KR20140112060A - Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출 - Google Patents

Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PTO 절단과 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다. 본 발명은 타겟 핵산서열과 혼성화 하여 타겟 시그널을 제공하는 프로브를 사용하지 않는다. 본 발명은 타겟-의존적(target-dependent manner)으로 형성되는 연장가닥과 혼성화하는 프로브(시그널링 올리고뉴클레오타이드)를 이용하며, 상기 연장가닥은 인위적으로 선택된 서열을 갖는 CTO를 템플레이트로하여 합성된다.

Description

ＰＴＯ 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출{Detection of Target Nucleic Acid Sequence by PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization Assay}
본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다.
DNA 혼성화(hybridization)는 분자 생물학의 기본적인 과정이며, 이온 강도, 염기 구성, 핵산 단편의 길이, 미스매칭 정도 및 변성제의 존재에 의해 영향을 받는다. DNA 혼성화-기반 기술은 특정 핵산서열 결정에 매우 유용한 도구가 될 것이며, 임상 진단, 유전자 연구 및 법의학적인 실험 분석에 명확하게 도움이 될 것이다.
그러나, 혼성화에만 의존하는 종래 방법 및 과정에서는 프로브와 비-타겟 서열간의 비-특이적인 혼성화로 인한 위양성 결과가 발생할 가능성이 높다. 따라서, 종래 방법 및 과정은 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 남아 있다.
프로브 혼성화 과정 이외에도 추가적으로 효소적 반응을 이용한 몇몇 접근법들, 예컨대, TaqManTM 프로브 방법이 제시되었다.
TaqManTM 프로브 방법에서, 타겟 핵산서열에 혼성화된 표지 프로브는 업스트림 프라이머-의존적 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되어, 타겟 서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생시킨다(미국 특허 제5,210,015호, 제5,538,848호 및 제6,326,145호). TaqManTM 프로브 방법은 시그널 발생을 위한 두 가지 접근법을 제시한다: 중합-의존적 절단(polymerization-dependent cleavage) 및 중합-독립적 절단(polymerization-independent cleavage). 중합-의존적 절단에서, 업스트림 프라이머의 연장은 반드시 핵산 중합효소가 표지 프로브의 5’-말단에 접촉하기 전에 발생되어야 한다. 연장반응이 진행되면서, 중합효소는 표지 프로브의 5’-말단을 점점 절단한다. 중합-독립적 절단에서, 업스트림 프라이머 및 표지 프로브는 매우 근접하여 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 업스트림 프라이머의 3’-말단과 핵산 중합효소의 결합은 상기 핵산 중합효소가 표지 프로브의 5’-말단에 접촉하도록 하여 표지가 방출된다. 또한, TaqManTM 프로브 방법은, 그의 5’-말단 부위에 타겟 서열과 혼성화 되지 않는 5’-테일구역을 갖는 표지 프로브가 절단되어 5’-테일 구역을 포함하는 단편이 형성되는 것을 개시하고 있다.
타겟 서열에 비-상보적인 5’-테일 구역을 갖는 프로브가 5’뉴클레아제에 의하여 절단되어 5’-테일 구역을 포함하는 단편이 방출되는 몇몇 방법들이 보고되었다.
예를 들어, 미국 특허 제5,691,142호는 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되는 절단구조를 개시하고 있다. 주형에 대해 비-상보적인 5’-부위 및 주형에 대해 상보적인 3’-부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 주형에 혼성화 되고, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 매우 근접하여 주형에 혼성화 되는 절단 구조가 예시되어 있다. 절단구조는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 감소된 합성 활성을 갖는 변형 DNA 중합효소에 의하여 절단되어 주형에 비-상보적인 5’-부위가 방출된다. 그 후 방출된 5’-부위는 헤어핀 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 절단구조를 형성하고, 이에 의해 점진적인 절단반응이 유도되어 타겟 서열이 검출된다.
미국 특허 제7,381,532호는, 3’-말단이 블록킹된 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 갖는 절단구조가, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제에 의하여 절단되어 비-상보적인 5’플랩(flap)부위가 방출되고, 방출된 5’플랩부위는 크기 분석 또는 상호작용적-이중표지에 의하여 검출되는 과정을 개시하고 있다. 미국 특허 제6,893,819호는, 검출가능한 방출된 플랩이 핵산 합성 의존적인, 플랩-매개 연속적 증폭 방법에 의하여 생성되는 것을 개시하고 있다. 이 방법에서, 첫 번째 절단구조로부터 방출된 플랩은, 핵산 합성 의존적인 방식으로 두 번째 절단구조를 절단하여 두 번째 절단구조로부터 플랩을 방출시키며, 방출된 플랩들을 검출한다.
액상에서의 형광-표지 프로브의 혼성화에 의하여, 한 종류의 형광 표지를 이용하더라도 멜팅 커브 분석에 의하여 다수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출할 수 있다. 그러나, 상호작용적-이중표지 프로브의 5’뉴클레아제-매개 절단에 의하여 타겟 서열을 검출하는 종래 기술은, 멀티플렉스 타겟 검출에서 서로 상이한 타겟 서열에 대하여 서로 상이한 종류의 형광 표지를 필요로 하며, 이러한 형광 표지 종류 수의 한계 때문에 검출되는 타겟 서열의 수는 제한된다.
미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 타겟 핵산서열에 비-상보적인 5’부위를 갖는 프로브의 절단 및 캡처(capture) 프로브의 혼성화를 이용한 타겟 검출 방법을 개시하고 있다. 표지는 비-상보적인 5’부위에 위치한다. 타겟 서열에 혼성화된 표지 프로브는 절단되어 단편을 방출하며, 이후 단편은 캡처 프로브에 혼성화 되어 타겟 서열의 존재가 검출된다. 이 방법에서, 비절단된/온전한(uncleaved/intact) 프로브는 캡처 프로브에 혼성화 되지 않는 것이 필수적이다. 이를 위해서는, 짧은 길이를 갖는 캡처 프로브가 고상 기질 상에 고정화되어야 한다. 그러나, 이러한 제한은 고상 기질에서의 혼성화의 효율성을 낮게 하고, 또한 반응 조건의 최적화도 어렵게 한다.
따라서, 보다 편리하고, 신뢰성 및 재현성이 있는 방식으로, 혼성화 뿐만 아니라 5’뉴클레오절단반응(5’nucleolytic reaction)과 같은 효소적 반응에 의하여 액상 및 고상에서 타겟 서열, 보다 바람직하게는 복수의 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 접근법에 대한 개발 요구가 대두되고 있다. 더욱이, 당업계에서 표지(특히, 형광 표지) 종류의 수에 제한받지 않는 신규한 타겟 검출 방법이 요구되고 있다.
그러므로, 종래 기술의 단점을 극복하면서 더욱 편리하고 신뢰할 만하며 재현가능한 방식으로 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는 방법에 대한 개발 요구가 계속되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 특히, 멀티플렉스 방식에서 타겟 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이 신규한 프로토콜에 따르면 타겟 검출은 프로브의 혼성화 뿐 만 아니라 5’뉴클레오절단반응(5’nucleolytic reaction) 및 연장 등의 효소적 반응과 연장반응-의존적 혼성화 반응을 포함한다. 본 발명의 프로토콜은 고상 반응뿐만 아니라 액상 반응에서도 잘 적용되며, 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고 복수의 타겟 서열이 검출되도록 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용하여 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 PCE-SH를 이용하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용하여 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO보다 업스트림에 위치하고;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며,
(e) 상기 연장가닥과 SO(Signaling Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고 최소 하나의 표지가 결합되어 있으며; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 검출 가능한 시그널을 제공하고; 및
(f) 상기 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 연장가닥의 존재를 나타내고, 상기 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 특히, 멀티플렉스 방식에서 타겟 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이 신규한 프로토콜에 따르면 타겟 검출은 프로브의 혼성화뿐만 아니라 5’뉴클레오절단반응(5’nucleolytic reaction) 및 연장 등의 효소적 반응과 연장반응-의존적 혼성화 반응을 포함한다. 본 발명의 프로토콜은 고상 반응뿐만 아니라 액상 반응에서도 잘 적용되며, 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고 복수의 타겟 서열이 검출되도록 한다.
본 발명은 프로브 혼성화에 의해 발생되는 events 즉 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)의 절단과 연장반응 및 연장반응-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화 반응을 이용하여 실시되며, 이에 “PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH) 분석”으로 명명된다.
본 발명을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 타겟 핵산서열과 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 PTO의 혼성화
본 발명의 방법에 따르면, 우선 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화 시킨다.
본 명세서에서 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산서열”또는 “타겟 서열”은 최종적으로 검출하고자 하는 서열을 의미하며, 특정 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브”는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일가닥 핵산 분자이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 핵산가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.
바람직하게는, 프로브 및 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일가닥이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMPs(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도의 길이를 가져야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 용어 “혼성화(hybridizing)”는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 타겟 핵산서열의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분 및 이들의 pH 및 이온세기와 같은 조건은 올리고뉴클레오타이드(업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO)의 길이 및 GC 양 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 낮은 엄격조건(stringent condition)을 선택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명에서 이용되는 PTO 및 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 상보적(substantially complementary)” 및 “완전히 상보적(perfectly complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 발명에서 이용되는 PTO의 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)의 템플레이팅 부위는 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “비-상보적”은 소정의 어닐링 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 특정 서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 비-상보적(substantially non-complementary)” 및 “완전히 비-상보적(perfectly non-complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
예를 들어, PTO의 5’-태깅 부위를 언급하면서 사용되는 용어 “비-상보적”은 소정의 어닐링 또는 엄격조건하에서 상기 5’-태깅 부위가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, “실질적으로 비-상보적(substantially non-complementary)” 및 “완전히 비-상보적 (perfectly non-complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
본 발명에서 채택되는 용어 “프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)”는 (i) 프로브 역할을 하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 타겟 핵산서열에 혼성화 후 후속적으로 PTO로부터 해리되는 5’-태깅 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위는 반드시 5’to 3’순서로 위치한다. PTO는 도 1에 예시되어 있다.
바람직하게는, 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화되고 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않는 엄격조건 하에서 단계 (a)의 혼성화가 실시된다.
PTO는 특정한 길이를 요구하지 않는다. 예를 들어, PTO는 15-150 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-150 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 30-150 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드, 30-50 뉴클레오타이드, 35-100 뉴클레오타이드, 35-80 뉴클레오타이드, 35-60 뉴클레오타이드, 또는 35-50 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. PTO의 3’-타겟팅 부위는 타겟 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 3’-타겟팅 부위는 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. PTO의 5’-태깅 부위는 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)의 템플레이팅 부위에 특이적으로 결합하여 연장될 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 5’-태깅 부위는 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
PTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널(terminal)을 가질 수도 있다. 바람직하게는, PTO의 3’-말단은 “블록킹”되어 그의 연장이 방지된다.
블록킹은 종래 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
택일적으로, PTO는 헤어핀 구조를 가지도록 디자인될 수 있다.
본 발명에서 상기 PTO의 5’-태깅 부위가 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않는다는 것은 주어진 혼성화 조건에서 상기 PTO의 5’-태깅 부위가 타겟 핵산서열과 안정적인 이중가닥을 형성하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 PTO의 5’-태깅 부위가 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않고 단일 가닥을 형성한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 업스트림에 위치한다.
또한, 타겟 핵산서열에 혼성화된 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 PTO 절단의 유도는 두 가지 방식으로 달성될 수 있다: (ⅰ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도; 및 (ⅱ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-의존적 절단 유도.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 PTO의 절단반응을 유도할 정도로 PTO에 근접해 있는 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 결합한 상기 효소는 연장반응 없이도 PTO를 절단한다. 반면에, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO로부터 이격되어 있는 경우, 중합효소 활성을 갖는 효소(예컨대, 주형-의존적 중합효소)는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프라이머)의 연장을 촉진시키고, 연장산물에 결합된 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 PTO를 절단한다.
따라서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 두 가지 방식으로 PTO에 대하여 상대적으로 위치할 수 있다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-독립적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO에 근접한 위치에 위치할 수 있다. 택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO로부터 이격된 위치에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 지점(positions) 또는 위치(locations)를 언급하면서 사용되는 용어“근접(adjacent)”은 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위 바로 가까이에 위치하여 닉(nick)을 형성하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위로부터 1-30 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드 또는 1-15 뉴클레오타이드 이격되어 위치하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 지점 또는 위치를 언급하면서 사용되는 용어“이격(distant)”은 연장반응이 일어나는데 충분할 정도의 어떠한 위치 또는 장소를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 PTO로부터 이격되어 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다. 업스트림 프라이머는 연장-독립적 절단 유도 또는 연장-의존적 절단에 적합하며, 업스트림 프로브는 연장-독립적 절단 유도에 적합하다.
선택적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 가질 수 있다. 바람직하게는, 겹치는 서열은 1-10 뉴클레오타이드 길이이며, 보다 바람직하게는 1-5 뉴클레오타이드, 보다 더욱 바람직하게는 1-3 뉴클레오타이드이다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 갖는 경우, 단계 (b)의 절단반응에서 3’-타겟팅 부위는 5’-태깅 부위와 함께 부분적으로 절단된다. 또한, 겹치는 서열은 3’-타겟팅 부위의 원하는 특정 위치가 절단되도록 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥에 의해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단반응을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO의 절단을 유도하여 PTO의 5’-태깅 부위 또는 PTO의 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편이 방출되는 한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 절단반응 관련 종래 기술들은 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호, 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 본 발명에 응용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시한다. 다운스트림 프라이머는 PTO가 혼성화 될 수 있는 타겟 핵산서열을 추가적으로 생성시켜 본 발명의 검출 민감도를 향상시킨다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 사용하는 경우, 상기 프라이머들의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소를 추가적으로 사용한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브), 다운스트림 프라이머 및/또는 PTO의 5’-태깅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는다. DPO 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 종래 프라이머 및 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이도를 나타낸다(참조 WO 2006/095981; Chun 등, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, PTO의 3’-타겟팅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는다. 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조는 종래 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2011/028041).
단계 (b): PTO로부터 단편의 방출
이어, PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시킨다. 상기 타겟 핵산서열에 혼성화된 상기 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의해 절단되어 상기 PTO의 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “PTO의 절단을 위한 조건”은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 타겟 핵산서열에 혼성화된 PTO의 절단이 발생되는 데 충분한 조건, 예컨대 온도, pH, 이온세기, 버퍼, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 효소를 의미한다. 예를 들어, 5’뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, PTO의 절단을 위한 조건은 Tris-HCl 버퍼, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.
PTO가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우, PTO의 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화 되지만 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않고 단일가닥을 형성한다(참조: 도 2). 이와 같이, 단일-가닥 및 이중-가닥 구조 모두를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 5’뉴클레아제활성을 갖는 효소를 이용하여 절단될 수 있다.
PTO의 절단 위치는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프로브 또는 업스트림 프라이머)의 종류, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 위치 및 절단 조건에 따라 다양해진다(참조 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호 및 제7,381,532호 또는 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호).
본 발명은 PTO의 절단을 위하여 종래에 알려진 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.
종합하면, 단계 (b)의 절단 반응에서 세 가지 절단 위치가 있을 수 있다. 첫 번째 절단 위치는 PTO의 혼성화 부위(3’-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5’-태깅 부위) 간의 정션 위치(junction site)이다. 두 번째 절단 위치는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다. 두 번째 절단 위치는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 (5‘-end part)에 위치할 수 있다. 세 번째 절단 위치는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 5’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머가 연장되면서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소에 의하여 PTO의 절단이 시작되는 위치는 PTO 및 타겟 핵산서열 간의 이중가닥이 시작되는 지점 또는 그 시작 지점으로부터 1-3 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.
따라서, 본 명세서에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 언급하면서 사용되는 용어 “PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 (i) 5’-태깅 부위, (ii) 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 (iii) 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에서 용어 “PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 “PTO 단편”으로 표현된다.
본 명세서에서 PTO의 5’-태깅 부위의 일부, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부와 같이 PTO 또는 CTO를 언급하면서 사용되는 용어 “일부(part)”는 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오타이드이다.
본 명세서의 바람직한 일 구현예에 따르면, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이며 보다 바람직하게는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이다.
본 발명에 적합한 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함한다. 가장 바람직하게는, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
택일적으로, 5’뉴클레아제 활성은 갖지만 중합 활성은 감소되도록 변형된 DNA 중합 효소를 사용할 수 있다.
사용되는 FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 5’플랩-특이적 뉴클레아제(5’flap-specific nuclease)이다.
본 발명에 적합한 FEN 뉴클레아제는 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 FEN 뉴클레아제를 포함하며, 이는 Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix 및Archaeaglobus veneficus를 포함한다.
단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하여 실시하는 경우 상기 PTO의 절단을 위한 조건은 업스트림 프라이머의 연장반응을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 상기 업스트림 프라이머를 이용하며, 상기 업스트림 프라이머를 연장하기 위하여 주형-의존적 중합효소를 사용한다. 상기 주형-의존적 중합효소는 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일하거나 다른 효소일 수 있다.
선택적으로, 단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하며, 상기 업스트림 프라이머를 연장하기 위하여 주형-의존적 중합효소를 사용하고, 상기 주형-의존적 중합효소는 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 서로 다른 효소이다.
단계 (c): PTO로부터 방출된 단편과 CTO의 혼성화
상기 PTO로부터 방출된 단편은 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)와 혼성화 된다.
CTO는 3’에서 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다.
CTO는 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 주형의 역할을 한다. 상기 단편은 프라이머로서 CTO에 혼성화되고, 연장되어 이합체를 형성한다.
템플레이팅 부위는 PTO의 5’-태깅 부위와 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 서열을 갖는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 또한, 템플레이팅 부위는 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 템플레이트 기능을 할 수 있는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, PTO의 5’-태깅 부위를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인 하는 것이 바람직하다. 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인 하는 것이 바람직하다. PTO의 5’-태깅 부위의 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인 하는 것이 바람직하다.
한편, PTO의 절단 위치를 예상함으로써 CTO의 캡처링 부위를 디자인할 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위가 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인하는 경우, 5’-태깅 부위의 일부를 갖는 단편 또는 5’-태깅 부위를 갖는 단편은 캡처링 부위와 혼성화 될 수 있으며 이후 연장된다. 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, 상기 단편은 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인된 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 될 수 있으며, 상기 단편의 3’-말단 부위에 미스매치 뉴클레오타이드가 존재함에도 불구하고, 성공적으로 연장될 수 있다. 이것은 프라이머의 3’-말단이 일부 미스매치 뉴클레오타이드(예컨대, 1-3 미스매치 뉴클레오타이드)를 포함함에도 불구하고, 프라이머가 반응 조건에 따라 연장될 수 있기 때문이다.
5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부는 상기 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 디자인함으로써 미스매치 뉴클레오타이드와 관련된 문제를 해결할 수 있다(참조: 도 1).
바람직하게는, 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 PTO의 3’-타겟팅 부위 상의 예상되는 절단 위치에 따라 선택될 수 있다. 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 1-10 뉴클레오타이드인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1-5 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 1-3 뉴클레오타이드이다.
CTO의 3’-말단은 단편과의 혼성화에 포함되지 않는 추가적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, CTO가 상기 단편과 안정되게 혼성화 되는 한, CTO의 캡처링 부위는 상기 단편의 일부(예컨대, 단편의 3’-말단 부위를 포함하는 단편의 일부)에만 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위”는 상술한 바와 같이 CTO의 캡처링 부위의 다양한 디자인 및 구성을 포함하여 설명한다.
CTO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인될 수 있다.
CTO의 길이는 다양해 질 수 있다. 예를 들어, CTO는 7-1000 뉴클레오타이드, 7-500 뉴클레오타이드, 7-300 뉴클레오타이드, 7-100 뉴클레오타이드, 7-80 뉴클레오타이드, 7-60 뉴클레오타이드, 7-40 뉴클레오타이드, 15-1000 뉴클레오타이드, 15-500 뉴클레오타이드, 15-300 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-1000 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드, 30-1000 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-40 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. CTO의 캡처링 부위는 PTO로부터 방출된 단편에 특이적으로 혼성화 되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위는 5-100 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 또한, CTO의 템플레이팅 부위는 PTO로부터의 방출 단편의 연장반응에서 템플레이트 기능을 할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, CTO의 템플레이팅 부위는 1-900 뉴클레오타이드, 1-400 뉴클레오타이드, 1-300 뉴클레오타이드, 1-100 뉴클레오타이드, 1-80 뉴클레오타이드, 1-60 뉴클레오타이드, 1-40 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드, 2-900 뉴클레오타이드, 2-400 뉴클레오타이드, 2-300 뉴클레오타이드, 2-100 뉴클레오타이드, 2-80 뉴클레오타이드, 2-60 뉴클레오타이드, 2-40 뉴클레오타이드, 2-20 뉴클레오타이드, 5-900 뉴클레오타이드, 5-400 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 10-900 뉴클레오타이드, 10-400 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 15-900 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
CTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널을 가질 수 있다. 바람직하게는, CTO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다. CTO의 비-연장 블록킹은 종래 방법들에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 CTO의 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
PTO로부터 방출된 단편은 CTO와 혼성화 되며, 단편의 연장에 적합한 형태를 제공한다. 또한, 비절단 PTO가 그의 5’-태깅 부위를 통하여 CTO의 캡처링 부위와 혼성화 되더라도, PTO의 3’-타겟팅 부위는 CTO에 혼성화 되지 않아, 연장이합체의 형성이 방지된다.
단계 (c)에서의 혼성화는 단계 (a)에서의 혼성화에 대한 설명을 참조하여 상세하게 설명될 수 있다.
단계 (d): 단편의 연장
이어, 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시한다. 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성한다. 반면, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 비절단 PTO는 연장되지 않고 연장가닥을 형성하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “연장이합체”는 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 된 단편이 주형-의존적 핵산 중합효소와 CTO의 템플레이팅 부위를 주형으로 이용하여 연장되는 연장반응에 의하여 형성된 이합체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 단편을 언급하면서 사용되는 용어 “연장가닥(extended strand)”은 단편과 이의 연장서열을 포함하는 의도로 사용된 용어이다.
본 명세서에서 용어 단편을 언급하면서 사용되는 용어 “연장서열(extended sequence)”은 연장가닥에서 단편을 제외한 새롭게 연장된 서열만을 지칭하는 의도로 사용된 용어이다.
단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 어떠한 핵산 중합효소도 포함되며, 예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus and Aquifex aeolieus를 포함한다. 가장 바람직하게는 주형-의존적 핵산 중합효소는 Taq 중합효소이다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 주형-의존적 핵산 중합효소는 역전사효소를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 단계 (d)의 주형-의존적 핵산 중합효소는 동일한 효소이다. 보다 바람직하게는, 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 업스트림 프라이머를 연장하기 위한 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (d)의 주형-의존적 핵산 중합효소는 동일한 효소이다.
단계 (e): 연장가닥과 SO의 혼성화에 의한 시그널 생성
상기 연장반응에 이어, 상기 단계 (d)의 연장가닥과 SO(Signaling Oligonucleotide)를 혼성화 시킨다. 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널이 생성된다. 시그널은 시그널 생성 또는 소멸, 또는 시그널 변화(시그널 증가 또는 감소)를 포함한다.
연장가닥에 혼성화되는 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함한다.
SO가 PTO 단편에 해당하는 부위에만 상보적인 서열을 포함하는 경우, 하기한 시그널링 방법 중 일부 방법에서는 비절단 PTO와 SO의 혼성화물 생성에 의한 비-타겟 시그널이 생성되지 않을 수 있다.
도 6에 도시된 바와 같이, 연장가닥에 삽입되는 표지의 위치가 적절히 조절되는 경우, PTO 단편에만 상보적인 서열을 포함하는 상기 SO를 사용하더라도 비-타겟 시그널은 생성되지 않을 수 있다.
한편, SO가 PTO 단편에만 상보적인 서열을 포함하는 경우, 하기한 시그널링 방법 중 일부 방법에서는 비절단 PTO 및 상기 SO의 혼성화 때문에 비-타겟 시그널이 생성될 수 있다(예를 들어, 도 2의 시그널링 시스템).
비-타겟 시그널이 문제가 될 경우, SO 부위는 새로이 합성되는 연장 서열 부위에 상보적인 서열을 포함하도록 디자인되어야 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 상기 연장서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO의 최소 한 부위는 연장서열에 상보적인 서열을 포함한다. 상기 연장서열에 상보적인 서열을 포함하는 SO 부위의 뉴클레오타이드 길이는 최소 1, 2, 3, 4, 5 또는 10개이다.
SO 부위가 새롭게 생성된 연장서열의 일부와 상보적인 서열을 포함하도록 디자인하면, SO와 연장가닥의 혼성화물의 Tm 값과 SO와 비절단 PTO의 혼성화물의 Tm 값은 달라진다. 상기 Tm 값의 차이는 상기 두 혼성화물로부터 제공되는 시그널을 구별할 수 있도록 해준다. 예를 들어, 실시간 검출시에는 상기 Tm 값을 고려하여 검출 온도를 조절하여 비-타겟 시그널을 제거할 수 있으며, 또는 멜팅 피크(melting peak)에 의한 멜팅 커브 분석에서 비-타겟 시그널을 제거할 수 있다.
바람직하게는 SO는 그의 서열 전체적으로 상기 연장서열에 상보적인 서열을 포함한다. 택일적으로 SO는 연장서열에 상보적인 서열을 갖는 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, SO의 한 부위는 연장서열에 상보적인 서열을 포함하고 다른 부위는 상기 절편에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는 SO는 그의 서열 전체적으로 상기 연장서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본 발명에서 이용되는 SO의 길이는 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 5-10 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 15-20 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
SO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인될 수 있다.
바람직하게는 SO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있다.
택일적으로, 블록킹되지 않은 -OH기를 가지는 SO는 연장될 수 있다.
본 발명에서 채택된 시그널링 시스템은 SO의 혼성화 반응과 시그널 생성이 연관되도록 한 것에 특징이 있다. 즉, SO와 연장가닥이 혼성화되면 검출가능한 시그널이 제공된다. SO와 연장가닥의 혼성화 반응은 타겟 핵산서열이 존재하여 PTO가 절단되는 경우에만 발생된다. 그러므로, 검출가능한 시그널은 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다. 따라서, 요구에 따라 본 발명은 실시간 방식으로 실시할 수 있다.
SO의 혼성화 반응과 시그널 제공을 직접적으로 연관시키기 위하여, 본 발명은 SO에 결합된 최소 하나의 표지를 이용한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 검출가능한 시그널은 (i) 상기 SO에 결합되어 있는 표지, (ii) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 PTO에서 방출된 단편에 결합된 표지, (iii) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 단계 (d)의 연장 반응 동안 상기 연장가닥에 삽입되는 표지 또는 (iv) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 인터컬레이팅 색소(intercalating dyes)로부터 제공된다.
본 발명에서 사용된 표지 시스템은 다음과 같이 상세히 기재될 수 있다:
(ⅰ) SO에 결합된 단일표지
본 발명은 단일표지를 이용하여 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 연장가닥 형성에 대한 시그널을 제공할 수 있다(참조: 도 3).
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO는 단일표지가 결합되어 있고 상기 단계 (e)에서 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 단일표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 단일표지는 표지가 결합되어 있는 핵산서열이 단일 가닥인 경우와 이중 가닥인 경우 서로 다른 시그널을 제공한다. 상기 단일 표지는 형광 표지, 발광(luminescent) 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, 전기화학적(electrochemical) 표지 및 금속 표지를 포함한다.
바람직하게는, 상기 단일표지는 표지가 결합되어 있는 핵산서열이 단일 가닥인지 또는 이중 가닥인지에 따라 서로 다른 세기(intensity)의 형광을 제공한다.
도 3은 단일표지를 사용한 본 발명의 바람직한 구현예를 예시한다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 연장가닥에 혼성화된 SO에 결합된 단일표지는 혼성화되지 않은 SO에 결합된 표지보다 높은 형광을 나타낸다.
단일 형광 표지의 형광 세기의 변화(증가 또는 감소)를 측정하여 타겟 핵산서열의 존재를 검출한다.
본 발명에서 사용되는 단일 형광 표지의 종류 및 바람직한 결합위치는 미국 특허 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시된 내용을 참조할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오르세인-기반 표지(fluorescein-based label)를 포함한다. 표지된 뉴클레오타이드 잔기는 바람직하게는 5’-말단 또는 3’-말단보다 상기 올리고뉴클레오타이드 내부 뉴클레오타이드 잔기에 위치한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 SO 상의 단일표지는 5’-말단 또는 3’-말단으로부터 1-15 뉴클레오타이드, 1-10 뉴클레오타이드 또는 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있으며, 보다 바람직하게는 SO의 중앙 부위에 위치한다.
본 발명에서 사용된 단일 형광 표지는 아래 기재된 리포터 분자 및 퀀처 분자에 대한 문헌에 의해 설명될 수 있다.
(ii) SO 가닥내(intrastrand) 상호작용적-이중표지
상호작용적 표지 시스템은 공여자 분자 및 수용자 분자 사이에 에너지가 비-방사능적(non-radioactively) 방식으로 패싱되는 시그널 발생 시스템(signal generating system)을 의미한다. 상호작용적 표지 시스템의 대표적인 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여자 분자) 및 퀀처 분자(수용자 분자)를 포함한다. FRET에서, 에너지 공여자는 형광성이지만, 에너지 수용자는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 예에서, 에너지 공여자는 비-형광성, 예컨대, 발색단(chromophore)이고, 에너지 수용자가 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 예에서, 에너지 공여자는 발광성, 예컨대 생물발광(bioluminescent), 화학발광(chemiluminescent), 전기화학발광(electrochemiluminescent)이고, 에너지 수용자가 형광성이다. 본 발명에서 공여자 분자 및 수용자 분자는 각각 상술한 리포터 분자 및 퀀처 분자일 수 있다.
바람직하게, 연장가닥의 생성을 나타내는 시그널(즉, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널)은 상호작용적 표지 시스템에 의해 발생되며, 보다 바람직하게는 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중표지 시스템)에 의해 발생된다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지가 결합되어 있고, 단계 (e)에서 SO와 연장가닥 사이의 혼성화는 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다. 상기 SO가 혼성화되기 전에는 상기 SO 상의 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적(conformational)으로 서로 근접하게 되어 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 상기 SO가 혼성화되면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하여, 상호작용적 이중표지로부터의 시그널 변화를 초래한다.
도 2는 상호작용적 이중표지를 사용한 본 발명의 바람직한 구현예를 예시한다. 타겟 핵산서열과 혼성화된 PTO로부터 방출된 단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되고, 연장되어 연장가닥이 생성된다. 연장가닥과 SO가 혼성화하면, SO 상의 상기 퀀처분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화(예컨대, 리포터 분자로부터의 시그널 증가)를 초래한다. 한편, 타겟 핵산서열이 없는 경우, PTO는 절단되지 않으며 비절단 PTO가 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되지만 연장되지 않는다. 혼성화 되지 않은 SO에 결합되어 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하게 되어 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다.
본 명세서에서 사용되는 표현 “리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 근접한”은 단편 또는 SO의 형태적 구조(conformational structure), 예컨대 랜덤 코일(coli) 및 헤어핀 구조에 의해 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3 차원적으로 서로 인접하게 되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적(conformational)으로 이격”은 SO가 연장가닥과 혼성화되어 이중가닥이 형성되면서 SO의 형태적 구조(conformational structure) 변화로 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 이격되는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 SO의 5’-말단(또는 3’-말단) 및 3’-말단(또는 5’-말단)에 위치한다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 5’-말단 또는 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고, 나머지 하나는 SO의 형태 (conformation)에 따라 리포터 분자의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 3’-말단 또는 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고, 나머지 하나는 SO의 형태에 따라 리포터 분자의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 80 뉴클레오타이드 이내, 보다 바람직하게는 60 뉴클레오타이드 이내, 보다 더 바람직하게는 30 뉴클레오타이드 이내, 보다 더욱 더 바람직하게는 25 뉴클레오타이드 이내에서 이격되어 위치한다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 최소 6 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 최소 10 뉴클레오타이드, 보다 더욱 더 바람직하게는 최소 15 뉴클레오타이드 이격된다.
본 발명에서 이용되는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 상기 형광 표지의 구체적인 예는 다음과 같다: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 또는 플루오르세인-기반 표지(fluorescein-based label)를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
본 발명에서 광범위한 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비형광 블랙 퀀처 분자(또는 다크 퀀처 분자)가 사용될 수 있다는 것도 주목할 만하다. 예를 들어, BHQ 및 DABCYL이 있다.
SO에 적용된 FRET 표지에서 리포터는 FRET의 공여자를 포함하고, 퀀처는 FRET의 다른 파트너(수용자)를 포함한다. 예를 들어, 플루오세인 색소는 리포터로 사용되고 로다인 색소는 퀀처로 사용된다.
(iii) 가닥 간(interstrand) 상호작용적-이중표지
가닥 간 상호작용적-이중표지를 사용하는 구현예에서, 연장가닥은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 하나를 가지며, 퀀처 분자 및 SO는 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 갖는다.
가닥 간 상호작용적-이중표지를 사용하는 구현예는 다음의 세 가지 방식에 따라 실시될 수 있다:
첫 번째 방식에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 포함하며, 상기 연장가닥은 상기 PTO로부터 방출된 단편에서 유래된 표지를 포함하고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다(참조: 도 5).
SO에 결합되는 표지는 리포터 분자 또는 퀀처 분자일 수 있고, 단편에 결합된 표지는 퀀처 분자 또는 리포터 분자일 수 있다.
PTO의 절단위치를 고려하여 PTO 상 표지 위치를 결정함으로써, PTO 단편 상에 표지가 존재하게 할 수 있다.
SO와의 혼성화에서 SO에 결합된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 표지는 PTO 단편의 어떠한 위치(예컨대, PTO의 태깅부위)에도 결합할 수 있다. PTO 단편과의 혼성화에서 PTO 단편에 결합된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 표지는 SO의 어떠한 위치(예컨대, SO의 5’-말단)에도 결합할 수 있다.
두 번째 방식에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 제1의 비-자연적 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 단계 (d)의 연장반응은 상기 제1의 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 제2의 비-자연 염기 및 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장가닥에 표지가 삽입되고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다(참조: 도 6).
본 명세서에서 사용된 용어 “비-자연 염기”는 수소결합 염기 쌍을 형성할 수 있는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 사이토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연적 염기(natural base)의 유도체를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “비-자연 염기”는 모화합물(mother compound)인 자연적 염기와 상이한 염기 쌍 패턴을 갖는 염기를 포함하며, 예를 들어, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호 및 제6,037,120호에 기재된 바와 같다. 비-자연 염기들 사이의 염기 쌍은 자연적 염기와 유사하게 둘 또는 세 개의 수소결합을 포함한다. 비-자연 염기들 사이의 염기 쌍도 특정한 방식으로 형성된다.
비-자연 염기의 특정한 예로 다음의 염기들의 염기 쌍 조합을 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J, 및 M/N(참조: 미국 특허 제7,422,850호).
연장과정에서 삽입되는 표지는 바람직하게는 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 뉴클레오타이드 트리포스페이트에 결합된다. 상기 표지는 바람직하게는 뉴클레오타이드 트리포스페이트의 염기에 결합된다.
예시된 실시예는 도 6을 참조하여 설명한다. 상기 단편은 CTO와 혼성화되며, 상기 CTO는 비-자연 염기(예를 들어, iso-dG)와 특이적 결합 친화성을 갖는 비-자연 염기(예를 들어, iso-dC)를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 연장은 퀀처로 표지된 iso-dG를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시된다. 연장 반응에서, 퀀처를 포함하는 iso-dG를 갖는 뉴클레오타이드는 iso-dC를 갖는 뉴클레오타이드의 반대쪽에 삽입된다. 이어, 리포터 분자가 표지된 SO가 퀀처분자-iso-dG를 포함하는 연장가닥에 혼성화 되면, 연장가닥에 있는 퀀처가 SO에 있는 리포터의 시그널을 퀀칭하여 시그널 변화를 초래하며, 이 시그널 변화는 검출가능한 시그널을 제공한다.
상호작용적 이중표지의 하나는 SO에 결합되며, 나머지 하나는 연장 반응 중 반응액으로부터 연장가닥에 삽입된다.
SO에 결합되는 표지는 리포터 분자 또는 퀀처 분자일 수 있고, 연장가닥에 삽입되는 표지는 퀀처 분자 또는 리포터 분자일 수 있다.
SO와의 혼성화에서 SO에 결합된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 연장가닥에 삽입되는 표지는 연장가닥의 어떠한 위치(예컨대, 연장가닥의 3’-말단)에도 결합할 수 있다. 연장가닥과의 혼성화에서 연장가닥에 삽입된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 표지는 SO의 어떠한 위치(예컨대, SO의 5’-말단)에도 결합할 수 있다.
세 번째 방식에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, 단계 (d)의 연장반응은 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장가닥에 표지가 삽입되고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다(참조: 도 7).
SO에 결합되는 표지는 리포터 분자 또는 퀀처 분자일 수 있고(바람직하게는 리포터 분자), 연장가닥에 삽입되는 표지는 퀀처 분자 또는 리포터 분자일 수 있다(바람직하게는 퀀처 분자).
(iv) 두 개의 SO를 이용한 상호작용적-이중표지
두 개의 SO를 이용한 상호작용적-이중표지의 구현예에서, 본 발명의 방법은 추가적으로 SO를 하나 더 포함하고, 상기 추가된 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하며, 상기 두 개의 SO는 상기 연장가닥에 근접하여 혼성화되고; 상기 두 개의 SO는 각각 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하며, 상기 두 개의 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다(참조: 도 4).
바람직하게는 상기 두 개의 SO 중 최소한 하나의 SO는 연장반응에서 새롭게 생성된 연장서열과 혼성화되는 부위를 포함한다.
두 개의 SO를 이용한 상호작용적-이중표지의 원리는 다음과 같다: 타겟 핵산서열과 혼성화된 PTO로부터 방출된 단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되고 연장되어 연장가닥을 형성한다. 이어 두 개의 SO는 상기 연장가닥과 혼성화된다. 혼성화에서 두 개의 SO는 서로 근접하여 연장가닥과 혼성화 되기 때문에, 두 개의 SO에 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 인접하여 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터 나오는 시그널을 퀀칭(quenching)하도록 하여 결과적으로 상호작용적 이중표지로부터 시그널의 변화(예컨대, 리포터 분자로부터의 시그널 증가)를 초래한다. 한편, 타겟 핵산서열이 없는 경우, PTO는 절단되지 않으며 비절단 PTO는 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되지만 연장되지 않는다. 혼성화 되지 않은 두 개의 SO에 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 이격되어 리포터 분자로부터 시그널을 발생시킨다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 연장가닥에 혼성화 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있도록 하는 한, 두 개의 SO는 연장가닥의 어떠한 위치에도 혼성화될 수 있다. 바람직하게는 바로 인접하거나, 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 두 개의 SO가 연장가닥에 인접하여 혼성화 되는 경우, 퀀처 분자가 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있도록 하는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 두 개의 SO의 어떠한 위치에도 결합할 수 있다. 예를 들어, 하나의 SO의 5’-말단 또는 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 결합되고, 다른 SO의 3’-말단 또는 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 퀀처 분자 또는 리포터 분자가 결합될 수 있다.
(v) 인터컬레이팅 색소를 이용한 FRET 표지
본 발명에 따르면, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 시그널링은 인터컬레이팅 색소를 이용하여 달성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO는 FRET의 수용자를 포함하고, 상기 단계 (e)의 혼성화는 인터컬레이팅 색소의 존재 하에서 실시하며; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 SO의 상기 수용자로부터의 시그널 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다(참조: 도 8).
본 발명에서 사용되는 인터컬레이팅 색소의 예는, SYBRTM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTOTM43, SYTOTM44, SYTOTM45, SYTOXTMBlue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PROTM1, TO-PROTM1, SYTOTM11, SYTOTM13, SYTOTM15, SYTOTM16, SYTOTM20, SYTOTM23, TOTO™-3, YOYOTM3, GelStarTM 및 티아졸 오렌지(thiazole orange)를 포함한다. 상기 인터컬레이팅 색소는 이중가닥 핵산 분자에 특이적으로 삽입되어 시그널을 발생시킨다.
인터컬레이팅 색소를 이용한 FRET 표지의 원리는 다음과 같다: 타겟 핵산서열과 혼성화된 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화 되고 연장되어 연장가닥을 형성한다. 이어, 수용자가 표지된 SO는 연장가닥과 혼성화 되어 이중가닥 핵산 분자를 형성하며, 인터켈레이팅 색소는 상기 이중가닥 핵산 분자에 결합한다. 공여자를 excitation을 하는 광을 조사하면 공여자 분자로 작용하는 인터켈레이팅 색소로부터 수용자로 에너지가 transfer 되고 수용자로부터의 시그널 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다. 한편, 타겟 핵산서열이 없는 경우에는 이러한 FRET 현상이 발생되지 않으며, 결과적으로 시그널 변화가 없다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO에 결합되는 수용자는 상술한 다양한 단일 형광표지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
표지는 공지된 방법에 의해 SO 또는 PTO에 연결될 수 있다. 바람직하게는, 표지는 최소한 3개의 탄소 원자를 포함하는 스페이서(spacer)(예를 들어, 3-탄소 스페이서, 6-탄소 스페이서 또는 12-탄소 스페이서)를 매개로 SO 또는 PTO에 연결된다.
본 발명에서 사용되는 SO는 혼성화에 의하여 시그널을 제공하는 어떠한 형태의 프로브를 포함하며, 예를 들면, 다음과 같다: Molecular beaconTM (US 5,925,517), HybeaconsTM (D. J. French, et al., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363374 and US 7,348,141), Dual-labeled, self-quenched probe (US 5,876,930), LUXTM (I. A. Nazarenko, et al. Nucleic Acids Res 2002, 30:2089-2095. 및 US pat no. 7,537,886) 및 Hybridization probe (Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148 and Deepti Parashar et al., Indian J Med Res 124, review article October 2006 385-398).
단계 (f): 타겟 시그널의 검출
최종적으로, 단계 (e)에서 제공되는 검출가능한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 연장가닥의 존재를 나타내고, 상기 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
상술한 바와 같이, SO의 혼성화는 혼성화 결과물의 표지로부터의 시그널링과 연동되어 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다. 따라서, 본 발명은 실시간으로 검출할 수 있는 시그널을 제공하는 표지를 사용하는 경우, 본 발명은 실시간 방식으로 실시할 수 있다.
택일적으로, 본 발명에서 이용되는 표지는 혼성화 결과물의 멜팅 또는 혼성화 결과물의 멜팅 및 혼성화 과정에서 검출 가능한 시그널을 제공할 수 있으므로 멜팅 분석을 통하여 타겟 시그널을 검출할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “멜팅 분석”은 연장이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 연장이합체의 멜팅을 통해 얻는 것을 의미하며 두 개의 다른 온도에서 시그널을 측정하는 방법, 멜팅 커브 분석, 멜팅 패턴 분석을 포함한다. 바람직하게는 멜팅 분석은 멜팅 커브 분석이다.
예를 들어, SO와 연장가닥의 이합체가 멜팅되는 경우, 단일가닥 SO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적(conformational)으로 서로 근접하여 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 시그널의 변화를 초래함으로써 검출 가능한 시그널을 제공한다. 한편, SO 및 연장가닥이 다시 혼성화되어 이합체를 형성하는 경우, SO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격되어 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 시그널의 언퀀칭을 유도하며, 시그널의 변화를 초래함으로써 검출 가능한 시그널을 제공한다(참조: 도 2).
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, PTO 단편의 연장가닥의 존재는 SO와 연장가닥 이합체의 Tm 값을 이용한 멜팅 커브 분석을 통하여 검출한다.
SO와 연장가닥 이합체의 Tm 값을 이용하여 분석하는 경우, SO와 연장가닥 간의 혼성화 결과물의 분리없이 homogeneous assay가 가능한 표지(예컨대, 형광 표지)를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO와 연장가닥 간의 혼성화 결과물은 상기 PTO 단편의 서열 및/또는 길이, 상기 CTO의 서열 및/또는 길이, 상기 SO의 서열 및/또는 길이 및 이들의 조합에 의하여 조절되는 Tm 값을 갖는다.
예를 들어, SO 서열의 미스매치 정도를 조절하여 혼성화 결과물의 Tm 값을 조절할 수 있다. 또는, SO의 길이를 조절하여 혼성화 결과물의 Tm 값을 조절할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 단계 (e)의 혼성화 결과물을 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시킴으로써 단계 (e) 및 (f) 사이에 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계 (f)는 상기 시그널을 검출하여 연장가닥의 존재를 검출한다.
택일적으로, 본 발명은 단계 (f) 후에 단계 (e)에서의 혼성화 결과물을 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널의 제공 및 검출 단계를 추가적으로 포함하며, 이로 인해 연장가닥의 존재를 한 번 더 검출한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, PTO 단편의 연장가닥 존재는 혼성화 커브 분석(hybridization curve analysis)으로 검출한다.
용어 “Tm”은 멜팅 온도를 의미한다. 상기 멜팅 온도는 이중가닥 핵산 분자 파퓰레이션(population)의 반이 단일가닥으로 해리되는 온도이다. Tm 값은 혼성화 되는 뉴클레오타이드의 길이 및 G/C 함량에 의해 결정된다. Tm 값은 Wallace rule(R.B. Wallace, et al., Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) 및 nearest-neighbor 방법(SantaLucia J. Jr., et al., Biochemistry, 35:35553562(1996)); Sugimoto N., et al., Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996))과 같은 공지된 방법에 의하여 계산될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 Tm 값은 실제 사용하는 반응 조건 하에서의 Tm 값을 의미한다.
멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 종래의 기술들 예컨대, 미국 특허 제6,174,670호 및 제5,789,167호, Drobyshev 등, Gene 188: 45(1997); Kochinsky and Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); Livehits 등, J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); 및 Howell 등, Nature Biotechnology 17:87(1999)에서 설명하는 바와 같이 얻을 수 있다. 예를 들어, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 혼성화 엄격도(stringency)의 파라미터에 대한 아웃풋 시그널(output signal) 변화의 그래픽 플롯(graphic plot) 또는 디스플레이(display)로 구성될 수 있다. 아웃풋 시그널은 혼성화 파라미터에 대하여 직접적으로 플롯팅을 할 수 있다. 전형적으로, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 예를 들어, Y-축에는 이합체 구조의 정도(즉, 혼성화 정도)를 나타내는 형광이, X-축에는 혼성화 파라미터가 플롯팅(plotting) 된 아웃풋 시그널을 갖는다.
형광 vs. 온도의 1차 도함수(derivative)의 플롯, 즉, 형광 vs. 온도(dF/dT vs. T) 또는 (-dF/dT vs. T)에서 변화율 플롯은 멜팅 피크를 제공한다.
연장가닥 생성은 연장가닥 크기에 의해 검출될 수 있다. 연장가닥과 혼성화된 SO는 연장가닥 사이즈로 연장가닥을 검출할 수 있는 검출 가능한 시그널을 제공한다. 예를 들어, 연장가닥의 생성을 겔 전기영동 및 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동과 같은 다양한 전기영동 방법으로 검출하는 경우, 상기 연장가닥과 혼성화된 SO는 연장가닥 존재를 나타내는 시그널을 겔 매트릭스 상에 제공한다. 바람직하게는, 상기 SO는 단일 형광 표지된 것을 사용한다.
PTO, CTO 및 SO는 자연(naturally occurring) dNMPs로 구성될 수 있다. 택일적으로, PTO, CTO 및 SO는 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드, 예컨대, PNA(Peptide Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 92/20702호) 및 LNA(Locked Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 98/22489호, 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호)를 포함할 수 있다. PTO, CTO 및 SO는 데옥시이노신, 이노신, 1-(2’-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함할 수 있다. 용어 “유니버설 염기”는 자연 DNA/RNA 염기들 각각에 대하여 거의 구별 없이 염기 쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
상술한 바와 같이, PTO는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 이격된 한 위치에서 절단될 수 있다. 상기 절단 위치는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치할 수 있다. PTO 단편이 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 혼성화 되는 CTO의 위치는 유니버설 염기, 축퇴성 서열(degenerate sequence) 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PTO가 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 하나의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, 상기 뉴클레오타이드와의 혼성화를 위하여 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 만일, PTO가 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 2 개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, CTO의 캡처링 부위의 5’-말단은 축퇴성 서열을 포함하고, 그의 3’-방향으로 인접한 뉴클레오타이드는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 이와 같이, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부의 다양한 위치에서 PTO의 절단이 일어나는 경우, CTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 것이 유용하다. 또한, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, 동일한 5’-태깅 부위를 갖는 PTO를 복수의 타겟 핵산서열 스크리닝에 이용하는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 서로 다른 PTO 단편들을 생성할 수 있다. 이러한 경우, 유니버설 염기 및 축퇴성 서열은 CTO에 유용하게 사용된다. CTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 전략은 복수의 타겟 핵산서열의 스크리닝을 위해서 한 타입의 CTO 또는 최소한의 타입의 CTO를 사용하도록 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (d)와 (e) 사이에 변성 단계를 추가적으로 포함한다. 단계 (d)에서 형성된 연장이합체는 단일가닥 형태로 변성된 다음, SO와 혼성화된다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 반복 사이클(repeating cycle) 사이에 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(f)의 모두 또는 일부를 반복적으로 실시하는 것을 추가적으로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(b), (a)-(d), (a)-(e) 또는 (a)-(f)를 반복적으로 실시하는 것을 추가적으로 포함한다. 이러한 반복에 의해 타겟 핵산서열 및/또는 타겟 시그널을 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(e)를 반복실시 하고, 단계 (e)의 혼성화 결과물을 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계 (f)는 시그널을 검출하여 연장가닥의 존재를 검출한다.
변성은 열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법 (예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하는 공지된 기술을 통해 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 변성은 80-105℃의 온도범위에서 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 변성의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명은 일련의 멜팅 분석을 실시하여 타겟 핵산서열을 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있다.
보다 바람직하게는, 본 발명은 (i) 연장가닥 생성을 위해 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하는 (a)-(d) 단계를 반복하는 단계; (ii) SO와 연장가닥의 혼성화 결과물의 멜팅 분석을 실시하는 단계; 및 (iii) 상기 단계 (i)과 (ii)를 최소 2회 이상 반복하는 단계를 포함한다. 이 경우, 멜팅 분석은 어떠한 간격(a certain interval)을 가지고 최소 2회 반복하여 실시된다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 (a)-(d) 단계의 반복 횟수는 임의적으로 조절될 수 있다. 일련의 멜팅 분석을 실시하는데 있어서, 어떤 하나의 멜팅 분석을 위해 실시되는 (a)-(d) 단계의 반복 횟수는 다른 하나의 멜팅 분석을 위해 실시되는 (a)-(d) 단계의 반복 횟수와 동일하거나 다를 수 있다.
상기 (a)-(d) 단계의 반복은 연장가닥 생성에 대한 일 예인 것은 당업자에게 명확하다. 예를 들어, 본 발명은 단계 (a)-(b)를 반복하고 단계 (c) 및 (d)를 실시하여 연장가닥을 생성한 다음, 멜팅 분석을 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 단계 (a)-(f)는 하나의 반응용기 또는 별도의 반응용기에서 실시한다. 예를 들어, 단계 (a)-(b), (c)-(d) 또는 (e)-(f)는 별도의 반응용기에서 실시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 단계 (a)-(b) 및 (c)-(f)는 반응 조건(특히, 온도)에 따라 하나의 반응용기에서 동시에 또는 별도로 실시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 단계 (a)-(b)는 변성과정을 포함하여 반복적으로 실시된다.
반복 과정에서 업스트림 올리고뉴클레오타이드로 업스트림 프라이머가 사용되는 경우, 본 발명의 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하며, 바람직하게는 PCR 방법에 의하여 실시한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 최소 2회의 멜팅 분석은 타겟 핵산서열의 정량 분석을 가능하게 한다.
멜팅 분석을 통해 얻어진 멜팅 피크의 면적 및 높이는 연장이합체의 양에 영향을 받으며, 이는 타겟 핵산서열의 최초 양에 대한 정보를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명은 (i) 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 (a)-(d) 단계를 반복함으로써 연장가닥의 수를 증가시키는 단계; (ii) SO와 연장가닥의 혼성화 결과물에 대한 멜팅 분석을 실시하는 단계; 및 (iii) 상기 단계 (i)과 (ii)를 최소 2회 반복하는 단계를 포함한다. 소정의 threshold 값 이상의 멜팅 피크 면적 및/또는 높이가 도달되는 멜팅 분석의 사이클 수를 측정함으로써, 타겟 핵산 서열의 양을 결정할 수 있다.
택일적으로, 타겟 핵산서열의 정량은 연장가닥의 양을 증가시키기 위한 반복 사이클 수에 대한 멜팅 분석 정보(예컨대, 피크의 면적 또는 높이)를 플롯팅함으로써 달성할 수 있다.
본 발명에서는 검출 및/또는 증폭하고자 하는 타겟 핵산서열이 모든 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포함하여 어떠한 특정 서열 또는 길이를 가지도록 요구하지 않는다.
mRNA를 초기 물질로 이용하는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 반응을 위해서는, 랜덤 헥사머 또는 mRNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용될 수 있다.
검출 및/또는 증폭할 수 있는 타겟 핵산서열은 어떠한 자연(naturally occurring) 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산도 모두 포함한다.
본 발명에 의하여 검출될 수 있는 타겟 핵산서열은 다양한 핵산서열, 예컨대, 지놈 내 서열, 인위적으로 분리되거나 단편화된 서열 및 합성 서열(예를 들어, cDNA 서열 및 바코드 서열)을 포함한다. 예컨대, 타겟 핵산서열은 Immuno-PCR (IPCR)을 위한 핵산 마커 서열을 포함한다. IPCR은 PCR과 함께 핵산 마커 서열 및 항체 간의 콘쥬게이트를 사용하며, 이는 단백질을 포함한 다양한 종류의 타겟들을 검출하는 데 널리 적용된다(Sano 등, Science 258 pp:120-122(1992), 미국 특허 제5,665,539호, Niemeyer 등, Trends in Biotechnology 23 pp:208-216(2005), 미국 출원 공개번호 제2005/0239108호 및 Ye 등, Journal of Environmental Science 22 pp:796-800(2010)).
또한, 본 발명은 뉴클레오타이드 변이의 검출에 유용하다. 바람직하게는, 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)”는 연속적 DNA 세그먼트들 또는 서열이 유사한 DNA 세그먼트들에서 특정 위치의 DNA 서열에서의 모든 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 세그먼트는 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의해 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 돌연변이, 결실, 삽입, 치환 및 전좌(translocation)를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예시는 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 암 발생의 원인이 되는 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드 변이”는 DNA 분자의 특정 위치에서의 어떠한 변이를 포함한다. 즉, 용어 “뉴클레오타이드 변이”는 DNA 분자의 특정 위치에서의 야생형 및 그것의 어떠한 변이형을 포함한다.
타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 본 발명에 있어서, 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산 서열은 매칭 템플레이트(matching template)로 표현된다. 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 비-상보적인 서열을 갖는 경우, 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산서열은 미스매칭 템플레이트(mismatching template)로 표현된다.
뉴클레오타이드 변이의 검출에 있어서, 업스트림 프라이머의 3’-말단은 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이 위치의 맞은편에 위치하도록 디자인할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머의 3’-말단은 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는 업스트림 프라이머의 3’-말단은 매칭 템플레이트에 어닐링되고 연장되어 PTO 절단을 유도한다. 그 결과 형성된 PTO 단편은 CTO와 혼성화 되고 연장되며, SO와 혼성화 되어 타겟 시그널을 제공한다. 반면, 업스트림 프라이머의 3’-말단이 미스매칭 템플레이트에서 뉴클레오타이드 변이에 미스매치되는 경우, 업스트림 프라이머가 미스매칭 템플레이트에 혼성화 되는 경우에도, 연장반응을 위해서 프라이머의 3’-말단의 어닐링이 필수적인 조건하에서는 연장되지 않으며, 따라서 타겟 시그널은 발생되지 않는다.
택일적으로, 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는 PTO의 혼성화에 의존적인 PTO 절단반응을 이용할 수 있다. 예를 들어, 조절된 조건 하에서, 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는 PTO는 매칭 템플레이트와 혼성화 되고 이어 절단된다. 그 결과 형성된 PTO 단편은 CTO와 혼성화 되고 연장되며, SO와 혼성화 되어 타겟 시그널을 제공한다. 반면, 조절된 조건 하에서, 상기 PTO는 뉴클레오타이드 변이 부위에 비-상보적인 서열을 갖는 미스매칭 템플레이트와 혼성화 되지 않으며, 상기 PTO는 절단되지 않는다. 바람직하게는, 이러한 경우, PTO에서 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열은 PTO의 3’-타겟팅 부위의 중앙에 위치한다.
택일적으로, 뉴클레오타이드 변이 검출을 위하여, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 위치시키며, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는다(참조: 도 9).
5’-말단 부위에 뉴클레오타이드 변이 구별 부위를 포함하는 프로브가 미스매치 템플레이트와 혼성화될 경우, 5’-말단 부위는 특정 조건 하에서 단일 가닥을 형성할 수 있다. 상기 프로브는 PTO에 해당한다고 할 수 있다. 시그널은 본 발명의 방법에 의해 제공될 수 있다. 이러한 접근은 프로브의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트(nucleotide variation discrimination site)에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열을 검출하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 타겟 핵산서열은 전-증폭된(pre-amplified) 핵산서열이다. 전-증폭된 핵산서열의 이용은 본 발명의 타겟 검출의 민감도 및 특이성을 현저히 증가시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시된다.
본 발명의 장점은 최소 2종의 타겟 핵산서열을 동시에(멀티플렉스) 검출할 수 있다는 것이다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)의 타겟 핵산서열을 검출하기 위해 실시된다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)의 타겟 핵산서열을 검출하기 위해 실시되며, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, PTO는 최소 2종(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)의 PTO를 포함하며, CTO는 최소 2종(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)의 CTO를 포함하고, SO는 최소 2종(보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 5종)의 SO를 포함하며, 최소 2종의 타겟 핵산서열이 존재하는 경우, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산서열에 상응하는 최소 2종의 타겟 시그널(검출가능한 시그널)을 제공한다.
최소 2개의 PTO의 5’-태깅 부위는 서로 동일한 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명이 타겟 핵산서열들의 스크리닝을 위해 실시되는 경우, PTO의 5’-태깅 부위는 동일한 서열을 가질 수 있다.
또한, 한 종류의 CTO는 다수의 타겟 핵산서열을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 5’-태깅 부위에 동일한 서열을 갖는 PTO가 타겟 핵산서열 스크리닝에 사용되는 경우, 한 종류의 CTO가 사용될 수 있다.
멜팅 커브 분석으로 최소 2종의 타겟 핵산서열을 동시에 검출하기 위해 본 발명이 실시되는 경우, 최소 2종의 상기 타겟 핵산서열에 상응하는 상기 단계 (e)의 혼성화 결과물은 서로 다른 Tm 값을 가지며, 이로 인해 단일 표지(예컨대, FAM)를 사용하더라도 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO/연장가닥 혼성화물의 Tm 값은 SO의 서열 및/또는 길이, SO에 혼성화되는 연장가닥 부위의 서열 및/또는 길이, 또는 이들의 조합에 의해 조절될 수 있다. 특히, 멀티플렉스 검출에서 생성된 연장가닥들이 상기 한 종류의 SO와 혼성화될 경우, SO와 혼성화되는 연장가닥의 부위들이 서로 다른 서열을 갖도록 디자인된다면 상기 연장가닥과 SO의 혼성화물의 Tm 값은 서로 다르다. 따라서, 한 종류의 SO를 사용하는 경우에라도 멀티플렉스 검출이 가능하다.
본 발명은 마이크로어레이와 같은 고체상에서 실시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명은 고상에서 실시되며, CTO 또는 SO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통해 고상 기질 상에 고정된다.
고상 반응을 위해, CTO 또는 SO는 5’-말단 또는 3’-말단(바람직하게는 3’-말단)을 통하여 고상 기질의 표면에 직접적 또는 간접적(바람직하게는 간접적)으로 고정화된다. 또한, 상기 CTO 또는 SO는 공유 또는 비-공유결합 방식으로 고상 기질 표면 상에 고정화될 수 있다. 상기 고정화된 CTO 또는 SO가 고상 기질 상에 간접적으로 고정화되는 경우, 적당한 링커가 이용된다. 본 발명에서 사용되는 링커는 고상 기질 표면 상에 프로브를 고정화하는데 이용하는 어떠한 링커도 포함할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물이 링커로써 CTO 또는 SO 고정화에 이용될 수 있다. 또한, 폴리 (T) 테일 또는 폴리 (A) 테일이 링커로 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 고상 기질은 마이크로어레이이다. 본 발명에서 반응 환경을 제공하는 마이크로어레이는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있다. 본 발명의 모든 과정, 즉, 타겟 핵산서열과의 혼성화, 절단, 연장, 멜팅 및 형광 검출은 마이크로어레이에서 실시된다. 마이크로어레이 상에 고정화된 상기 CTO 또는 SO는 혼성화 가능한 어레이 요소(hybridizable array element)의 역할을 한다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다수의 고정화된 CTO 또는 SO는 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 부위 또는 두 개 또는 그 이상의 어드레서블 부위에 고정화 될 수 있으며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 부위를 포함할 수 있다. 포토리토그래피, 잉크-젯팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사방법과 같은 종래 제작 기술을 통해 어레이 또는 특정 응용을 위한 어레이를 생산하기 위하여 고정화된 CTO 또는 SO가 조립(fabricate)될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 고상 기질의 표면상에 고정화된 SO는 상호작용적 이중표지를 포함한다.
본 발명에서 PTO 단편은 타겟 핵산과 혼성화된 PTO의 절단에 의해 생성되며, 어닐링된 다음 CTO상에서 연장되어 결과적으로 연장가닥을 생성한다.
연장가닥의 수를 증가시키기 위해서, 추가적인 PTO를 이용한 추가적인 5’뉴클레아제 절단 반응에 의하여 CTO 상에서 연장 가능한 추가적인 단편을 제공할 수 있다. 상기 추가적인 PTO는 (i) 연장가닥에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 및 (ii) 연장가닥에는 비-상보적이지만 CTO의 캡처링 부위에는 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함한다.
바람직하게는 상기 추가적인 PTO는 연장가닥에 혼성화되는 SO의 다운스트림에 위치한다. 상기 SO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 추가적인 PTO 절단을 유도한다. SO의 3’-말단이 연장가능한 경우, SO의 연장가닥은 상기 추가적인 PTO의 절단을 유도한다.
상기 바람직한 구현예는 추가적인 단편 형성이 연장가닥 형성에 의존적인 특징을 나타낸다.
택일적으로, 상기 추가적인 단편은 다음의 추가적인 PTO의 사용에 의해 제공될 수 있다. 상기 추가적인 PTO는 (i) CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 및 (ii) CTO의 템플레이팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 CTO의 캡처링 부위에 상보적인 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함한다.
타겟 핵산서열 증폭을 수반하는 바람직한 구현예
바람직하게는, 본 발명은 타겟 핵산서열을 합성할 수 있는 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 타겟 핵산서열을 동시에 증폭한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용하여 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머는 각각 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 PTO는 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머 사이에 위치하고; 상기 PTO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있으며;
(b) 상기 PTO의 절단 및 상기 프라이머의 연장을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 PTO가 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되면, 상기 업스트림 프라이머는 연장되고, 상기 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 주형-의존적 핵산 중합효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며,
(e) 상기 연장가닥과 SO(Signaling Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고 최소 하나의 표지가 결합되어 있으며; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 검출 가능한 시그널을 제공하고; 및
(f) 상기 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 연장가닥의 존재를 나타내고, 상기 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예는 상술된 본 발명의 단계들을 실시하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(f)의 모두 또는 일부를 반복적으로 실시하는 것을 추가적으로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 추가적으로 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(f)를 반복적으로 실시한다. 상기 반응 반복은 타겟 핵산서열의 증폭을 수반한다. 바람직하게는 상기 증폭은 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 및 제4,800,159호에 기재된 PCR에 따라 실시된다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산서열의 검출을 위해 실시된다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성에 기초한 PCE-SH를 이용하는 타겟 검출
본 발명은 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않고 실시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용하여 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의해 절단되어 상기 PTO의 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며,
(e) 상기 연장가닥과 SO(Signaling Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고 최소 하나의 표지가 결합되어 있으며; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 검출 가능한 시그널을 제공하고; 및
(f) 상기 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 연장가닥의 존재를 나타내고, 상기 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
타겟 핵산서열의 증폭 및 상기 PTO의 절단 효율을 고려할 때, 본 발명의 PCE-SH는 바람직하게는 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실시한다.
PCE-SH를 이용한 뉴클레오타이드 변이 검출
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 타겟 핵산서열 내 뉴클레오타이드 변이를 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용하여 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위, 및 (iii) 타겟 핵산 상 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트 (nucleotide variation discrimination site)를 포함하며; 상기 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하고, 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO 절단을 유도하며;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 PTO가 상기 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열과 혼성화되고, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열과 이중 가닥을 형성하여, 제1초기 절단 위치로부터 절단을 유도하면, 제1단편을 방출하며; 상기 PTO가 상기 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열과 혼성화되고, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열과 이중 가닥을 형성하지 않아 제1초기 절단 위치의 다운스트림에 위치하는 제2초기 절단 위치로부터 절단을 유도하면, 제2단편을 방출하며; 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 제2단편이 제1단편과 다르도록 하며;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 제1단편 또는 제2단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 제1단편이 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면 상기 제1단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되며; 상기 제2단편이 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면 연장되지 않고;
(e) 상기 연장가닥과 SO를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고 최소 하나의 표지가 결합되어 있으며; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 검출 가능한 시그널을 제공하고; 및
(f) 상기 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 PTO의 뉴클레오타이드 구별 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 변이의 존재를 나타낸다.
본 발명자들은 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 존재 또는 부재에 의존적으로 상기 프로브 절단 위치가 조절될 수 있고, 서로 다른 위치에서 절단되어 방출된 상기 단편들 인위적 템플레이트 상에서의 연장 가능성에 의해 구분된다는 것을 발견하였다.
본 발명은 프로브 혼성화; PTO의 절단 및 연장; 뉴클레오타이드 변이-의존적 연장가닥의 생성; 및 시그널링 올리고뉴클레오타이드를 이용한 연장가닥 검출의 연속적인 단계를 이용한다. 따라서, PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화에 의한 변이 검출(Variation Detection PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: VD-PCE-SH)로 명명하였다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명에 의해 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP와 같은 단일 뉴클레오타이드에 의한 변이이다.
본 발명에서 PTO의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열은 “매치 템플레이트”로 기재한다. PTO의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열은 “미스매치 템플레이트”로 기재한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이와 관련하여 사용되는 용어 “비-상보적”은 삽입 또는 결실에 의한 비-상보성을 포함한다.
본 발명의 VD-PCE-SH는 특정 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO 선택성을 위해 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 갖는 PTO를 사용한다. 상기 PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열(즉, 매치 템플레이트)와 혼성화되면, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 매치 템플레이트와 이중 가닥을 형성한다. 반면, 상기 PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열(즉, 미스매치 템플레이트)와 혼성화되면, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 미스매치 템플레이트와 이중 가닥을 형성하지 않는다.
이와 같이 관심있는 뉴클레오타이드 변이에 대한 다른 혼성화 패턴은 PTO의 초기 절단 위치에서의 차이를 제공하며, 이에 의해 2 종의 PTO 단편이 생성되어 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 존재 여부에 따라 시그널 차이가 발생한다는 것은 주목할 만하다.
제1단편은 PTO 및 매칭 템플레이트 혼성화물의 절단에 의해 생성되고, 제2단편은 PTO 및 미스매칭 템플레이트 혼성화물의 절단에 의해 각각 생성된다. 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 제2단편이 제1단편과 다르도록 만든다.
제1단편 또는 제2단편의 생성은 CTO 상의 연장반응에 의해 검출될 수 있다.
일반적으로 프라이머의 3’-말단 일부 및 템플레이트의 혼성화는 엄격한 조건에서의 프라이머 연장에 매우 중요하다. 본 발명에서 제1단편 및 제2단편은 각각 CTO의 동일 위치에 혼성화된다. 상기 언급된 바와 같이, 제1단편과 비교하여, 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함한다. 혼성화 조건 및 제2단편의 추가적인 3’-말단 부위의 맞은편 CTO 서열을 조절함으로써 상기 제1단편만을 연장시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 제2단편이 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되는 경우, CTO가 상기 제2단편의 상기 추가적인 3’-말단 부위와 혼성화되지 않아서, 상기 제2단편의 연장이 방지되도록 CTO의 서열을 선택한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 제2단편의 추가적인 3’-말단 부위의 맞은편 CTO의 서열은 상기 추가적인 3’-말단 부위에 비-상보적이다.
상기 제1단편의 연장에 의한 연장가닥의 생성은 상기에서 언급된 SO를 사용하여 검출할 수 있다.
뉴클레오타이드 변이 검출을 위해 5’뉴클레아제 활성을 이용하는 종래 기술에 따르면, 사용된 프로브의 혼성화는 프로브 전체 서열에 의해 영향을 받거나 결정된다. 이러한 종래 기술에서, 프로브 디자인 및 제작 그리고 반응 조건의 최적화는 용이한 것이 아니며, 이는 뉴클레오타이드 변이의 존재에 의존하는 프로브의 혼성화가 단일 뉴클레오타이드 차이에 의해 주로 결정되기 때문이다.
VD-PCE-SH에 따르면, 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 프로브의 혼성화-관여 부위의 5’-말단 일부에 위치하며, 이는 혼성화 조건 최적화를 편리하게 한다. 또한, VD-PCE-SH는 프로브의 전체 서열 보다는 프로브의 일부 부위를 통해 뉴클레오타이드 변이를 구별하여 검출하며, SNP와 같은 단일 뉴클레오타이드에 의한 차이도 정확하게 검출할 수 있다.
SNP에 대한 맞은편 서열에 인접한 프로브 서열이 프로브의 혼성화에 큰 영향을 미친다는 것이 당업계에 알려져 있다. 종래 프로브는 일반적으로 그들의 중앙 부위에 SNP에 대한 맞은편 서열을 갖는다. 이 점에서 종래 프로브는 혼성화에 관여하는 SNP 주변 서열을 선택할 수 없다. 종래 기술은 SNP 주변 서열 때문에 심각한 한계점을 갖는다.
본 발명의 VD-PCE-SH 어세이를 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
본 발명의 VD-PCE-SH 어세이는 상기 언급된 PCE-SH 어세이의 하나이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
단계 (a): 타겟 핵산서열과 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO의 혼성화
본 발명의 방법에 따르면, 우선 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 혼성화 시킨다.
뉴클레오타이드 변이 검출에 사용되는 PTO는 (i) 프로브 역할을 하는 3’-타겟팅 부위; (ii) 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위; 및 (iii) 타겟 핵산 상의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 포함하고, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함한다. 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열과 혼성화된 후 PTO로부터 뉴클레오절단(nucleolytically) 방식으로 해리된다. 상기 PTO에서 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위는 반드시 5’to 3’순서로 위치한다. PTO는 도 9에 예시되어 있다.
PTO는 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함하며, 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치한다.
PTO가 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열과 혼성화되는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열과 이중 가닥을 형성한다. PTO가 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열과 혼성화되는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열과 이중 가닥을 형성하지 않는다. 이와 같이, 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 뚜렷한 혼성화 패턴이 PTO의 초기 절단 위치에서의 차이를 제공하며, 이에 의해 2 종의 PTO 단편이 생성되어 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 존재 여부에 따라 시그널 차이가 발생한다. 또한, 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 타겟 핵산서열과 혼성화되는 경우, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 단일가닥을 형성하는(single strand-forming) 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부라고 기재할 수 있다.
상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치한 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 포함한다. 예를 들어, 검출되는 뉴클레오타이드 변이가 SNP일 경우, 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 상기 SNP에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 8 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 6 뉴클레오타이드, 보다 더욱 더 바람직하게는 4 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드 또는 1 뉴클레오타이드 이격된 위치 이내에 위치한다. 바람직하게는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단에 위치한다.
프로브의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트 또는 타겟 서열 상의 뉴클레오타이드 변이 사이트를 언급하면서 사용되는 용어 “사이트(site)”는 단일 뉴클레오타이드 뿐 만 아니라 다수의 뉴클레오타이드도 포함한다.
바람직하게는 단계 (a)에서 혼성화는 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산서열과 혼성화되고, 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않는 엄격조건 하에서 실시된다.
단계 (b): PTO로부터 단편의 방출
이어, PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시킨다.
PTO가 상기 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열(즉, 매치 템플레이트)에 혼성화되고, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열과 이중 가닥을 형성하여 제1초기 절단 위치로부터 절단을 유도하면, 제1단편을 방출한다(참조 :도 9).
PTO가 상기 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열(즉, 미스매치 템플레이트)에 혼성화되고, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산서열과 이중 가닥을 형성하지 않아 제1초기 절단 위치의 다운스트림에 위치한 제2초기 절단 위치로부터 절단을 유도하면, 제2단편을 방출한다. 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 제2단편이 제1단편과 다르도록 한다(도 9).
시료 내에 타겟 핵산서열이 존재하지 않는 경우, PTO 절단이 발생하지 않는다.
이와 같이, 타겟 핵산서열 상의 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 존재 여부에 따른 절단 위치 차이 및 생성된 PTO 단편의 차이는 상이한 연장 패턴을 나타내며, 타겟 핵산서열 상 뉴클레오타이드 변이를 구별하여 검출할 수 있도록 한다.
업스트림 프라이머 연장에 의한 절단 위치는 일반적으로 5’to 3’방향으로 단일 가닥 및 이중 가닥을 포함하는 구조 내 이중 가닥(즉, bifurcation site) 개시 뉴클레오타이드 또는 개시 뉴클레오타이드로부터 1-2 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치한다. 절단 반응에 의해 5’-태깅 부위 및 3-타겟팅 부위의 일부를 포함하는 단편이 생성된다. 본 발명이 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도에 의해 실시되면, PTO의 절단 위치는 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 위치에 의해 조절된다.
본 명세서에서 PTO를 언급하면서 사용되는 용어 “제1초기 절단 위치(a first initial cleavage site)”는 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열에 PTO가 혼성화되는 경우, 첫 번째로 절단되는 PTO의 절단 위치를 의미한다. 본 명세서에서 PTO를 언급하면서 사용되는 용어 “제2 초기 절단 위치(a second initial cleavage site)”는 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열에 PTO가 혼성화되는 경우, 첫 번째로 절단되는 PTO의 절단 위치를 의미한다.
본 발명에서 사용된 “제1단편(a first fragment)”은 제1초기 절단 위치에서 절단에 의해 생성된 단편을 의미한다. “제1단편”은 “제1분절(a first segment)” 및 “PTO 제1단편(a PTO first fragment)”과 교체되어 사용될 수 있다. 용어 “제2단편(a second fragment)”는 제2초기 절단 위치에서 절단에 의해 생성된 단편을 의미한다. “제2단편”은 “제2분절(a second segment)” 및 “PTO 제2단편(a PTO second fragment)”과 교체되어 사용될 수 있다.
바람직하게는 상기 제1단편 및 제2단편은 각각 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함한다.
상기 절단은 이용되는 절단 방법에 따라 상기 제1초기 절단 위치(또는 제2초기 절단 위치)의 절단 이후에도 연속적으로 일어날 수 있다. 예를 들어, 업스트림 프라이머의 연장과 함께 5’뉴클레아제 절단 반응을 이용하는 경우, 초기 절단 위치 및 이에 연속된 서열이 절단된다. 업스트림 프로브를 사용하는 경우, 절단 반응은 상기 프로브가 위치한 지점으로부터 떨어져 있는 특정 위치에서 일어나고, 상기 절단 반응은 상기 위치에서만 일어나며, 연속적인 절단은 일어나지 않는다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머 연장에 의존적인 초기 절단 위치는 5’to 3’방향으로 이중 가닥의 개시 뉴클레오타이드(즉, bifurcation site)에 위치할 수 있다.
도 9에서 보는 바와 같이, 상기 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부의 5’-말단에 위치한다. 이런 경우에 제1초기 절단 위치는 5’to 3’방향으로 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 바로 인접하게 위치한다. 즉, 상기 제1초기 절단 위치는 3’방향으로 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 바로 인접하게 위치한다. 제2초기 절단 위치는 일반적으로 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 3’방향으로 1 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치한다.
상기 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트가 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부의 5’-말단으로부터 1 뉴클레오타이드 이격되어 위치하는 경우, 제1초기 절단 위치는 5’방향으로 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 바로 인접하게 위치한다. 제2초기 절단 위치는 일반적으로 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 3’방향으로 1 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 5’-말단 일부는 부분적으로 비-혼성화 서열(또는 비-염기 쌍 서열)을 포함한다. 상기 PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열과 혼성화되는 경우, 상기 5’-말단 일부에 비-혼성화 서열을 도입하는 것은 상기 5’-말단 일부가 단일 가닥을 형성하도록 하는 것에 매우 유용하다. 또한, 비-혼성화 서열의 도입은 제2초기 절단 위치를 조절할 수 있게 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 1-10 뉴클레오타이드(더욱 바람직하게는 1-5 뉴클레오타이드) 이격된 위치 이내에 위치한 비-염기 쌍 모이어티(non-base pairing moiety)를 포함한다. PTO가 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열과 혼성화되는 경우, 상기 비-염기 쌍 모이어티는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 타겟 뉴클레오타이드 서열과 이중 가닥을 형성하는 것을 방지한다.
비-염기 쌍 모이어티(예컨대, 미스매치 뉴클레오타이드)의 이용은 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 구별 능력을 향상시킨다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산서열에 PTO가 혼성화되는 경우, 비-염기 쌍 모이어티는 5’-말단 일부가 타겟 핵산서열과 이중가닥을 형성하는 것을 억제하지 않는다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티는 제1초기 절단 위치 및 제2초기 절단 위치 간의 거리를 확대시킨다.
바람직하게는 비-염기 쌍 모이어티는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트의 다운스트림에 위치한다.
예를 들어, 비-염기 쌍 모이어티인 미스매치 뉴클레오타이드가 3’방향으로 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 2 뉴클레오타이드 이격된 부위로 도입될 경우, 제2초기 절단 위치는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 2 뉴클레오타이드 이격된 위치로 조정된다. 미스매치 뉴클레오타이드를 사용하지 않는 경우, 제2 초기 절단 위치는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 1 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치한다. 즉, 비-염기 쌍 모이어티는 제1초기 절단 위치 및 제2초기 절단 위치 사이의 거리를 확대시킨다.
비-염기 쌍 모이어티는 타겟 핵산서열 간에 염기 쌍을 형성하지 않는 어떠한 모이어티도 포함한다. 바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 (ⅰ) 인위적인 미스매치 염기, 염기 쌍을 할 수 없도록 변형된 비-염기 쌍 염기 또는 유니버설 염기를 포함하는 뉴클레오타이드, (ⅱ) 염기 쌍을 형성 할 수 없도록 변형된 비-염기 쌍 뉴클레오타이드 또는 (ⅲ) 비-염기 쌍 형성 화합물이다(non-base pairing chemical compound).
예를 들어, 비-염기 쌍 모이어티는 알킬렌 기, 리보퓨라노실 나프탈렌, 데옥시 리보퓨라노실 나프탈렌, 메타포스페이트, 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결 및 아릴 포스포로아미데이트 연결을 포함한다. 종래 탄소 스페이서 또한 비-염기 쌍 모이어티로 이용된다. 비-염기 쌍 모이어티로서의 유니버설 염기는 PTO의 절단 위치를 조정하는데 유용하다.
디옥시이노신, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5’-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함하는 염기 쌍은 자연 염기들 간의 결합력 보다 낮은 결합력을 가지며, 유니버설 염기는 특정 혼성화 조건하에서 비-염기 쌍 모이어티로서 이용될 수 있다.
5’-말단 일부에 도입된 비-염기 쌍 모이어티는 바람직하게는 1-10개의 모이어티, 보다 바람직하게는 1-5개의 모이어티, 보다 더욱 바람직하게는 1-2개의 모이어티를 갖는다. 5’-말단 일부의 다수의 비-염기 쌍 모이어티는 연속적 또는 불연속적으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 2-5개의 연속적인 모이어티를 갖는다.
바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 비-염기 쌍 형성 화합물이다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트 및 PTO의 비-염기 쌍 모이어티는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드(보다 바람직하게는 8 뉴클레오타이드, 7 뉴클레오타이드, 6 뉴클레오타이드, 5 뉴클레오타이드, 4 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드 또는 1 뉴클레오타이드, 보다 더욱 바람직하게는 1 뉴클레오타이드) 이격된 위치 이내에 위치한다.
택일적으로 절단 반응은 상기 제1초기 절단 위치에서만 실시될 수 있다. 예를 들어, 업스트림 프로브가 사용되고, 상기 절단 반응은 상기 프로브가 위치한 지점으로부터 떨어져 있는 특정 위치에서 일어나는 경우에는 PTO가 매치 템플레이트와 혼성화될 때 제1초기 절단 위치에서만 절단 반응이 일어날 수 있다. PTO와 미스매치 템플레이트가 혼성화될 경우, bifurcation site(제2초기 절단 위치)는 업스트림 프로브로부터 멀리 떨어져 있기 때문에 절단될 수 없다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, PTO와 미스매치 템플레이트가 혼성화될 경우, 제2초기 절단 위치는 단일 가닥 및 이중 가닥을 포함하는 구조에서 이중 가닥의 개시 위치(즉, bifurcation site)를 포함한다.
일 구현예에 따르면, PTO는 블록커(blocker)로서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 절단에 대하여 내성을 갖는 최소 1 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 블록커 부위를 갖고, 상기 블록커 부위는 제2초기 절단 위치에 위치한다. 상기 블록커 부위는 제2초기 절단 위치에서의 절단 및 연속적 절단을 방지한다.
블록커 부위에 포함되는 블록커의 개수는 제한되지 않으며, 바람직하게는 1-10 블록커, 보다 바람직하게는 2-10 블록커, 보다 더욱 바람직하게는 3-8 블록커, 가장 바람직하게는 3-6 블록커이다. 프로브에 존재하는 블록커는 연속적 또는 불연속적인 방식으로 존재할 수 있으며, 바람직하게는 연속적인 방식이다. 블록커로서의 뉴클레오타이드, 즉 5’to 3’엑소뉴클레아제 활성에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 어떠한 것도 포함한다. 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드는 다양한 포스포로티오에이트 연결, 포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결 및 2’-카보하이드레이트 변형을 포함한다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 5’to 3’엑소뉴클레아제에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결, 아릴 포스포로아미데이트 연결, 포스포로세레네이트 연결, 2’-O-아미노프로필 변형, 2’-O-알킬 변형, 2’-O-알릴 변형, 2’-O-부틸 변형, α-아노머릭 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 1-(4’-티오-β-D-리보퓨라노실) 변형이다.
단계 (c): PTO로부터의 방출된 단편과 CTO의 혼성화
PTO로부터 방출된 단편은 CTO와 혼성화 된다.
제1단편 및 제2단편은 일반적으로 CTO의 캡처링 부위와 혼성화 할 수 있는 서열을 포함하며 그로인해 제1단편 및 제2단편 중 하나는 CTO와 혼성화된다.
미스매치 템플레이트와 혼성화되어 생성되는 제2단편은 매치 템플레이트와 혼성화되어 생성되는 제1단편과 다르게 추가적인 3’-말단 부위를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 제2단편이 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되는 경우, CTO가 상기 제2단편의 상기 추가적인 3’-말단 부위와 혼성화되지 않아서, 상기 제2단편의 연장이 방지되도록 CTO의 서열을 선택한다. 예를 들어, CTO의 서열은 제2단편의 추가적인 3’-말단 부위의 맞은편에 미스매치 뉴클레오타이드를 갖도록 선택될 수 있다. 택일적으로, 유니버설 염기는 미스매치 뉴클레오타이드 대신 사용될 수 있다.
제1초기 절단 위치(또는 제2초기 절단 위치)는 어떤 조건에서는 고정되어 있지 않고 다수일 수 있다. 예를 들어, 초기 절단 위치가 5’to 3’방향으로 단일 가닥 및 이중 가닥을 포함하는 구조에서 이중 가닥(즉, bifurcation site)의 개시 뉴클레오타이드 및 개시 뉴클레오타이드로부터 1-2 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치할 수 있다. 이와 같은 경우, 바람직하게는, CTO의 서열은 본 발명에서 제1초기 절단에 의해 방출되는 단편 중 가장 짧은 단편이 선택적으로 연장되어 뉴클레오타이드 변이의 존재를 나타내는 연장 가닥을 생성하도록 선택된다.
단계 (d): 절단 단편의 연장
CTO의 캡처링 부위와 제1단편이 혼성화되면, 상기 단편은 연장되어 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성된다. 제2단편이 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 경우, 상기 제2단편은 연장되지 않는다.
일반적으로 프라이머의 연장은 프라이머의 3’-말단 일부와 템플레이트의 혼성화에 의해 조절될 수 있다. 프라이머 서열 및 반응 조건(예컨대, 어닐링 온도)을 조절함으로써 3’-말단 일부에 1-3 미스매치 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머의 연장이 가능하도록 할 수 있다. 택일적으로 프라이머의 연장은 프라이머가 타겟 서열에 완전히 상보적인 서열을 가질 때만 가능하도록 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, CTO의 서열은 제1단편 또는 제2단편 중 어느 하나가 선택적으로 연장되도록 선택된다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 단편의 연장은 단편의 3’-말단 일부에 하나의 미스매치라도 존재하는 경우에는 연장되지 않는 조건 하에서 실시된다.
단계 (e): 연장가닥과 SO의 혼성화에 의한 시그널 생성
상기 연장반응에 이어, 상기 연장가닥과 SO를 혼성화 시킨다. PTO의 뉴클레오타이드 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이의 존재를 나타내는 시그널이 생성된다.
연장가닥 및 SO의 혼성화와 표지 시스템 및 시그널 생성에 대한 상세한 내용은 상술한 내용에 의해 설명된다.
단계 (f): 시그널의 검출
최종적으로, 단계 (e)에서 제공되는 검출가능한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 연장가닥의 존재 및 PTO의 뉴클레오타이드 구별 사이트에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 변이의 존재를 나타낸다.
시그널 검출에 대한 상세한 내용은 상술한 내용에 의해 설명된다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 도움없이 뉴클레오타이드 변이를 검출할 수 있다. 본 발명은 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 사용한다. 타겟 핵산서열의 증폭, 반응 조건 및 5’뉴클레아제 활성을 고려할 때, 본 발명은 바람직하게 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실시하며, 보다 바람직하게는 업스트림 프라이머를 사용하여 실시한다.
타겟 검출을 위한 키트
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용하여 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열과 혼성화 되지 않으며;
(b) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO 보다 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여 상기 PTO의 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
(c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며, 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되며; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며;
(d) SO(Signaling Oligonucleotide); 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고 최소 하나의 표지가 결합되어 있으며; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO의 최소 한 부위는 상기 연장서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 (i) 상기 SO에 결합되어 있는 표지, (ii) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 PTO에서 방출된 단편에 결합된 표지의 조합, (iii) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 상기 연장가닥에 삽입되는 표지의 조합 또는 (iv) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 인터컬레이팅 색소의 조합을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지가 결합되어 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면,SO는 단일표지가 결합되어 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 키트는 추가적으로 SO를 하나 더 포함하고, 상기 추가된 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하며, 상기 두 개의 SO는 상기 연장가닥에 근접하여 혼성화되고; 상기 두 개의 SO는 각각 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 어느 하나의 표지를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 어느 하나의 표지를 포함하고, 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 갖는다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 제1의 비-자연적 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 키트는 상기 제1의 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 제2의 비-자연 염기 및 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 키트는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, SO는 FRET(fluorescence resonance energy transfer)의 수용자를 포함하고, 상기 키트는 인터컬레이팅 색소를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, PTO, CTO 및/또는 SO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 키트는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 키트는 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트이고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2종의 CTO를 포함하며, 상기 SO는 최소 2종의 SO를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 키트는 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 타겟 핵산서열과 혼성화 하여 타겟 시그널을 제공하는 프로브를 사용하지 않는다. 흥미롭게도, 본 발명은 타겟-의존적 방식(target-dependent manner)으로 형성되는 연장가닥과 혼성화하는 프로브(시그널링 올리고뉴클레오타이드)를 이용하며, 상기 연장가닥은 인위적으로 선택된 서열을 갖는 CTO를 템플레이트로하여 합성된다. 본 발명은 1차로 타겟 핵산서열을 탐지하는 PTO를 사용하고, 2차로 타겟-의존적인 연장가닥과 혼성화하여 시그널을 제공하는 SO를 사용하므로, 특이도를 극대화할 수 있고, 타겟 핵산서열과 무관하게 시그널 발생 조건을 조절할 수 있어 반응 조건의 설정이 용이하다. 이와 같은 특징은 다양한 양상을 갖는 임상 샘플에서 동시 다중 타겟 검출 시 시그널 반응 조건을 용이하게 설정하고 위양성 시그널을 방지할 수 있도록 한다.
(b) 타겟 핵산서열과 혼성화하는 프로브를 이용하는 종래 기술에서 프로브는 타겟 핵산서열과 혼성화하면서 타겟 핵산 서열의 상보적인 서열과 경쟁하여야한다. 하지만, 본 발명에서는 템플레이트인 CTO의 양을 조절하여 연장가닥만을 증폭시킬 수 있으므로 프로브의 효율적인 혼성화가 가능하고, 결국 효과적으로 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 얻을 수 있다.
(c) 본 발명은 실시간으로 타겟 핵산서열의 존재를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 멜팅 커브 분석을 통하여 타겟 핵산서열의 존재를 검출할 수 있다.
(d) 연장가닥과 SO의 혼성화 결과물의 Tm 값은 SO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절될 수 있으므로 상기 혼성화 결과물의 Tm 값은 임의적으로 미리 결정(pre-determined)할 수 있다. 이러한 특징을 이용하면, (i) 본 발명은 소정의 Tm 값 이외의 온도에서 발생되는 시그널은 위양성 시그널이므로 위양성 시그널을 구별하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다. (ii) 상기 혼성화 결과물에 대한 Tm 값의 임의적인 결정은 최소 2 종 이상의 타겟 핵산서열에 대한 멀티플렉스 검출에서 더욱 유리하다.
(e) 프로브 및 타겟 핵산서열의 혼성화물(hybrid)에 대한 종래 멜팅 커브 분석에서의 Tm 값은 타겟 핵산서열 상의 서열 변이에 의해 영향을 받는다. 반면, 본 발명에서 연장가닥은 타겟 핵산서열 상의 변이 서열에 관계없이 일정한 Tm 값을 갖기 때문에 멜팅 커브 분석에서 우수한 정확도를 나타낸다.
(f) PTO의 5’-태깅 부위, CTO 및 SO의 서열은 타겟 핵산서열을 고려하지 않고 선택될 수 있다. 따라서, PTO의 5’-태깅 부위, CTO 및 SO에 대한 서열 pool을 미리 디자인할 수 있다. PTO의 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산서열을 고려하여 제조하여야 하나, CTO 및 SO의 경우는 타겟 핵산서열의 정보 또는 고려 없이 ready-made 방식으로 제조할 수 있다.
(g) 본 발명은 다양한 종래의 표지된 프로브를 적용하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다.
(h) 연장가닥 및 SO의 혼성화 결과물이 각각 다른 Tm 값을 갖는 경우, 동일한 형광 특성의 시그널을 제공하는 표지 방법을 사용하더라도 멜팅 커브 분석을 통하여 동시에 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 대한 다중 타겟 핵산서열 검출이 가능하다. 이와 같은 장점은 멀티플레스 실시간 검출에서 검출 가능한 형광 레이블 수의 제한으로 인한 멀티플렉스의 구현의 한계를 극복할 수 있다.
도 1은 PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 어세이에서 이용되는 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide), CTO(Captureing and Templating Oligonucleotide) 및 SO(Signaling Oligonucleotide)의 도식적 구조를 보여준다. 바람직하게는, PTO, CTO 및 SO의 3’-말단은 연장되는 것을 막기 위해 블로킹된다.
도 2는 가닥내 상호작용적 이중표지를 이용하는 PCE-SH 어세이를 도식적으로 보여준다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함한다.
도 3은 단일표지를 이용하는 PCE-SH 어세이를 도식적으로 보여준다. SO는 단일표지로 리포터 분자를 가진다. 리포터 분자는 단일가닥 형태 또는 이중가닥 형태에 존재하는지에 따라 다른 시그널 강도를 나타내야한다.
도 4는 가닥간 상호작용적 이중표지 및 2개의 SO를 이용하는 PCE-SH 어세이를 도식적으로 보여준다. 2개의 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 각각 포함한다.
도 5는 가닥간 상호작용적 이중표지를 이용하는 PCE-SH 어세이를 도식적으로 보여준다. SO는 리포터 분자를 포함하고 연장가닥은 퀀처분자를 포함한다.
도 6은 가닥간 상호작용적 이중표지를 이용하는 PCE-SH 어세이를 도식적으로 보여준다. SO는 리포터 분자를 포함하고 연장가닥은 연장반응 동안 삽입되는 퀀처-iso-dG 잔기를 포함한다.
도 7은 가닥간 상호작용적 이중표지를 이용하는 PCE-SH 어세이를 도식적으로 보여준다. SO는 리포터 분자를 포함하고 연장가닥은 연장반응 동안 삽입되는 퀀처-dA 잔기를 포함한다.
도 8은 인터컬레이팅 색소(intercalating dyes)를 이용하는 PCE-SH 어세이를 도식적으로 보여준다. SO는 수용체(acceptor)를 포함하며, SYBR 그린은 공여자(donor)로 이용된다.
도 9는 뉴클레오타이드 변이를 검출하기 위한 PCE-SH 어세이를 도식적으로 보여준다.
도 10A는 PCE-SH 어세이를 통해 Neisseria gonorrhoeae의 유전자를 실시간 검출한 결과이다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함한다.
도 10B는 멜팅 분석 단계를 포함하는 PCE-SH 어세이를 통해 Neisseria gonorrhoeae의 유전자를 검출한 결과이다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함한다.
도 11A는 PCR 증폭과 더불어 PCE-SH 어세이를 이용하여 Neisseria gonorrhoeae의 유전자를 실시간 검출한 결과이다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함한다.
도 11B는 포스트-PCR 멜팅 분석 단계를 포함하는 PCE-SH 어세이를 통해 Neisseria gonorrhoeae의 유전자를 검출한 결과이다. SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함한다.
도 12는 포스트-PCR 멜팅 분석 단계를 포함하는 PCE-SH 어세이를 통해 타겟 핵산서열의 단일 뉴클레오타이드 변이를 검출한 결과이다. MTHFR(Methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자에서 C677T 돌연변이가 검출되었다.
도 13A는 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’-뉴클레아제 활성을 이용한 PCE-SH 어세이를 통해 Neisseria gonorrhoeae의 유전자를 실시간 검출한 결과이다.
도 13B는 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’-뉴클레아제 활성을 이용한 멜팅 분석 단계를 포함하는 PCE-SH 어세이를 통해 Neisseria gonorrhoeae의 유전자를 검출한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization; PCE-SH) 어세이의 평가
신규한 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization; PCE-SH) 어세이를 (i) 지정(pre-determined) 온도에서 실시간 검출 또는 (ii) 멜팅 분석 방식으로 실시하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는지를 실험하였다 (참조: 도 2).
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 업스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다.
PTO 및 CTO는 표지하지 않았고, 3’-말단을 탄소 스페이서로 블록킹하였다. Neisseria gonorrhoeae(NG) 유전자에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드를 타겟 주형으로 이용하였다. SO는 5’-말단에 형광 리포터 표지 분자(CAL Fluor Red 610)를 포함하고, 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)를 포함한다.
본 실시예에서 사용된 합성 템플레이트, 업스트림 프라이머, PTO, CTO 및 SO 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 3)
NG-CTO 5’-GCGCTGGATACCCTGGACGATATGCAGCCAAGCCGTCGT[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 4)
NG-SO-1 5’-[CAL Fluor Red 610]GCGCTGGATACCCTGGACGATATG[BHQ-2]-3’ (SEQ ID NO: 5)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
1-1. 지정 온도에서 실시간 검출
2 pmole의 NG 유전자에 대한 합성 템플레이트(SEQ ID NO: 1), 10 pmole 업스트림 프라이머 (SEQ ID NO: 2), 5 pmole PTO(SEQ ID NO: 3), 0.5 pmole CTO(SEQ ID NO: 4), 0.5 pmole SO(SEQ ID NO: 5) 그리고 10 ㎕의 2X Master Mix (final, 200 μM dNTPs, 2.5 mM MgCl2, 1.6 U의 H-Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea)를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15분 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하였다. 발생된 시그널의 검출은 매 사이클마다 혼성화 단계(60℃)에서 수행하였다. 검출 온도는 연장가닥-SO 혼성화물(hybrid)이 이중가닥 형태를 유지할 수 있는 범위에서 결정하였다.
도 10A에서 보는 바와 같이, 형광 시그널은 템플레이트가 존재할 경우 검출되었다. 템플레이트, PTO, CTO 또는 SO가 없는 경우, 시그널은 검출되지 않았다.
1-2. 멜팅 분석
실시예 1-1의 반응 후, 반응 혼합물을 55℃로 식히고, 55℃에서 30초 유지한 다음 55℃에서 85℃까지 서서히 가열하여 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 증가하는 동안 연속적으로 형광을 측정하여 연장가닥-SO 혼성화물의 해리를 모니터링하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터에서 얻었다.
도 10B에서 보는 바와 같이, 템플레이트가 존재할 경우에는 연장가닥-SO 혼성화물의 예측되는 Tm 값(68.5℃)에서 피크가 검출되었다. 템플레이트, PTO, CTO 또는 SO가 없는 경우에는, 피크가 관찰되지 않았다.
실시예 2: PCE-SH 어세이를 이용한 타겟 핵산서열의 검출
PCE-SH 어세이가 (i) 실시간 PCR 방식 또는 (ii) post-PCR 멜팅 분석 방식으로 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는지를 추가적으로 실험하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다.
PTO 및 CTO는 표지하지 않고, 3’-말단을 탄소 스페이서로 블록킹하였다. NG 유전자의 genomic DNA는 타겟 템플레이트로 사용하였다. SO는 5’-말단에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)를 포함하고, 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)를 포함한다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, CTO 및 SO 서열은 다음과 같다:
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 6)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 3)
NG-CTO 5’-GCGCTGGATACCCTGGACGATATGCAGCCAAGCCGTCGT[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 4)
NG-SO-1 5’-[CAL Fluor Red 610]GCGCTGGATACCCTGGACGATATG[BHQ-2]-3’ (SEQ ID NO: 5)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
2-1. PCR 동안 지정 온도에서 실시간 검출
100 pg의 NG의 genomic DNA, 10 pmole 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 2), 10 pmole 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 6), 5 pmole PTO(SEQ ID NO: 3), 0.5 pmole CTO(SEQ ID NO: 4), 0.5 pmole SO(SEQ ID NO: 5) 그리고 10 ㎕의 2X Master Mix (final, 200 μM dNTPs, 2.5 mM MgCl2, 1.6 U의 H-Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea)를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15분 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초 과정을 50회 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 혼성화 단계(60℃)에서 수행하였다. 검출 온도는 연장가닥-SO 혼성화물이 이중가닥 형태를 유지할 수 있는 범위에서 결정하였다.
도 11A에서 보는 바와 같이, 형광 시그널(Ct: 30.34)은 템플레이트가 존재할 경우 검출되었다. 템플레이트가 없는 경우, 시그널은 검출되지 않았다.
2-2. Post-PCR 멜팅 분석
실시예 2-1의 반응 후, 반응 혼합물을 55℃로 식히고, 55℃에서 30초 유지한 다음 55℃에서 85℃까지 서서히 가열하여 온도가 증가하는 동안 연속적으로 형광을 측정하여 연장가닥-SO 혼성화물의 해리를 모니터링하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터에서 얻었다.
도 11B에서 보는 바와 같이, 템플레이트가 존재할 경우, 연장가닥-SO 혼성화물의 예측되는 Tm 값(68.5℃)에서 피크가 관찰되었다. 템플레이트가 없는 경우, 피크는 관찰되지 않았다.
실시예 3: PCE-SH를 이용한 타겟 핵산서열의 단일 뉴클레오타이드 변이의 식별
PCE-SH를 통해 타겟 핵산서열의 단일 뉴클레오타이드 변이를 식별할 수 있는지를 추가적으로 실험하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다. PTO 및 CTO는 표지하지 않고, 3’-말단을 탄소 스페이서로 블록킹하였다. MTHFR 유전자의 C677T 변이에 대한 human genomic DNA의 Wild-type (C), hetero-type (C/T) 및 mutant-type (T)을 타겟 핵산으로 사용하였다. SO는 5’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)를 포함하고, 3’-말단에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)를 포함한다.
PTO-1(SEQ ID NO:9) and CTO-1 (SEQ ID NO:11)은 wild-type 검출에 사용되었고, PTO-2(SEQ ID NO:10) and CTO-2(SEQ ID NO:12)는 mutant-type 검출에 사용되었다. wild-type 유전자가 존재할 경우, CTO-1을 템플레이트로 하여 연장가닥(이하, “wild-type 연장가닥”)이 생성되었다. mutant-type 유전자가 존재할 경우, CTO-2를 템플레이트로 하여 연장가닥(이하, “mutant-type 연장가닥”)이 생성되었다. 멜팅 분석을 통해 연장가닥과 SO의 혼성화물을 검출하는데 있어서, 한 종류의 SO를 사용한 경우에도 2종류의 연장가닥을 별개로 검출 가능하다. 예를 들어, SO와 혼성화 되는 부위에서 각각 다른 서열을 갖도록 연장가닥을 디자인하면, 혼성화물은 다른 Tm 값을 가지므로 연장가닥의 생성을 구별하여 검출할 수 있다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, CTO 및 SO 서열은 다음과 같다:
M677-F 5’- GCAGGGAGCTTTGAGGCTGIIIIIAAGCACTTGA-3’ (SEQ ID NO: 7)
M677-R 5’- CCTCACCTGGATGGGAAAGATIIIIIGGACGATGG-3’ (SEQ ID NO: 8)
M677-PTO-1 5’- CCCAGGCAACCCT CCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCT[Spacer C3]-3’ (SEQ ID NO: 9)
M677-PTO-2 5’-CTCCTGCTCGCGT ACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAG[Spacer C3] -3’ (SEQ ID NO: 10)
M677-CTO-1 5’-TCCGCTGCTTCACCACGCCTTCGAGAGGGTTGCCTGGG[Spacer C3] -3’ (SEQ ID NO: 11)
M677-CTO-2 5’-TCCGCTGCTTGACGACGCCTTCGATACGCGAGCAGGAG[Spacer C3] -3’ (SEQ ID NO: 12)
M677-SO 5’- [BHQ-2]TCCGCTGCTTCACCACGCCTTCGA[CAL Red 610] -3’ (SEQ ID NO: 13)
(I : Deoxyinosine)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
(볼드체 문자는 MTHFR 유전자의 C677T 변이 위치에 서열을 나타냄)
30 ng의 MTHFR(C677T) wild (C), hetero(C/T) 또는 mutant (T) type human genomic DNA, 10 pmole 업스트림 프라이머(SEQ ID NO: 7), 10 pmole 다운스트림 프라이머(SEQ ID NO: 8), 각 5 pmole의 PTO(SEQ ID NO: 9 및 10), 각 0.1 pmole의 CTO(SEQ ID NO: 11 및 12), 0.5 pmole SO(SEQ ID NO: 13) 그리고 10 ㎕의 2X Master Mix (final, 200 μM dNTPs, 2.5 mM MgCl2, 1.6 U의 H-Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea)를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15분 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 60초, 72℃에서 30초 과정을 40회 반복하였다. 반응 후, 반응 혼합물을 45℃로 식히고, 45℃에서 30초 유지한 다음 45℃에서 85℃까지 서서히 가열하여 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 증가하는 동안 연속적으로 형광을 측정하여 연장가닥-SO 혼성화물의 해리를 모니터링하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터에서 얻었다.
도 12에서 보는 바와 같이, wild-type 템플레이트가 존재하는 경우, wild-type 연장가닥-SO 혼성화물의 예측되는 Tm 값(71.0℃)에서 피크가 관찰되었다. mutant-type 템플레이트가 존재하는 경우, mutant-type 연장가닥-SO 혼성화물의 예측되는 Tm 값(55.5℃)에서 피크가 검출되었다. hetero-type 템플레이트가 존재하는 경우, 71.0℃(wild-type) 및 55.5℃(mutant-type)에서 피크가 관찰되었다. 어떠한 템플레이트도 없는 경우에는 피크는 관찰되지 않았다.
실시예 4: PTO의 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 절단을 이용하는 PCE-SH의 평가
업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않고 PCE-SH 어세이를 (i) 지정 온도에서 실시간-검출 또는 (ii) 멜팅 분석 방식으로 실시하여 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는지를 추가적으로 실험하였다.
5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다.
PTO 및 CTO는 표지하지 않고, 3’-말단을 탄소 스페이서로 블록킹하였다. Neisseria gonorrhoeae (NG) 유전자에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드를 타겟 템플레이트로 사용하였다. SO는 5’-말단에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)를 포함하고, 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)를 포함한다.
본 실시예에서 사용된 합성 템플레이트, PTO, CTO 및 SO 서열은 다음과 같다:
NG-T 5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1)
NG-PTO 5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 3)
NG-CTO 5’-GCGCTGGATACCCTGGACGATATGCAGCCAAGCCGTCGT[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 4)
NG-SO-1 5’-[CAL Fluor Red 610]GCGCTGGATACCCTGGACGATATG[BHQ-2]-3’ (SEQ ID NO: 5)
(밑줄 친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
4-1. 지정 온도에서 실시간 검출
2 pmole의 NG 유전자에 대한 합성 템플레이트(SEQ ID NO: 1), 5 pmole PTO(SEQ ID NO: 3), 0.5 pmole CTO(SEQ ID NO: 4), 0.5 pmole SO(SEQ ID NO: 5) 그리고 10 ㎕의 2X Master Mix(final, 200 μM dNTPs, 2.5 mM MgCl2, 1.6 U의 H-Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea)를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15분 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하였다. 발생된 시그널의 검출은 매 사이클마다 혼성화 단계(60℃)에서 수행하였다. 검출 온도는 연장가닥-SO 혼성화물(hybrid)이 이중가닥 형태를 유지할 수 있는 범위에서 결정하였다.
도 13A에서 보는 바와 같이, 형광 시그널은 템플레이트가 존재할 경우 검출되었다. 템플레이트가 없는 경우, 시그널은 검출되지 않았다.
4-2. 멜팅 분석
실시예 4-1의 반응 후, 반응 혼합물을 55℃로 식히고, 55℃에서 30초 유지한 다음 55℃에서 85℃까지 서서히 가열하여 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 증가하는 동안 연속적으로 형광을 측정하여 연장가닥-SO 혼성화물의 해리를 모니터링하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터에서 얻었다.
도 13B에서 보는 바와 같이, 템플레이트가 존재하는 경우, 연장가닥-SO 혼성화물의 예측되는 Tm 값(68.5℃)에서 피크가 관찰되었다. 템플레이트가 없는 경우에는 피크는 관찰되지 않았다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SEEGENE, INC. <120> DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCE BY PTO CLEAVAGE AND EXTENSION-DEPENDENT SIGNALING OLIGONUCLEOTIDE HYBRIDIZATION ASSAY <130> PI140005 <150> KR 10-2012-0010681 <151> 2012-02-02 <150> KR 10-2012-0028429 <151> 2012-03-20 <150> PCT/KR2012/005281 <151> 2012-07-03 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-T <400> 1 aaatatgcga aacacgccaa tgaggggcat gatgctttct ttttgttctt gctcggcaga 60 gcgagtgata ccgatccatt gaaaaa 86 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-R <400> 2 caatggatcg gtatcactcg c 21 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-PTO <400> 3 acgacggctt ggctgcccct cattggcgtg tttcg 35 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-CTO <400> 4 gcgctggata ccctggacga tatgcagcca agccgtcgt 39 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-SO-1 <400> 5 gcgctggata ccctggacga tatg 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-F <400> 6 tacgcctgct actttcacgc t 21 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M677-F <220> <221> misc_feature <222> (20)..(24) <223> n denotes deoxyinosine <400> 7 gcagggagct ttgaggctgn nnnnaagcac ttga 34 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M677-R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 8 cctcacctgg atgggaaaga tnnnnnggac gatgg 35 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M677-PTO-1 <400> 9 cccaggcaac cctccgattt catcatcacg cagcttttct ttgaggct 48 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M677-PTO-2 <400> 10 ctcctgctcg cgtactcccg cagacacctt ctccttcaag 40 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M677-CTO-1 <400> 11 tccgctgctt caccacgcct tcgagagggt tgcctggg 38 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M677-CTO-2 <400> 12 tccgctgctt gacgacgcct tcgatacgcg agcaggag 38 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M677-SO <400> 13 tccgctgctt caccacgcct tcga 24

Claims (45)

  1. 다음 단계를 포함하는 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용하여 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO보다 업스트림에 위치하고;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며,
    (e) 상기 연장가닥과 SO(Signaling Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고 최소 하나의 표지가 결합되어 있으며; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 검출가능한 시그널을 제공하고; 및
    (f) 상기 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 연장가닥의 존재를 나타내고, 상기 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 SO의 최소 한 부위는 상기 연장서열에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 검출가능한 시그널은 (i) 상기 SO에 결합되어 있는 표지, (ii) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 상기 PTO에서 방출된 단편에 결합된 표지, (iii) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 단계 (d)의 연장 과정에서 상기 연장가닥에 삽입되는 표지 또는 (iv) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 인터컬레이팅 색소(intercalating dye)로부터 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지가 결합되어 있고, 상기 단계 (e)에서 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 단일표지가 결합되어 있고 상기 단계 (e)에서 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 단일표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 단일표지는 단일 형광표지인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 추가적으로 SO를 하나 더 포함하고, 상기 추가된 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하며, 상기 두 개의 SO는 상기 연장가닥에 근접하여 혼성화되고; 상기 두 개의 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 각각 포함하며, 상기 두 개의 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 가지며, 상기 연장가닥은 상기 PTO로부터 방출된 단편에서 유래된 표지를 가지고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 제1의 비-자연적 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 단계 (d)의 연장반응은 상기 제1의 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 제2의 비-자연 염기 및 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장가닥에 표지가 삽입되고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 단계 (d)의 연장반응은 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장가닥에 표지가 삽입되고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 SO는 FRET(fluorescence resonance energy transfer)의 수용자(acceptor)를 포함하고, 상기 단계 (e)의 혼성화 반응은 인터컬레이팅 색소의 존재 하에서 실시하며; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 SO에 결합된 상기 수용자로부터의 시그널 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 PTO, CTO 및/또는 SO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의해 상기 PTO의 절단반응을 유도할 정도로 상기 PTO에 근접해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥에 의해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 부위는 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열은 1-10 개의 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (e) 및 단계 (f) 사이에 단계 (e)에서의 혼성화 결과물을 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계 (f)는 상기 시그널을 검출하여 연장가닥의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (f) 후에 단계 (e)에서의 혼성화 결과물을 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 시그널을 검출하여 연장가닥의 존재를 한 번 더 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 연장가닥의 존재는 멜팅 커브 분석 (melting curve analysis) 또는 혼성화 커브 분석(hybridization curve analysis)에 의하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)와 (e) 사이에 변성 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(f) 전체 또는 일부를 변성을 포함하여 반복적으로 추가 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)-(e)를 변성 포함하여 반복실시 하고, 단계 (e)의 혼성화 결과물을 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계 (f)는 상기 시그널을 검출하여 연장가닥의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(f)는 하나의 반응용기에서 실시하거나 또는 상기 단계 (a)-(f) 중 일부는 별도의 반응용기에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 방법이고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2종의 CTO를 포함하며, 상기 SO는 최소 2종의 SO를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 상기 단계 (b)에서 업스트림 프라이머를 연장하기 위하여 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 다음 단계를 포함하는 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용하여 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 프라이머쌍 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머는 각각 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 PTO는 상기 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머 사이에 위치하고; 상기 PTO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있으며;
    (b) 상기 PTO의 절단 및 프라이머 연장을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 PTO가 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되면, 상기 업스트림 프라이머는 연장되고, 상기 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 주형-의존적 핵산 중합효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여, 상기 PTO의 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
    (c) 단계 (b)에서 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며,
    (e) 상기 연장가닥과 SO(Signaling Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고 최소 하나의 표지가 결합되어 있으며; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 검출가능한 시그널을 제공하고; 및
    (f) 상기 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 연장가닥의 존재를 나타내고, 상기 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  30. 다음 단계를 포함하는 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용하여 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의해 절단되어 상기 PTO의 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며,
    (e) 상기 연장가닥과 SO(Signaling Oligonucleotide)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고 최소 하나의 표지가 결합되어 있으며; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 검출가능한 시그널을 제공하고; 및
    (f) 상기 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 연장가닥의 존재를 나타내고, 상기 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
  31. 다음을 포함하는 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization: PCE-SH)를 이용하여 검출하기 위한 키트:
    (a) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않으며;
    (b) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO 보다 업스트림에 위치하고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하여 상기 PTO의 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
    (c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며, 상기 PTO로부터 방출된 단편은 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되며; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며; 및
    (d) SO(Signaling Oligonucleotide); 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하고 최소 하나의 표지가 결합되어 있으며; 상기 SO는 상기 연장가닥과 혼성화하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 SO의 최소 한 부위는 상기 연장서열에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  33. 제 31 항에 있어서, 상기 키트는 (i) 상기 SO에 결합되어 있는 표지, (ii) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 PTO에서 방출된 단편에 결합된 표지, (iii) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 연장 과정에서 상기 연장가닥에 삽입되는 표지 또는 (iv) 상기 SO에 결합되어 있는 표지 및 인터컬레이팅 색소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  35. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 단일표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  36. 제 31 항에 있어서, 상기 키트는 추가적으로 SO를 하나 더 포함하고, 상기 추가된 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하며, 상기 두 개의 SO는 상기 연장가닥에 근접하여 혼성화되고; 상기 두 개의 SO는 각각 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  37. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 가지는 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 제1의 비-자연적 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 키트는 상기 제1의 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 제2의 비-자연 염기 및 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 키트는 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  40. 제 31 항에 있어서, 상기 SO는 FRET(fluorescence resonance energy transfer)의 수용자(acceptor)를 포함하고, 상기 키트는 인터컬레이팅 색소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  41. 제 31 항에 있어서, 상기 PTO, CTO 및/또는 SO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  42. 제 31 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 키트.
  43. 제 31 항에 있어서, 상기 키트는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  44. 제 31 항에 있어서, 상기 키트는 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트이고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2종의 CTO를 포함하며, 상기 SO는 최소 2종의 SO를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  45. 제 31 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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