KR20200038338A - Pto 절단 및 연장-의존적 연장 분석에 의한 타겟 핵산 서열의 검출 - Google Patents

Pto 절단 및 연장-의존적 연장 분석에 의한 타겟 핵산 서열의 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTOCE-E) 분석에 의한 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PTOCE-E 분석은 종래 PTOCE 및 PCE-SH 방법과 비교하여 비타겟 시그널을 감소시키고 타겟 시그널을 증가시켜 보다 정확한 타겟 핵산 서열의 검출을 가능하게 한다.

Description

PTO 절단 및 연장-의존적 연장 분석에 의한 타겟 핵산 서열의 검출
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2017년 9월 29일에 대한민국 특허청에 출원된 대한민국 특허출원 제2017-0128110호의 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
기술분야
본 발명은 PTOCE-E(PTO Cleavage and Extension-dependent Extension) 분석에 의한 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다.
타겟 핵산 서열의 검출을 위해, 실시간 방식으로 타겟 증폭을 모니터링하면서 타겟 핵산 서열을 검출하는 실시간 검출 방법이 널리 사용되고 있다. 실시간 검출 방법은 일반적으로 타겟 핵산 서열과 특이적으로 혼성화되는 표지된 프로브 또는 프라이머를 사용한다. 표지된 프로브와 타겟 핵산 서열 간의 혼성화를 이용하는 방법의 예로서, 헤어핀 구조를 갖는 이중표지된 프로브를 이용한 Molecular beacon 방법(Tyagi et al., Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), HyBeacon 방법(French DJ et al., Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 공여자 및 수용자로 각각 표지된 2개의 프로브를 이용한 혼성화 프로브 방법(Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일 표지된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 Lux 방법(미국 특허 제7,537,886호)이 있다. 또한, 이중표지된 프로브와 DNA 폴리머라아제의 5'-뉴클레아제 활성에 의한 상기 프로브의 절단을 이용한 TaqMan 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)이 본 기술분야에서 널리 이용되고 있다.
표지된 프라이머를 이용한 방법의 예로는 Sunrise 프라이머 방법(Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 제6,117,635호), Scorpion 프라이머 방법(Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 제6,326,145) 및 TSG 프라이머 방법(WO 2011/078441)이 있다.
대안적인 방법으로서, 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체를 이용한 실시간 검출 방법이 제안되어왔다: Invader 분석(미국 특허 제5,691,142호, 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 방법(WO 2012/096523), PCEC(PTO Cleavage and Extension-dependent Cleavage) 방법(WO 2012/134195), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442), PCE-SC(PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage) 방법(WO 2013/157821), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-dependent Non-Hybridization) 방법(WO 2014/104818), PCE-IH(PTO Cleavage and Extension-dependent Immobilized Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2015/008985).
그러나, 이들 방법은 특히 멀티플렉스 증폭 반응에서 타겟 시그널의 감소 또는 비타겟 시그널의 증가와 같은 몇 가지 단점이 있다.
따라서, 타겟 시그널을 유지하면서 뉴클레오타이드 변이의 검출시 비-타겟 시그널을 감소시킬 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 특히 멀티플렉스 방식에서 타겟 핵산 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 프로브 혼성화뿐만 아니라 절단 및 연장의 1차 효소적 반응과 추가 연장의 2차 효소적 반응에 의해 타겟 검출이 달성되는 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였다. 본 발명의 프로토콜은 고상 반응뿐만 아니라 액상 반응에서도 잘 적용되며, 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고 복수의 타겟 서열이 검출되도록 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTO Cleavage and Extension-dependent Extension: PTOCE-E) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
I. PTOCE -E 분석에 의한 타겟 핵산 서열의 검출
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTO Cleavage and Extension-dependent Extension: PTOCE-E) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3'-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO의 5'-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5'-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 PTO 단편을 방출하며;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 제1 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제1 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO 단편에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO 단편은 상기 제1 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서, 상기 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 PTO 단편은 연장되어 상기 제1 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제1 연장서열을 포함하는 제1 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제1 연장가닥과 제1 CTO 간에 제1 연장 이합체를 형성하며,
(e) 상기 제1 연장가닥과 제2 CTO를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제2 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 제1 연장가닥은 상기 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(f) 상기 단계 (e)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서, 상기 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 제1 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제2 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체를 형성하며;
(g) 상기 제2 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제2 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 특히 멀티플렉스 방식에서 타겟 핵산 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 프로브 혼성화뿐만 아니라 절단 및 연장의 1차 효소적 반응과 추가 연장의 2차 효소적 반응에 의해 타겟 검출이 달성되는 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였다. 본 발명의 프로토콜은 고상 반응뿐만 아니라 액상 반응에서도 잘 적용되며, 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고 복수의 타겟 서열이 검출되도록 한다.
본 발명의 방법은 프로브 혼성화에 의해 발생되는 연속적인 사건, 즉 PTO의 절단, 연장 및 추가 연장을 이용하며, 이는 "PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTO Cleavage and Extension-Dependent Extension)" 분석으로 명명된다.
본 발명의 PTOCE-E 분석에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(및 선택적으로 다운스트림 올리고뉴클레오타이드); PTO; 제1 CTO; 및 제2 CTO를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오타이드들은 타겟 핵산 서열 또는 반응 생성물과의 혼성화에 관여한다. 본원에서 달리 명확히 언급되지 않는 한, 각 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산 서열 또는 다른 올리고뉴클레오타이드와 혼성화되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 PTOCE-E 분석이 도 2에 개략적으로 도시되어 있다. PTOCE-E 분석을 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 타겟 핵산 서열과의 혼성화
본 발명의 방법에 따르면, 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화시킨다.
본원에서 사용된 용어 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 검출하기 위한 관심있는 핵산 서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본원에서 사용된 용어 "프로브"는 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 부위(들)를 포함하는 단일 가닥 핵산 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "프라이머"는 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH에 있을 때 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
특히, 프로브 및 프라이머는 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍하기 위해 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함하는 많은 인자에 따라 달라질 것이다. 본원에 사용된 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본원에 사용된 용어 "혼성화하다", "혼성화하는" 또는 "혼성화"는 특정 혼성화 조건 또는 엄격 조건 하에 2개의 상보적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 간의 비공유 결합에 의한 이중 가닥의 형성을 지칭한다.
특히, 본원에서 하나의 올리고뉴클레오타이드가 다른 올리고뉴클레오타이드에 대한 "혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다"는 표현은 하나의 올리고뉴클레오타이드의 전체 또는 일부가 다른 올리고뉴클레오타이드의 전체 또는 일부와 혼성화하는데 필요한 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
또한, 본원에서 하나의 올리고뉴클레오타이드의 부위와 다른 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 언급할 때, 상기 하나의 올리고뉴클레오타이드의 부위는 개별적인 올리고뉴클레오타이드로 간주될 수 있다.
혼성화는 완전히 매치하거나 일부 미스매치(예컨대, 1-4개의 미스매치)를 갖고 실질적으로 매치되는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 타겟 핵산 서열의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분 및 이들의 pH 및 이온 세기와 같은 조건은 올리고뉴클레오타이드(업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO)의 길이 및 GC 양 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 낮은 엄격 조건(stringent condition)을 채택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 문헌[Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)]에서 확인할 수 있다.
용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 이들 용어는 상호교환적으로 사용될 것이다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드와 PTO는 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 엄격 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하기 위해 사용되며, "실질적으로 상보적(substantially complementary)" 및 "완전히 상보적(perfectly complementary)"인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
반면, 용어 "비-상보적"은 소정의 어닐링 또는 엄격 조건 하에서 프라이머 또는 프로브가 특정 서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하기 위해 사용되며, "실질적으로 비-상보적(substantially non-complementary)" 및 "완전히 비-상보적(perfectly noncomplementary)"인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)"는 (i) 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위; 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미하며; 상기 PTO의 3'-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO의 5'-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않는다.
상기 PTO가 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, PTO는 하기 2가지 부위를 포함한다: (i) 프로브 역할을 하는 3'-타겟팅 부위; 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 타겟 핵산 서열에 혼성화 후 PTO로부터 핵산절단에 의해 방출되는 5'-태깅 부위. 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위는 5'에서 3' 순서로 위치해야 한다.
특히, 단계 (a)의 혼성화는 3'-타겟팅 부위가 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 5'-태깅 부위가 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않는 엄격 조건 하에서 실시된다.
PTO는 특정한 길이를 요구하지 않는다. 예를 들어, PTO의 길이는 15-150 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-150 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 30-150 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드, 30-50 뉴클레오타이드, 35-100 뉴클레오타이드, 35-80 뉴클레오타이드, 35-60 뉴클레오타이드, 또는 35-50 뉴클레오타이드일 수 있다.
PTO의 3'-타겟팅 부위는 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 한 어떠한 길이일 수 있다. 예를 들어, PTO의 3'-타겟팅 부위는 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
PTO의 5'-태깅 부위는 제1 CTO의 템플레이팅 부위에 특이적으로 혼성화하여 연장될 수 있는 한, 어떠한 길이일 수 있다. 예를 들어, PTO의 5'-태깅 부위는 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이일 수 있다.
PTO의 3'-말단은 3'-OH 터미널(terminal)을 가질 수 있다. 특히, PTO의 3'-말단은 연장이 되지 않도록 "블록킹"될 수 있다.
블록킹은 종래 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3'-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올과 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3'-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같은 3'-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
택일적으로, PTO는 헤어핀 구조를 가지도록 디자인될 수 있다.
상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 타겟 핵산 서열 간의 비-혼성화는 특정 혼성화 조건 하에서 이들 사이의 안정적인 이중 가닥의 비형성을 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열과의 혼성화에 관여하지 않는 PTO의 5'-태깅 부위는 단일 가닥을 형성한다.
본 발명에서 사용되는 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 업스트림에 위치하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 타겟 핵산 서열이 이중 가닥인 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO는 이중 가닥 타겟 핵산 중 한 가닥에 혼성화되고, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림에 PTO가 위치한다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO가 혼성화된 타겟 핵산 가닥의 부위와 비교하여 3'-방향에 있는 특정 부위에 혼성화된다.
타겟 핵산 서열에 혼성화된 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 PTO 절단의 유도는 두 가지 방식으로 달성될 수 있다: (ⅰ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도; 및 (ⅱ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-의존적 절단 유도.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 PTO의 절단을 유도할 정도로 PTO에 근접해 있는 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 결합한 상기 효소는 연장 반응 없이도 PTO를 절단한다. 반면에, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO로부터 이격되어 있는 경우, 중합효소 활성을 갖는 효소(예컨대, 주형-의존적 중합효소)는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프라이머)의 연장을 촉진시키고, 연장산물에 결합된 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 PTO를 절단한다.
따라서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 두 가지 방식으로 PTO에 대하여 상대적으로 위치할 수 있다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-독립적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO에 근접한 위치에 위치할 수 있다. 택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO로부터 이격된 위치에 위치할 수 있다.
본원에서 지점(positions) 또는 위치(locations)를 언급하면서 사용되는 용어 "근접(adjacent)"은 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3'-타겟팅 부위 바로 가까이에 위치하여 닉(nick)을 형성하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3'-타겟팅 부위로부터 1-30 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드 또는 1-15 뉴클레오타이드 이격되어 위치하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 지점 또는 위치를 언급하면서 사용되는 용어 "이격(distant)"은 연장 반응이 일어나는데 충분할 정도의 어떠한 위치 또는 장소를 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 PTO로부터 이격되어 위치한다.
특정 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다. 업스트림 프라이머는 연장-독립적 절단 유도 또는 연장-의존적 절단에 적합하며, 업스트림 프로브는 연장-독립적 절단 유도에 적합하다.
택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 가질 수 있다. 바람직하게는, 겹치는 서열은 1-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 1-5 뉴클레오타이드, 보다 더욱 바람직하게는 1-3 뉴클레오타이드 길이이다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 갖는 경우, 단계 (b)의 절단 반응에서 3'-타겟팅 부위는 5'-태깅 부위와 함께 부분적으로 절단된다. 또한, 겹치는 서열은 3'-타겟팅 부위의 원하는 부위가 절단되도록 한다.
특정 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통해 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO의 절단을 유도하여 PTO의 5'-태깅 부위 또는 PTO의 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하는 한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 절단 반응에 대한 종래 기술들이 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호, 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호가 본 발명에 적용될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시한다. 상기 다운스트림 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머로도 지칭될 수 있다. 다운스트림 프라이머는 업스트림 프라이머 및 PTO가 혼성화되는 핵산 가닥에 상보적인 핵산 가닥에 혼성화된다. 특히, 다운스트림 프라이머는 PTO가 혼성화된 핵산 가닥의 부위에 상보적인 다른 핵산 가닥의 부위와 비교하여 3'-방향에 있는 특정 부위에 혼성화된다. 다운스트림 프라이머는 PTO와 혼성화되는 타겟 핵산 서열을 추가적으로 생성시켜 타겟 검출 민감도를 향상시킨다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 사용하는 경우, 상기 프라이머들의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소를 추가적으로 사용한다.
바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브), 다운스트림 프라이머 및/또는 PTO의 5'-태깅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는다. DPO 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 종래 프라이머 및 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2006/095981; Chun 등, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).
본 발명의 일 구현예에 따르면, PTO의 3'-타겟팅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는다. 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조는 종래 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2011/028041).
단계 (b): PTO의 절단
이어, PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시킨다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5'-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 PTO 단편을 방출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "PTO의 절단을 위한 조건"은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO를 절단시키는데 충분한 조건, 예컨대 온도, pH, 이온 세기, 버퍼, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 효소를 의미한다. 예를 들어, 5' 뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, PTO의 절단을 위한 조건은 Tris-HCl 버퍼, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.
PTO가 타겟 핵산 서열과 혼성화되는 경우, 그의 3'-타겟팅 부위는 혼성화에 관여하며 그의 5'-태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않고 단일 가닥을 형성한다(도 2 참고). 이와 같이, 단일-가닥 및 이중-가닥 구조 모두를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 절단될 수 있다.
PTO의 절단 부위는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프로브 또는 업스트림 프라이머)의 종류, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 위치 및 절단 조건에 따라 달라진다(미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호 및 제7,381,532호 또는 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호 참고).
5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하는 PTO의 절단 반응을 위하여 많은 종래의 기술들이 사용될 수 있다.
간략하게, 단계 (b)에서 세 가지 절단 부위가 있을 수 있다. 첫 번째, 절단 부위는 PTO의 혼성화 부위(3'-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5'-태깅 부위) 간의 정션 위치(junction site)이다. 두 번째 절단 부위는 PTO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다. 두 번째 절단 부위는 PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부(5'-end part)에 위치할 수 있다. 세 번째 절단 부위는 PTO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 5'-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머가 연장되면서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소에 의하여 PTO의 절단이 시작되는 위치는 PTO 및 타겟 핵산 서열 간의 이중가닥이 시작되는 지점 또는 그 시작 지점으로부터 1-3 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.
이와 관련하여, 본원에서 사용된 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단의 맥락에서 문구 "PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 PTO 단편"은 (i) 5'-태깅 부위, (ii) 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부 및 (iii) 5'-태깅 부위의 일부를 포함하기 위해 사용된다. 문구 "PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편"은 "PTO 단편"으로 축약될 수 있다.
PTO의 5'-태깅 부위의 일부, PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부 및 제1 또는 제2 CTO의 캡처링 부위의 5'-말단 일부와 같이 PTO 또는 제1 또는 제2 CTO의 맥락에서 사용되는 용어 "일부(part)"는 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오타이드이다.
일 구현예에 따르면, 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이며, 특히 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이다.
본 발명에서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 적합한 DNA 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함한다. 가장 바람직하게는, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
택일적으로, 본 발명은 중합 활성이 감소되도록 변형된 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합 효소를 사용할 수 있다.
사용되는 FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 5' 플랩-특이적 뉴클레아제(5' flap-specific nuclease)이다.
본 발명에 적합한 FEN 뉴클레아제는 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 FEN 뉴클레아제를 포함하며, 이는 Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix 및 Archaeaglobus veneficus를 포함한다.
단계 (a)에서 업스트림 프라이머가 사용되는 경우, 상기 PTO의 절단을 위한 조건은 업스트림 프라이머의 연장 반응을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 업스트림 프라이머가 사용되며, 상기 업스트림 프라이머를 연장하기 위하여 주형-의존적 핵산 중합효소가 사용되고, 상기 주형-의존적 중합효소는 상기 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일하다.
또 다른 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 업스트림 프라이머가 사용되며, 상기 업스트림 프라이머를 연장하기 위하여 주형-의존적 핵산 중합효소가 사용되고, 상기 주형-의존적 중합효소는 상기 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 상이하다.
단계 (c): PTO 단편과 제1 CTO의 혼성화
상기 PTO로부터 방출된 단편은 제1 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(제1 CTO)와 혼성화된다.
제1 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO 단편에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하고; 상기 PTO 단편은 상기 제1 CTO의 캡처링 부위와 혼성화된다(도 2 참고).
제1 CTO는 PTO 단편의 연장을 위한 주형으로서의 역할을 한다. 상기 PTO 단편은 프라이머로서 제1 CTO에 혼성화되고, 연장되어 제1 연장 이합체를 형성한다.
제1 CTO의 템플레이팅 부위는 PTO의 5'-태깅 부위와 3'-타겟팅 부위에 비-상보적인 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 또한, 제1 CTO의 템플레이팅 부위는 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 템플레이트 기능을 할 수 있는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다.
제1 CTO의 캡처링 부위는 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 택일적으로, 제1 CTO의 캡처링 부위는 상기 PTO의 5'-태깅 부위에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상술한 바와 같이, PTO의 5'-태깅 부위를 갖는 PTO 단편이 방출되는 경우, 제1 CTO의 캡처링 부위는 상기 5'-태깅 부위에 대한 혼성화 또는 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인되는 것이 바람직하다. 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부를 갖는 PTO 단편이 방출되는 경우, 제1 CTO의 캡처링 부위는 상기 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 대한 혼성화 또는 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인되는 것이 바람직하다. PTO의 5'-태깅 부위의 일부를 갖는 PTO 단편이 방출되는 경우, 제1 CTO의 캡처링 부위는 상기 5'-태깅 부위의 일부에 대한 혼성화 또는 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인되는 것이 바람직하다.
또한, PTO의 절단 부위를 예상함으로써 제1 CTO의 캡처링 부위를 디자인할 수 있다. 예를 들어, 제1 CTO의 캡처링 부위가 5'-태깅 부위에 대한 혼성화 또는 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인하는 경우, 5'-태깅 부위의 일부를 갖는 단편 또는 5'-태깅 부위를 갖는 단편은 제1 CTO의 캡처링 부위와 혼성화된 다음 연장될 수 있다. 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부를 포함하는 PTO 단편이 방출되는 경우, 상기 단편은 5'-태깅 부위에 대한 혼성화 또는 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인된 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화될 수 있으며, 상기 단편의 3'-말단 부위에 미스매치 뉴클레오타이드가 존재함에도 불구하고, 성공적으로 연장될 수 있다. 이것은 프라이머의 3'-말단이 일부 미스매치 뉴클레오타이드(예컨대, 1-4 미스매치 뉴클레오타이드)를 포함함에도 불구하고, 프라이머가 반응 조건에 따라 연장될 수 있기 때문이다.
5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부를 포함하는 PTO 단편이 방출되는 경우, 제1 CTO의 캡처링 부위의 5'-말단 일부는 상기 절단된 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인되어 미스매치 뉴클레오타이드와 관련된 문제를 해결할 수 있다(도 1 참고).
특히, 절단된 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 상보적인 제1 CTO의 캡처링 부위의 5'-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 PTO의 3'-타겟팅 부위 상의 예상되는 절단 부위에 따라 선택될 수 있다. 절단된 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 상보적인 제1 CTO의 캡처링 부위의 5'-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 1-10 뉴클레오타이드, 1-5 뉴클레오타이드, 또는 1-3 뉴클레오타이드이다.
제1 CTO의 3'-말단은 PTO 단편과의 혼성화에 관여하지 않는 추가적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 제1 CTO의 캡처링 부위가 상기 PTO 단편과 안정되게 혼성화되는 한, 제1 CTO의 캡처링 부위는 상기 PTO 단편의 일부(예컨대, PTO 단편의 3'-말단 부위를 포함하는 PTO 단편의 일부)만에 대한 혼성화 또는 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
사용되는 용어 "5'-태깅 부위 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위"는 상술한 바와 같이 제1 CTO의 캡처링 부위의 다양한 디자인 및 조성을 포함하도록 본원에 기술된다.
제1 CTO는 헤어핀 구조를 갖거나 헤어핀 구조를 갖지 않도록 디자인될 수 있다.
제1 CTO의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 제1 CTO는 5-1000 뉴클레오타이드, 5-500 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 7-1000 뉴클레오타이드, 7-500 뉴클레오타이드, 7-300 뉴클레오타이드, 7-100 뉴클레오타이드, 7-80 뉴클레오타이드, 7-60 뉴클레오타이드, 7-40 뉴클레오타이드, 15-1000 뉴클레오타이드, 15-500 뉴클레오타이드, 15-300 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-1000 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드, 30-1000 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-40 뉴클레오타이드의 길이이다.
제1 CTO의 캡처링 부위는 PTO 단편에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 CTO의 캡처링 부위는 5-100 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이이다.
제1 CTO의 템플레이팅 부위는 PTO 단편의 연장에서 템플레이트로서 작용할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 CTO의 템플레이팅 부위는 1-900 뉴클레오타이드, 1-400 뉴클레오타이드, 1-300 뉴클레오타이드, 1-100 뉴클레오타이드, 1-80 뉴클레오타이드, 1-60 뉴클레오타이드, 1-40 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드, 2-900 뉴클레오타이드, 2-400 뉴클레오타이드, 2-300 뉴클레오타이드, 2-100 뉴클레오타이드, 2-80 뉴클레오타이드, 2-60 뉴클레오타이드, 2-40 뉴클레오타이드, 2-20 뉴클레오타이드, 5-900 뉴클레오타이드, 5-400 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 10-900 뉴클레오타이드, 10-400 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 15-900 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이이다.
제1 CTO의 3'-말단은 3'-OH 터미널을 가질 수 있다. 택일적으로, 제1 CTO의 3'-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다. 제1 CTO의 비-연장 블록킹은 종래 방법들에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 제1 CTO의 마지막 뉴클레오타이드의 3'-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올과 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3'-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3'-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
PTO 단편은 제1 CTO와 혼성화되어, 상기 PTO 단편의 연장에 적합한 형태를 제공한다. 비절단 PTO도 그의 5'-태깅 부위를 통하여 제1 CTO의 캡처링 부위와 혼성화하긴 하지만, 그의 3'-타겟팅 부위는 제1 CTO에 혼성화되지 않아, 제1 연장 이합체의 형성이 방지된다.
단계 (c)에서의 혼성화는 단계 (a)에서의 설명을 참조하여 상세하게 설명될 수 있다.
단계 (d): PTO 단편의 연장 및 제1 연장 이합체의 형성
단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시한다. 상기 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 PTO 단편은 연장되어 상기 제1 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제1 연장서열을 포함하는 제1 연장가닥을 생성한다. 이는 제1 연장가닥과 제1 CTO 간에 제1 연장 이합체를 형성한다. 반면, 상기 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 비절단 PTO는 연장되지 않으므로, 제1 연장 이합체가 형성되지 않는다.
단계 (d)에서, 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 PTO 단편은 주형으로서 제1 CTO의 템플레이팅 부위를 따라 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 연장된다.
단계 (d)에서 PTO 단편의 연장 반응과 관련하여 사용된 용어 "제1 연장서열", "제1 연장가닥" 및 "제1 연장 이합체"는 다음의 의미를 갖는다:
본원에서 사용된 용어 "제1 연장서열(extended sequence)"은 단계 (d)에서 PTO 단편으로부터 연장에 의해 새롭게 형성된 서열을 지칭한다. 다시 말하면, 상기 제1 연장서열은 PTO 단편을 제외한 하기 설명할 제1 연장가닥의 부위를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제1 연장가닥(extended strand)"은 상기 PTO 단편과 상기 제1 연장서열을 포괄하는 서열을 지칭한다. 다시 말하면, 상기 제1 연장가닥은 제1 CTO를 제외한 하기 설명할 제1 연장 이합체의 부위를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제1 연장 이합체"는 상기 제1 연장가닥과 상기 제1 CTO 간의 혼성화물 또는 이합체(상보성을 통함)를 의미한다. 다시 말하면, 제1 연장 이합체는 PTO 단편 및 제1 연장서열로 구성된 제1 연장가닥과 제1 CTO 간의 이합체를 의미한다.
용어 "제1 연장서열", "제1 연장가닥" 및 "제1 연장 이합체"는 본원의 다른 곳에 기재된 "제2 연장서열", "제2 연장가닥" 및 "제2 연장 이합체"와 구별되는 것으로 이해되어야 한다.
제1 연장 이합체는 하기 설명될 제2 연장 이합체와 상이한 Tm 값을 갖는다.
제1 연장 이합체의 Tm은 (i) PTO의 서열 및/또는 길이, (ii) 제1 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (iii) PTO 단편의 서열 및/또는 길이 및 제1 CTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "Tm"은 이중 가닥 핵산 분자의 집단의 절반이 단일 가닥 분자로 해리되는 용융 온도를 지칭한다. Tm 값은 혼성화되는 뉴클레오타이드의 길이 및 G/C 함량에 의해 결정된다. Tm 값은 Wallace rule (R.B. Wallace, et al., Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) 및 nearest-neighbor method (SantaLucia J. Jr., et al., Biochemistry, 35:3555-3562(1996)); Sugimoto N., et al., Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996))와 같은 통상적인 방법에 의해 계산될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, Tm 값은 실제 실시되는 반응 조건 하에서의 실제 Tm 값을 지칭한다.
단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 어떠한 핵산 중합효소도 포함되며, 예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 특히, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus and Aquifex aeolieus를 포함한다. 가장 특히, 주형-의존적 핵산 중합효소는 Taq 중합효소이다.
일 구현예에 따르면, 주형-의존적 핵산 중합효소는 역전사효소를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 단계 (d)의 주형-의존적 핵산 중합효소는 단계 (b)에서 이용되는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 상이하다.
다른 구현예에 따르면, 단계 (d)의 주형-의존적 핵산 중합효소는 단계 (b)에서 이용되는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일하다.
종합적으로, 단계 (b)에서 이용되는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 단계 (b)에서 업스트림 프라이머를 연장에 사용되는 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (d)에서 사용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 서로 완전히 또는 일부 동일하거나 상이할 수 있다.
단계 (e): 제1 연장가닥과 제2 CTO의 혼성화
상기 단계 (d)에서 생성된 제1 연장가닥을 제2 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(제2 CTO)와 혼성화시킨다.
상기 제1 연장가닥과 제2 CTO 간의 혼성화를 위해, 본 발명의 방법은 상기 단계 (e)를 실시하기 전에 제1 연장 이합체를 변성시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 추가적인 변성 단계 동안, 제1 연장 이합체가 해리되어 제1 연장가닥이 제2 CTO와 접촉할 수 있는 환경이 조성된다. 변성은 열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예컨대, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하는 통상의 기술에 의해 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 변성은 80-105℃의 온도범위에서 가열함으로써 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 문헌[Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)]에 개시되어 있다.
본 발명의 가장 큰 특징은 제1 CTO와 구별되는 제2 CTO를 사용하여 제1 연장 이합체와 구별되는 제2 연장 이합체를 추가적으로 형성시키는 것이다.
본 단계에서 사용되는 제2 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다(도 1 참고). 따라서, 제1 연장가닥은 상기 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된다.
제2 CTO의 캡처링 부위는 제1 연장가닥을 혼성화시키는 역할을 하고, 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 상기 제1 연장가닥을 추가적으로 연장시키는 주형으로서의 역할을 한다.
일 구현예에 따르면, 제2 CTO의 캡처링 부위는 제1 CTO의 템플레이팅 부위의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 제2 CTO의 캡처링 부위는 제1 CTO의 템플레이팅 부위의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 동일한 서열은 제2 CTO의 템플레이팅 부위 및/또는 제1 CTO의 캡처링 부위에 존재하지 않는다. 다시 말하면, 제2 CTO의 템플레이팅 부위 및/또는 제1 CTO의 캡처링 부위는 제1 CTO의 템플레이팅 부위의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다.
용어 "동일한"은 2개의 뉴클레오타이드 서열이 서로 동일한 것을 의미하기 위핸 본원에 사용되며, 용어 "실질적으로 동일한" 및 "완전히 동일한"을 포함한다. 용어 "완전히 동일한"은 2개의 뉴클레오타이드 서열이 어느 뉴클레오타이드의 예외 없이 동일한 것을 의미하는 반면, 용어 "실질적으로 동일한"은 2개의 뉴클레오타이드 서열이 일부 상이한 뉴클레오타이드(예컨대, 1-10, 1-7, 1-5 및 1-3 뉴클레오타이드)를 갖는 유사한 것을 의미한다. 용어 "실질적으로 동일한"은 또한 이러한 상이한 뉴클레오타이드가 제1 연장가닥, 특히 제1 연장서열 및 제2 CTO의 캡처링 부위 간의 혼성화를 방해하지 않는 정도로 여러 상이한 뉴클레오타이드가 존재한다는 것을 의미한다. 용어 "동일한"은 또한 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 적어도 5, 6, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 뉴클레오타이드가 동일하다는 것을 의미한다.
제1 CTO와 제2 CTO의 특정 부위 간의 이러한 서열 동일성 또는 차이는 제1 CTO와 제2 CTO 간의 구별을 허용한다.
본원에서 사용된 제1 CTO는 PTO 단편에 혼성화하여 이를 연장시키는 역할을 하는 반면, 제2 CTO는 제1 연장가닥에 혼성화하여 이를 연장시키는 역할을 한다. 따라서, 제1 CTO는 제2 CTO와 구별된다.
본원에서 사용된 제2 CTO의 캡처링 부위는 다음과 같이 제1 연장가닥의 다양한 부분과 혼성화되도록 디자인될 수 있다:
(i) 제1 구현예: 제2 CTO와 전체 제1 연장가닥의 혼성화
제1 구현예에서, 제2 CTO의 캡처링 부위는 PTO 단편 및 제1 연장서열로 구성되는 전체 제1 연장가닥과 혼성화된다. 이를 위해, 제2 CTO의 캡처링 부위는 상기 전체 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다.
제1 구현예에 따르면, PTO 단편은 제1 CTO 및 제2 CTO 모두에 혼성화될 수 있으므로 제1 연장 이합체 및 제2 연장 이합체의 형성에 관여할 수 있다.
상기 제1 구현예는 제1 연장가닥이 제2 CTO에 혼성화되어 제2 연장 이합체를 생성하는 과정을 포함하므로, 제1 구현예는 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해될 것이다.
제2 CTO의 캡처링 부위는 전체 PTO 단편의 혼성화를 허용하지만 그의 연장을 허용하지 않는(예를 들어, PTO 단편의 3'-말단 부분과 미스매치된 뉴클레오타이드(들)을 혼입시킴으로써) 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 디자인될 수 있다.
(ii) 제2 구현예: 제2 CTO와 제1 연장가닥의 일부(PTO 단편의 일부 포함)의 혼성화
제2 구현예에서, 제2 CTO의 캡처링 부위는 PTO 단편의 부분 및 전체 제1 연장서열로 구성되는 제1 연장가닥의 일부와 혼성화된다. 이를 위해, 제2 CTO의 캡처링 부위는 상기 PTO 단편의 부분 및 전체 제1 연장서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다.
제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 "PTO 단편의 부분"은 특히 PTO 단편의 3'-말단에 있는 부분을 가리킨다. 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 PTO 단편의 부분의 길이에 따라, 상기 제2 CTO의 캡처링 부위는 PTO 단편 자체와 추가적으로 혼성화되거나 혼성화되지 않을 수 있다.
일 예로서, 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 PTO 단편의 부분의 길이가 PTO 단편 자체가 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되기에 충분히 긴 경우, 전술한 제1 구현예과 마찬가지로 PTO 단편이 제2 CTO에 혼성화하여 제2 연장 이합체를 형성하는데 관여할 수 있다.
다른 예로서, 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 PTO 단편의 부분의 길이가 PTO 단편 자체가 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되기에 충분하지 않은 경우, 전술한 제1 구현예와 달리 PTO 단편이 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화하여 제2 연장 이합체를 형성하는데 관여할 수 없다.
제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 PTO 단편의 부분의 길이는, 예를 들어 1 뉴클레오타이드 이상, 2 뉴클레오타이드 이상, 3 뉴클레오타이드 이상 또는 4 뉴클레오타이드 이상일 수 있다. 또한, 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 PTO 단편의 부분의 길이는, 예를 들어 12 뉴클레오타이드 이하, 10 뉴클레오타이드 이하, 8 뉴클레오타이드 이하 또는 6 뉴클레오타이드 이하일 수 있다.
(iii) 제3 구현예: 제2 CTO와 제1 연장가닥 일부(PTO 단편 제외)의 혼성화
제3 구현예에 따르면, 제2 CTO의 캡처링 부위는 제1 연장서열만으로 구성되는 제1 연장가닥의 일부와 혼성화된다. 이를 위해, 제2 CTO의 캡처링 부위는 상기 전체 제1 연장서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다.
제3 구현예에 따르면, PTO 단편은 제1 CTO에만 혼성화되어 제1 연장 이합체를 형성시키며, 상기 제1 연장 이합체를 구성하는 제1 연장가닥은 제2 CTO에 혼성화되어 제2 연장 이합체를 형성시킨다. 타겟-의존적 방식으로 생성된 PTO 단편이 전부 제1 연장가닥을 형성하는데 사용되고, 상기 생성된 제1 연장가닥이 전부 제2 연장 이합체를 형성하는데 사용되며, 이에 따라 제2 연장 이합체로부터의 시그널은 손실없이 제공될 수 있다.
(iv) 제4 구현예: 제2 CTO와 제1 연장가닥 일부(제1 연장서열의 일부)의 혼성화
제4 구현예에 따르면, 제2 CTO의 캡처링 부위는 제1 연장서열의 일부로만 구성되는 제1 연장가닥의 일부와 혼성화된다. 이를 위해, 제2 CTO의 캡처링 부위는 상기 제1 연장서열의 일부에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다.
제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 "제1 연장서열의 일부"는 제1 연장서열의 3'-말단 부분을 포함한다. 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 제1 연장서열의 부분의 길이는, 예를 들어 5 뉴클레오타이드, 6 뉴클레오타이드, 7 뉴클레오타이드, 8 뉴클레오타이드, 9 뉴클레오타이드, 10 뉴클레오타이드, 11 뉴클레오타이드, 12 뉴클레오타이드, 13 뉴클레오타이드, 14 뉴클레오타이드, 15 뉴클레오타이드, 20 뉴클레오타이드, 25 뉴클레오타이드, 30 뉴클레오타이드 또는 그 이상일 수 있다.
제4 구현예에 따르면, PTO 단편은 제1 CTO에만 혼성화되어 제1 연장 이합체를 형성시키며, 상기 제1 연장 이합체를 구성하는 제1 연장가닥은 제2 CTO에 혼성화되어 제2 연장 이합체를 형성시킨다. 타겟-의존적 방식으로 생성된 PTO 단편이 전부 제1 연장가닥을 형성하는데 사용되고, 상기 생성된 제1 연장가닥이 전부 제2 연장 이합체를 형성하는데 사용되며, 이에 따라 제2 연장 이합체로부터의 시그널은 손실없이 제공될 수 있다.
전술한 바와 같이, 제2 CTO의 캡처링 부위는 구현예 1~4 중 어느 하나를 위해 의도된 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
제2 CTO에 혼성화된 제1 연장가닥은 단계 (f)에서 추가로 연장되므로, 제2 CTO의 캡처링 부위는 제1 연장가닥의 3'-말단 부분과 혼성화될 필요가 있다. 일 구현예에 따르면, 제2 CTO의 캡처링 부위는 그의 5'-말단에 (i) 최소한 제1 연장가닥의 3' 첫 번째 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드; (ii) 최소한 제1 연장가닥의 3' 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드; 또는 (iii) 최소한 제1 연장가닥의 3' 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다.
일 구현예에 따르면, 상기 제2 CTO의 캡처링 부위는 상기 PTO 단편에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 특정 구현예에 따르면, 제2 CTO의 캡처링 부위는 전체 PTO 단편에 혼성화하지 않는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 다시 말하면, 상기 제2 CTO의 캡처링 부위는 상기 PTO 단편의 일부 및 제1 연장서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 전체 제1 연장서열(상기 PTO 단편 제외)과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제2 CTO의 캡처링 부위는 제1 연장서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다시 말하면, 제2 CTO의 캡처링 부위는 제1 연장서열의 전체 또는 일부에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한, 제2 CTO의 캡처링 부위는 본 발명의 방법에 사용된 타겟 핵산 서열 및 올리고뉴클레오타이드(예컨대, PTO의 3'-타겟팅 부위, 제1 CTO의 캡처링 부위, 및 제1 CTO의 태깅 부위)에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
제2 CTO의 템플레이팅 부위는 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 따라서, 제1 연장가닥은 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 혼성화되지 않는다. 일 구현예에서, 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 제1 연장가닥에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 따라서 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 제1 연장가닥에 혼성화되지 않는다.
추가적으로, 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 본 발명의 방법에 사용된 타겟 핵산 서열 및 올리고뉴클레오타이드(예컨대, PTO의 5'-태깅 부위(또는 PTO 단편), PTO의 3'-타겟팅 부위, 제1 CTO의 캡처링 부위, 제1 CTO의 태깅 부위)에 대해 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 따라서, 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 타겟 핵산 서열 및 올리고뉴클레오타이드에 혼성화되지 않는다.
제2 CTO의 템플레이팅 부위는 전술한 부위에 혼성화되지 않는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 또한, 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 제1 연장가닥의 추가 연장을 위한 주형으로서의 기능을 할 수 있는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다.
제2 CTO의 3'-말단은 제1 연장가닥과의 혼성화에 관여하지 않는 추가적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
제2 CTO는 헤어핀 구조를 갖거나 헤어핀 구조를 갖지 않도록 디자인될 수 있다.
제2 CTO의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 제2 CTO는 5-1000 뉴클레오타이드, 5-500 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 7-1000 뉴클레오타이드, 7-500 뉴클레오타이드, 7-300 뉴클레오타이드, 7-100 뉴클레오타이드, 7-80 뉴클레오타이드, 7-60 뉴클레오타이드, 7-40 뉴클레오타이드, 15-1000 뉴클레오타이드, 15-500 뉴클레오타이드, 15-300 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-1000 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드, 30-1000 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-40 뉴클레오타이드 길이이다.
제2 CTO의 캡처링 부위는 제1 연장가닥에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 CTO의 캡처링 부위는 5-100 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드 길이이다.
제2 CTO의 템플레이팅 부위는 제1 연장가닥의 연장에서 주형으로서의 기능을 할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 1-900 뉴클레오타이드, 1-400 뉴클레오타이드, 1-300 뉴클레오타이드, 1-100 뉴클레오타이드, 1-80 뉴클레오타이드, 1-60 뉴클레오타이드, 1-40 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드, 2-900 뉴클레오타이드, 2-400 뉴클레오타이드, 2-300 뉴클레오타이드, 2-100 뉴클레오타이드, 2-80 뉴클레오타이드, 2-60 뉴클레오타이드, 2-40 뉴클레오타이드, 2-20 뉴클레오타이드, 5-900 뉴클레오타이드, 5-400 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 10-900 뉴클레오타이드, 10-400 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 15-900 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드 길이이다.
제2 CTO의 3'-말단은 3'-OH 말단을 가질 수 있다. 택일적으로, 제2 CTO의 3'-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다. 제2 CTO의 비-연장 블록킹은 종래 방법들에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 제1 CTO의 마지막 뉴클레오타이드의 3'-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올과 같은 화학적 모이어티를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3'-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3'-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
본원에서 사용되는 제2 CTO는 그 디자인 방식에 따라 비절단 PTO와 혼성화될 수 있다. 그럼에도 불구하고, PTO의 3'-타겟팅 부위는 제2 CTO에 혼성화 되지 않아, 제2 연장 이합체의 형성이 방지된다.
본 발명의 방법에서, 제1 CTO는 제1 연장가닥과의 혼성화에 대해 제2 CTO와 경쟁하여, 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화를 방해할 수 있다. 즉, 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화는 제1 연장가닥 및 제1 CTO 간의 제1 연장 이합체의 형성에 의해 방해받을 수 있다. 따라서, 상기 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화 방해를 최소화하기 위해, 상기 단계 (e)는 제1 연장가닥과 제2 CTO의 혼성화에 유리한 조건 하에서 실시될 수 있으며, 이의 세부사항은 PCE-IH 섹션에 기재되어 있다.
단계 (f): 제1 연장가닥의 추가 연장 및 제2 연장 이합체의 형성
단계 (e)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시한다. 상기 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 제1 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제2 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체를 형성한다.
제2 CTO의 캡처링 부위가 PTO 단편과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, 비절단 PTO가 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화될 수 있으나 연장되지 않아 제2 연장 이합체를 형성하지 않고; 제2 CTO의 캡처링 부위가 PTO 단편과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 경우, 비절단 PTO가 제2 CTO에 혼성화되지 않으므로 제2 연장 이합체가 형성되지 않는다.
상기 단계 (f)에서 제1 연장가닥의 연장 반응과 관련하여 사용된 용어 "제2 연장서열", "제2 연장가닥" 및 "제2 연장 이합체"는 다음의 의미를 갖는다:
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제2 연장서열(extended sequence)"은 단계 (f)에서 제1 연장가닥으로부터 추가 연장에 의해 새롭게 형성된 서열을 지칭한다. 다시 말하면, 상기 제2 연장서열은 제1 연장가닥을 제외한 하기 설명할 제2 연장가닥의 부분을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제2 연장가닥(extended strand)"은 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 연장서열을 포괄하는 서열을 지칭한다. 다시 말하면, 상기 제2 연장가닥은 제2 CTO를 제외한 하기 설명할 제2 연장 이합체의 부분을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제2 연장 이합체"는 상기 제2 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화물 또는 이합체(상보성을 통함)를 의미한다. 다시 말하면, 제2 연장 이합체는 PTO 단편, 제1 연장서열 및 제2 연장서열로 구성된 제2 연장가닥과 제2 CTO 간의 이합체를 의미한다.
용어 "제2 연장서열", "제2 연장가닥" 및 "제2 연장 이합체"는 앞서 설명한 "제1 연장서열", "제1 연장가닥" 및 "제1 연장 이합체"와 구별되는 것으로 이해되어야 한다.
일 구현예에 따르면, 제2 연장 이합체는 제1 연장 이합체와 동일하거나 상이한 Tm 값을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 제2 연장 이합체는 제1 연장 이합체보다 높은 Tm 값(예컨대, 2℃ 이상, 5℃ 이상, 10℃ 이상, 15℃ 이상, 또는 20℃ 이상)을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 제2 연장 이합체는 제1 연장 이합체보다 낮은 Tm 값(예컨대, 2℃ 이하, 5℃ 이하, 10℃ 이하, 15℃ 이하, 또는 20℃ 이하)을 갖는다.
제2 연장 이합체의 Tm 값은 (i) 제2 연장가닥의 서열 및/또는 길이, (ii) 제2 CTO의 서열 및/또는 길이, 또는 이의 조합에 의해 조절될 수 있다.
단계 (f)에서 사용되는 주형-의존적 핵산 중합효소에 관한 설명은 단계 (d)의 개시 내용을 참고한다.
단계 (g): 제2 연장가닥의 존재의 검출
마지막으로, 제2 연장가닥의 존재를 검출한다. 상기 제2 연장가닥의 존재는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
단계 (g)는 제2 연장가닥의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 검출함으로써 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "타겟 시그널"은 제2 연장가닥의 존재를 나타낼 수 있는 임의의 시그널을 의미한다. 예를 들어, 타겟 시그널은 표지로부터의 시그널(시그널 발생 또는 소멸), 표지로부터의 시그널의 변화(시그널 증가 또는 감소), 멜팅 커브, 멜팅 패턴 및 멜팅 온도(또는 Tm 값)를 포함한다.
상기 단계 (g)에서의 제2 연장가닥의 존재의 검출은 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다. PTOCE 방법, PCE-SH 방법, PCE-SC 방법, PCE-NG 방법, 또는 PCE-IH를 개시하는 여러 참고문헌들은 다양한 표지 시스템 및 그를 뒷받침하는 작동 원리를 교시하며, 이는 제2 연장 이합체의 검출을 위해 본 방법에 적용될 수 있다.
상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재의 검출은, (i) 미리 정해진 온도에서 시그널을 측정하거나, 또는 (ii) 멜팅 분석 또는 멜팅 후 혼성화 분석에 의해 시그널을 측정함으로써 실시될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서의 검출은 미리 정해진 온도에서 제2 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 측정함으로써 실시된다.
일 예로서, 제2 연장가닥의 존재는 제2 연장 이합체가 그의 이중 가닥 형태를 유지하는 미리 정해진 온도에서 제2 연장 이합체로부터의 타겟 시그널을 측정함으로써 또는 이합체가 그의 이중 가닥 형태를 유지하는 미리 정해진 온도에서 제2 연장 이합체 및 또 다른 올리고뉴클레오타이드 간의 또 다른 이합체로부터의 타겟 시그널을 측정함으로써 검출된다.
일 구현예에 따르면, 제2 연장 이합체는 혼성화물이 부분적으로 해리되는 온도에서 검출될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 제2 연장 이합체는 비타겟 시그널을 제거하기 위해 혼성화물을 해리하는데 충분한 온도에서 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서의 검출은 멜팅 분석 또는 멜팅 후 혼성화 분석에 의해 제2 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 측정함으로써 실시된다.
본원에서 사용된 용어 "멜팅 분석(melting analysis)"은 이합체를 멜팅시켜 제2 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 얻는 방법을 의미하며, 멜팅 커브 분석, 멜팅 패턴 분석, 및 멜팅 피크 분석을 포함한다. 특히, 멜팅 분석은 멜팅 커브 분석이다.
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 검출은 멜팅 분석에 의해 실시되며, 여기서 제2 연장 이합체는 멜팅되어 제2 연장가닥을 나타내는 타겟 시그널을 제공한다.
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 검출은 멜팅 분석에서 수행되며, 여기서 제2 연장가닥과 또 다른 올리고뉴클레오타이드 간의 또 다른 이합체가 멜팅되어 제2 연장가닥의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "멜팅 후 혼성화 분석"은 제2 연장 이합체를 멜팅한 후 멜팅된 제2 연장 이합체를 혼성화하여 제2 연장 이합체를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 방법을 의미한다. 특히, 멜팅 후 혼성화 분석은 멜팅 커브 분석이다.
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 검출은 멜팅 후 혼성화 분석을 통해 실시된다. 특히, 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 검출은, 제2 연장 이합체를 멜팅시키고 결과물을 특정 온도 범위에서 혼성화하여 제2 연장가닥을 나타내는 타겟 시그널을 제공함으로써 수행된다.
멜팅 커브 또는 혼성화 커브는, 예컨대, 미국 특허 제6,174,670호 및 제5,789,167호, Drobyshev 등, Gene 188:45(1997); Kochinsky 및 Mirzabekov, Human Mutation 19:343(2002); Livehits 등, J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); 및 Howell 등, Nature Biotechnology 17:87(1999)에서 설명하는 바와 같은 종래의 기술들에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 혼성화 엄격도(stringency)의 파라미터에 대한 아웃풋 시그널(output signal) 변화의 그래픽 플롯(graphic plot) 또는 디스플레이(display)로 구성될 수 있다. 아웃풋 시그널은 혼성화 파라미터에 대하여 직접적으로 플롯팅을 할 수 있다. 전형적으로, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는, 예를 들어, Y-축에는 이합체 구조의 정도(즉, 혼성화 정도)를 나타내는 아웃풋 시그널, 예를 들면 형광이 플롯팅되고, X-축에는 혼성화 파라미터가 플롯팅될 것이다.
형광 대 온도의 1차 도함수(derivative)의 플롯, 즉, 형광 대 온도(dF/dT 대 T) 또는 (-dF/dT 대 T)에서 변화율 플롯은 멜팅 피크를 제공한다.
전술한 바와 같이, 미리 정해진 온도에서 또는 멜팅 분석 또는 멜팅 후 혼성화 분석에 의한 제2 연장 이합체의 검출은 다음과 같은 다양한 방식으로 실시될 수 있다:
A. 제2 연장 이합체의 검출;
B. 제2 연장 이합체의 절단의 검출;
C. 제2 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드(SO) 간의 혼성화물의 검출;
D. 제2 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드(SO) 간의 혼성화물의 절단의 검출;
E. 제2 CTO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드(HO) 간의 혼성화물의 검출; 및
F. 제2 연장가닥과 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드(IO) 간의 혼성화물의 검출.
상기 분석 방법을 하기에 상세히 설명한다.
A. 제2 연장 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서의 검출은 제2 연장가닥과 제2 CTO 간의 제2 연장 이합체로부터의 시그널을 이용하는 PTOCE 분석을 기반으로 실시된다(참조 WO 2012/096523).
일 구현예에 따르면, 제2 연장가닥 및 제2 CTO는 상기 단계 (f)에서 제2 연장 이합체를 형성하며; 상기 제2 연장 이합체는 (i) 상기 PTO 단편 및/또는 제2 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장 반응 동안 상기 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장 반응 동안 상기 제1 연장갇가 및/또는 제2 연장가닥 내에 삽입된 표지 및 상기 제2 CTO에 연결된 최소 하나의 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 제2 연장가닥의 존재는 상기 제2 연장 이합체로부터의 시그널을 측정함으로써 검출된다.
상기 PTOCE 분석 기반의 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) PTO 단편 및/또는 제2 CTO에 연결된 최소 하나의 표지
일 구현예에 따르면, 타겟 시그널은 PTO 단편 및/또는 제2 CTO에 연결된 최소 하나의 표지에 의하여 제공된다.
상기 표지는 상호작용적 이중표지 및 단일 표지를 포함한다.
(i-1) 상호작용적 이중표지
상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여자 분자) 및 퀀처 분자(수용자 분자)를 포함한다. FRET에서, 에너지 공여자는 형광성이나, 에너지 수용자는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여자는 비-형광성, 예컨대, 크로모포어(chromophore)이고 에너지 수용자는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여자는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용자는 형광성이다. 공여자 분자 및 수용자 분자는 본 발명에서 각각 리포터 분자 및 퀀처 분자로 기술될 수 있다. 상호작용적 이중표지는 "온 접촉-매개된 퀀칭(on contact-mediated quenching)"에 기초한 이중 표지를 포함한다(Salvatore 등., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 및 Johansson 등., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 상기 상호작용적 표지 시스템은 최소 2개 분자들(예컨대, 염료들) 간의 상호작용에 의해 시그널 변화가 유도되는 임의의 표지 시스템을 포함한다.
특히, 제2 연장 이합체의 존재(즉, 타겟 핵산 서열의 존재)를 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의하여 발생되며, 특히 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중표지 시스템)에 의해 발생된다.
구현예 1 (가닥 내 상호작용적-이중표지)
상호작용적 이중표지 시스템의 구현예 1에서, PTO 단편 또는 제2 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며; 상기 단계 (e)에서 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화, 상기 단계 (f)에서 상기 제2 연장가닥과 상기 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체의 형성, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다. 상기 구현예 1은 가닥 내 상호작용적-이중표지로 명명된다.
구현예 1-1 (제2 CTO 상의 가닥 내 상호작용적-이중표지)
구현예 1-1에 따르면, 제2 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며, 상기 단계 (e)에서 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화, 상기 단계 (f)에서 상기 제2 연장가닥과 상기 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체의 형성, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 구현예 1-1에 따르면, 제1 연장가닥과 제2 CTO 간의 혼성화시에, 제2 CTO에 혼성화된 제1 연장가닥의 추가 연장 후 제2 연장 이합체를 형성시에, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화시에, 리포터 분자 및 퀀처 분자간의 구조적 간격의 변화가 야기되어 타겟 시그널이 생성된다.
예를 들어, 제1 연장가닥과 제2 CTO의 캡처링 부위와의 혼성화 전에는, 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 서로 구조적으로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하는데 반해; 상기 단계 (f)에서 제2 CTO에 혼성화된 제1 연장가닥이 추가로 연장되어 제2 연장 이합체가 형성되는 경우에는, 제2 CTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고, 이에 의해 타겟 시그널이 제공된다. 또한, 상기 제2 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 이에 의해 타겟 시그널이 제공되고; 상기 멜팅된 제2 연장 이합체가 다시 혼성화하는 경우 리포터 분자 및 퀀처 분자가 다시 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고, 이에 의해 타겟 시그널이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 근접한다"는 것은 PTO 단편 또는 제2 CTO의 형태적 구조, 예컨대 랜덤 코일(coli) 및 헤어핀 구조에 의해 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 서로 근접하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 이격된다"는 것은 이중 가닥의 형성시 PTO 단편 또는 제2 CTO의 형태적 구조의 변화에 의하여 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 이격되는 것을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 제1 연장가닥과 제2 CTO 간의 혼성화, 제2 연장 이합체의 형성, 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 따라 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되거나 또는 언퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 제2 CTO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 적어도 하나는 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 제2 CTO의 캡처링 부위에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 제2 CTO의 5'-말단 및 3'-말단에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 제2 CTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 5'-말단에 위치하거나 또는 5'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 다른 하나는 제2 CTO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 제2 CTO의 3'-말단에 위치하거나 또는 3'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 다른 하나는 CTO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 80 뉴클레오타이드 이하, 보다 바람직하게는 60 뉴클레오타이드 이하, 보다 더 바람직하게는 30 뉴클레오타이드 이하, 가장 바람직하게는 25 뉴클레오타이드 이하로 이격되어 위치한다. 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 최소 6 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 최소 10 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 최소 15 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
제2 CTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자의 상대적 위치의 설명은 또 다른 올리고뉴클레오타이드 상의 가닥내 상호작용 이중 표지의 위치를 정의하는데 사용될 수 있다.
제2 CTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자의 위치에 따라, 시그널이 생성되는(즉, 시그널 변화가 야기되는) 시점이 달라질 수 있다.
일 예로서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두가 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 위치하고 리포터 분자와 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하기에 충분할 정도로 이격되어 있는 경우, 상기 단계 (f)에서 제2 연장 이합체의 형성은 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공할 수 있다.
다른 예로서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두가 제2 CTO의 캡처링 부위에 위치하고 리포터 분자와 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하기에 충분할 정도로 이격되어 있는 경우, 상기 단계 (e)에서 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (f)에서 제2 연장 이합체의 형성은 상기 시그널을 유지시킨다.
구현예 1-2 (PTO 상의 가닥 내 상호작용적-이중표지)
구현예 1-2에 따르면, PTO 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며, 상기 단계 (e)에서 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 구현예 1-2에서, 제2 연장 이합체로부터 타겟 시그널을 제공하기 위해, 제2 CTO의 캡처링 부위는 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드를 포함하여야 한다.
일 구현예에 따르면, 제1 연장가닥과 제2 CTO 간의 혼성화 또는 멜팅에 따라 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되거나 또는 언퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 PTO 단편의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, PTO 단편 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 5'-말단에 위치하거나 또는 그의 5'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 다른 하나는 PTO 단편의 형태(conformation)에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
상기 구현예 1-2에서, 제2 CTO의 캡처링 부위가 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, 비절단 PTO와 제1 CTO 간의 혼성화물뿐만 아니라 비절단 PTO와 제2 CTO 간의 혼성화물이 형성되어 비-타겟 시그널을 제공할 수 있다. 이 경우, 상기 비절단 PTO와 제1 CTO 간의 혼성화물 및 비절단 PTO와 제2 CTO 간의 혼성화물이 모두 해리되는 온도에서의 시그널의 측정, 또는 제2 연장 이합체 및 상기 혼성화물의 Tm 값의 차이는 제2 연장 이합체의 타겟 시그널과 상기 혼성화물의 비-타겟 시그널을 구별할 수 있게 해 준다.
구현예 2 (가닥간 상호작용적-이중표지)
구현예 2에 따르면, PTO 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 제2 CTO는 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 가지며, 상기 단계 (e)에서 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
예를 들어, PTO 단편이 퀀처 분자를 갖고 제2 CTO가 리포터 분자를 갖는 경우, 상기 제1 연장가닥이 제2 CTO에 혼성화되기 전에는 제2 CTO 상의 리포터 분자로부터의 시그널은 PTO 단편 상의 퀀처 분자에 의해 퀀칭되지 않는 반면, 상기 단계 (e)에서 제1 연장가닥이 제2 CTO에 혼성화되는 경우, 제2 CTO에 연결된 리포터 분자로부터의 시그널이 PTO 단편에 연결된 퀀처 분자에 의하여 퀀칭되어 타겟 시그널을 제공한다. 또한, 상기 단계 (f)에서 상기 제2 연장가닥과 상기 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체의 형성은 상기 시그널을 유지시킨다. 이후, 상기 제2 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 타겟 시그널이 제공된다.
퀀처 분자에 의하여 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 PTO 단편 및 제2 CTO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다. 제1 연장가닥과 제2 CTO 간의 혼성화시에 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하는 것을 용이하게 하기 위해, 퀀처 분자와 리포터 분자는 서로 근접하여 위치하는 것이 바람직하다.
일 구현예에 따르면, PTO 단편 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 5'-태깅 부위의 5'-말단에 위치한다.
일 구현예에 따르면, PTO 단편 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 5'-태깅 부위의 3'-말단 또는 그 근처에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 제2 CTO 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 제2 CTO의 캡처링 부위에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 제2 CTO 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 3'-말단에 위치하거나 그의 3'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
구현예 2에서, 제2 CTO의 캡처링 부위가 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 제1 연장가닥과 제2 CTO의 혼성화시 리포터 분자와 퀀처 분자가 근접한 경우, 비절단 PTO와 제2 CTO 간의 혼성화물이 형성되어 비-타겟 시그널을 제공할 수 있다. 이 경우, 상기 비절단 PTO와 제2 CTO 간의 혼성화물이 해리되는 온도에서의 시그널의 측정, 또는 제2 연장 이합체 및 상기 혼성화물의 Tm 값의 차이는 제2 연장 이합체의 타겟 시그널과 상기 혼성화물의 비-타겟 시그널을 구별할 수 있게 해 준다.
본 발명에서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™(506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y(580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™(670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위의 최대 발광 파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같이 다양한 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
본 발명에서, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비-형광 블랙 퀀처 분자가 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 이들의 예는 BHQ 및 DABCYL이다.
제2 CTO에 채택되는 FRET 표지에서, 리포터는 FRET의 공여자를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용자)를 포함한다. 예를 들어, 플루오레세인 염료(fluorescein dye)는 리포터로 사용되고 로다민 염료(rhodamine dye)는 퀀처로 사용된다.
상기 표지는 종래의 방법에 의해 제2 CTO 또는 PTO(특히, PTO의 5'-태깅 부위)에 연결될 수 있다. 특히, 상기 표지는 탄소 원자를 포함하는 스페이서(예컨대, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 통해 제2 CTO 또는 PTO(특히, PTO의 5'-태깅 부위)에 연결된다.
(i-2) 단일 표지
본 발명은 또한 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 단일 표지 시스템을 이용하여 우수하게 실시된다.
일 구현예에 따르면, PTO 단편 또는 제2 CTO는 단일 표지를 가지며, 상기 단계 (e)에서 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화, 상기 단계 (f)에서 상기 제2 연장가닥과 상기 제2 CTO 간에 연장 이합체의 형성, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
구현예 1 (제2 CTO 상의 단일 표지)
구현예 1에 따르면, 제2 CTO는 단일 표지를 가지며, 상기 단계 (e)에서 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화, 상기 단계 (f)에서 상기 제2 연장가닥과 상기 제2 CTO 간에 연장 이합체의 형성, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 구현예 1에서, 제1 연장가닥과 제2 CTO 간의 혼성화시에, 제2 CTO에 혼성화된 제1 연장가닥의 추가 연장시에, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화시에, 단일 형광 표지로부터 형광 강도가 증가하게 되고, 이에 의해 타겟 시그널이 제공된다.
일 구현예에 따르면, 제1 연장가닥과 제2 CTO 간의 혼성화, 제2 연장 이합체의 형성, 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 따라 단일 표지로부터의 시그널 강도가 변화되는 한, 상기 단일 표지는 제2 CTO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 CTO의 템플레이팅 부위 또는 캡처링 부위에 위치한다.
구현예 2 (PTO 상의 단일 표지)
구현예 2에 따르면, PTO 단편은 단일 표지를 가지며, 상기 단계 (e)에서 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 구현예 2에서, 제2 연장 이합체로부터 타겟 시그널을 제공하기 위해, 제2 CTO의 캡처링 부위는 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드를 포함하여야 한다.
일 구현예에 따르면, 제1 연장가닥과 제2 CTO 간의 혼성화, 제2 연장 이합체의 형성, 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 따라 단일 표지로부터의 시그널 강도가 변화되는 한, 상기 단일 표지는 PTO 단편의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
본원에서 사용되는 단일 표지는 그 표지가 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 시그널을 제공할 수 있어야 한다. 상기 단일 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학 표지 및 금속 표지를 포함한다. 특히, 상기 단일 표지는 형광 표지를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 단일 형광 표지의 종류 및 바람직한 결합 사이트는 미국 특허 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시되어 있으며, 그의 교시 사항은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 특히, 상기 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다. 표지된 뉴클레오타이드 잔기는 특히 5'-말단 또는 3'-말단보다 올리고뉴클레오타이드 내의 내부 뉴클레오타이드 잔기에 위치한다.
본 발명에서 유용한 단일 형광 표지는 상기 서술한 리포터 및 퀀처 분자에 대한 설명을 참조하여 설명할 수 있다.
특히, 고상에서의 본 발명이 단일 표지를 이용하여 실시되는 경우, 일반적인 형광 표지를 이용할 수 있으며, 단일 표지가 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 강도의 형광 시그널을 제공할 수 있는 특정 형광 표지를 요구하지는 않는다. 고상 기질에서 제공되는 타겟 시그널이 측정된다.
고상 기질 상에 고정된 제2 CTO를 이용하는 경우, 화학 표지(예컨대, 바이오틴) 또는 효소 표지(예컨대, 알카라인 포스페이트, 퍼록시다제, β-갈락토시다제 및 β-글루코시다제)를 이용할 수 있다.
"PTO 단편 및/또는 제2 CTO에 연결된 표지"를 이용하는 표지 시스템에서, 비절단 PTO와 제1 CTO 간의 혼성화물 또는 비절단 PTO와 제2 CTO 간의 혼성화물이 형성되는 경우에 상기 표지는 상기 혼성화물이 단계 (g)에서 비-타겟 시그널을 제공하지 않는 범위 내에 위치할 수 있다. 택일적으로, 비절단 PTO와 제1 CTO 간의 혼성화물 또는 비절단 PTO와 제2 CTO 간의 혼성화물이 형성되는 경우에 상기 표지는 상기 혼성화물이 단계 (g)에서 비-타겟 시그널을 제공하는 범위 내에 위치할 수 있고; 제2 연장 이합체의 Tm 값은 비절단 PTO와 제1 CTO 간의 혼성화물 또는 비절단 PTO와 제2 CTO 간의 혼성화물의 Tm 값보다 높다.
특히, 상기 표지가 비절단 PTO와 제1 CTO 간의 혼성화물 또는 비절단 PTO와 제2 CTO 간의 혼성화물이 비-타겟 시그널을 제공하지 않는 범위 내에 위치하는 경우, 상기 혼성화물의 Tm 값을 포함하고 범위는 타겟 핵산 서열 검출을 위한 제2 연장 이합체의 Tm 값을 선택하는 데 이용될 수 있다.
(ii) 연장 반응 동안 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥에 삽입된 표지
본 발명은 제2 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하기 위하여, 단계 (d)의 연장 반응 동안 제1 연장가닥 내에 삽입된 표지를 이용할 수 있다.
택일적으로, 본 발명은 제2 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하기 위하여, 단계 (f)의 연장 반응 동안 제2 연장가닥 내에 삽입된 표지를 이용할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 제1 연장가닥 내로 삽입된 표지 및 제2 연장가닥 내로 삽입된 표지 모두를 이용한다.
문구 "제1 연장가닥 내로 삽입된 표지"는 PTO 단편 상에 존재하지 않으나 PTO 단편의 연장 동안 삽입되는 표지를 의미하기 위해 본원에 사용된다.
문구 "제2 연장가닥 내로 삽입된 표지"는 제1 연장가닥 상에 존재하지 않지만 제1 연장가닥의 추가 연장 동안 삽입되는 표지를 의미하기 위해 본원에 사용된다.
문구 "제2 연장 이합체 내로 삽입된 표지"는 PTO 단편의 연장 동안 또는 제1 연장가닥의 추가 연장 동안 삽입되며 따라서 생성되는 제2 연장 이합체 상에 존재하는 표지를 의미하기 위해 본원에 사용된다.
PTO 단편 또는 제2 CTO는 표지를 갖지 않지만, 연장 반응 동안 제1 연장 이합체 및/또는 제2 연장 이합체 내에 삽입된 표지는 성공적으로 제2 연장 이합체를 표지시킬 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단계 (d) 또는 (f)의 연장 반응은 단일 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 실시되며, 이에 의해 상기 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥 내에 단일 표지가 삽입되고; 상기 제1 연장가닥과 제2 CTO와의 혼성화, 단계 (f)에서 상기 제2 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 제2 연장 이합체의 형성, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
표지 삽입에 의한 시그널 발생 방법에 대한 세부사항은 전술한 바와 같은 PTO 단편에 대한 설명에서 발견될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기(non-natural base)를 가지며, 제1 CTO 또는 제2 CTO는 상기 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 특히, 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제1 CTO 또는 제2 CTO의 템플레이팅 부위의 어떠한 사이트에도 위치한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비-자연 염기"는 수소-결합 염기 쌍을 형성할 수 있는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연 염기의 유도체를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "비-자연 염기"는 모화합물(mother compound)로서 자연 염기와 상이한 염기 쌍 패턴을 갖는 염기를 포함하며, 예컨대, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호 및 제6,037,120호에 기재되어 있다. 비-자연 염기들 간의 염기 쌍은 자연 염기와 유사하게 둘 또는 세 개의 수소 결합을 포함한다. 또한, 비-자연 염기들 간의 염기 쌍은 특정한 방식으로도 형성된다.
비-자연 염기의 특정한 예는 염기 쌍 조합된 다음 염기들을 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J 및 M/N (미국특허 제7,422,850호 참조).
예를 들어, 제1 비-자연 염기(예컨대, iso-dG)에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는 제2 CTO에 제1 연장가닥이 혼성화된다. 단일 형광 표지로 표지된 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 연장이 실시되어, 제2 연장 이합체를 형성한다. 연장 반응에서, 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 맞은편 사이트에 삽입된다.
제2 연장 이합체로부터 나오는 형광 시그널은 고정화된 제2 CTO가 있는 고상 기질의 스팟 상에서 검출될 수 있다. 또한, 제2 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 형광 표지를 갖는 가닥은 방출되고, 스팟 상에서는 더 이상 형광 시그널이 검출되지 않는다. 따라서, 시그널의 변화가 제2 연장 이합체의 멜팅에 의하여 스팟 상에서 제공될 수 있다. 즉, 타겟 시그널이 제공되어 단계 (e)에서 제2 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
사용되는 단일 표지의 종류 및 특징은 전술한 바와 같은 "PTO 단편 및/또는 제2 CTO에 연결된 표지"를 이용하는 표지 시스템에 대한 섹션을 참조한다.
(iii) 연장 반응 동안 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥 내에 삽입된 표지 및 PTO 단편 또는 제2 CTO에 연결된 최소 하나의 표지
본 발명은 연장 반응 동안 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥 내에 삽입된 표지 및 PTO 단편 및/또는 제2 CTO에 연결된 표지의 조합을 이용하는 표지 시스템을 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 제2 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 단계 (d)의 연장 반응은 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 제1 연장서열 내에 뉴클레오타이드 상의 표지가 삽입되고; 상기 단계 (e)에서 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화, 또는 상기 제1 연장가닥을 함유하는 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
일 구현예에서, 제2 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 단계 (f)의 연장 반응은 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 제2 연장서열에 표지가 삽입되고; 상기 단계 (f)에서 상기 제2 연장가닥과 상기 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체의 형성, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
특히, 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가지며, 제2 CTO는 상기 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다.
제2 CTO 상의 표지의 부위 및 삽입되는 표지의 삽입 부위는, 제2 연장 이합체의 혼성화 및 멜팅에서 상기 2개의 표지가 시그널의 변화를 유도하는 상호작용적 이중표지로서 작용하는 범위 내에서 결정된다.
특히, 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 리포터 또는 퀀처 분자 및 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다.
(ⅳ) 인터컬레이팅 표지(Intercalating label)
본 발명은 제2 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 인터컬레이팅 표지를 사용할 수 있다. 샘플에 존재하는 이중-가닥 핵산 분자가 시그널을 발생시킬 수 있기 때문에, 고정화된 제2 CTO를 이용하는 고상 반응에서는 인터컬레이팅 표지가 보다 유용하다.
일 구현예에서, 타겟 시그널은 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 제공되며, 상기 단계 (e)에서 상기 제1 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 혼성화, 상기 단계 (f)에서 상기 제2 연장가닥과 상기 제2 CTO 간의 제2 연장 이합체의 형성, 또는 상기 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 인터컬레이팅 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 표지의 예는, SYBR™ Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTO™ 43, SYTO™ 44, SYTO™ 45, SYTOX™ Blue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PRO™ 1, TO-PRO™ 1, SYTO™ 11, SYTO™ 13, SYTO™ 15, SYTO™ 16, SYTO™ 20, SYTO™ 23, TOTO™-3, YOYO™ 3, GelStar™ 및 티아졸 오렌지를 포함한다. 인터컬레이팅 염료는 이중-가닥 핵산 분자 내에 특이적으로 끼어들어가서 시그널을 발생시킨다.
본 구현예는 멜팅 분석을 이용하는 다른 구현예들에도 적용할 수 있다.
일 구현예에서, 제2 연장가닥 또는 제2 CTO는 FRET(fluorescence resonance energy transfer)의 수용자를 포함하고 검출은 인터컬레이팅 염료의 존재하에 실시된다. 단계 (f)에서 제2 연장가닥과 제2 CTO 간의 제2 연장 이합체의 형성, 또는 제2 연장 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 수용자로부터 시그널의 변화를 유도하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
B. 제2 연장 이합체의 절단의 발생의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서의 검출은 제2 연장가닥과 제2 CTO 간의 제2 연장 이합체의 절단으로부터 발생되는 시그널을 이용하는 PCEC 분석에 기초하여 실시된다(참조 WO 2012/134195).
일 구현예에 따르면, 제2 연장 이합체는 표지 및 핵산 절단효소에 의하여 절단되는 절단 부위를 포함하고, 상기 제2 연장 이합체는 상기 절단 부위에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재는 상기 제2 연장 이합체를 핵산 절단효소에 의하여 절단시키고, 상기 절단에 의해 발생된 시그널을 측정함으로써 검출된다.
제2 연장 이합체의 형성시에, 핵산 절단효소에 대한 절단 부위가 생성된다. 이합체 구조에 특이적으로 작용하는 다수의 핵산 절단효소는 당업자에게 알려져 있다.
일 구현예에 따르면, 핵산 절단효소는 제한효소이며, 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 제한 효소에 의해 인식되는 서열을 포함하고 단계 (f)에서 제2 연장 이합체의 형성은 제한 효소의 절단 부위를 생성한다. 일 구현예에 따르면, 핵산 절단효소는 리보뉴클레아제이며, 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 RNA 서열을 포함하고 단계 (f)에서 제2 연장 이합체의 형성은 DNA-RNA 혼성화 이합체를 생성하여 리보뉴클레아제의 절단 부위를 생성한다. 일 구현예에 따르면, 핵산 분해효소는 5' → 3' 엑소뉴클레아제이고 단계 (f)에서 연장 이합체의 형성은 CTO 상에 5' → 3' 엑소뉴클레아제의 절단 부위를 생성한다.
PTO 단편, 제1 연장가닥 및/또는 제2 CTO는 핵산 절단효소에 대한 원하는 종류의 절단 부위가 도입되도록 설계되고 제작된다.
PCEC 분석에서, 검출가능한 시그널은 (i) PTO 단편 및/또는 제2 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 연장 반응 동안 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥에 삽입된 표지, (iii) 연장 반응 동안 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥에 삽입된 표지 및 제2 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지에 의해 제공될 수 있다.
PCEC 분석의 원리에 관한 세부사항은 WO 2012/134195호를 참조한다. 상기 PCEC 분석 기반의 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(ⅰ) 단일 표지
본 발명은 단일 표지를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 제2 연장 이합체 절단 발생에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
단일 표지의 종류 및 특성은 전술한 PTOCE 분석 섹션을 참조한다.
일 구현예에 따르면, 제2 CTO는 단일 표지를 갖고, 제2 연장 이합체의 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 제2 연장 이합체가 절단되기 이전의 단일 표지로부터 나오는 시그널은 제2 연장 이합체가 절단된 이후의 단일 표지로부터 나오는 시그널과 상이하여, 이러한 시그널들의 차이가 제2 연장 이합체의 절단 발생이 검출되도록 한다.
일 구현예에 따르면, PTO 단편, 제1 연장가닥 또는 제2 연장가닥은 단일 표지를 갖고, 제2 연장 이합체 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 제2 연장 이합체가 절단되기 이전의 단일 표지로부터 나오는 시그널은 제2 연장 이합체가 절단된 이후의 단일 표지로부터 나오는 시그널과 상이하여, 이러한 시그널들의 차이가 제2 연장 이합체의 절단 발생이 검출되도록 한다.
일 구현예에 따르면, 제2 연장 이합체의 절단에 의존적으로 상이한 시그널을 제공하는 단일 표지는 형광성 테르비움 킬레이트 또는 편광된 형광을 방출하는 단일 표지이다.
일 구현예에 따르면, 단일 표지는 제2 CTO, 특히 제2 CTO의 템플레이팅 부위, 보다 특히 제2 CTO의 템플레이팅 부위의 5'-말단에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 단일 표지는 PTO, 특히 PTO의 5'-태깅 부위에 연결된다. 특히, 단일 표지는 PTO 단편이 단일 표지를 갖도록 PTO 상에 위치한다.
본 발명이 단일 표지를 이용하는 경우, 본 발명은 고정화된 제2 CTO를 이용하여 고상에서 실시하는 것이 바람직하다. 단일 표지를 이용하는 본 발명을 고상에서 실시하는 경우, PTO 또는 제2 CTO에 연결된 단일 표지는 제2 연장 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 제2 CTO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다.
제2 CTO가 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화되고 단일 표지를 이용하는 경우, 단일 표지는 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 연결되고, 핵산 절단효소의 절단 부위는 5' → 3' 엑소뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제에 대해 생성되는 것이 바람직하다.
한 가지 예로서, 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 제2 CTO에 제1 연장가닥이 혼성화되고 추가로 연장되어 제2 연장 이합체가 형성되면 5' → 3' 엑소뉴클레아제의 절단 부위가 생성된다. 5' → 3' 엑소뉴클레아제가 절단위치를 절단함으로써 제2 연장 이합체가 절단되어 제2 CTO의 5'-말단으로부터 형광 리포터 분자가 방출된다. 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 고정화된 제2 CTO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸한다. 타겟 핵산 서열이 부존재하는 경우, 고정화된 제2 CTO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸하지 않는다.
추가의 예로서, 5'-말단 또는 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 제2 CTO(그의 템플레이팅 부위에 제한효소 또는 RNA 분자에 의하여 인식되는 서열을 포함)에 제1 연장가닥이 혼성화되고 추가로 연장되어 제2 연장 이합체가 형성이 되면 제한효소의 절단 부위가 생성된다. 제한효소는 제2 연장 이합체를 절단하여 제2 CTO의 3'-말단 또는 5'-말단으로부터 형광 리포터 분자를 방출시킨다. 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 고정화된 제2 CTO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸한다. 타겟 핵산 서열이 부존재하는 경우, 고정화된 제2 CTO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸하지 않는다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, PTO에 연결되는 단일 표지는 5'-말단 또는 그로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
(ⅱ) 상호작용적 이중표지
본 발명은 상호작용적 이중표지를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 제2 연장 이합체 절단 발생에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
상호작용적 이중표지의 종류 및 특성은 전술한 PTOCE 분석 섹션을 참조한다.
일 구현예에 따르면, 상호작용적 이중표지는 제2 CTO에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 핵산 절단효소에 대한 절단 부위는 제2 CTO에 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치하고, 제2 연장 이합체가 형성되기 이전에는 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 제2 연장 이합체의 절단은 리포터 분자와 퀀처 분자를 서로 분리시키고, 제2 연장 이합체의 절단의 발생은 표지로부터의 시그널을 측정하여 검출된다.
본 발명의 상호작용적 표지 시스템은 액상 및 고상에서 유용하다.
상호작용적 표지 시스템을 이용하는 경우, 제2 연장 이합체 상에 생성되는 절단 부위는 5' → 3' 엑소뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제에 대한 절단 부위이다.
일 예로서, 제1 연장가닥이 제2 CTO에 혼성화되고 추가로 연장되어 제2 연장 이합체가 형성되며, 이에 의해 5' → 3' 엑소뉴클레아제의 절단 부위가 생성된다. 5' → 3' 엑소뉴클레아제의 절단 부위는 제2 CTO에 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치한다.
제2 연장 이합체가 형성되기 전에, 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하기에 적합한 부위에 위치한다. 특히, 상기 두 개의 표지가 제2 CTO의 길이를 따라 근접하거나 또는 랜덤 코일 및 헤어핀 구조와 같은 입체적 구조의 형성에 의해 3차원적인 방식으로 근접하는 경우, 퀀칭이 발생한다.
5' → 3' 엑소뉴클레아제는 제2 연장 이합체의 5'-말단을 절단하고 형광 리포터 분자를 방출시켜 형광 리포터 분자로부터의 시그널 변화를 초래한다. 제한 효소는 절단 부위를 공격함으로써 제2 연장 이합체를 절단하고 형광 리포터 분자를 방출하여 형광 리포터 분자로부터 시그널 변화를 초래한다. 제2 연장 이합체의 절단의 발생은 타겟 핵산의 존재의 결정을 위해 형광 시그널 변화를 측정함으로써 검출된다.
퀀처 분자가 형광성인 경우, 퀀처 분자로부터의 시그널을 이용하여 측정하는 것이 바람직하다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 최소 하나는 제2 CTO의 템플레이팅 부위, 특히 제2 CTO의 5'-말단에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 제2 CTO의 5'-말단에 연결되고, 다른 하나는 3'-말단에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 연결된 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 예를 들어, 퀀처 분자는 제2 CTO의 템플레이팅 부위의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1-5 이격되어 위치할 수 있고, 리포터 분자는 퀀처 분자로부터 5-50 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상호작용적 이중표지는 상호작용적 이중 표지 간의 퀀칭이 제2 연장 이합체가 형성되는 경우에 유지되고, 상호작용적 이중 표지 간의 언퀀칭이 제2 연장 이합체의 절단에 의하여 표지가 방출되는 경우에 달성되도록 적합한 위치에 위치한다.
제2 연장 이합체의 절단 동안의 실시간 시그널 발생을 고려하여, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 25 뉴클레오타이드 이하, 보다 특히 20 뉴클레오타이드 이하, 보다 더욱 특히 15 뉴클레오타이드 이하, 가장 특히 10 뉴클레오타이드 이하로 이격되어 위치한다. 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 3 뉴클레오타이드, 특히 최소 4 뉴클레오타이드, 보다 특히 최소 5 뉴클레오타이드, 가장 특히 최소 6 뉴클레오타이드 이격된다.
제2 연장 이합체가 형성되는 경우, 제2 CTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하도록 할 수 있다. 제2 연장 이합체의 절단은 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 완전히 분리시켜, 언퀀칭에 의한 시그널의 변화를 보다 크게 할 수 있다.
또한, 표지(예를 들어, 리포터 분자)를 갖는 절단 단편이 생성되므로, 보다 유연하거나 편리한 조건(예를 들어, 고-엄격 조건 또는 고상에서 세척 후 조건)하에서, 절단 단편에 연결된 표지로부터의 시그널을 직접 검출하여 제2 연장 이합체의 절단 발생을 분석할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 고정화된 제2 CTO에 연결된 상호작용적 이중표지 중 하나는 제2 연장 이합체의 절단 후 고상 기질 상에 유지된다.
일 구현예에 따르면, 고상 기질 상에 고정화된 제2 CTO가 상호작용적 이중표지를 갖고 핵산 절단효소로서 5' → 3' 엑소뉴클레아제를 이용하는 경우, 제2 연장 이합체로부터 제2 CTO의 단편이 분리되기에 적합한 조건을 부여하거나 또는 제2 CTO의 내부 뉴클레오타이드에 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 내성을 부여함으로써, 제2 연장 이합체의 절단 후 상호작용적 이중표지 중 하나가 고상 기질 상에 확실하게 유지되도록 할 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 내성은 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성에 내성인 백본을 갖는 뉴클레오타이드에 의하여 부여되며, 이는 다양한 포스포로티오에이트 연결(linkage), 포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결 및 2'-카보하이드레이트 변형을 포함하고, 보다 바람직하게는 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결, 아릴 포스포로아미데이트 연결, 포스포로세레네이트 연결, 2'-O-아미노프로필 변형, 2'-O-알킬 변형, 2'-O-알릴 변형, 2'-O-부틸 변형, α-아노머릭 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 1-(4'-티오-β-D-리보퓨라노실) 변형을 포함한다.
본 발명에 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 PTOCE 분석에서 확인될 수 있다.
(ⅲ) 인터컬레이팅 표지(Intercalating label)
본 발명은 인터컬레이팅 표지(intercalating label)를 이용하여 제2 연장 이합체의 절단 반응과 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 발생을 연계시킬 수 있다.
샘플에 존재하는 이중-가닥 핵산 분자가 시그널을 발생시킬 수 있기 때문에, 고정화된 제2 CTO를 이용하는 고상 반응에서는 인터컬레이팅 표지가 보다 유용하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제2 CTO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화되어 있고, 인터컬레이팅 염료가 표지로 이용되며, 제2 연장 이합체 절단은 인터컬레이팅 염료를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 절단 단편은 고상 기질로부터 방출되어, 고상 기질 상에서 시그널의 변화를 초래하여 제2 연장 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 제2 연장 이합체의 절단 반응은 제한효소 또는 RNase를 이용하여 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 고상 기질 상에 고정화되지 않은 절단 단편은 고상 기질로부터 해리된다.
본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 염료의 예는 PTOCE 분석 섹션에서 확인될 수 있다.
C. 제2 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드(SO) 간의 혼성화물의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서의 검출은 제2 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드(SO) 간의 혼성화물로부터 발생되는 시그널을 이용하는 PCE-SH 분석에 기초하여 실시된다(WO 2013/115442 참고).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고; 상기 SO는 제2 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하며; 상기 SO는 상기 제2 연장가닥에의 혼성화에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고; 상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재는 상기 SO를 상기 제2 연장가닥에 혼성화시키고, 상기 혼성화에 의해 발생된 시그널을 측정함으로써 검출된다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 제2 연장서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 PCE-SH 분석에서, 검출가능한 시그널은 (i) 상기 SO에 연결된 표지, (ii) 상기 SO에 연결된 표지 및 상기 PTO 단편에 연결된 표지의 조합, (iii) 상기 SO에 연결된 표지 및 단계 (d) 및/또는 단계 (f)의 연장 반응 동안 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥에 삽입된 표지의 조합, 또는 (iv) 상기 SO에 연결된 표지 및 인터컬레이팅 표지(intercalating label)의 조합에 의해 제공될 수 있다.
PCE-SH 분석의 원리에 관한 세부사항은 WO 2013/115442를 참조한다. 상기 PCE-SH 분석에 기초한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(ⅰ) SO에 연결된 단일 표지
본 발명은 단일 표지를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 제2 연장가닥 형성에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, SO는 단일 표지로 표지되고 상기 SO와 제2 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
단일 표지의 종류 및 특징에 대해서는 전술한 PTOCE 분석 섹션을 참조한다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상의 단일 표지는 5'-말단 또는 3'-말단으로부터 1-15 뉴클레오타이드, 1-10 뉴클레오타이드 또는 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 보다 특히, 단일 표지는 SO의 중앙 부위에 위치한다.
(ii) SO에 연결된 가닥내(intrastrand) 상호작용적 이중표지
가닥내 상호작용적 이중표지의 종류 및 특징은 PTOCE 분석 섹션에 개시된 내용을 참조한다.
일 구현예에 따르면, SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지로 표지되고, 상기 SO와 제2 연장가닥 사이의 혼성화는 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다. 상기 SO가 혼성화되기 전에는 상기 SO 상의 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적(conformational)으로 서로 근접하여 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 혼성화시에, 상기 SO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하여, 상호작용적 이중표지로부터의 시그널 변화를 초래한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 SO의 5'-말단(또는 3'-말단) 및 3'-말단(또는 5'-말단)에 위치한다. 일 구현예에 따르면, SO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고, 나머지 하나는 SO의 형태(conformation)에 따라 리포터 분자의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 따르면, SO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고, 나머지 하나는 SO의 형태에 따라 리포터 분자의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
(iii) 가닥 간(interstrand) 상호작용적 이중표지
가닥 간 상호작용적 이중표지를 사용하는 구현예에서, 제2 연장가닥은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 하나를 가지며, SO는 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 갖는다.
일 구현예에 따르면, SO는 상호작용적 이중 표지의 리포터 분자와 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, 제2 연장가닥은 연장 반응 동안 제1 연장가닥에 사입되거나 연장 반응 동안 제2 연장가닥에 삽입된, PTO 단편으로부터 유래된 리포터 분자와 퀀처 분자 중에서 다른 표지를 포함하고; SO와 제2 연장가닥 간의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
제1 연장가닥 또는 제2 연장가닥 내로의 표지의 삽입은 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
상기 SO에 연결된 표지는 리포터 분자 또는 퀀처 분자일 수 있고, PTO 단편에 대한 표지는 퀀처 분자 또는 리포터 분자일 수 있다.
표지는 제2 연장가닥과의 혼성화시에 제2 연장가닥 상의 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, SO 상의 어느 위치(예컨대, SO의 5'-말단)에 연결될 수 있다.
(iv) 2개의 SO를 이용한 상호작용적 이중표지
2개의 SO를 이용한 상호작용적 이중표지의 구현예에서, 본 발명의 방법은 제2 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하는 추가적인 SO를 사용하며, 상기 2개의 SO는 상기 제2 연장가닥에 근접 방식으로 혼성화되고, 상기 2개의 SO는 각각 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하며, 상기 2개의 SO와 상기 제2 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
특히, 상기 2개의 SO 중 최소 하나는 단계 (f)의 연장 반응에서 새롭게 생성된 제2 연장서열과 혼성화되는 부위를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 연장가닥과의 혼성화에 의해 퀀처 분자가 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있도록 하는 한, 2개의 SO는 제2 연장가닥의 어떠한 위치에도 혼성화될 수 있다. 특히, 2개의 SO는 바로 인접한 방식으로 위치하거나, 서로 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 2개의 SO가 제2 연장가닥에 인접하여 혼성화되는 경우, 퀀처 분자가 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 2개의 SO의 어떠한 위치에도 연결될 수 있다. 예를 들어, 하나의 SO의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 연결되고, 다른 SO의 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 퀀처 분자 또는 리포터 분자가 연결된다.
(v) 인터컬레이팅 염료를 이용한 FRET 표지
본 발명에 따르면, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 시그널링은 인터컬레이팅 염료를 이용하여 달성할 수 있다.
일 구현예에 따르면, SO는 FRET의 수용자를 포함하고, 상기 단계 (e)의 혼성화는 인터컬레이팅 염료의 존재 하에서 실시하며; 상기 SO와 상기 제1 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 SO의 상기 수용자로부터의 시그널 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 제1 연장가닥의 연장은 상기 시그널을 유지시킨다.
D. 제2 연장 이합체와 시그널링 올리고뉴클레오타이드(SO) 간의 혼성화물의 절단의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서의 검출은 제2 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드(SO) 간의 혼성화물의 절단으로부터의 시그널을 이용하는 PCE-SC 분석에 의해 실시된다(WO 2013/157821 참고).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하며; 상기 SO는 제2 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하고; 상기 SO와 상기 제2 연장 이합체 간의 혼성화물은 핵산 절단효소에 대한 절단 부위를 포함하며, 상기 혼성화물은 상기 절단 부위에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재는 상기 혼성화물을 핵산 절단효소에 의하여 절단시키고, 상기 절단에 의해 발생된 시그널을 측정함으로써 검출된다.
상기 PCE-SC 분석에서, 상기 SO 및 제2 연장가닥 간의 혼성화물은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 또는 단일 표지, 및 5'-> 3' 엑소뉴클레아제, 리보뉴클레아제 또는 제한효소에 대한 절단 부위를 포함하고, 상기 SO 및 제2 연장가닥 간의 혼성화물의 절단은 상기 상호작용적 이중표지 또는 단일 표지로부터 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
PCE-SC 분석의 원리에 관한 세부사항은 WO 2013/157821을 참조한다. 상기 PCE-SC 분석에 기초한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) 상호작용적 이중표지
상호작용적 이중표지의 종류 및 특징은 전술한 PTOCE 분석 섹션을 참고한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 발생(즉, 타겟 핵산 서열의 존재)을 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의하여 발생되며, 특히 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중표지 시스템)에 의하여 발생된다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고, 상기 핵산절단 효소에 대한 절단 부위는 상기 SO에 연결된 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 사이에 위치하며, 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 SO의 절단은 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자를 서로 분리시키고, 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 SO의 절단반응의 발생은 상기 표지로부터의 시그널을 측정함으로써 검출된다.
특정 구현예에서, 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 생성 전에 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있는 위치에 위치한다.
본 발명에서 상기 상호작용적 표지 시스템은 액상 및 고상에서 유용하다.
상기 상호작용적 표지 시스템이 이용될 경우, 생성되는 절단 부위는 5' 뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제에 대한 절단 부위이다.
상기 핵산절단 효소(예컨대, 5' 뉴클레아제)는 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 SO의 5'-말단 부위를 절단하여 상기 리포터 분자를 방출할 수 있으며, 그로 인해 상기 리포터 분자로부터 시그널 변화를 유도한다. 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 발생은 상기 타겟 핵산 서열의 존재 결정을 위한 형광 시그널을 측정함으로써 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 최소 하나는 상기 SO의 5'-말단에 연결된다. 특정 구현예에서, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 상기 SO의 5'-말단에 연결되고, 다른 하나는 3'-말단에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 5'-말단 또는 그의 5'-말단으로부터 1-10 뉴클레오타이드 이격되어 위치하며, 다른 하나는 상기 제2 연장가닥과 SO의 혼성화 전에 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 3'-말단 또는 그의 3'-말단으로부터 1-10 뉴클레오타이드 이격되어 위치하며, 다른 하나는 상기 제2 연장가닥과 SO의 혼성화 전에 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭하도록 위치한다.
예를 들어, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자는 그의 5'-말단 또는 그의 5'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있으며, 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 5-80 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 상호작용적 이중표지는 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 형성 전에 퀀칭 현상을 유지하기에 충분한 위치에 위치하며, 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 절단시 언퀀칭을 유도한다.
상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 동안 실시간 시그널 생성을 고려할 때, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 80 뉴클레오타이드 이내, 60 뉴클레오타이드 이내, 30 뉴클레오타이드 이내, 25 뉴클레오타이드 이내, 20 뉴클레오타이드 이내, 15 뉴클레오타이드 이내 또는 10 뉴클레오타이드 이내에서 이격되어 위치할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 3 뉴클레오타이드, 최소 4 뉴클레오타이드, 최소 5 뉴클레오타이드, 최소 6 뉴클레오타이드, 최소 10 뉴클레오타이드 또는 최소 15 뉴클레오타이드 이격된다.
또한, 표지(예컨대, 리포터 분자)를 갖는 절단된 단편이 생성되기 때문에, 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 발생은 보다 유연하거나 편리한 조건(예컨대, 고엄격 조건 또는 고상 기질 상에서 세척 후 조건) 하에서 상기 절단된 단편에 연결된 표지로부터 시그널을 직접적으로 검출함으로써 분석될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 고정화된 SO에 연결된 상호작용적 이중표지 중 하나는 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 후에 고상 기질 상에 유지된다.
일 구현예에 따르면, 고상 기질 상에 고정화된 상기 SO가 상호작용적 이중표지를 갖고, 5' 뉴클레아제가 핵산절단 효소로 사용되는 경우, 상기 혼성화물로부터 SO 단편을 해리하는 적당한 조건을 부여하거나 상기 SO의 내부 뉴클레오타이드에 5' 뉴클레아제 활성에 대한 내성(예컨대, 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성 또는 그의 염기 상에 표지를 갖는 뉴클레오타이드에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드)을 부여함으로써, 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 절단 후 상기 상호작용적 이중표지 중 하나는 고상 기질 상에 확실히 유지될 수 있다.
상기 SO가 상기 제2 연장가닥에 비-상보적인 5'-태깅 부위를 포함하는 경우, 리포터 또는 퀀처 분자는 상기 절단 부위를 고려하여 상기 5'-태깅 부위에 위치할 수 있다.
(ii) 단일 표지
본 발명은 또한 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 발생에 대한 시그널을 제공하는 단일 표지 시스템을 이용하여 우수하게 실시된다.
단일 표지의 구체적인 종류 및 특징은 전술한 PTOCE 분석의 섹션을 참조한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 SO는 단일 표지를 가지고, 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성하며, 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단 발생은 상기 단일 표지된 단편의 방출을 검출함으로써 검출한다. 이 경우, 상기 SO의 절단에 앞서 상기 단일 표지로부터 발생한 시그널은 상기 SO의 절단 후 상기 단일 표지로부터 발생한 시그널과 상이하고, 상기 시그널의 차이는 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단 발생을 검출할 수 있도록 한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 상기 SO의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된다.
본 발명이 단일 표지를 사용하는 경우, 본 발명은 고정화된 SO를 사용하여 고상에서 효율적으로 실시된다. 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정화된다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질의 표면 상에 고정화되고, 상기 SO는 단일 표지를 가지며, 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성시키고, 상기 단편은 고상 기질 상에서 방출되며, 그로 인해 시그널 변화가 상기 고상 기질 상에서 발생하여 상기 제2 연장가닥/SO 혼성화물의 SO 절단 발생을 검출한다.
상기 SO가 그의 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정화되는 경우, 상기 단일 표지는 상기 SO의 5'-말단에 연결되며, 생성되는 상기 절단 부위는 5'-뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제에 대한 절단 부위이다.
특정 구현예에서, 상기 SO의 단일 표지는 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 택일적으로, 상기 단일 표지는 상기 SO의 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
E. 제2 CTO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드(HO) 간의 혼성화물의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서의 검출은 제2 CTO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드(HO) 간의 혼성화물로부터 발생되는 시그널을 이용하는 PCE-NH 분석에 따라 실시된다(WO 2014/104818 참고).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 혼성화 뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide; HO)를 추가적으로 사용하며; 상기 HO는 제2 CTO에 대한 혼성화 올리고뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하고; 상기 HO와 상기 제2 CTO 간의 혼성화물은 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재는 상기 혼성화물로부터의 시그널을 측정함으로써 검출되며, 상기 혼성화물로부터의 시그널의 존재는 상기 제2 연장가닥의 부존재를 나타낸다.
상기 PCE-NH 분석에서, 검출가능한 시그널은 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 제2 CTO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 제2 CTO에 연결된 표지의 조합, 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 제공될 수 있다.
PCE-NH 분석의 원리에 관한 세부사항은 WO 2014/104818을 참조한다. 상기 PCE-NH 분석에 기초한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) HO 또는 제2 CTO에 연결된 단일 표지
본 발명은 단일 표지가 있는 HO를 제 2CTO에 혼성화시킴으로써 또는 HO를 단일 표지가 있는 제2 CTO에 혼성화시킴으로써, 타겟 핵산 서열의 부존재를 나타내는 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, HO와 제2 CTO 간의 혼성화가 가능한 온도에서 시그널을 검출하는 것이 필요하다.
(ii) HO 또는 제2 CTO에 연결된 상호작용적 이중표지
일 구현예에 따르면, 검출가능한 시그널은 HO 또는 제2 CTO에 연결된 상호작용적 이중표지에 의해 제공된다.
구체적으로, 제1 연장가닥이 제2 CTO에 혼성화된다. 이후, 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지로 표지된 HO가 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 혼성화된다. 그리고 나서, 상기 제1 연장가닥이 추가적으로 연장되어 상기 HO의 절단을 유도하여 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 분리시키고, 이에 의해 제2 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
이러한 구현예에서, 이중표지-연결된 뉴클레오타이드가 상대적으로 근접하는 경우, HO 절단 전의 시그널과 HO 절단 후의 시그널 사이의 변화가 시그널 검출에 사용될 수 있다.
이중표지-연결된 뉴클레오타이드가 상대적으로 이격된 경우, HO와 제2 CTO 간의 혼성화는 상호작용적 이중표지의 구조적 이격을 유도하여 HO가 절단되지 않는 경우에도 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 시그널의 변화를 제공한다. 이러한 경우, HO의 절단된 단편으로부터의 시그널은 HO와 제2 CTO 간의 혼성화를 방지하는 보다 높은 온도(예컨대, 95℃)에서 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 절단된 HO 및 비절단된 HO가 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HO의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다.
특정 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 각각 HO의 양 말단에 위치한다.
(iii) HO 및 제2 CTO에 연결된 상호작용적 이중표지
일 구현예에 따르면, 하나는 HO에 연결되고 다른 하나는 제2 CTO에 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지에 의해 검출가능한 시그널이 제공된다.
특정 구현예에서, HO가 제2 CTO에 혼성화되는 경우, 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의해 퀀칭되도록, 리포터 분자 및 퀀처 분자가 HO 및 제2 CTO 상에 위치한다. 제1 연장가닥의 추가 연장에 의해 유도된 HO의 절단은 제2 CTO로부터 HO를 방출시키고 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 이격시켜, 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하게 하며, 이에 의해 제2 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
일 구현예에 따르면, HO와 제2 CTO간의 혼성화가 가능한 온도에서 시그널을 검출하는 것이 필요하다.
일 구현예에 따르면, 상기 HO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인될 수 있다.
특정 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 HO의 3'-말단에 연결되고 다른 하나는 제2 CTO의 5'-말단에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 2개의 HO를 사용한 상호작용적-이중표지와 같은 표지 시스템이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 절단된 HO 및 비절단된 HO가 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, 상호작용적-이중표지는 2개의 HO의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다. 표지의 종류 및 위치는 전술한 SO를 사용하는 표지 시스템에서 확인될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 인터컬레이팅 염료를 사용한 FRET과 같은 표지 시스템이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 절단된 HO 및 비절단된 HO가 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, FRET 표지는 2개의 HO의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다.
F. 제2 연장가닥과 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드(IO) 간의 혼성화물의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (g)에서의 검출은 제2 연장가닥과 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilized Oligonucleotide, IO) 간의 혼성화물로부터 발생되는 시그널을 이용하는 PCE-IH 분석에 의해 실시된다(WO 2015/008985 참고).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilizing Oligonucleotide; IO)를 추가적으로 사용하며; 상기 IO는 제2 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 제2 연장가닥은 표지를 포함하며, 상기 IO는 상기 제2 연장가닥에의 혼성화에 의해 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재는 상기 IO를 상기 제2 연장가닥에 혼성화시키고, 상기 혼성화에 의해 발생된 시그널을 측정함으로써 검출된다.
상기 PCE-IH 분석에서, 상기 검출가능한 시그널은 (i) 상기 PTO 단편에 연결된 표지, (ii) 상기 단계 (d) 또는 단계 (f)의 연장 반응 동안 상기 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥에 삽입되는 표지, 또는 (iii) 상기 단계 (d) 또는 단계 (f)의 연장 반응 동안 상기 제1 연장가닥 또는 제2 연장가닥에 삽입되는 표지 및 상기 PTO 단편에 연결된 표지의 조합에 의해 제공될 수 있다.
PCE-IH 분석의 원리에 관한 세부사항은 WO WO 2015/008985를 참조한다. 상기 PCE-IH 분석에 기초한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(ⅰ) PTO 단편에 결합된 단일 표지
본 발명은 단일 표지를 이용함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 제2 연장가닥의 존재에 대한 시그널을 제공할 수 있다. 단일 표지로 표지된 PTO 단편은 제1 CTO에 혼성화되고 제1 CTO 상에서 연장되어 제1 연장가닥을 생성한다. 상기 제1 연장가닥은 제2 CTO에 혼성화되고 제2 CTO 상에서 연장되어 제2 연장가닥을 생성하며, 상기 단일 표지는 상기 제2 연장가닥에 포함된다. 이어, 상기 제2 연장가닥이 고상 기질에 고정된 IO에 혼성화되어 고상 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공한 후, 제2 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널이 검출된다.
단일 표지의 종류 및 특징은 전술한 PTOCE 분석 섹션을 참고한다.
일 구현예에 따르면, PTO 단편이 단일 표지를 포함하는 한, 상기 PTO 상의 단일 표지는 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 PTO 상의 단일 표지는 5'-태깅 부위의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있으며, 예컨대 5'-태깅 부위의 5'-말단에 위치할 수 있다.
(ii) 연장 반응 동안 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥에 삽입되는 표지
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 표지는 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥에 삽입되는 표지이고, 제1 CTO 및/또는 제2 CTO의 템플레이팅 부위는 제2 비-자연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 단계 (d) 또는 단계 (f)의 연장 반응은 표지 및 상기 제2 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성을 갖는 제1 비-자연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드의 존재하에서 실시되며, 이에 의해 상기 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥에 표지가 삽입된다. 이어, 상기 제2 연장가닥이 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화되어 고상 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공하며, 제2 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널이 검출된다.
(iii) PTO 단편의 단일 표지 및 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥에 삽입되는 표지의 조합
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 표지는 PTO 단편에 연결된 단일 표지 및 연장 반응 동안 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥에 삽입되는 표지의 조합이고, 상기 단일 표지 및 상기 삽입된 표지는 수용자(acceptor) 및 공여자(donor)의 쌍을 포함하는 상호작용적 이중표지이다.
일 예로서, 형광 단일 표지(공여자)로 표지된 5'-태깅 부위를 포함하는 PTO는 타겟 핵산 서열에 혼성화된 다음 절단된다. 상기 형광 단일 표지(공여자)를 포함하는 PTO 단편은 iso-dC를 포함하는 제1 CTO에 혼성화되며, 수용자로 표지된 iso-dG가 연장 반응 동안 iso-dC의 반대쪽에 삽입되어 제1 연장가닥에 수용자가 도입되며, 이에 의해 제1 연장가닥상에 상호작용적 이중표지가 형성된다. 이어, 상기 제1 연장가닥은 제2 CTO에 혼성화된 다음, 추가로 연장되어 제2 연장가닥을 생성한다. 이후, 상기 제2 연장가닥은 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화되고, 공여자에 대한 여기 광(excitation light)을 이용하여 조사시켜 공여자로부터 수용자로의 에너지 전이를 유발하며, 이에 의해 수용자로부터의 시그널 변화를 유도하여 고상 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공한다.
다른 예로서, 형광 단일 표지(공여자)로 표지된 5'-태깅 부위를 포함하는 PTO는 타겟 핵산 서열에 혼성화된 다음 절단된다. 상기 형광 단일 표지(공여자)를 포함하는 PTO 단편은 제1 CTO에 혼성화된 다음 연장되어 제1 연장가닥을 형성한다. 상기 제1 연장가닥은 iso-dC를 포함하는 제2 CTO에 혼성화되며, 수용자로 표지된 iso-dG가 연장 반응 동안 iso-dC의 반대쪽에 삽입되어 제2 연장가닥에 수용자가 도입되며, 이에 의해 제2 연장가닥 상에 상호작용적 이중표지가 형성된다. 이후, 상기 제2 연장가닥은 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화되고, 공여자에 대한 여기 광(excitation light)을 이용하여 조사시켜 공여자로부터 수용자로의 에너지 전이를 유발하며, 이에 의해 수용자로부터의 시그널 변화를 유도하여 고상 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공한다.
(iv) 인터컬레이팅 염료
일 구현예에 따르면, 제2 연장가닥과 IO 간의 혼성화는 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 실시하며, 제2 연장가닥에 포함된 표지는 상기 인터컬레이팅 염료로부터의 시그널을 받는 수용자이고, 상기 제2 연장가닥 및 IO 간의 혼성화물에 삽입된 인터컬레이팅 염료로부터의 시그널은 상기 수용자로 전이되며, 상기 수용자는 검출가능한 시그널을 제공한다.
예를 들어, 형광 표지(수용자)로 표지된 5'-태깅 부위를 포함하는 PTO가 타겟 핵산 서열에 혼성화된 다음 절단된다. 형광 표지(수용자)를 포함하는 PTO 단편이 제1 CTO에 혼성화되고, 연장되어 제1 연장가닥을 형성한다. 이어, 상기 제1 연장가닥이 제2 CTO에 혼성화되고, 연장되어 제2 연장가닥을 형성한다. 이어, 상기 제2 연장가닥은 공여자로서의 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화되어 상기 혼성화물 내로 인터컬레이팅 염료가 삽입된다. 공여자에 대한 여기 광을 이용하여 조사 후, 공여자로부터 수용자로의 에너지 전이가 유발되고, 이에 의해 수용자로부터의 시그널 변화를 유도하여 고체 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공한다.
택일적으로, 제2 연장가닥에 포함되는 표지의 사용 없이, 제2 연장가닥과 IO 간의 혼성화는 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 실시될 수 있으며, 제2 연장가닥 및 IO 간의 혼성화물에 삽입된 인터컬레이팅 염료로부터의 시그널을 검출하여, 타겟 핵산 서열의 존재를 분석한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (e)는 제1 연장가닥이 단일-가닥 상태에서 제2 CTO와 혼성화하는데 유리한 조건하에서 실시되며, 제1 연장가닥 및 제1 CTO 간의 제1 연장 이합체 형성에 의한 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화 억제가 방지된다.
일 구현예에 따르면, 제1 연장가닥이 단일-가닥 상태에서 제2 CTO와 혼성화하는데 유리한 조건은 상기 단계 (e)에서 단일-가닥 상태의 제1 연장가닥의 수를 증가시키는 조건이다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (e)에서 단일-가닥 상태의 연장가닥의 수를 증가시키는 조건은 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화 전에 상기 제1 연장 이합체를 변성시키는 조건일 수 있다. 상기 변성은 단일-가닥 상태의 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 접촉 기회를 증가시키며, 이에 의해, 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 증가된 수의 혼성화물이 생성된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화 전에 제1 연장 이합체를 변성시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (e)에서 단일-가닥 상태의 제1 연장가닥의 수를 증가시키는 조건은 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화 전에 제1 CTO를 제거하는 조건일 수 있다. 예를 들어, 비오틴화 CTO(biotinylated CTO)는 스트렙타비딘(straptavidin) 또는 아비딘(avidin)에 대한 특이적 친화성을 통해 제거될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화 전에 제1 CTO를 제거하는 단계를 추가적으로 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제1 CTO의 제거는 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화에 사용되는 용기와는 다른 용기에서 실시된다.
택일적으로, 상기 단계 (e)에서 단일-가닥 상태의 제1 연장가닥의 수를 증가시키는 조건은 1 초과의 몰비(구체적으로, 1.2 이상, 1.3 이상, 1.5 이상, 1.8 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 7 이상 또는 10 이상)로 PTO 및 제1 CTO를 사용하는 것이다. 몰비를 조절함으로써, 제1 CTO와 제1 연장 이합체를 형성하지 않고, 단일-가닥 상태로 존재하는 제1 연장가닥의 수가 증가할 것이다.
본 발명자들은 본 발명의 방법의 검출 효율을 향상시키고자 예의 연구 노력하였으며, 다음과 같은 결과를 얻었다: 본 발명의 방법의 전체 반응 동안 제1 CTO의 양은 일정하게 유지되는 반면, 제1 연장가닥은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 방식으로 생성된다. 제1 연장가닥의 수가 증가함에 따라, 제1 CTO에 혼성화되지 않은 단일 가닥 상태의 제1 연장가닥의 수는 증가하게 된다. 따라서, 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화에 대한 제1 CTO에 의한 억제가 최대한 배제될 수 있으며, 제1 연장가닥 및 제2 CTO 간의 혼성화가 충분히 발생하여 본 발명의 방법의 검출 효율을 개선시킬 수 있다.
PTO의 절단 효율, PTO 단편 및 제1 CTO 간의 혼성화 효율 및 PTO 단편의 연장 효율 등을 고려할 때, PTO의 양은 제1 CTO보다 많은 것이 바람직하다. 이러한 PTO 대 제1 CTO의 양(즉, 몰비)이 조절되는 경우, 본 발명의 방법은 상기 단계 (a)-(g)의 전부 또는 일부를 반복하는 단계를 추가적으로 포함한다. 예를 들어, 단계 (a)-(d)를 변성을 포함하여 반복하는 경우, 제1 CTO의 양은 변함없이 제1 연장가닥만이 반복적으로 생성된다. 이와 같이, 제1 연장가닥이 보다 효율적으로 생성될 수 있고, 단일-가닥 상태의 제1 연장가닥이 더 우세해질 수 있으며, 나아가 제1 CTO보다 제1 연장가닥의 수가 더 많아질 수 있다. 일 구현예에서, 변성을 포함하는 반복 단계는 최소한 연장 이합체를 변성시키는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구성요소(예컨대, 업스트림 올리고뉴클레오타이드, 다운스트림 프라이머 및 효소)는 제한 인자가 되지 않도록 충분한 양으로 사용될 수 있다.
상기 제1 연장가닥의 수를 증가시키는 방식은 전술한 PCE-SH 분석에도 동일하게 적용될 수 있다.
PTO, 제1 CTO, 제2 CTO, 및 선택적으로 SO, HO 및 IO는 자연(naturally occurring) dNMPs로 구성될 수 있다. 택일적으로, PTO, 제1 CTO, 제2 CTO, 및 선택적으로 SO, HO 및 IO는 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드, 예컨대, PNA(Peptide Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 92/20702호) 및 LNA(Locked Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 98/22489호, 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호)를 포함할 수 있다. PTO, 제1 CTO, 제2 CTO, 및 선택적으로 SO, HO 및 IO는 데옥시이노신, 이노신, 1-(2'-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함할 수 있다. 용어 "유니버설 염기"는 자연 DNA/RNA 염기들 각각에 대하여 거의 구별없이 염기 쌍을 형성할 수 있는 염기를 의미한다.
상술한 바와 같이, PTO는 PTO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 이격된 부위에서 절단될 수 있다. 절단 부위는 PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 위치할 수 있다. PTO 단편이 PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부를 포함하는 경우, 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 혼성화되는 제1 CTO의 부위는 유니버설 염기, 축퇴성 서열(degenerate sequence) 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PTO가 PTO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 하나의 뉴클레오타이드만큼 이격된 부위에서 절단되는 경우, 상기 뉴클레오타이드와의 혼성화를 위하여 제1 CTO의 캡처링 부위의 5'-말단 일부는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. PTO가 PTO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 2개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 부위에서 절단되면, 제1 CTO의 캡처링 부위의 5'-말단은 축퇴성 서열을 포함하고, 그의 3'-방향으로 인접한 뉴클레오타이드는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 이와 같이, 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부의 다양한 부위에서 PTO의 절단이 일어나는 경우, 제1 CTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 것이 유용하다. 또한, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, 동일한 5'-태깅 부위를 갖는 PTO를 복수의 타겟 핵산 서열을 스크리닝하는데 이용하는 경우, 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부가 서로 다른 PTO 단편들을 생성할 수 있다. 이러한 경우, 유니버설 염기 및 축퇴성 서열은 제1 CTO에 유용하게 사용된다. 제1 CTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 전략은 복수의 타겟 핵산 서열의 스크리닝을 위해서 한 타입의 제1 CTO 또는 최소한의 타입의 제1 CTO를 사용하도록 한다.
특정 구현예에서, 제1 CTO는 캡처링 부위의 5'-말단에 G(구아닌)를 갖는 제1 CTO, 캡처링 부위의 5'-말단에 C(시토신)를 갖는 제1 CTO, 캡처링 부위의 5'-말단에 A(아데닌)를 갖는 제1 CTO, 및 캡처링 부위의 5'-말단에 T(티민)를 갖는 제1 CTO의 세트를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 CTO는 캡처링 부위의 5'-말단에 G(구아닌)를 갖는 제1 CTO 및 캡처링 부위의 5'-말단에 C(시토신)를 갖는 제1 CTO의 세트를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 CTO는 상기 세트에서 캡처링 부위의 5'-말단에 또 다른 축퇴성 염기를 갖는 제1 CTO를 추가로 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 단계 (a)-(g)의 전체 또는 일부를 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 반복은 타겟 핵산 서열 및/또는 타겟 시그널을 증폭시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 단계 (g) 후에 제2 연장 이합체를 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 시그널을 검출하여 제2 연장가닥의 존재를 다시 검출한다.
변성은 열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법 (예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하는 공지된 기술을 통해 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 변성은 80-105℃의 범위의 온도에서 열처리하여 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하는 일반적인 방법은 문헌[Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)]에 개시되어 있다.
상기 단계 (g)의 검출은 실시간 방식으로, 엔드-포인트 방식으로, 또는 미리 정해진 시간 간격 방식으로 수행될 수 있다. 본 발명이 단계 (a)-(g)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 경우, 미리 정해진 온도에서 반복의 각 사이클에 대해(즉, 실시간 방식), 미리 정해진 온도에서 반복의 말기에(즉, 엔드-포인트 방식) 또는 미리 정해진 온도에서 반복 동안 미리 정해진 시간 간격 각각에서 시그널 검출이 수행된다. 바람직하게는, 검출은 검출 효율 및 정량을 개선하기 위해 실시간 방식으로 반복의 각 사이클에 대해 수행될 수 있다.
상기 반복에서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드로서 업스트림 프라이머가 사용되는 경우, 본 발명의 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되며, 특히 PCR 방법에 의하여 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(g)는 하나의 반응 용기에서 실시되거나 또는 상기 단계 (a)-(g) 중 일부는 별도의 반응 용기에서 실시된다.
본 발명은 검출 및/또는 증폭하고자 하는 타겟 핵산 서열이 모든 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포함하여 어떠한 특정 서열 또는 길이를 가질 것을 요구하지 않는다.
mRNA를 출발 물질로 이용하는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 문헌[Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)]에 개시되어 있다. 역전사 반응을 위해서는, 랜덤 헥사머 또는 mRNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용될 수 있다.
검출 및/또는 증폭할 수 있는 타겟 핵산 서열은 어떠한 자연(naturally occurring) 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산도 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 뉴클레오타이드 변이의 검출에 유용하다. 특히, 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 서열이 유사한 연속적 DNA 세그먼트들 중에서 특정 위치의 DNA 서열에서의 모든 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 세그먼트는 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 돌연변이(mutation), 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 암 발생-관련 변이를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 핵산 서열 내의 특정 위치에서의 어떠한 변이를 포함한다. 즉, 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 핵산 서열 내의 특정 위치에서의 야생형 및 그것의 어떠한 돌연변이형을 포함한다.
타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 본 발명에서, 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열의 상기 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산 서열은 본 명세서에서 매칭 주형(matching template)으로 기재된다. 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 비-상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산 서열은 본 명세서에서 미스매칭 주형(mismatching template)으로 기재된다.
뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, 업스트림 프라이머의 3'-말단은 타겟 핵산 서열에서의 뉴클레오타이드 변이 위치의 맞은편에 위치하도록 디자인할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머의 3'-말단은 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 업스트림 프라이머의 3'-말단은 매칭 주형에 어닐링되고 연장되어 PTO 절단을 유도한다. 생성된 PTO 단편은 제1 CTO에 혼성화된 후 제1 연장가닥이 제2 CTO에 혼성화되어 타겟 시그널을 제공한다. 반대로, 업스트림 프라이머의 3'-말단이 미스매칭 주형에서 뉴클레오타이드 변이에 미스매치되는 경우, 업스트림 프라이머가 미스매칭 주형에 혼성화되더라도, 프라이머의 3'-말단의 어닐링이 연장에 필수적인 조건하에서는 연장되지 않으며, 이에 타겟 시그널이 발생되지 않는다.
택일적으로, 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 PTO의 혼성화에 의존적인 PTO 절단을 이용할 수 있다. 예를 들어, 조절된 조건 하에서, 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 PTO는 매칭 주형에 혼성화된 후 절단된다. 생성된 PTO 단편은 제1 CTO에 혼성화되어 제1 연장가닥을 생성하고, 상기 제1 연장가닥은 제2 CTO에 혼성화되어 타겟 시그널을 제공한다. 반면, 조절된 조건하에서, PTO는 뉴클레오타이드 변이 위치에 비-상보적인 서열을 갖는 미스매칭 주형에는 혼성화되지 않으며, 절단되지 않는다. 특히, 이러한 경우, PTO의 뉴클레오타이드 변이에 대한 상보적인 서열은 PTO의 3'-타겟팅 부위의 중간에 위치한다.
택일적으로, 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부가 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 위치하고, PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부는 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 것이 바람직하다.
단일 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위한 구현예에서, PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단은 타겟 핵산 서열의 단일 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 상술한 바와 같이, 매칭 주형에 혼성화된 PTO의 절단은 예컨대, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단에 3'-방향으로 바로 근접(immediately adjacent)한 부위에서 유도될 수 있다. PTO 단편의 3'-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. PTO 단편은 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 서열을 포함하는 캡처링 부위를 갖는 제1 CTO에 혼성화되고 연장되어 제1 연장가닥을 형성하고, 상기 제1 연장가닥은 제2 CTO에 혼성화되고 연장되어 제2 연장 이합체를 형성하여, 타겟 시그널을 제공한다.
동일한 PTO가 단일 뉴클레오타이드 변이를 제외한 매칭 주형에 대하여 동일한 서열을 갖는 미스매칭 주형에 혼성화되는 경우, PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단으로부터 3'-방향으로 2개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 부위에서 PTO의 절단이 발생될 수 있다. PTO 단편의 3'-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드 이외에 추가적으로 절단되는 뉴클레오타이드를 갖는다. 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드에 혼성화되는 제1 CTO의 부위가 상기 추가적으로 절단되는 뉴클레오타이드에 대하여 비-상보적인 서열을 갖도록 디자인된 경우, PTO 단편의 3'-말단은 제1 CTO에 혼성화되지 않으며, 조절된 조건에서 PTO 단편이 연장되지 않는다. PTO 단편이 연장되어 제1 연장 이합체 및 이어서 제2 연장 이합체를 형성하는 경우에도, 상기 이합체는 PTO 및 미스매칭 주형 간의 혼성화로부터 유래되는 이합체와 상이한 Tm 값을 갖는다.
바람직한 구현예에 따르면, 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 뉴클레오타이드 변이에 대한 상보적인 서열을 가지는 PTO의 절단 부위는, 매칭 주형 또는 미스매칭 주형과의 혼성화에 의존적으로 달라지며, 이에 의해 상기 어느 하나의 혼성화 이벤트로부터 방출되는 PTO 단편은 상이한 서열을 가지며, 특히 그의 3'-말단 일부, 보다 특히 그의 3'-말단에서 상이한 서열을 갖는다.
바람직한 구현예에 따르면, PTO 단편의 3'-말단 일부의 차이를 고려한 제1 CTO의 뉴클레오타이드 서열의 선택은 매칭 주형과 미스매칭 주형을 구별할 수 있게 해준다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 사용되는 타겟 핵산 서열은 전-증폭된 핵산 서열이다. 전-증폭된 핵산 서열의 이용은 본 발명의 타겟 검출의 민감도 및 특이성을 상당히 증가시킨다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에 실시된다.
본 발명의 장점은 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 동시(멀티플렉스) 검출에서 강조될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산 서열(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)을 검출하기 위해 실시된다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 실시되고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, PTO는 최소 2종(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)의 PTO를 포함하고, 제1 CTO는 최소 1종(보다 바람직하게는 최소 2종, 보다 더 바람직하게는 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 제1 CTO를 포함하며; 제2 CTO는 최소 1종의 제2 CTO를 포함한다. 선택적으로, SO, HO 및/또는 IO가 사용되는 경우, 상기 SO, HO 및/또는 IO는 최소 2종(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)을 포함할 수 있다. 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2종의 타겟 시그널을 제공한다.
최소 2개의 PTO의 5'-태깅 부위는 서로 동일한 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 본 발명이 타겟 핵산 서열의 스크리닝에 실시되는 경우, PTO의 5'-태깅 부위는 동일한 서열을 가질 수 있다.
더욱이, 한 종류의 제1 CTO를 다수의 타겟 핵산 서열의 검출에 이용할 수 있다. 예를 들면, 5'-태깅 부위에 동일한 서열을 갖는 PTO들을 타겟 핵산 서열의 스크리닝에 이용하는 경우, 한 종류의 제1 CTO를 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 다수의 타겟 핵산 서열의 검출을 위해, 한 종류의 PTO의 5'-태깅 부위, 즉 동일한 서열을 갖는 5'-태깅 부위를 사용할 수 있다. 즉, 5'-태깅 부위의 서열은 검출되는 타겟 핵산 서열에 관계없이 임의의 서열을 갖도록 결정될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 방법은 한 종류의 제2 CTO, 즉 동일한 서열을 갖는 한 종류의 제2 CTO를 사용할 수 있다. 예를 들어, 제2 CTO의 캡처링 부위가 제1 연장가닥의 제1 연장서열에만 혼성화하도록 설계되는 경우, 제2 CTO는 다양한 타겟 핵산 서열을 검출하는데 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법에 사용되는 제2 CTO는 타겟 핵산 유형의 관계없이 미리 제조될 수 있으므로, 유니버설 올리고뉴클레오타이드로서 제2 CTO의 사용은 간단하고 비용 효과적인 타겟 검출을 가능하게 할 것이다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 제1 연장 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 제2 연장 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2종의 타겟 시그널은 서로 상이한 종류의 표지로부터 제공된다.
바람직한 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2 종의 타겟 시그널은 서로 동일한 종류의 표지로부터 제공된다.
바람직한 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2종의 타겟 시그널은 동일한 종류의 표지로부터 제공되며; 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 제1 연장 이합체 또는 제2 연장 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는다.
본원에 사용되는 용어 "상이한 종류의 표지"는 검출가능한 시그널이 상이한 특징을 갖는 표지를 의미한다. 예를 들면, 형광 리포터 표지로서의 FAM 및 TAMRA가 상이한 종류의 표지로써 고려되는데 이는 이들의 여기 및 방출 파장이 서로 상이하기 때문이다.
본 발명이 멜팅 커브 분석에 의하여 최소 2 종의 타겟 핵산 서열을 동시적으로 검출하기 위해 동시에 수행되고 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 제2 연장 이합체가 서로 상이한 Tm 값을 갖는 경우, 한 종류의 표지(예컨대, FAM)를 이용하더라도 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
이와 같이, 하나 이상의 타겟 핵산 서열을 하나의 튜브에서 검출하고자 하는 경우, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하는데 사용될 수 있다.
고상에서 고정화된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 검출
본 발명의 두드러진 이점은 마이크로어레이와 같은 고상에서도 타겟 핵산 서열을 검출하는데 효과적이라는 것이다.
일 구현예에 따르면, 제2 CTO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정된다.
고상 반응을 위해, 제2 CTO는 5'-말단 또는 3'-말단(바람직하게는 3'-말단)을 통하여 고상 기질의 표면에 직접적 또는 간접적(특히 간접적)으로 고정화된다. 또한, 상기 제2 CTO는 공유 또는 비-공유결합 방식으로 고상 기질 표면 상에 고정화될 수 있다. 상기 고정화된 제2 CTO가 고상 기질 상에 간접적으로 고정화되는 경우, 적당한 링커가 이용된다. 본 발명에 유용한 링커는 고상 기질 표면 상에 프로브를 고정화하는데 이용하는 어떠한 링커도 포함할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물이 제2 CTO 고정화를 위한 링커로서의 역할을 한다. 또한, 폴리 (T) 테일 또는 폴리 (A) 테일이 링커로서의 역할을 할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 고상 기질은 마이크로어레이이다. 본 발명에서 반응 환경을 제공하는 마이크로어레이는 당업자에게 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있다. 본 발명의 모든 과정, 즉, 타겟 핵산 서열과의 혼성화, 절단, 연장, 혼성화, 연장 및 형광 검출은 마이크로어레이에서 실시된다. 마이크로어레이 상에 고정화된 제2 CTO는 혼성화 가능한 어레이 요소(hybridizable array element)의 역할을 한다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소 나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 다수의 고정화된 제2 CTO는 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 부위 또는 두 개 이상의 어드레서블 영역에 고정화 될 수 있으며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 부위를 포함할 수 있다. 포토리토그래피, 잉크-젯팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사 방법과 같은 종래 제작 기술을 통해 어레이 또는 특정 응용을 위한 어레이를 생산하기 위하여 고정화된 제2 CTO가 조립(fabricate)될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 고상 기질의 표면상에 고정화된 제2 CTO는 상호작용적 이중표지를 포함한다.
본 발명에서, PTO 단편은 타겟 핵산과 혼성화된 PTO의 절단에 의해 생성되며, 상기 PTO 단편은 제1 CTO 상에서 연장되어 제1 연장가닥을 생성하고, 상기 제1 연장가닥은 제2 CTO 상에서 추가 연장되어 제2 연장가닥을 생성한다.
제2 연장가닥의 수를 증가시키기 위해서, PTO의 5' 뉴클레아제 절단 반응에 의하여 제1 CTO 상에서 연장 가능한 추가적인 단편을 생산하는 추가적인 PTO가 사용될 수 있다. 상기 추가적인 PTO를 사용하여 추가적인 단편을 생성하는 방식은 다양할 수 있다.
일 구현예에서, 추가적인 PTO는 (i) 제1 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 제1 CTO의 템플레이팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열 및 제1 CTO의 캡처링 부위에 상보적인 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다. 이 구현예에서, 상기 추가적인 PTO는 상기 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되는 PTO 단편의 다운스트림에 위치한다. 상기 PTO 단편은 연장되면서 추가적인 PTO를 절단시키고, 상기 절단은 추가적인 PTO 단편을 생성한다.
일 구현예에서, 추가적인 PTO는 (i) 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열 및 제1 CTO의 캡처링 부위에 상보적인 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다. 이 구현예에서, 상기 추가적인 PTO는 상기 제2 CTO에 혼성화되는 제1 연장가닥의 다운스트림에 위치한다. 상기 제1 연장가닥은 연장되면서 추가적인 PTO를 절단시키고, 상기 절단은 추가적인 PTO 단편을 생성한다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 SO(Signaling Oligonucleotide)를 사용하고, 상기 SO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정된다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 HO(Hybridizing Oligonucleotide)를 사용하고, 상기 HO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정된다.
고상 방법의 일 구현예에 다르면, 본 발명은 고상 기질 상에 고정된 IO를 사용하고 제2 CTO는 고상 기질에 직접 고정화되지 않고 상기 IO를 통해 고정화될 수 있다. 이 경우, 제2 CTO는 상기 IO에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 추가적으로 포함한다. 이 구현예에서, IO-혼성화 부위는 제2 CTO의 3'- 또는 5'-말단에 위치할 수 있다. 또한, 상기 IO-혼성화 부위가 상기 제2 CTO의 5'-말단에 위치하는 경우, 상기 제2 CTO는 제1 연장가닥의 연장 반응을 방지하기 위해 제2 CTO의 템플레이팅 부위와 IO-혼성화 부위 사이에 블록커 부위를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 hCTO를 사용하는 구현예의 세부사항은 본원에 참고로 포함된 제WO 2015/057008호를 참조한다.
특히, 본 발명이 단일 표지를 이용하여 고상에서 실시되는 경우, 상기 단일 표지는 특정한 특징이 요구되지 않는다. 고상 반응을 위해서는, 어떠한 단일 표지도 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 제1 연장 이합체로부터의 타겟 시그널을 검출하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 제1 연장 이합체가 최소 하나의 표지를 추가적으로 포함하도록 하는 표지의 존재하에 실시되고, 상기 제1 연장 이합체에 의하여 제공되는 타겟 시그널을 검출하는 것을 추가적으로 포함한다. 상기 구현예는 제2 연장 이합체와 마찬가지로 제1 연장 이합체 역시 타겟 시그널을 제공하도록 하고, 제1 연장 이합체 및 제2 연장 이합체 모두로부터 제공되는 시그널을 검출한다.
제1 연장 이합체 상의 표지 및 이들의 시그널 발생 시스템에 관한 세부사항은 제2 연장 이합체의 설명을 참조함다. 본 기술분야의 숙련가는 제1 연장 이합체로부터의 시그널이 PTOCE 방법, PCEC 방법, PCE-SH 방법, PCE-SC 방법, PCE-NH 방법 또는 PCE-IH 방법과 같은 다양한 방식에 의해 생성 및 검출될 수 있음을 이해할 것이다.
전술한 바와 같은 제1 연장 이합체 및 제2 연장 이합체 모두로부터의 시그널의 발생 및 검출은 제2 연장 이합체로부터의 시그널의 발생 및 검출과 비교하여 타겟 시그널의 강도를 증가시킬 수 있다.
II. 제1 연장 이합체 상의 표지 시스템을 이용한 PTOCE -E에 의한 타겟 핵산 서열의 검출
본 발명의 제2 양태에 따르면, 다음 단계를 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTO Cleavage and Extension-dependent Extension: PTOCE-E) 분석에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법이 제공된다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3'-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO의 5'-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5'-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 PTO 단편을 방출하며;
(c) 상기 PTO 단편과 제1 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(First Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제1 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO 단편은 상기 제1 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서, 상기 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 PTO 단편은 연장되어 상기 제1 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제1 연장서열을 포함하는 제1 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제1 연장가닥과 제1 CTO 간에 제1 연장 이합체를 형성하며,
(e) 상기 제1 연장가닥과 제2 CTO를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제2 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 제1 연장가닥은 상기 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(f) 상기 단계 (e)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서, 상기 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 제1 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제2 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체를 형성하며;
(g) 상기 제1 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제1 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 제1 양태는 제2 연장 이합체로부터 생성되는 시그널을 측정하여 제2 연장가닥의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는데 반해, 본 발명의 제2 양태는 제1 연장 이합체로부터 생성되는 시그널을 측정하여 제1 연장가닥의 존재를 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제2 양태는 제2 연장 이합체 대신에 제1 연장 이합체가 시그널을 제공한다는 것을 제외하면 제1 양태와 동일하므로, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
일 예로서, 상기 제1 연장 이합체는 (i) 상기 PTO 단편 및/또는 제1 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장 반응 동안 상기 제1 연장 이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장 반응 동안 상기 제1 연장 이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 제1 CTO에 연결된 최소 하나의 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 제1 연장가닥의 존재는 상기 제1 연장 이합체로부터의 시그널을 측정함으로써 검출될 수 있다.
본 기술분야의 숙련가는 제1 연장 이합체로부터의 시그널이 전술한 PTOCE 방법, PCEC 방법, PCE-SH 방법, PCE-SC 방법, PCE-NH 방법 또는 PCE-IH 방법과 같은 다양한 방식에 의해 생성 및 검출될 수 있음을 이해할 것이다.
III. 절단 부위를 함유하는 PTO를 이용한 PTOCE -E에 의한 타겟 핵산 서열의 검출
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다음 단계를 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTO Cleavage and Extension-dependent Extension: PTOCE-E) 분석에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법이 제공된다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO) 및 역방향 프라이머와 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 제한 효소, RNase, 또는 엔도뉴클레아제에 대한 절단 부위를 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3'-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO의 5'-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며;
(b) 상기 PT 및 역방향 프라이머를 타겟 핵산 서열을 따라 연장시키고 제한 효소, RNase, 또는 엔도뉴클레아제에 의해 절단 부위에서 PTO를 절단시켜 PTO의 5'-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 PTO 단편을 방출시키는 단계;
(c) 상기 PTO 단편과 제1 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(First Capturing and Templating Oligonucleotide: 1st CTO)를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제1 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO 단편은 상기 제1 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서, 상기 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 PTO 단편은 연장되어 상기 제1 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제1 연장서열을 포함하는 제1 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제1 연장가닥과 제1 CTO 간에 제1 연장 이합체를 형성하며,
(e) 상기 제1 연장가닥과 제2 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Second Capturing and Templating Oligonucleotide: 2nd CTO)를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제2 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 제1 연장가닥은 상기 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(f) 상기 단계 (e)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서, 상기 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 제1 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제2 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체를 형성하며;
(g) 상기 제1 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제1 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 제3 양태는 상기 섹션 I에 기재된 PTO 대신에 그의 5'-태깅 부위에 절단 부위를 갖는 PTO를 사용하는 것을 특징으로 하므로, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
이 방법은 PTO가 정방향 프라이머의 역할을 하기 때문에 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 필요로 하지 않는 반면, PTO의 단일 가닥 5'-태깅 부위를 이중 가닥으로 만들기 위해(절단 부위를 형성하기 위해) 역방향 프라이머를 필요로 한다.
일 구현예에서, 절단 부위는 제한 효소, RNase, 엔도뉴클레아제에 의해 인식가능한 부위이다. 절단 부위가 제한 효소에 대한 것인 경우, 상기 부위는 Pho I, PspGI, BstNI, TfiI, ApeKI, TspMI, BstBI, BstEII, BstNI, BstUI, BssKI, BstYI, TaqI, MwoI, TseI, Tsp45I, Tsp509I, TspRI, Tth111I, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nt.BspQI, Nt.BstNBI 및 닉 제한 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제한 효소에 대한 부위일 수 있다.
일 구현예에서, PTO, 역방향 프라이머, PTO 단편, 제1 연장가닥의 연장은 핵산 중합효소에 의해 실시된다.
타겟 핵산 서열과 혼성화된 PTO 및 역방향 프라이머는 타겟 핵산 서열을 따라 연장되어 PTO의 5'-태깅 부위를 이중 가닥으로 만든다. PTO의 이중 가닥의 5'-태깅 부위는 제한 효소, RNase, 또는 엔도뉴클레아제에 의해 절단 부위에서 절단되어 PTO의 5'-태깅 부위 또는 이의 일부를 포함하는 PTO 단편을 방출한다. 생성된 PTO 단편은 전술한 바와 같은 제1 CTO와의 혼성화, 제1 연장 이합체의 형성, 제2 CTO와의 혼성화, 및 제2 연장 이합체의 형성의 일련의 단계에 관여한다.
절단 부위에서의 절단으로 인한 단편의 생성에 관한 세부사항은 대한민국 특허공개 제10-2017-0121700호에서 확인될 수 있다.
IV. 타겟 검출을 위한 키트
본 발명의 추가 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTO Cleavage and Extension-dependent Extension: PTOCE-E) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드;
(b) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3'-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO의 5'-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여 상기 PTO의 상기 5'-태깅 부위 또는 상기 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 제1 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(First Capturing and Templating Oligonucleotide: 1CTO); 상기 제1 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO 단편은 상기 제1 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고; 상기 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 PTO 단편은 연장되어 제1 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 제1 연장서열을 포함하는 제1 연장가닥을 생성하고, 이에 의해 제1 연장가닥 및 제1 CTO 사이에 제1 연장 이합체를 형성하며;
(d) 제2 CTO; 상기 제2 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 제1 연장가닥은 추가로 연장되어 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 의해 제2 연장가닥 및 제2 CTO 사이에 제2 연장이합체를 형성한다.
본 발명의 키트는 상기 설명된 본 발명의 검출 방법을 실시할 수 있도록 구성된 것이므로, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
일 구현예에 따르면, 상기 PTO, 제1 CTO 또는 상기 제2 CTO는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지를 갖는다. 일 구현예에 따르면, 제1 CTO가 표지를 갖는 경우, 제2 CTO는 표지를 갖지 않으며, 제2 CTO가 표지를 갖는 경우, 제1 CTO는 표지를 갖지 않는다.
일 구현예에 따르면, 상기 키트는 (i) 상기 연장 반응 동안 상기 제1 연장 이합체 및/또는 상기 제2 연장 이합체 내에 삽입되는 표지, 또는 (ii) 인터컬레이팅 표지를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 키트는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소 및 주형-의존적 핵산 중합효소 또는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소 및 주형-의존적 핵산 중합효소는 서로 동일하다.
일 구현예에 따르면, 상기 키트는 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출하는데 사용하며, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 제1 CTO는 최소 1종의 CTO를 포함하고, 제2 CTO는 최소 1종의 CTO를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 제2 CTO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다.
일 구현예에 따르면, 상기 키트는 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 3'에서 5' 순서로 다음을 포함하는 제2 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Second Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 포함하는 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(i) 상기 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위; 및
(ii) 상기 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위;
상기 제1 연장가닥은 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO를 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 절단하여 PTO 단편을 방출하고, 상기 PTO 단편을 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화하고, 상기 PTO 단편을 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 연장시킴으로써 형성되며;
상기 PTO는 (i) 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위, 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하고;
제1 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다.
일 구현예에서, 키트는 제1 CTO를 추가로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 제1 CTO 및/또는 제2 CTO는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지를 갖는다.
특정 구현예에서, 제1 CTO는 캡처링 부위의 5'-말단에 G(구아닌)를 갖는 제1 CTO, 캡처링 부위의 5'-말단에 C(시토신)를 갖는 제1 CTO, 캡처링 부위의 5'-말단에 A(아데닌)를 갖는 제1 CTO, 및 캡처링 부위의 5'-말단에 T(티민)를 갖는 제1 CTO의 세트를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 CTO는 캡처링 부위의 5'-말단에 G(구아닌)를 갖는 제1 CTO 및 캡처링 부위의 5'-말단에 C(시토신)를 갖는 제1 CTO의 세트를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 CTO는 상기 세트에서 캡처링 부위의 5'-말단에 또 다른 축퇴성 염기를 갖는 제1 CTO를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 상술한 본 발명의 모든 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수적인 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)에 앞서 언급된 구성성분들을 포함하도록 제작된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)가 절단되어 PTO 단편을 방출하고, 상기 PTO 단편은 제1 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)에 혼성화되어 제1 연장가닥을 형성하고, 상기 제1 연장가닥이 제2 CTO에 혼성화되어 타겟-의존적인 방식으로 생성되는 제2 연장가닥을 제공한다.
(b) 제2 연장가닥의 존재는 제2 연장 이합체로부터 또는 제2 연장가닥의 존재를 검출하기 위한 추가적인 올리고뉴클레오타이드로부터 제공되는 시그널을 사용하여 검출될 수 있다. 제2 연장가닥의 존재는 멜팅 커브 분석 및 지정 온도에서의 검출(예컨대, 실시간 방식 및 엔드-포인트 방식)과 같은 다양한 방법 또는 과정에 의해 결정될 수 있다.
(c) 본 발명자에 의해 개발된 PTOCE 방법은 PTO 단편이 CTO를 따라 연장시에 시그널을 제공한다. 하지만, 타겟 핵산 서열이 아닌 비타겟 핵산 서열과 혼성화된 PTO가 절단되는 경우, 상기 PTO 단편이 CTO와 혼성화되고 CTO를 따라 연장되어 위양성 시그널을 야기할 수 있다(예컨대, PTOCE를 사용한 SNP 분석). 이에 반해, 본 발명의 PTOCE-E 방법에 따르면, 제1 CTO 상에서의 PTO 단편의 연장에 의해 생성된 제1 연장가닥은 시그널을 제공하지 않고, 또 다른 CTO(제2 CTO)를 사용하여 생성된 제2 연장가닥이 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 적절한 양의 제1 CTO 및 제2 CTO를 사용함으로써 비타겟 핵산 서열에 의해 생성된 소량의 제1 연장가닥(위양성 가닥)으로부터 제2 연장 이합체의 형성을 방지할 수 있으며, 결과적으로, 위양성 시그널의 발생을 감소시킬 수 있다.
(d) 본 발명자들에 개발된 PCE-SH 방법은 표지된 프로브(즉, SO)가 연장가닥과의 혼성화에 대해 CTO와 경쟁함으로써 시그널 감소를 나타낼 수 있다. 대조적으로, 본 발명의 PTOCE-E 방법에 따르면, 제1 연장가닥은 제2 CTO에 혼성화할 뿐만 아니라 연장되어 제2 연장가닥을 형성하므로. 상기 경쟁을 보다 효율적으로 해결할 수 있다.
(e) 본 발명자에 의해 개발된 PTOCE 방법에 따르면, 사용되는 5' 뉴클레아제에 따라 PTO의 절단시 생성되는 PTO 단편은 PTO의 5'-태깅 부위뿐만 아니라, PTO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단의 일부 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 동일한 5'-태깅 부위를 갖는 PTO를 사용하여 서로 다른 타겟 핵산 서열을 검출하더라도, PTO 단편의 3'-말단의 뉴클레오타이드는 타겟 서열에 의존적이기 때문에, 이에 따라 생성되는 PTO 단편의 3'-말단은 달라질 수 있다. 따라서, 다양한 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해(예컨대, 스크리닝 접근법), PTO 단편의 3'-말단의 뉴클레오타이드에 상보적이도록 복수의 표지된 CTO가 설계되어야 한다. 이에 반해, 본 발명의 PTOCE-E 방법은 비용이 드는 표지가 없는 복수의 유형의 제1 CTO와 표지를 갖는 단일 유형의 CTO를 사용하여 비용 효과적인 방식으로 수행될 수 있다.
(f) 본 발명의 PTOCE-E 분석은 하나의 타겟 핵산 서열 검출시 제1 연장가닥 및 제2 연장가닥이 시그널을 제공하도록 할 수 있으므로, 타겟 시그널의 강도를 증가시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 PTOCE-E 분석에 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 개략적인 구조를 나타낸 것이다: A: 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(PTO); B: 제1 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(제1 CTO); C: 제2 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(제2 CTO). 일 예로서, 상기 제2 CTO는 그의 템플레이팅 부위에 리포터 분자(R) 및 퀀처 분자(Q)를 포함하는 상호작용적 이중표지로 표지된다.
도 2는 본 발명에 따른 PTOCE-E 분석을 개략적으로 도시한 것이다. 업스트림 프라이머, PTO 및 다운스트림 프라이머가 타겟 핵산 서열에 혼성화된다(A: PTO의 혼성화). 상기 PTO가 업스트림 프라이머의 연장을 통해 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 절단되어 PTO 단편을 방출한다(B: PTO의 절단). 상기 PTO 단편이 제1 CTO에 혼성화된 다음 연장되어 제1 연장가닥과 제1 CTO 간에 제1 연장 이합체를 형성하는 반면; 비절단 PTO 단편은 제1 CTO에 혼성화된 다음 연장되지 않는다(C: 제1 연장 이합체의 형성). 상기 제1 연장가닥이 제2 CTO에 혼성화된 다음 연장되어 제2 연장가닥과 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체를 형성하고, 상기 제2 연장 이합체는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 생성한다(D: 제2 연장 이합체의 형성).
도 3은 PTOCE-E 분석에 기초한 실시간 PCR에 의해 타겟 핵산 서열(야생형 KRAS 유전자)의 검출 결과를 나타낸 것이다. 도면에서 "-○-"는 타겟 핵산 서열을 포함하는 샘플에 대한 결과를 나타내고, "-X-"는 타겟 핵산 서열을 포함하지 않는 샘플(No Target Control)에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 PTOCE-E 분석에 기초한 실시간 PCR에 의해 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다. 도면에서 "-○-"는 야생형 KRAS 유전자를 함유하는 타겟 핵산 서열을 포함하는 샘플에 대한 결과를 나타내고, "-△-"는 돌연변이형 KRAS 유전자를 함유하는 타겟 핵산 서열을 포함하는 샘플에 대한 결과를 나타내며, "-X-"는 타겟 핵산 서열을 포함하지 않는 샘플(No Target Control)에 대한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: PTOCE-E 분석을 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
본 발명에 따른 PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTO Cleavage and Extension-dependent Extension: PTOCE-E) 분석이 실시간 PCR 방식으로 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는지 조사하였다.
<1-1> 타겟 핵산 서열 및 올리고뉴클레오타이드의 준비
정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 연장, PTO의 절단, PTO 단편의 연장, 및 제1 연장가닥의 추가 연장을 위해 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. 또한, 야생형 KRAS(NCBI Accession No. NG_007524) 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 타겟 핵산 서열로서 사용하였다.
PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 갖도록 디자인하였다.
PTO 단편과 혼성화되는 제1 CTO는 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위 모두에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 갖도록 디자인하였다.
또한, 제1 연장가닥과 혼성화되는 제2 CTO는 (i) 상기 제1 연장가닥(특히 제1 연장서열)에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 제1 연장가닥, PTO의 5'-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 갖도록 디자인하였다. 상기 제2 CTO는 그의 5'-말단에 퀀처 분자(BHQ-1)로 표지되고 그의 템플레이팅 부위에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)를 표지되었다.
상기 PTO, 제1 CTO 및 제2 CTO는 DNA 중합효소에 의한 연장을 막기 위해 3'-말단에 카본 스페이서(carbon spacer)로 블록킹하였다.
본 실시예에서 사용된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, PTO, 제1 CTO 및 제2 CTO의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
명칭 타입 서열 (5' → 3') 서열번호
FPm 정방향 프라이머 ATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATT 1
RPm 역방향 프라이머 CTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 2
PTO PTO GTCGCGCGTAATC GGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGA[C3 spacer] 3
CTO-1 제1 CTO GTACGCGGTCGACGGTGCGATTACGCGCGAC[C3 spacer] 4
CTO-2 제2 CTO [BHQ-1]GGTGGATGACGCGCG[T(Cal Red 610)]TTTGTACGCGGTCGACGG[C3 spacer] 5
PTO의 5'-태깅 부위
볼드체 글자: 돌연변이 부위
<1-2> 실시간 PCR 수행 및 타겟 시그널의 검출
5 pmole의 정방향 프라이머(서열번호: 1), 5 pmole의 역방향 프라이머(서열번호: 2), 3 pmole의 PTO(서열번호: 3), 0.5 pmole의 제1 CTO(서열번호: 4), 1 pmole의 제2 CTO(서열번호: 5), 105 카피의 야생형 타겟 핵산 서열, 및 10 ㎕의 2X 마스터 믹스(최종, 200 uM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소)(Enzynomics, Korea)를 포함한 20 ㎕의 최종 부피에서 반응을 수행하였고; 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 써모사이클러(CFX96, Bio-Rad사)에 넣고; 반응 혼합물을 50℃에서 5분 및 95℃에서 15분 동안 변성시키고, 95℃에서 10초, 55℃에서 40초, 72℃에서 10초 반응과정을 50회 반복하였다. 시그널의 검출을 매 사이클의 55℃에서 수행하였다. 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 증폭 곡선에 RFU 50의 (threshold) 값을 적용하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, 타겟 핵산 서열을 포함하는 샘플(-○-)은 30.72의 Ct 값을 갖는 타겟 시그널을 나타내어, 샘플 내의 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내었다. 반면, 타겟 핵산 서열을 포함하지 않는 샘플(-X-)은 역치를 초과하는 타겟 시그널을 나타내지 않아, 샘플 내의 타겟 핵산 서열의 부존재를 나타내었다.
상기 결과는 본 발명의 PTOCE-E 분석을 사용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 정확히 결정할 수 있음을 보여준다.
실시예 2: PTOCE -E 분석을 사용한 단일 뉴클레오타이드 변이의 구별
본 발명의 방법에 따른 PTOCE-E 분석이 단일 뉴클레오타이드 변이(Single Nucleotide Variation, SNV)를 갖는 타겟 핵산 서열을 구별할 수 있는지 조사하였다.
<2-1> 타겟 핵산 서열 및 올리고뉴클레오타이드의 준비
야생형 KRAS 유전자(NCBI Accession No. NG_007524) 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 및 돌연변이형 KRAS 유전자(NCBI Accession No. M_54968) 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 각각 야생형 및 돌연변이형 타겟 핵산 서열로서 사용하였다. 상기 야생형 KRAS 유전자는 12번째 아미노산 위치에 글리신(GGT)을 코딩하는 반면, 돌연변이형 KRAS 유전자는 해당 위치에 시스테인(TGT)을 코딩한다(즉, G에서 T로의 단일 뉴클레오타이드 변이).
상기 야생형 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드를 실시예 <1-1>과 동일하게 준비하였다.
<2-2> 실시간 PCR 수행 및 타겟 시그널의 검출
10 pmole의 정방향 프라이머 및 10 pmole의 역방향 프라이머, 3 pmole의 PTO, 0.5 pmole의 제1 CTO, 1 pmole의 제2 CTO, 및 106 카피의 야생형 타겟 핵산 서열 또는 돌연변이형 타겟 핵산 서열을 사용하는 것을 제외하고 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 반응을 실시하였다. 이후, 실시간 PCR에 의해 타겟 시그널을 검출하였다.
도 4에서 보는 바와 같이, 야생형 타겟 핵산 서열을 포함하는 샘플(-○-)은 25.84의 Ct 값을 갖는 타겟 시그널을 나타내어 샘플 내에 야생형 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내었다. 반면, 돌연변이형 타겟 핵산 서열을 포함하는 샘플(-△-) 및 야생형 및 돌연변이형 타겟 핵산 서열을 포함하지 않는 샘플(-X-)은 상기 역치를 초과하는 타겟 시그널을 나타내지 않아 샘플 내에 야생형 타겟 핵산 서열의 부존재를 나타내었다.
상기 결과는 본 발명의 PTOCE-E 분석을 사용하여 타겟 핵산 서열 내의 단일 뉴클레오타이드 변이를 구별하여 검출할 수 있음을 보여준다. 본 실시예에서는 야생형 타겟 핵산 서열의 검출을 예시하고 있으나, 당업자라면 돌연변이형 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 동일한 방식으로 돌연변이형 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seegene, INC. <120> Detection of target nucleic acid sequences by PTO cleavage and extension-dependent extension assay <130> PP180044KR <150> KR 10-2017-0128110 <151> 2017-09-29 <150> PCT/KR 2018/011373 <151> 2018-09-27 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: FPm <400> 1 atgttctaat atagtcacat tttcatt 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: RPm <400> 2 ctctattgtt ggatcatatt cgtc 24 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: PTO <400> 3 gtcgcgcgta atcggtggcg taggcaagag tgccttga 38 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: First CTO <400> 4 gtacgcggtc gacggtgcga ttacgcgcga c 31 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: Second CTO <400> 5 ggtggatgac gcgcgttttg tacgcggtcg acgg 34

Claims (21)

  1. 다음 단계를 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTO Cleavage and Extension-dependent Extension: PTOCE-E) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3'-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO의 5'-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5'-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 PTO 단편을 방출하며;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 제1 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(First Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제1 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO 단편에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO 단편은 상기 제1 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서, 상기 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 PTO 단편은 연장되어 상기 제1 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제1 연장서열을 포함하는 제1 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제1 연장가닥과 제1 CTO 간에 제1 연장 이합체를 형성하며,
    (e) 상기 제1 연장가닥과 제2 CTO를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제2 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 제1 연장가닥은 상기 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (f) 상기 단계 (e)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서, 상기 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 제1 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제2 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체를 형성하며;
    (g) 상기 제2 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제2 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 CTO의 캡처링 부위는 제1 연장서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2 연장 이합체는 (i) 상기 PTO 단편 및/또는 제2 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장 반응 동안 상기 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장 반응 동안 상기 제1 연장가닥 및/또는 제2 연장가닥 내에 삽입된 표지 및 상기 제2 CTO에 연결된 최소 하나의 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 제2 연장가닥의 존재는 상기 제2 연장 이합체로부터의 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 연장 이합체는 표지 및 핵산 절단효소에 대한 절단 부위를 포함하고, 상기 제2 연장 이합체는 상기 절단 부위에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재는 상기 제2 연장 이합체를 핵산 절단효소에 의하여 절단시키고, 상기 절단에 의해 발생된 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방법은 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고; 상기 SO는 제2 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하며; 상기 SO는 상기 제2 연장가닥에의 혼성화에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고; 상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재는 상기 SO를 상기 제2 연장가닥에 혼성화시키고, 상기 혼성화에 의해 발생된 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 방법은 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하며; 상기 SO는 제2 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하고; 상기 SO와 상기 제2 연장가닥 간의 혼성화물은 핵산 절단효소에 대한 절단 부위를 포함하며, 상기 혼성화물은 상기 절단 부위에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재는 상기 혼성화물을 핵산 절단효소에 의하여 절단시키고, 상기 절단에 의해 발생된 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 방법은 혼성화 뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide; HO)를 추가적으로 사용하며; 상기 HO는 제2 CTO에 대한 혼성화 올리고뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하고; 상기 HO와 상기 제2 CTO 간의 혼성화물은 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재는 상기 혼성화물로부터의 시그널을 측정함으로써 검출되며, 상기 혼성화물로부터의 시그널의 존재는 상기 제2 연장가닥의 부존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 방법은 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilizing Oligonucleotide; IO)를 추가적으로 사용하며; 상기 IO는 제2 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 제2 연장가닥은 표지를 포함하며, 상기 IO는 상기 제2 연장가닥에의 혼성화에 의해 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (g)에서 제2 연장가닥의 존재는 상기 IO를 상기 제2 연장가닥에 혼성화시키고, 상기 혼성화에 의해 발생된 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 방법은 변성을 포함하여 단계 (a)-(g)의 전체 또는 일부를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 상기 단계 (d)의 주형-의존적 핵산 중합 효소 및 단계 (f)의 주형-의존적 핵산 중합 효소는 서로 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 방법은 제1 연장 이합체가 최소 하나의 표지를 추가적으로 포함하도록 하는 표지의 존재하에 실시되고, 상기 제1 연장 이합체에 의하여 제공되는 타겟 시그널을 검출하는 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 다음 단계를 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTO Cleavage and Extension-dependent Extension: PTOCE-E) 분석에 의하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3'-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO의 5'-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5'-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 PTO 단편을 방출하며;
    (c) 상기 PTO 단편과 제1 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(First Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제1 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO 단편은 상기 제1 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서, 상기 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 PTO 단편은 연장되어 상기 제1 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제1 연장서열을 포함하는 제1 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제1 연장가닥과 제1 CTO 간에 제1 연장 이합체를 형성하며,
    (e) 상기 제1 연장가닥과 제2 CTO를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제2 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 제1 연장가닥은 상기 제2 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (f) 상기 단계 (e)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서, 상기 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 제1 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제2 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제2 CTO 간에 제2 연장 이합체를 형성하며;
    (g) 상기 제1 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제1 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
  16. 다음을 포함하는 PTO 절단 및 연장-의존적 연장(PTO Cleavage and Extension-dependent Extension: PTOCE-E) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트:
    (a) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드;
    (b) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3'-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO의 5'-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여 상기 PTO의 상기 5'-태깅 부위 또는 상기 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 제1 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(First Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 제1 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO 단편은 상기 제1 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고; 상기 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 PTO 단편은 연장되어 제1 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 제1 연장서열을 포함하는 제1 연장가닥을 생성하고, 이에 의해 제1 연장가닥 및 제1 CTO 사이에 제1 연장 이합체를 형성하며;
    (d) 제2 CTO; 상기 제2 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 제2 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 제1 연장가닥은 추가로 연장되어 제2 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 의해 제2 연장가닥 및 제2 CTO 사이에 제2 연장이합체를 형성한다.
  17. 제16항에 있어서, 상기 PTO, 상기 제1 CTO, 또는 상기 제2 CTO는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지를 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제16항에 있어서, 상기 키트는 (i) 상기 연장 반응 동안 상기 제1 연장 이합체 및/또는 상기 제2 연장 이합체 내에 삽입되는 표지, 또는 (ii) 인터컬레이팅 표지를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제16항에 있어서, 상기 키트는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소 및 주형-의존적 핵산 중합효소 또는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 3'에서 5' 순서로 다음을 포함하는 제2 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Second Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 포함하는 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트:
    (i) 상기 제1 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위; 및
    (ii) 상기 제1 연장가닥에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위;
    상기 제1 연장가닥은 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO를 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 절단하여 PTO 단편을 방출하고, 상기 PTO 단편을 제1 CTO의 캡처링 부위에 혼성화하고, 상기 PTO 단편을 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 연장시킴으로써 형성되며;
    상기 PTO는 (i) 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위, 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함하고;
    제1 CTO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 PTO 단편에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 대한 비-혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다.
  21. 제20항에 있어서, 상기 키트는 제1 CTO를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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