 같은 핵산 유사체는 단일 염기 차이에 대해서도 상당한 Tm 차이를 나타낸다는 점에서, 증폭 블로커로서 유용하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭 블로커는 또한 본 발명에서 특히 마이너리티-변이체(minority-variant) 검출을 위해 사용된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭 블로커는 증폭 블로커의 업스트립에 위치한 프라이머의 연장을 방지한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭 블로커 및 PTO는 이중 가닥 또는 서로 상이한 가닥에서 동일한 가닥과 혼성화 되도록 디자인할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭 블로커는 5’뉴클레아제 활성에 백본 내성을 갖는 뉴클레오시드/뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭 블로커는 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모포리노(morpholino), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 브릿지 핵산(BNA), N3′-P5′포스포르아미데이트(NP) 올리고머, minor groove 바인더-연결-올리고뉴클레오타이드(MGB-linked oligonucleotides), 포스포로티케이트(PS) 올리고머, C1-C4 알킬포스포네이트 올리고머, 포스포르아미데이트, ß-포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드, a-포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합을 포함한다.
5’-말단 부위에 하나의 뉴클레오타이드 변이 구별 부위를 갖는 프로브가 미스매치 주형과 혼성화하는 경우, 5’-말단 부위는 특정 조건하에 단일 가닥을 형성할 수 있다. 상기 프로브는 PTO에 해당할 수 있다. 시그널은 본 발명의 PTO 어세이에 의해 생성될 수 있다. 이러한 접근법은 프로브의 뉴클레오타이드 변이 구별 위치에 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열의 검출에 유용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 타겟 핵산서열은 전-증폭된(pre-amplified) 핵산서열이다. 전-증폭된 핵산서열의 이용은 본 발명의 타겟 검출에 민감도 및 특이도를 의미 있게 증가시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 PTO에 다운스트림 프라이머의 존재하에 실시된다.
최소 2 종의 타겟 핵산서열이 동시에 검출(멀티플렉스)된다는 점에서 본 발명의 이점이 더욱 두드러진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 타겟 핵산서열의 최소 2 가지 형태에(보다 구체적으로는, 최소 3 가지 형태, 더욱 구체적으로는, 최소 5 가지 형태) 검출을 위해 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 최소 2종(보다 구체적으로는, 최소 3종, 더욱 구체적으로는, 최소 5종)의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 방법이고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종(보다 구체적으로는, 최소 3종, 더욱 구체적으로는, 최소 5종)의 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종(보다 구체적으로는, 최소 3종, 더욱 구체적으로는, 최소 5종)의 PTO를 포함하고, 상기 CTO는 최소 2종(보다 구체적으로는, 최소 3종, 더욱 구체적으로는, 최소 5종)의 CTO를 포함하고, 상기 HO는 최소 2종(보다 구체적으로는, 최소 3종, 더욱 구체적으로는, 최소 5종)의 HO를 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 최소 2종의 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 그것에 해당하는 시그널 또한 최소 2종이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 PTO에 대하여 최소 2종의 다운스트림 프라이머를 사용하여 실시된다.
본 발명은 또한 연장가닥의 수를 증가시키기 위하여, (i) 상기 연장가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 및 (ii) 상기 CTO의 캡처링 부위에 상보적이지만 연장가닥에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하는 추가적인 PTO를 이용하여, 추가적인 5’ 뉴클레아제 절단 반응에 의해 CTO 상에 연장할 수 있는 추가적 단편을 제공하는 것이 가능하다. 5’ 뉴클레아제 절단 반응을 위하여, 연장가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 추가적인 PTO의 업스트림에 위치하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 추가적으로 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, HO는 추가적 PTO로서 역할을 할 수 있다.
상기 바람직한 구현예는 상기 추가적인 단편의 형성이 연장가닥의 형성에 의존한다는 특징을 갖는다.
택일적으로, 상기 추가적인 단편은 (i) 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 및 (ii) 상기 CTO의 캡처링 부위에 상보적이지만 CTO에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하는 추가적인 PTO에 사용에 의해 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 추가적인 연장이합체는 연장가닥의 추가적 생성에 의해 형성되어, 타겟 시그널의 증폭에 기여한다.
본 발명의 특징 및 이점은 다음과 같이 요약될 것이다:
(a) 타겟 서열의 존재에 결정을 위하여, 본 발명은 (i) 상기 타겟 서열과 혼성화되는 PTO, (ii) 타겟-의존적 방법으로 연장이합체를 형성할 수 있는 CTO, (iii) 상기 CTO와 혼성화되는 HO를 이용하고, 이에 의해 타겟 서열에 특이성을 극적으로 증가시킨다. 또한, 시그널 발생을 위한 조건은 타겟 서열에 관계없이 조절될 수 있으므로, 본 발명의 방법에 대한 반응 조건을 용이하게 설정할 수 있다. 상기 특징은 시그널 발생을 위한 조건을 쉽게 결정할 수 있도록 할 뿐만 아니라 시료, 특히, 임상 시료에 대한 멀티플렉스 타겟 검출시 위양성 시그널을 방지할 수 있도록 한다.
(b) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 Tm 값은 서열 및/또는 HO의 길이에 의해 조절될 수 있으므로 상기 혼성화물의 Tm 값을 임의적으로 미리 결정(pre-determined)할 수 있다. 상기 특징을 이용함으로써, (i) CTO/HO 혼성화물의 고유의 Tm 값은 CTO/HO 혼성화물의 존재에 대한 구별 인자로 사용할 수 있으며(예컨대, 멜팅 분석에서); 및 (ii) CTO/HO 혼성화물을 유지하기 위한 검출 온도 및 최소 두 개의 타겟 서열의 멀티플렉스 검출을 위한 반응 조건들을 쉽게 결정할 수 있다.
(c) 본 발명은 타겟-의존적 연장이합체의 형성에 의한 CTO와 온전한 HO 간에 혼성화 억제의 발생을 이용한다. 따라서, 본 발명은 HO가 절단되지 않았을 경우에도 타겟 서열을 검출할 수 있다. 이와 관련하여, CTO와 HO 간의 혼성화물의 검출은 CTO의 연장 반응과는 다른 용기에서 실시할 수 있다.
(d) 본 발명의 제 1 양태 및 제 3 양태는 HO의 절단뿐만 아니라 CTO와 온전한 HO 간에 혼성화의 억제를 이용한다. 따라서, PTO의 5’-태깅 부위, CTO 및 HO 서열의 디자인이 수월하고, 반응조건 또한 용이하게 설정할 수 있다.
(e) 본 발명의 제 1 양태 및 제 3 양태는 타겟 서열 검출을 위한 다양한 표지를 이용할 수 있다.
(f) 최소 두개의 타겟 서열 검출을 위한 본 발명의 제 1 양태에서, CTO와 HO 간의 혼성화물들이 서로 상이한 Tm 값을 갖는 경우, 상기 최소 두 개의 타겟 핵산서열은 동일한 형광 특성을 가진 시그널을 제공하는 표지 시스템을 사용하여도 멜팅 커브 분석에 의해 검출될 수 있다. 이와 같은 장점은 멀티플레스 실시간 검출에서 검출 가능한 형광 레이블 수의 제한으로 인한 멀티플렉스의 구현의 한계를 극복할 수 있다.
(g) 멜팅 분석을 이용하여 프로브와 타겟 서열 간에 혼성화물 또는 타겟 서열의 PCR 증폭 산물(amplicon)을 분석하는 종래 기술은 임상 시료와 같은 뉴클레오타이드 변이-민감성 시료(nucelotide variation-susceptible samples)의 경우 분석 편차를 보여줄 가능성이 높다. 그러나, 본 발명의 제 1 양태는 타겟의 서열에 상관없이 디자인될 수 있는 CTO 및 HO를 사용하여, 시료에 편차가 없는 분석 결과를 얻을 수 있다.
(h) 고상에 고정된 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산서열 간의 직접적인 혼성화를 통하여 타겟 핵산서열을 검출하는 종래의 고상 반응은 고상이라는 제한된 반응 환경에 의하여, 효율적인 반응 결과를 얻지 못할 수 있다. 반면, 본 발명은 고상에서는 타겟 핵산서열의 관여 없이 CTO와 HO와의 혼성화 반응을 이용하므로 정형화된 반응 조건에서도 보다 효율적으로 결과를 얻을 수 있다.
(i) 본 발명의 고상 반응에서, 최소 두 개의 타겟 서열이 단일 표지를 사용하더라도 동시에 검출할 수 있다.
(j) 상기 HO가 상기 CTO와의 혼성화 측면에서, 상기 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, HO의 절단이 실질적으로 배제될 수 있다. 이와 같은 경우, 타겟 서열의 검출은 HO 절단의 영향 없이 수행될 수 있다.
(k) 상기 HO가 상기 CTO와의 혼성화 측면에서, 상기 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, 단일 반응 용기에서 HO는 PTO가 CTO에 결합하는 것을 억제하기 때문에, PTO는 CTO보다 타겟 서열에 더 혼성화될 가능성이 있다.
(i) 상기 CTO와의 혼성화 측면에서, 상기 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 HO를 사용하는 본 발명의 일 구현예에서, 비교적 짧은 CTO를 사용할 수 있고, 이는 CTO의 합성 효율성 및 비용 효율을 개선시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: CTO와 HO의 혼성화에 대한 연장이합체 형성의 영향 평가
본 발명자들은 혼성화 올리고뉴클레오타이드(HO)의 CTO에 대한 혼성화가 연장이합체의 수를 증가시킴으로 인해 감소되는지 여부를 실험하였고, 이는 연장이합체의 형성이 HO 및 CTO 간의 혼성화를 억제(inhibit)함을 나타낸다. CTO에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 합성 연장가닥(Syn-ES)을 연장이합체의 양을 조절하기 위하여 준비하였고, 다양한 양의 Syn-ES를 고정된 양의 CTO와 사용하여 연장이합체를 형성시켰다.
Syn-ES 및 CTO는 표지를 갖지 않는다. CTO의 3’-말단은 카본 스페이서로 블록킹된다. HO는 5’-말단에 형광 리포터 분자(Cal Fluor Red 610)를 갖고 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)를 갖는다.
본 실시예에서, CTO-HO 혼성화물의 존재는 멜팅 분석에 의해 검출하였다.
본 실시예에서 이용된 Syn-ES, CTO 및 HO의 서열은 다음과 같다:
NG-Syn-ES 5’-ACGACGGCTTGGCTGAGCGCTGGATACCCTGGACGATATG-3’(SEQ ID NO: 1)
NG-CTO-1 5’-CATATCGTCCAGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[Spacer C3]-3’(SEQ ID NO: 2)
NG-HO-1 5’-[Cal Fluor Red 610]GCGCTGGATACCCTG[BHQ-2]-3’(SEQ ID NO: 3)
반응은 Syn-ES(SEQ ID NO: 1)(3, 2, 1, 0.5, 0.1 or 0 pmole), CTO(SEQ ID NO: 2) 1 pmole, HO(SEQ ID NO: 3) 1 pmole 및 2X 마스터 믹스[2.5 mM MgCl2, dNTPs 200 ㎛ 및 H-Taq DNA 중합효소 1.6 units (Solgent,Korea) 포함] 10 ㎕의 양을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 그리고 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15분간 변성시켰다. 변성과정 후, 반응 혼합물을 40℃로 냉각시키고, 40℃에서 10 분간 유지시킨 다음, 40℃에서 85℃로 천천히 가열시킴으로써 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 CTO-HO 혼성화물의 해리를 모니터링 하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다.
도 19a 내지 19b에서 보여주는 바와 같이, Syn-ES의 0 ~ 0.5 pmole의 범위에서, CTO-HO 혼성화물의 예상 Tm 값에 해당하는 57℃에서 멜팅 피크가 검출되었고 그 높이는 Syn-ES의 양에 반비례하게 감소되었다. Syn-ES를 1pmole 이상 사용한 경우 피크가 검출되지 않았다.
이러한 결과는 CTO와 HO의 혼성화가 연장이합체 형성으로 감소됨을 보여주며, 연장이합체의 형성이 CTO와 HO 간의 혼성화를 억제함을 나타낸다.
실시예 2: PCE -NH 어세이를 이용한 타겟 핵산서열의 검출
또한, 본 발명자들은 PCE-NH 어세이가 (i) 지정 온도에서 실-시간 검출 또는 (ii) 멜팅 분석 방식으로 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는 지의 여부를 실험하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다.
PTO 및 CTO는 표지를 갖지 않는다. PTO 및 CTO의 3’-말단은 카본 스페이서로 블로킹된다. Neisseria gonorrhoeae(NG) 유전자의 지놈 DNA를 타겟으로 사용하였다. HO는 5’-말단에 형광 리포터 분자(Cal Fluor Red 610)를 갖고 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)를 갖는다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, CTO 및 HO의 서열은 다음과 같다:
NG-F-1 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(SEQ ID NO: 4)
NG-R-1 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(SEQ ID NO: 5)
NG-PTO 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[SpacerC3]-3’(SEQ ID NO: 6)
NG-CTO-1 5’-CATATCGTCCAGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[Spacer C3]-3’(SEQ ID NO: 2)
NG-HO-1 5’-[Cal Fluor Red 610]GCGCTGGATACCCTG[BHQ-2]-3’(SEQ ID NO: 3)
(밑줄 문자는 PTO의 5’-태깅 부위 표시)
2-1. PCR 동안 지정 온도에서의 실-시간 검출
반응은 NG의 지노믹 DNA 100 pg, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 4) 10 pmole , 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 5) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 6) 5 pmole , CTO(SEQ ID NO: 2) 0.5 pmole, HO(SEQ ID NO: 3) 0.5 pmole 및 2X 마스터 믹스 [MgCl2 2.5 mM , dNTPs 200 ㎛ 및 H-Taq DNA 중합효소 1.6 units (Solgent,Korea)] 10 ㎕의 양을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 55℃에서 60 초 및 72℃에서 30 초 과정을 50 회 반복하였다. 시그널의 검출은 CTO-HO 혼성화물이 이중-가닥 형태를 유지할 것으로 예상되는 각 사이클의 혼성화 단계(55℃)에서 실시하였다. 또한, 시그널을 각 사이클의 변성 단계(95℃)에서 측정하였다.
지정 온도에서의 실-시간 검출을 포함하는 PCE-NH 어세이는 CTO와 HO의 혼성화에 의해 형성된 이중 가닥으로부터의 시그널이 CTO와 HO 간의 혼성화의 억제에 의해 존재하는 단일 가닥 HO으로부터의 시그널과 상이하다는 사실을 이용한다.
본 실시예에서, HO는 상호작용적 이중 표지를 갖는다. HO가 단일 가닥 상태인 경우, HO의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 타겟 핵산서열이 비존재하고 CTO/HO 혼성화물이 형성되는 경우, HO 상에 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격되어 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭한다.
타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 연장이합체의 타겟-의존적 형성은 CTO와 HO의 혼성화를 억제하고, 이에 의해 HO가 단일 가닥 상태가 되는 것을 가능하게 하고, 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭된다. 따라서, 단일 가닥 상태의 HO의 수는 연장이합체의 수가 증가함에 따라 증가되고, 그 결과, 최종적으로 검출되는 신호의 세기는 감소된 패턴을 나타낸다.
한편, 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, CTO와 혼성화된 HO는 PTO 단편의 연장 동안에 절단될 수 있다. 상기 절단은 영구적으로 이격된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 생성시켜 리포터 분자로부터의 시그널을 완전히 언퀀칭시킨다. HO의 절단에 의한 언퀀칭 정도는 CTO와 HO의 혼성화에 의한 언퀀칭 정도보다 크다. 따라서, HO의 절단에 의해 제공되는 시그널이 검출되는 경우, 시그널 세기는 절단된 HO 수가 증가함에 따라 증가된 패턴을 보여준다. HO의 절단에 의해 제공되는 시그널은 다양한 온도에서 검출될 수 있다. 높은 온도에서 검출은 HO와 CTO 간의 혼성화에 의해 제공되는 시그널을 제거할 수 있다.
본 실시예에서, 온전한 HO와 CTO 간에 혼성화의 억제및 HO의 절단을 포함하는 두 상황이 동시에 발생하는 동안, 보다 우세한 상황에 부합되는 시그널 패턴이 제공될 것이다.
도 20a에서 보여주는 바와 같이, 혼성화 단계(55℃)에서 측정된 형광 시그널의 세기는 타겟의 존재 하에서 감소되는 패턴을 보여준다. 타겟의 비존재 시에는 시그널이 검출되지 않는다. 이러한 결과는 PCE-NH 어세이가 실-시간 검출 방법으로 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다는 것을 보여주고, 또한 온전한 HO와 CTO의 혼성화의 억제는 PCE-NH 어세이에 의하여 타겟 서열의 존재를 검출할 수 있게 한다.
또한, 반응 동안 일부 HO 절단의 존재를 관찰하기 위해, 상기 반응 동안 각 사이클의 변성 단계(95℃)에서 시그널의 검출을 실시한다. 도 20b에서 보여주는 바와 같이, 형광 시그널의 세기는 타켓의 존재에서 증가된다. 어떠한 시그널도 타겟의 비존재에서는 검출되지 않는다. 이러한 결과는 일부 HO가 반응 동안 절단 될 수 있음을 보여준다.
2-2. 멜팅 분석
실시예 2-1에 반응 후, 멜팅 커브는 반응 혼합물을 40℃로 냉각시키고, 40℃에서 10 분간 유지시킨 다음, 40℃에서 85℃로 천천히 가열시킴으로써 얻었다. 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 CTO-HO 혼성화물의 해리를 모니터링 하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다.
도 20c에서 보여주는 바와 같이, 멜팅 피크는 타겟의 비존재 시에는 예상되는 CTO-HO 혼성화물의 Tm 값에 해당하는 59℃에 검출된다. 타겟의 존재 시에는 어떠한 시그널도 검출되지 않는다. 이러한 결과는 PCE-NH 어세이가 멜팅 분석 방식으로 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 3: 타겟 핵산서열의 검출을 위하여 경쟁적 HO를 사용하는 PCE -NH 어세이의 평가
또한, 본 발명자들은 PCE-NH 어세이가 (i) 지정 온도에서 실-시간 검출 또는 (ii) 멜팅 분석 방식으로 HO의 절단으로부터 제공된 시그널 없이 CTO와 온전한 HO의 혼성화 억제로부터 제공된 시그널을 사용하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는 지의 여부를 실험하였다. PTO 단편 연장 동안 HO의 절단의 효과를 배제시키기 위해, 경쟁적 HO는 CTO에 대한 혼성화 측면에서 PTO 단편과 경쟁하도록 디자인하였다. 실시예에서 경쟁적 HO는 PTO 단편 서열 및 그의 3’-말단 일부에 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 추가적인 서열을 포함한다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다.
PTO 및 CTO는 표지를 갖지 않는다. PTO 및 CTO의 3’-말단은 카본 스페이서로 블로킹된다. Neisseria gonorrhoeae(NG) 유전자의 지놈 DNA를 타겟으로 사용하였다. 경쟁적 HO는 5’-말단에 형광 리포터 분자(Cal Fluor Red 610)를 갖고 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)를 갖는다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, CTO 및 경쟁적 HO의 서열은 다음과 같다:
NG-F-2 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’(SEQ ID NO: 7)
NG-R-2 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO: 8)
NG-PTO 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[SpacerC3]-3’(SEQ ID NO: 6)
NG-CTO-1 5’-CATATCGTCCAGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[Spacer C3]-3’(SEQ ID NO: 2)
NG-HO-2 5’-[Cal Fluor Red 610]ACGACGGCTTGGCTGAGCGC[BHQ-2]-3’(SEQ ID NO: 9)
(밑줄 문자는 PTO의 5’-태깅 부위 표시)
3-1. 지정 온도에서의 실-시간 검출
반응은 NG의 지노믹 DNA 100 pg, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 7) 10 pmole , 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 8) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 6) 5 pmole , CTO(SEQ ID NO: 2) 0.5 pmole, 경쟁적 HO(SEQ ID NO: 9) 1 pmole 및 2X 마스터 믹스[MgCl2 2.5 mM , dNTPs 200 ㎛ 및 H-Taq DNA 중합효소 1.6 units (Solgent,Korea)] 10 ㎕의 양을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초, 및 72℃에서 30초 과정을 50 회 반복하였다. 시그널의 검출은 CTO-HO 혼성화물이 이중-가닥 형태를 유지할 것으로 예상되는 혼성화 단계(60℃)에서 실시하였다. 또한, 시그널을 각 사이클의 변성 단계(95℃)에서 측정하였다.
도 21a에서 보여주는 바와 같이, 타겟의 존재 시에, 혼성화 단계(60℃)에서 측정된 형광 시그널의 세기가 감소하는 패턴이 얻어졌다. 타겟의 비존재 시에는 시그널이 검출되지 않는다.
이러한 결과는 PCE-NH 어세이가 HO의 절단 없이, 온전한 HO와 CTO의 혼성화의 억제를 이용함으로써 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다는 것을 보여준다.
또한, 반응 동안 일부 HO 절단의 존재를 관찰하기 위해, 상기 반응 동안 각 사이클의 변성 단계(95℃)에서 시그널의 검출을 실시한다. 도 21b에서 보여주는 바와 같이, 타겟의 비존재뿐만 아니라 타겟의 존재 하에서도 어떠한 시그널도 검출되지 않는다. 이러한 결과는 HO가 반응 동안 절단되지 않음을 보여준다.
3-2. 멜팅 분석
실시예 4-1에 반응 후, 멜팅 커브는 반응 혼합물을 55℃로 냉각시키고, 55℃에서 30 초간 유지시킨 다음, 55℃에서 85℃로 천천히 가열시킴으로써 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 CTO-HO 혼성화물의 해리를 모니터링 하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 유래되었다.
도 21c에서 보여주는 바와 같이, CTO-HO 혼성화물의 예상되는 Tm 값에 해당하는 70℃에 멜팅 피크는 타겟의 비존재에서 검출된다. 타겟의 존재에서는 어떠한 시그널도 검출되지 않는다.
이러한 결과는 멜팅 분석을 포함하는 PCE-NH가 HO 절단 없이 CTO에 온전한 HO의 혼성화의 억제를 사용하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4: 단일- 표지된 CTO 및 마이크로어레이에 고정화된 HO를 사용하는 PCE -NH 어세이의 평가
또한, 본 발명자들은 단일-표지된 CTO 및 마이크로어레이에 고정화된 HO를 사용하는 PCE-NH 어세이를 실험하였다. PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장, 고정화된 HO에 CTO의 혼성화를 마이크로어레이에서 동시에 실시하였다. 반응 후, CTO-HO 이합체의 존재 또는 비존재를 분석하였다. PTO 단편이 HO의 존재 하에서 연장되는 경우, CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성은 (i) HO와 CTO 간의 혼성화의 억제 및/또는 (ii) PTO 단편의 연장동안 HO의 절단에 의해 방지될 수 있다.
5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 업스트림 프라이머 및 다운스트림프라이머의 연장, PTO 단편의 절단 및 연장을 위해 사용하였다. PTO의 3’-말단은 카본 스페이서로 블로킹된다. CTO는 3’-말단에 형광 리포터 분자(Quasar670)를 갖는다. HO는 링커 암(linker arm)으로서 poly(T)10을 갖고 그의 3’-말단의 아미노 그룹(AminnoC7)을 사용하여 글라스 슬라이드의 표면에 고정화하였다. 5’-말단에 형광 리포터 분자(Quasar670)를 갖는 마커 프로브는 3’-말단의 아미노 그룹을 사용하여 글라스 슬라이드의 표면에 고정화하였다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, CTO, HO 및 마커의 서열은 다음과 같다:
NG-F-2 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’(SEQ ID NO: 7)
NG-R-2 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO: 8)
NG-PTO 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO: 6)
NG-CTO-2 5’-CATATCGTCCAGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[Quasar670]-3’(SEQ ID NO: 10)
NG-HO-3 5’-GCGCTGGATACCCTGGACGATATGTTTTTTTTTT[Amino C7]-3’(SEQ ID NO: 11)
Marker 5’-[Quasar670]ATATATATAT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO: 12)
(밑줄 문자는 PTO의 5’-태깅 부위 표시)
NSB9 NHS 슬라이드(NSBPOSTECH, Korea)를 HO 및 마커(SEQ ID NO: 11 및 12)의 제작에 이용하였다. NSB 스팟팅 버퍼(NSB spotting buffer)로 최종 농도 50 ㎛이 되도록 용해시킨 HO 및 마커를 PersonalArrayer™16 Microarray Spotter(CapitalBio, China)를 이용하여 NSB9 NHS 슬라이드 상에 프린팅 하였다. HO 및 마커를 2x1 포맷(duplicate spots)으로 나란히 스팟팅(spotting) 하였고, 이렇게 하여 제작된 마이크로어레이를 약 85% 습도로 유지되는 챔버에 하룻밤 인큐베이팅하였다. 비-특이적으로 결합된 CTO 및 마커를 제거하기 위하여, 상기 슬라이드들을 2x SSPE(0.3 M 소디윰 클로라이드, 0.02 M 소디윰 하이드로겐 포스페이트 및 2.0 mM EDTA), pH 7.4 및 7.0 mM SDS를 함유한 버퍼 용액에 37℃에서 30 분 동안 세척하고 증류수로 세척하였다. 그 후 슬라이드 원심분리기를 이용하여 상기 DNA-기능화된(DNA-functionalized) 슬라이드들을 건조시키고 사용 전까지 4℃ 암실 에서 보관하였다.
PCE-NH 반응을 NG 유전자의 지노믹 DNA 100 pg, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 7) 10 pmole , 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 8) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 6) 5 pmole , CTO(SEQ ID NO: 10) 0.5 pmole 및 2X 마스터 믹스[MgCl2 2.5 mM , dNTPs 200 ㎛ 및 H-Taq DNA 중합효소 1.6 units (Solgent,Korea)] 15 ㎕의 양을 함유한 30 ㎕의 최종 부피로 실시하였다; 상기 전체 혼합물을 HO(SEQ ID NO: 11)가 교호-결합(cross-linked)된 NSB 글라스 슬라이드의 표면에 조립된 챔버에 적용하였다. 상기 슬라이드를 인 시추(in situ) 블록 방식으로 열순환기(GenePro B4I, China)에 위치시켰다; 상기 PCE-NH 반응을 다음과 같이 실시하였다: 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초, 및 72℃에서 30초 과정을 40 회 반복하고 55℃에서 5 분간 혼성화.
반응 후, 슬라이드를 1 분 동안 증류수로 세척하였다. 이미지 획득은 공초점 레이저 스캐너 Axon GenePix4300A(molecular Device, US)을 이용하여 5-㎛ 픽셀 해상도의 스캐닝으로 실시하였다. 형광강도는 정량적인 마이크로어레이 분석 소프트웨어, GenePix pro7.0 소프트웨어(molecular Device, US)를 이용하여 분석하였다. 형광 강도는 주변 백그라운드를 제거한 후 스팟-중앙값(spot-medians)으로 표현하였다. 재현성을 조사하기 위하여, 각 스팟은 2개씩 스팟팅하였다. 형광 강도를 반복된 스팟들의 평균 값으로 나타냈다.
도 22에서 보여주는 바와 같이, 형광 강도는 타겟의 비존재 시에 비해 타겟의 존재 시에 명백하게 감소되었다. 이러한 결과는 단일-표지된 CTO 및 마이크로어레이에 고정화된 HO를 사용하는 PCE-NH 어세이가 타겟 핵산서열을 검출할 수 있음을 보여준다.
실시예 5: HO의 절단 없이 단일- 표지된 CTO 및 마이크로어레이에 고정화된 HO를 사용하는 PCE -NH 어세이의 평가
또한, 본 발명자들은 단일-표지된 CTO 및 마이크로어레이에 고정화된 HO를 사용하는 PCE-NH 어세이를 실험하였다. PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 하나의 용기에서 실시하고 그 결과물은 HO가 고정화된 마이크로어레이로 이동시켰다. 이는 PTO 단편의 연장동안에 HO가 절단되는 것을 배제할 수 있도록 한다. 혼성화 반응 후, CTO-HO 이합체의 존재 또는 비존재를 분석하였다.
상기 실시예 4처럼 동일한 Taq DNA 중합효소, PTO, CTO, HO 및 마커를 사용하였다.
슬라이드 제조는 실시예 4에서 사용된 프로토콜과 동일하게 실시하였다.
PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장은 NG의 지노믹 DNA 100 pg, 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 7) 10 pmole , 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 8) 10 pmole, PTO(SEQ ID NO: 6) 5 pmole , CTO(SEQ ID NO: 10) 0.5 pmole 및 2X 마스터 믹스[MgCl2 2.5 mM , dNTPs 200 ㎛ 및 H-Taq DNA 중합효소 1.6 units (Solgent,Korea)] 15 ㎕의 양을 함유한 30 ㎕의 최종 부피로 실시하였다; 반응 혼합물을 포함하는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초, 및 72℃에서 30초 과정을 40 회 반복하였다.
상기 결과물인 혼합물을 HO(SEQ ID NO: 11)가 교호결합(cross-linked)된 NSB 유리 슬라이드의 표면상에 조립된 챔버에 적용하였다. 슬라이드를 인 시추(in situ) 블록 방식으로 열순환기(Genepro B4I, China)에 위치시켰다. 혼성화 반응을 55℃에서 30 분 동안 실시하였다. 최종적으로, 슬라이드를 증류수로 1 분 동안 세척시켰다. 이미지 획득은 공초점 레이저 스캐너 Axon GenePix4300A(molecular Device, US)을 이용하여 5-㎛ 픽셀 해상도의 스캐닝으로 실시하였다. 형광 강도는 정량적인 마이크로어레이 분석 소프트웨어, GenePix pro7.0 소프트웨어(molecular Device, US)를 이용하여 분석하였다. 형광 강도는 주변 백그라운드를 제거한 후 스팟-중앙값(spot-medians)으로 표현하였다. 재현성을 조사하기 위하여, 각 스팟은 2개씩 스팟팅하였다. 형광 강도를 반복된 스팟들의 평균 값으로 나타냈다.
도 23에서 보여주는 바와 같이, 형광 강도는 타겟의 비존재 시에 비해 타겟의 존재 시에 명백하게 감소되었다. 이러한 결과는 단일-표지된 CTO 및 마이크로어레이에 고정화된 HO를 사용하는 PCE-NH 어세이가 HO를 절단하는 단계 없이 타겟 핵산서열을 검출할 수 있음을 보여준다.
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였으며, 본 발명의 원리를 따르는 변이 및 수정이 가능하고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다는 것은 당업계 통상의 지식을 가진 자에게 잘 인식된다.
<110> SEEGENE, INC. <120> DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCE BY PTO CLEAVAGE AND EXTENSION-DEPENDENT NON-HYBRIDIZATION ASSAY <130> PI150012 <150> KR 10-2012-0154834 <151> 2012-12-27 <150> KR 10-2013-0008580 <151> 2013-01-25 <150> KR 10-2013-0034670 <151> 2013-03-29 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> NG-Syn-ES <400> 1 acgacggctt ggctgagcgc tggataccct ggacgatatg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> NG-CTO-1 <400> 2 catatcgtcc agggtatcca gcgctcagcc aagccgtcgt 40 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> NG-HO-1 <400> 3 gcgctggata ccctg 15 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> NG-F-1 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 4 tacgcctgct actttcacgc tnnnnngtaa tcagatg 37 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> NG-R-1 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 5 caatggatcg gtatcactcg cnnnnncgag caagaac 37 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> NG-PTO <400> 6 acgacggctt ggctgcccct cattggcgtg tttcg 35 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> NG-F-2 <400> 7 tacgcctgct actttcacgc t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> NG-R-2 <400> 8 caatggatcg gtatcactcg c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> NG-HO-2 <400> 9 acgacggctt ggctgagcgc 20 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> NG-CTO-2 <400> 10 catatcgtcc agggtatcca gcgctcagcc aagccgtcgt 40 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> NG-HO-3 <400> 11 gcgctggata ccctggacga tatgtttttt tttt 34 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Marker <400> 12 atatatatat 10

Claims (36)

  1. 다음 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화(hybridizing)시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥(extended strand)을 생성하고 연장이합체(extended duplex)를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고;
    (e) 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO)의 존재 하에서, 일정 온도 범위에 걸쳐 상기 단계 (d)의 결과물에 대한 멜팅 분석 또는 혼성화 분석을 실시하는 단계로서; 상기 타겟 핵산서열이 상기 핵산 시료 내에 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO 와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공하며; 상기 타겟 핵산서열이 상기 핵산 시료 내에 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)하고, 이에 의해 상기 시그널이 제공되지 않으며; 상기 시그널은 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 CTO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅(intercalating) 표지에 의해 제공되고 ; 및
    (f) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 HO의 존재 하에서 실시되고; (i) 상기 CTO의 캡쳐링 부위와 혼성화된 상기 단편은 상기 HO의 혼성화 이전에 연장되거나, (ii) 상기 단편의 연장 전에 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화된 경우, 상기 단편의 연장은 상기 CTO로부터 상기 HO를 절단 또는 분리(displace)시키거나, 또는 (ⅲ) 상기 CTO의 캡쳐링 부위와 혼성화된 상기 단편은 상기 HO의 혼성화 이전에 연장되며 그리고 상기 단편의 연장 전에 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화된 경우, 상기 단편의 연장은 상기 CTO로부터 상기 HO를 절단 또는 분리(displace)시키며, 이에 상기 연장이합체의 형성은, 상기 CTO와 HO 간의 혼성화 억제(inhibition), 절단에 의한 HO의 소모 또는 상기 CTO와 HO 간의 혼성화 억제(inhibition) 및 절단에 의한 HO의 소모로 인하여 상기 단계 (e)에서 상기 HO와 CTO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 HO 또는 상기 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 비형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중표지가 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 HO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 하나를 갖고, 상기 CTO는 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 가지며; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 비형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중표지가 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HO를 하나 더 추가적으로 사용하여 실시되고 상기 두 개의 HO는 상기 CTO에 서로 근접하여 혼성화되며; 상기 두 개의 HO 중 하나는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 하나를 갖고 두 개의 HO 중 나머지 하나는 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 갖고; 상기 CTO와 두 개의 HO 간의 혼성화물이 형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 두 개의 HO 간의 혼성화물이 비형성된 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중표지가 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 HO 또는 상기 CTO는 단일표지를 갖고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 형성된 경우에 상기 단일표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 비형성된 경우에 상기 단일표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 단일표지가 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 CTO 및 HO 중 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단계 (f)에서의 시그널 검출 전에 고상 기질 상에 고정화 되며, 상기 시그널은 상기 고상 기질 상에서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 다음 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 고상에서 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화(hybridizing)시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고;
    (e) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화에 적합한 조건 하에서 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO)와 상기 단계 (d)의 결과물을 혼성화시키는 단계로서; 상기 CTO 및 HO 중 하나는 단일표지로 표지되고, 표지되지 않은 나머지 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단계 (f)에서의 시그널 검출 전에 고상 기질 상에 고정화되며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO 및 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 고상 기질 상에서 상기 단일표지로부터의 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)하고, 이에 의해 고상 기질 상에서 상기 단일표지로부터의 시그널이 제공되지 않으며; 및
    (f) 상기 고상 기질 상의 상기 시그널을 검출하여 상기 고상 기질 상에서 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물을 검출하는 단계로서; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 HO의 존재 하에서 실시되고; (i) 상기 CTO의 캡쳐링 부위와 혼성화된 상기 단편은 상기 HO의 혼성화 이전에 연장되거나, (ii) 상기 단편의 연장 전에 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화되는 경우, 상기 단편의 연장은 상기 CTO로부터 상기 HO를 절단 또는 분리(displace)시키거나, 또는 (ⅲ) 상기 CTO의 캡쳐링 부위와 혼성화된 상기 단편은 상기 HO의 혼성화 이전에 연장되며 그리고 상기 단편의 연장 전에 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화되는 경우, 상기 단편의 연장은 상기 CTO로부터 상기 HO를 절단 또는 분리(displace)시키며, 이에 의해 상기 연장이합체의 형성은 상기 CTO와 HO 간의 혼성화 억제(inhibition), 절단에 의한 HO의 소모 또는 상기 CTO와 HO 간의 혼성화 억제(inhibition) 및 절단에 의한 HO의 소모로 인하여 상기 단계 (e)에서 상기 HO와 CTO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, (i) 상기 CTO는 단일 표지를 갖고 상기 HO는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단계 (f)에서의 시그널 검출 전에 고상 기질 상에 고정화되고 또는 (ii) 상기 HO는 단일 표지를 갖고 상기 CTO는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단계 (f)에서의 시그널 검출 전에 고상 기질 상에 고정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 다음 단계를 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 고상에서 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화(hybridizing)시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고;
    (e) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화에 적합한 조건 하에서 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO)와 상기 단계 (d)의 결과물을 혼성화시키는 단계로서; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO 와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 제 1 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체는 상기 CTO와 HO의 혼성화를 억제(inhibit)하며, 이에 의해 상기 CTO와 비혼성화된 HO의 존재를 나타내는 제 2 시그널이 제공되며 ; 상기 시그널은 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 CTO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅(intercalating) 표지에 의해 제공되고 ; 및
    (f) 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물이 이중-가닥 형태를 유지하는 지정 온도(predetermined temperature) 하에 상기 제 1 시그널 또는 상기 제 2 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 비존재를 나타내고; 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 비존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내며; 상기 제 1 시그널과 제 2 시그널의 차이는 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 존재 또는 비존재를 결정할 수 있게 하여 상기 핵산 시료 내의 상기 타겟 핵산서열의 존재 또는 비존재를 나타낸다.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 HO의 존재 하에서 실시되고; (i) 상기 CTO의 캡쳐링 부위와 혼성화된 상기 단편은 상기 HO의 혼성화 이전에 연장되거나, (ii) 상기 단편의 연장 전에 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화되는 경우, 상기 단편의 연장은 상기 CTO로부터 상기 HO를 절단 또는 분리(displace)시키거나, 또는 (ⅲ) 상기 CTO의 캡쳐링 부위와 혼성화된 상기 단편은 상기 HO의 혼성화 이전에 연장되며 그리고 상기 단편의 연장 전에 상기 HO가 상기 CTO와 혼성화되는 경우, 상기 단편의 연장은 상기 CTO로부터 상기 HO를 절단 또는 분리(displace)시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 HO 또는 상기 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고; 상기 CTO와 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO가 서로 떨어져서 있는 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중표지가 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 HO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 갖고 CTO는 상호작용적 이중 표지 중 나머지 하나를 가지며; 상기 CTO와 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO가 서로 떨어져 있는 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중 표지가 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11 항에 있어서, 상기 방법은 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HO를 하나 더 추가적으로 사용하여 실시되고 상기 두 개의 HO는 상기 CTO에 서로 근접하여 혼성화되며; 상기 두 개의 HO 중 하나는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 갖고 상기 두 개의 HO 중 나머지 하나는 상기 상호작용적 이중 표지 중 나머지 하나를 갖으며; 상기 CTO와 두 개의 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 상기 두 개의 HO가 서로 떨어져 있는 경우에 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 상호작용적 이중표지가 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11 항에 있어서, 상기 HO 또는 CTO는 단일 표지를 갖고; 상기 CTO와 HO가 혼성화되어 혼성화물을 형성하는 경우에 상기 단일표지로부터의 시그널과 상기 CTO와 HO가 서로 떨어져 있는 경우에 상기 단일표지로부터의 시그널이 상이하게 되는 위치에 상기 단일표지가 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 11 항에 있어서, 상기 CTO 및 HO 중 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단계 (f)에서의 시그널 검출 전에 고상 기질 상에 고정화 되며, 상기 시그널은 고상 기질 상에서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HO는 상기 CTO와 혼성화에 있어서, 상기 단편과 경쟁하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 HO는 상기 단편 또는 그의 연장 산물에 의해 절단되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(f)는 하나의 반응 용기 또는 별도의 반응 용기에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PTO, 상기 CTO, 상기 HO, 상기 PTO 및 상기 CTO, 상기 PTO 및 상기 HO, 상기 CTO 및 상기 HO, 또는 상기 PTO, 상기 CTO 및 상기 HO는 연장되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고 뉴클레오타아드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도할 정도로 상기 PTO에 근접하게 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통해 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTO의 캡처링 부위는 그의 5’말단 일부에 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 타겟 핵산서열이 없거나 또는 지정된 함량(predetermined amount)의 타겟 핵산서열을 포함하는 대조군을 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)-(f) 전부 또는 일부 단계를 변성을 포함하여 반복적으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 방법이고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2종의 CTO를 포함하며, 상기 HO는 최소 2종의 HO를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 상기 단계 (b)에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위한 주형-의존적 핵산 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않고 실시되고, 상기 단계 (b)에서 상기 PTO의 절단은 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥의 도움 없이 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 다음을 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하는 키트:
    (a) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    (b) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의하여 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화된 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고; 및
    (d) 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO); 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 상기 HO와 CTO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)하고, 이에 의해 시그널이 제공되지 않으며; 상기 키트는 (i) HO에 연결된 표지, (ii) CTO에 연결된 표지, (iii) HO에 연결된 표지 및 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅(intercalating) 표지를 추가적으로 포함한다.
  35. 다음을 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 고상에서 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하는 키트:
    (a) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    (b) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의하여 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고; 및
    (d) 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO); 상기 CTO 및 상기 HO 중 하나는 단일 표지로 표지되고 표지되지 않은 나머지 하나는 고상 기질 상에 고정화되거나 또는 상기 단일표지로부터의 시그널 검출 전에 고상 기질에 고정화되며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 고상 기질 상에서 상기 단일표지로부터의 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체가 형성되어 상기 CTO와 HO 간의 혼성화물의 형성을 방지(prevent)하고, 이에 의해 상기 고상 기질 상에서 상기 단일표지로부터의 시그널이 제공되지 않는다.
  36. 다음을 포함하며, PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization: PCE-NH) 어세이에 의하여 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 검출하는 키트:
    (a) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    (b) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의하여 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고 연장이합체를 형성하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고; 및
    (d) 상기 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide: HO); 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 비존재하는 경우, 상기 연장이합체는 형성되지 않고, 상기 CTO와 HO는 혼성화물을 형성하며, 이에 의해 상기 HO와 CTO 간의 혼성화물의 존재를 나타내는 제 1 시그널을 제공하며; 상기 핵산 시료 내에 상기 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 연장이합체는 상기 CTO와 상기 HO의 혼성화를 억제(inhibit)하며, 이에 의해 상기 CTO와 비혼성화된 HO의 존재를 나타내는 제 2 시그널을 제공하며; 상기 키트는 (i) HO에 연결된 표지, (ii) CTO에 연결된 표지, (iii) HO에 연결된 표지 및 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅(intercalating) 표지를 추가적으로 포함한다.
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