NO20140948A1

NO20140948A1 - Deteksjon av målnukleinsyresekvens med PTO-spalting og ekstensjonsavhengig signaleringsoligonukleotidhybrydiseringsanalyse

Info

Publication number: NO20140948A1
Application number: NO20140948A
Authority: NO
Inventors: Young Jo Lee; Jong Yoon Chun
Original assignee: Seegene Inc
Priority date: 2012-02-02
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2014-10-30
Also published as: BR112014018940A2; AU2016204887B2; CN104145029A; BR112014018940A8; US9868980B2; AU2016204887A1; MX2014009403A; EP2809797B1; CN106011234A; KR101832867B1; JP6005180B2; US20150072887A1; MX361903B; BR112014018940B1; US10731203B2; KR20140112060A; CA2862488C; AU2012368436B2; IL233773A0; CN106011234B

Abstract

Det beskrives deteksjon av en målnukleinsyresekvens med en PCR-SH (PTO spaltings og ekstensjonsavhengig signaleringsoligonukleotidhybridiserings) analyse. Oppfinnelsen benytter ikke prober som hybridiseres med målnukleinsyresekvenser for å tilveiebringe målsignaler. Oppfinnelsen benytter prober (signalerende oligonukleotider) som hybridiseres med den forlengede tråd som er dannet på en mål-avhengig måte hvor den forlengede tråd syntetiseres med anvendelse av CTO artifisielt valgt som templater.

Description

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Område for oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører deteksjon av en målnukleinsyresekvens med en PCE-SH (PTO spalting og ekstensjonsavhengig signalerende oligonukleotidhybridiserings) analyse.

Beskrivelse av beslektet teknikk.

DNA-hybridisering er en fundamental prosess innen molekylærbiologi og påvirkes av ionestyrke, basesammensetning, fragmentlengde hvortil nukleinsyren har blitt redusert, grad av mismatching, og nærvær av denaturerende midler. DNA hybridiseringsbaserte teknologier vil være svært nyttige redskaper i spesifikk nukleinsyrebestemmelse og være av klar verdi innen klinisk diagnose, genetisk forskning, og juridiske laboratorieanalyser.

Imidlertid, de konvensjonelle fremgangsmåter og prosesser som i stor grad er avhengig av hybridisering produserer svært ofte falske positive resultater på grunn av ikke-spesifikk hybridisering mellom prober og ikke-målsekvenser. Derfor er der fortsatt problemer som må løses for å forbedre pålitelighet.

I tillegg til probehybridiseringsprosesser har flere tilnærminger ved anvendelse av ytterligere enzymatiske reaksjoner, for eksempel TaqMan™-probemetoden blitt foreslått.

I TaqMan™ -probemetoden spaltes den merkede probe hybridisert med en målnukleinsyresekvens med en 5'-nukleaseaktivitet av en oppstrøms primeravhengig DNA-polymerase, som genererer et signal som indikerer nærvær av en målsekvens (US patenter nr. 5210015, 5538848 og 6326145). TaqMan™-probemetoden antyder to tilnærminger for signalgenerering: polymeriseringsavhengig og polymeriseringsuavhengig spalting. I polymeriseringsavhengig spalting, må ekstensjon av oppstrøms-primeren foregå før en nukleinsyrepolymerase treffer på 5'-enden av den merkede probe. I det ekstensjonsreaksjonen fortsetter, spalter polymerasen progressivt 5'-enden av den merkete probe. I polymeriseringsuavhengig spalting, hybridiseres oppstrømsprimer og den merkede probe med en målnukleinsyresekvens i nær nærhet slik at binding av nukleinsyrepolymerasen til 3'-enden av oppstrømsprimer plasserer den i kontakt med 5'-enden av den merkede probe for å frigjøre markøren. I tillegg, TaqMan™-probemetoden beskriver at den merkede probe ved dets 5'-ende har en 5'-haleregion som ikke er hybridiserbar med en målsekvens også spaltes for å danne et fragment som består av 5'-haleregionen.

Der har også blitt rapportert noen metoder hvor en probe som har en 5'-haleregion som er ikke-komplementær til en målsekvens spaltes av 5'-nuklease for å frigjøre et fragment som omfatter 5'-haleregionen.

For eksempel, US patenter nr. 5691142 beskriver en spaltingsstruktur som kan oppkuttes med 5'-nukleaseaktivitet av DNA-polymerase. Spaltingsstrukturen er eksemplifisert med en oligonukleotid som omfatter en 5'-porsjon som er ikke-komplementær til, og en 3'-porsjon som er komplementær til et templat som hybridiseres med templatet og et oppstrøms oligonukleotid hybridiseres med templatet i nær nærhet. Spaltingsstrukturen spaltes med DNA polymerase som er 5' nukleaseaktivitet eller modifisert DNA polymerase med redusert synteseaktivitet for å frigi 5' porsjonen ikke-komplementær til templatet. Den frigjorte 5'-porsjon hybridiseres deretter med et oligonukleotid som har en hårnålstruktur for å danne en spaltestruktur, og inkluderer dermed progressive spaltingsreaksjoner for å detektere en målsekvens.

US patent nr. 7381532 beskriver en fremgangsmåte hvor spaltestrukturen har oppstrøms oligonukleotidet med blokkert 3'-ende spaltes av DNA polymerase som har 5'-nukleaseaktivitet eller FEN-nuklease for å frigjøre ikke-komplementær 5' flagreregion, og den frigjorte 5' flagreregion detekteres med størrelsesanalyser eller interaktiv dobbelmarkør. US patent nr. 6893819 beskriver at detekterbare frigjorte flagrer produseres med en nukleinsyresynteseavhengig, flagremediert sekvensiell mangfoldiggjøringsmetode. I denne metode vil en frigjort flagre fra en første spaltingsstruktur spalte, på en nukleinsyresynteseavhengig måte, en andre spaltestruktur for å frigjøre en flagre fra den andre spaltestruktur og de frigjorte flagrer detekteres.

Med hybridisering av fluoressensmerkede prober i en væskefase, kan et flertall nukleinsyresekvenser samtidig detekteres selv ved anvendelse av en enkelt type av en fluoriserende markør med smeltekurveanalyse. Imidlertid, de konvensjonelle teknologier for deteksjon av målsekvenser med 5'-nukleasemediert spalting av interaktive dobbeltmerkede prober krever forskjellige typer fluoriserende markører for forskjellige målsekvenser i multiplekse måldeteksjoner, som begrenser antallet målsekvenser som kan detekteres på grunn av begrensning på antallet typer fluoriserende markører.

US patentpublikasjon 2008-0241838 beskriver en måldeteksjonsmetode som anvender spalting av en probe som har en 5'-porsjon ikke-komplementær til en målnukleinsyresekvens og hybridisering av en fangeprobe. En markør posisjoneres på den ikke-komplementære 5'-porsjon. Den merkede probe hybridisert med målsekvensen spaltes for å frigjøre et fragment, hvoretter fragmentet deretter hybridiseres med fangeproben for å detektere nærvær av målsekvensen. I denne metode er det nødvendig at en uspaltet/intakt probe ikke er hybridisert med fangeproben. For å oppnå dette, må fangeproben som har en kortere lengde immobiliseres på et faststoffsubstrat. Imidlertid, en slik begrensning resulterer i lavere effektivitet av hybridisering på et faststoffsubstrat og også i vanskelig-heter med å optimalisere reaksjonsbetingelser.

Derfor, der er fortsatt et behov innen fagfeltet for å utvikle nye tilnærminger for deteksjon av en målsekvens, fortrinnsvis multiple målsekvenser, i en væskefase og på en faststoffase, men ikke kun hybridisering men også enzymatiske reaksjoner så som 5' nukleolytisk reaksjon på en mer hensiktsmessig, pålitelig og reproduserbar måte. Videre, en ny måldeteksjonsmetode som ikke er begrenset av antallet typer markører (fortrinnsvis fluoriserende markører) er det også et behov for innen fagfeltet.

Derfor, der er fortsatt et behov innen fagfeltet for å utvikle nye tilnærminger for deteksjon av en målnukleinsyresekvens på en mer hensiktsmessig, pålitelig og reproduserbar måte som er fri for de ulempene som er beheftet med konvensjonelle teknologier.

Gjennom denne søknad blir forskjellige patenter og publikasjoner referert og sitert og disse angis i parentes. Beskrivelse av disse patenter og publikasjoner i sine helheter inkorporeres heri med referanse i denne søknad for mer fullstendig å beskrive denne oppfinnelse og teknikkens stilling hvortil denne oppfinnelse hører.

Sammendrag av oppfinnelsen.

Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har utført intensiv forskning for å utvikle nye løsninger for å detektere målsekvenser med forbedret nøyaktighet og hensiktsmessighet inter alia, i en multipleks måte. Som et resultat, har det blitt etablert nye protokoller for deteksjon av målsekvenser, hvor måldeteksjon utføres med enzymatiske reaksjoner så som 5'-nukleolytisk reaksjon og ekstensjon og ekstensjonsavhengig hybridisering og likeledes probehybridisering. De foreliggende protokoller er godt tilpasset til væskefasereaksjoner og likeledes faststoff-fasereaksjoner, og sikrer deteksjon av multiple målsekvenser med en forbedret nøyaktighet og hensiktsmessighet.

Således, det er et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for deteksjon av en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyrer med en PCE-SH (PTO spalting- og ekstensjonsavhengig signalerings oligonukleotid hybridiserings) analyse.

Det er et annet formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et kitt for deteksjon av en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyrer med en PCE-SH analyse.

Andre formål og fordeler med foreliggende oppfinnelse vil bli åpenbare fra den detaljerte beskrivelse sammen med de medfølgende patentkrav og figurer.

Kort beskrivelse av figurene.

Fig 1 viser skjematiske strukturer av PTO (Probing og merking oligonukleotid), CTO (Fange og templatoligonukleotid) og SO (Signalerings oligonukleotid) anvendt i PCE-SH (PTO Spalting og ekstensjonsavhengig signaleringsoligonukleotid hybridisering) analyse. Fortrinnsvis, 3'-endene av nevnte PTO, CTO og SO er blokkert for å hindre deres forlengelse. Fig 2 representerer skjematisk PCE-SH analyse ved anvendelse av en intertråd interaktiv dobbel - markør. SOen har et reportermolekyl og et quenchermolekyl. Fig 3 representerer skjematisk PCE-SH analyse ved anvendelse av en enkelt markør. SOen har et reportermolekyl som en enkelt markør. Reportermolekylet er nødvendig for å vise forskjellig signalintensitet avhengig av dets nærvær på en enkelt trådform eller en dobbelt trådform. Fig 4 representerer skjematisk PCE-SH-analyse ved anvendelse av en intertråd interaktiv dobbel-markør og to SOer. De to SOer omfatter hver en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør. Fig 5 representerer skjematisk PCE-SH analyse ved anvendelse av en intertråd interaktiv dobbel-markør. SO omfatter et reportermolekyl og den forlengede tråd omfatter et quenchermolekyl. Fig 6 representerer skjematisk PCE-SH analyse ved anvendelse av en intertråd interaktiv dobbel-markør. SO omfatter et reportermolekyl og den forlengede tråd omfatter quencher-iso-dG-enhet inkorporert under ekstensjonsreaksjonen. Fig 7 representerer skjematisk PCE-SH-analyse ved anvendelse av en intertråd interaktiv dobbel-markør. SO omfatter et reportermolekyl og den forlengede tråd omfatter quencher-dA-enheter inkorporert under ekstensjonsreaksjonen. Fig 8 representerer skjematisk PCE-SH-analyse ved anvendelse av interkalerende fargestoff. SO omfatter en akseptor. SYBR grønn anvendes som donorer.

Fig 9 representerer skjematisk PCE-SH- analyse for deteksjon av en nukleotid variasjon.

Fig 10 A viser resultatene av sanntids deteksjon av Neisseria gonorrhoeae - genet med PCE-SH-analyse. SO har et reportermolekyl og et cancermolekyl. Fig 10 B viser resultatene av deteksjon av Neisseria gonorrhoeae- genet med PCE-SH-analyse omfattende trinnene for en smelteanalyse. SOen har et reportermolekyl og et quencher molekyl. Fig 11 A viser resultatene av sanntidsdeteksjon av Neisseria gonorrhoeae- gen med PCE-SH -analyse med PCR mangfoldiggjøring. SOen har et reportermolekyl og et cancermolekyl. Fig 12 viser resultatene av deteksjon av en enkelt nukleotidvariasjon av en målnukleinsyresekvens med PCE-SH-analyse som omfatter trinnene for post PCR smelteanalyse. C677T-mutasjon for MTHFR (Metylentetrahydrofolatreduktase) genet ble detektert. Fig 13 A viser resultatene av sanntidsdeteksjon av Neisseria gonorrhoeae- gen med PCE-SH-analyse ved anvendelse av oppstrøms oligonukleotid avhengig 5'-nukleaseaktivitet. Fig 13 B viser resultatene av deteksjon av Neisseria gonorrhoeae- genet med PCE-SH-analyse omfattende trinnene for en smelteanalyse ved anvendelse av oppstrøms oligonukleotid uavhengig 5' nukleaseaktivitet.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.

I et aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for å detektere en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyrer med en PCE-SH (PTO spalting og ekstensjonsavhengig signaleringsoligonukleotidhybridisering) analyse, omfattende: (a) hybridisere målnukleinsyresekvensen med en oppstrøms oligonukleotid og en probing- og målrettingsoligonukleotid (PTO); hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid omfatter en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen; PTOen omfatter (I) en 3'-målporsjon omfattende et hybridiseringsnukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen og (II) en 5'-merkeporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen; hvor 3'-målporsjonen av PTO hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5'-merkeporsjonen ikke hybridiseres med målnukleinsyresekvensen; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid er lokalisert oppstrøms for PTOen; (b) sette resultanten av trinn (a) i forbindelse med et enzym som har en 5' nukleaseaktivitet under betingelser for spalting av PTOen; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid eller dets forlengede tråd inkluderer spalting av PTOen ved enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet slik at spaltingen frigjør et fragment omfattende 5'-merkeporsjonen eller en del av 5'-merkeporsjonen av PTOen; (c) hybridisere fragmentet frigjort fra PTOen med en fange- og templatoligonukleotid (CTO) hvor CTOen omfatter i en 3' til 5'-retning (i) en fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-merkeporsjonen eller en del av 5'-merkeporsjonen av PTOen, og (ii) en templatporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5'-merkeporsjonen og 3'-målrettet porsjon av PTOen; hvor fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen; (d) utføre en ekstensjonsreaksjon ved anvendelse av resultanten fra trinn (c) og en templatavhengig nukleinsyrepolymerase; hvor fragmentet hybridisert med fangeporsjonen av CTOen forlenges for å danne en forlenget tråd omfattende en forlenget sekvens komplementær til templatporsjonen av CTOen, og danner dermed en forlenget dupleks; (e) hybridisere den forlengede tråd med et signalerende oligonukleotid (SO); hvor nevnte SO omfatter en komplementær til den forlengede tråd og minst en markør; hvor SO tilveiebringer et detekterbart signal ved hybridisering med den forlengede tråd; og (f) deteksjon av signalet; hvorved deteksjonen av signalet indikerer nærvær av den forlengede tråd og nærvær av målnukleinsyresekvensen.

Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har utført utstrakt forskning for å utvikle nye tilnærminger for å detektere målsekvenser med mer forbedret nøyaktighet og hensiktsmessighet, inter al ia, i en multipleks måte. Som et resultat har det blitt etablert nye protokoller for deteksjon av målsekvenser, hvor måldeteksjon utføres med enzymatiske reaksjoner så som 5' nukleolytisk reaksjon og ekstensjon og ekstensjonsavhengig hybridisering og likeledes probehybridisering. De foreliggende protokoller er godt tilpasset til væskefasereaksjoner og likeledes faststoffasereaksjoner, og sikrer deteksjon av multiple målsekvenser med mer forbedret nøyaktighet og hensiktsmessighet.

Foreliggende oppfinnelse benytter påfølgende hendelser etterfulgt av probehybridisering; spalting og ekstensjon av PTO (probing og merking oligonukleotid); og ekstensjonsavhengig signaleringsoligonukleotidhybridisering. Derfor, har den fått navnet SO (PTO spalting og ekstensjonsavhengig signaleringsoligonukleotidhybridiserings) analyse.

PCE-SH-analysen vil bli beskrevet i mer detalj som følger:

Trinn (a): Hybridisering av en oppstrøms oligonukleotid og en PTO med en målnukleinsyresekvens.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse hybridiseres først en målnukleinsyresekvens med en oppstrøms oligonukleotid og en PTO (probing og merkeoligonukleotid). Termene som anvendes heri; «målnukleinsyre», «målnukleinsyresekvens» eller «målsekvens» refererer til en nukleinsyresekvens som er aktuell for deteksjon, som anneales til eller hybridiseres med en probe eller primer under hybridisering, annealing eller mangfoldiggjøringsbetingelser.

Termen «probe som anvendes heri» refererer til en enkelttrådet nukleinsyremolekyl omfattende en porsjon eller porsjoner som er i hovedsak komplementære til en målnukleinsyresekvens.

Termen «primer» som anvendt heri refererer til et oligonukleotid som er i stand til å virke som et initieringspunkt for syntese idet det plasseres under betingelser hvor syntese av primerekstensjons-produkter som er komplementære til en nukleinsyretråd (templat) induseres, det vil si i nærvær av nukleotidet og et middel for polymerisering, så som DNA polymerase, og ved en egnet temperatur og pH.

Fortrinnsvis, proben og primeren er enkelttrådet deoksyribonukleotidmolekyler. Probene eller primerne anvendt ifølge oppfinnelsen kan være naturlig forekommende dNMPer (det vil si dAMP, dGM, dCMP og dTMP), modifisert nukleotid, eller ikke-naturlig nukleotid. Probene eller primerne kan også inkludere ribonukleotider.

Primeren må være tilstrekkelig lang til å prime syntese av ekstensjonsprodukter i nærvær av middelet for polymerisering. Den eksakte lengde av primerne vil avhenge av mange faktorer, inkluderende temperatur, applikasjon og kilder for primer. Termen «annealing» eller «priming» som anvendt heri refererer til økning av en oligodeoksynukleotid eller nukleinsyre til en templatnukleinsyre, hvorved økningen muliggjør polymerasen å polymerisere nukleotider til et nukleinsyremolekyl som er komplementær til templatnukleinsyren eller en del derav.

Termen «hybridisering» anvendt heri refererer til dannelse av en dobbelttrådet nukleinsyre fra komplementære enkelttrådete nukleinsyrer. Hybridiseringen kan foregå mellom to nukleinsyretråder som er perfekt matchet eller som er vesentlig matchet men med noe mismatcher. Komplementariteten for hybridiseringen kan avhenge av hybridiseringsbetingelser, spesielt temperatur.

Hybridisering av en målnukleinsyresekvens med oppstrøm oligonukleotid og PTOen kan utføres under egnete hybridiseringsbetingelser som rutinemessig bestemmes med optimaliseringsprosedyrer. Betingelser så som temperatur, konsentrasjon av komponenter, hybridisering og vasketider, buffer-komponenter, og deres pH og ionestyrke kan varieres avhengig av forskjellige faktorer, inkluderende lengden og GC-innhold av oligonukleotid (oppstrøms oligonukleotid og PTO) og målnukleotidsekvensen. For eksempel, idet et relativt kort oligonukleotid anvendes er det foretrukket at lave stringentbetingelser tilpasses. De detaljerte betingelser for hybridisering kan finnes i Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); og M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999).

Der er ingen tiltenkt forskjell mellom termene «annealing» og «hybridisering», og disse termer vil anvendes om hverandre.

Oppstrøms oligonukleotid og PTO har hybridiserende nukleotidsekvenser komplementære til målnukleinsyresekvensen. Termen «komplementær» anvendes heri for å angi at primere eller prober er tilstrekkelig komplementære til å hybridisere selektivt til en målnukleinsyresekvens under de angitte annealings betingelser eller stringente betingelser, og omfatter termene «i hovedsak komplementær» og «perfekt komplementær», fortrinnsvis perfekt komplementær.

5'-taggingporsjonen av PTOen har en nukleotidsekvens som er ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen. Templatporsjonen av CTOen (Capturing and Templating Oligonucleotide) har en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5'-taggingporsjonen og 3'-målporsjonen av PTOen. Termen «ikke-komplementær» anvendes heri for å angi at primere eller prober er tilstrekkelig ikke-komplementære til ikke å hybridisere selektivt til en målnukleinsyresekvens under de angitte annealingsbetingelser eller stringente betingelser, og omfatter termene «i hovedsak ikke-komplementær» og «perfekt ikke-komplementær», fortrinnsvis perfekt ikke-komplementær.

For eksempel, termen «ikke-komplementær» i sammenheng med 5'-taggingporsjonen av PTOen angir at 5'-taggingporsjonen er tilstrekkelig ikke komplementær til ikke å hybridisere selektivt til en målnukleinsyresekvens under de angitte annealingsbetingelser eller stringente betingelser, som omfatter termene «i hovedsak ikke-komplementær» og «perfekt ikke-komplementær», fortrinnsvis

perfekt ikke-komplementær.

Termen som anvendes heri «PTO» (Probing og tagging oligonukleotid) angir et oligonukleotid som omfatter (i) en 3'-målporsjon som fungerer som en probe og (ii) en 5' målporsjon med en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen, som er nukleolytisk frigjort fra PTOen etter hybridisering med målnukleinsyresekvensen. 5'-taggingporsjonen og 3'-målporsjonen i PTOen må posisjoneres i et 5' til 3' rekkefølge. PTOen er skjematisk illustrert i fig 1.

Fortrinnsvis, hybridiseringen i trinn (a) utføres under stringente betingelser slik at 3'målporsjonen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5'-taggingporsjonen ikke-hybridiseres med målnukleinsyresekvensen.

PTOen krever ikke noen spesifikke lengder. For eksempel, lengde av PTOen kan være 15-150 nukleotider, 15-100 nukleotider, 15-80 nukleotider, 15-60 nukleotider, 15-40 nukleotider, 20-150 nukleotider, 20-100 nukleotider, 20-80 nukleotider, 20-60 nukleotider, 20-50 nukleotider, 30-150 nukleotider, 30-100 nukleotider, 30-80 nukleotider, 30-60 nukleotider, 30-50 nukleotider, 35-100 nukleotider, 35-80 nukleotider, 35-60 nukleotider, eller 35-50 nukleotider. 3'-målporsjonen av PTOen kan være en i enhver lengde så lenge den spesifikt hybridiseres med målnukleinsyresekvensen. For eksempel, 3'-målporsjonen av PTOen kan være 10-100 nukleotider, 10-80 nukleotider, 10-50 nukleotider, 10-40 nukleotider, 10-30 nukleotider, 15-100 nukleotider, 15-80 nukleotider, 15-50 nukleotider, 15-40 nukleotider, 15-30 nukleotider, 20-100 nukleotider, 20-80 nukleotider, 20-50 nukleotider, 20-40 nukleotider eller 20-30 nukleotider i lengde. 5'-taggingporsjonen kan være enhver lengde så lenge den spesifikt hybridiseres med templatporsjonen av CTOen og deretter forlenges. For eksempel, 5'-taggingporsjonen av PTOen kan være 5-50 nukleotider, 5-40 nukleotider, 5-30 nukleotider, 5-20 nukleotider, 10-50 nukleotider s, 10-40 nukleotider, 10-30 nukleotider, 10-20 nukleotider, 15-50 nukleotider, 15-40 nukleotider, 15-30 nukleotider eller 15-20 nukleotider i lengde.

3'-enden av PTOen kan ha en 3' OH-terminal. Fortrinnsvis, 3'-enden av PTOen er blokkert for å hindre dets forlengelse.

Blokkeringen kan oppnås i samsvar med konvensjonelle metoder. For eksempel, blokkeringen kan utføres ved å tilsette til 3'-hydroksylgruppen av den siste nukleotid en kjemisk enhet så som biotin, markør, en fosfatgruppe, alkylgruppe, ikke-nukleotid linker, fosforotioat eller alkandiol. Alternativt, blokkeringen kan utføres ved å fjerne 3'-hydroksylgruppen av den siste nukleotid eller anvende et nukleotid med ingen 3'-hydroksylgruppe så som dideoksynukleotid.

Alternativt, PTOen kan konstrueres til å ha en hårnålstruktur.

Ikke-hybridiseringen mellom 5'-taggingporsjonen av PTOen og målnukleinsyresekvensen refererer til ikke-dannelse av en stabil dobbelttråd mellom disse under visse hybridiseringsbetingelser. I samsvar med en foretrukket utførelse, er 5'-taggingporsjonen av PTOen ikke involvert i hybridiseringen med målnukleinsyresekvensen danner en enkelt tråd.

Oppstrøms oligonukleotid er lokalisert oppstrøms for PTOen. I tillegg, oppstrøms oligonukleotid eller dets forlengede tråd hybridisert med målnukleinsyresekvensen induserer spalting av PTOen med et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet.

Indiksjon av PTO-spalting med oppstrøms oligonukleotid kan utføres på to måter:

(i) oppstrøms oligonukleotid ekstensjon-uavhengig spaltingsinduksjon; og (ii) oppstrøms oligonukleotid ekstensjon-avhengig spaltingsinduksjon.

Idet oppstrømsoligonukleotidet er posisjonert tilgrensende til PTOen tilstrekkelig til å indusere PTO-spalting av et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet, så vil enzymet som er bundet til oppstrøms-oligonukleotidet oppkutte PTOen uten noen ekstensjonsreaksjon. I motsetning, idet oppstrøms-oligonukleotidet er posisjonert i avstand til PTOen, vil et enzym som har en polymeraseaktivitet (for eksempel templatavhengig polymerase) katalysere ekstensjon av oppstrøms oligonukleotidet (for eksempel oppstrøms primer) og et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet bundet til det forlengede produkt oppkutter PTOen.

Derfor, oppstrømsoligonukleotidet kan derfor være lokalisert relativt til PTOen på to måter. Oppstrømsoligonukleotidet kan være lokalisert tilgrensende til PTOen tilstrekkelig til å indusere PTO spalting på en ekstensjonsuavhengig måte.

Alternativt, oppstrømsoligonukleotidet kan være lokalisert i avstand til PTOen tilstrekkelig til å indusere PTO-spalting på en ekstensjonsavhengig måte.

Termen anvendt heri «tilgrensende» med hensyn til posisjoner eller lokalisasjoner betyr at oppstrøms oligonukleotid er lokalisert tilgrensende til 3'-målporsjonen av PTOen til å danne et «nick». Videre, termen betyr at oppstrømsoligonukleotidet er lokalisert 1-30 nukleotider, 1-20 nukleotider eller 1-15 nukleotider fra 3'-målporsjonen av PTOen.

Termen anvendt heri «i avstand» med referanse til posisjoner eller lokalisasjoner inkluderer enhver posisjon eller lokalisasjon tilstrekkelig til å sikre ekstensjonsreaksjoner.

I samsvar med en foretrukket utførelse, oppstrømsoligonukleotidet er lokalisert i avstand til PTOen tilstrekkelig til å indusere PTO-spalting på en ekstensjonsavhengig måte.

I samsvar med en foretrukket utførelse, oppstrømsoligonukleotidet er en oppstrøms primer eller en oppstrøms probe. Oppstrømsprimeren er egnet på en ekstensjonsuavhengig spaltingsinduksjon eller en ekstensjonsavhengig spalting, og oppstrømsproben er egnet i en ekstensjonsuavhengig spaltingsinduksjon.

Alternativt, oppstrømsoligonukleotidet kan ha en partiell overlappende sekvens med 5'-delen av 3'-målporsjonen av PTOen. Fortrinnsvis, den overlappende sekvens er 1-10 nukleotider, mer foretrukket 1-5 nukleotider, enda mer foretrukket 1-3 nukleotider i lengde. Idet oppstrømsoligonukleotidet har en partielle overlappende sekvens med 5'-delen av 3'-målporsjonen av PTOen, så vil 3'-målporsjonen delvis oppkuttes sammen med 5'-målporsjonen i spaltingsreaksjonen i trinn (b). I tillegg, den overlappende sekvens muliggjør å spalte et ønsket sete på 3'-målporsjonen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, oppstrøms primeren induserer gjennom dets forlengede tråd spalting av PTOen med enzymet som har 5' nukleaseaktivitet. De konvensjonelle teknologier for spaltingsreaksjoner med oppstrøms oligonukleotider kan appliseres med foreliggende oppfinnelse, så lenge oppstrøms oligonukleotidet induserer spalting av PTOen hybridisert med målnukleinsyresekvensen for å frigjøre et fragment omfattende 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen. For eksempel, US patenter nr. 5210015, 5487972, 5691142, 5994069 og 7381532 og US søknader med publiseringsnummer 2008-0241838 kan anvendes i foreliggende oppfinnelse.

I samsvar med en foretrukket utførelse, fremgangsmåten utføres i nærvær av en nedstrøms primer. Nedstrømsprimeren genererer i tillegg en målnukleinsyresekvens som kan hybridiseres med PTOen, forsterker sensitivitet i måldeteksjon.

I samsvar med en foretrukket utførelse, idet oppstrøms primeren og nedstrøms primeren anvendes, så benyttes i tillegg en templatavhengig nukleinpolymerase for ekstensjon av primerne.

I samsvar med en foretrukket utførelse, oppstrøms oligonukleotider (oppstrøms primer eller oppstrøms probe), nedstrøms primer og/eller 5'-taggingporsjon av PTOen har en dobbel primende oligonukleotid (DPO) struktur utviklet av oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse. Oligo-nukleotidene som har DPO-strukturen viser signifikant forbedret målspesifisitet sammenlignet med konvensjonelle primere og prober (se WO 2006/095981; Chun et al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucle/c AcidResearch, 35 :<5e40(2007)).

I samsvar med en foretrukket utførelse, 3'-målporsjonen av PTOen har en modifisert dobbel-spesifisitet oligonukleotid (mDSO) struktur utviklet av oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse. Den modifiserte dobbelspesifisitets oligonukleotid (mDSO) struktur viser signifikant forbedret målspesifisitet sammenlignet med konvensjonelle prober (se WO 2011/028041).

Trinn (b). Frigivelse av et fragment fra PTOen.

Deretter så kontaktes resultanten av trinn (a) til et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet under betingelser for spalting av PTOen. PTOen hybridisert med målnukleinsyresekvensen oppkuttes av enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet for å frigi et fragment omfattende 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen.

Termen som anvendes heri «betingelser og spalting av PTO» betyr betingelse tilstrekkelig til å oppkutte PTOen hybridisert med målnukleinsyresekvensen med enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet, så som temperatur, pH, ionestyrke, buffer, lengde og sekvens av oligonukleotider og enzymer. For eksempel, idet Taq DNA polymerase anvendes som enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet, så inkluderer betingelsene for PTOen Tris-HCL buffer, KC1, MgC^ og temperatur.

Idet PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen så er dets 3'-målporsjon involvert i hybridiseringen og 5'-taggingporsjonen danner en enkelttråd uten hybridisering med målnukleinsyresekvensen. (se fig 2). Som sådan, et oligonukleotid som omfatter både enkelttrådet og dobbelt - trådete strukturer kan oppkuttes ved anvendelse av et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet med en rekke teknologier kjent for den fagkyndige innen feltet.

Spaltingssetene av PTOen varieres avhengig av type oppstrøms oligonukleotider (oppstrøms probe eller oppstrøms primer), hybridiseringssete for oppstrøms oligonukleotider og spaltingsbetingelser (se US patenter nr. 5210015, 5487972, 5691142, 5994069 og 7381532 og US søknad med publiseringsnummer 2008-0241838).

Et antall konvensjonelle teknologier kan benyttes for spaltingsreaksjonen av PTOen, som frigjør et fragment omfattende 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen.

Kort forklart, der kan være tre seter for spalting i trinn (b). Først, spaltingssetet er et koblingssete mellom en hybridiseringsporsjon av PTOen (3'-målporsjon) og en ikke-hybridiseringsporsjon (5'-målporsjon). Det andre spaltingssetet er et sete lokalisert flere nukleotider i en 3'-retning fra 3'-enden av 5'-taggingporsjonen av PTOen. Det andre spaltingssetet er lokalisert ved 5'-endedelen av 3'-målporsjonen av PTOen. Det tredje spaltingssetet er et sete lokalisert flere nukleotider i en 5'-retning fra 3'-enden av 5'-målporsjonen av PTOen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, det innledende setet for spalting av PTOen med en templatavhengig polymerase som har 5'-nukleaseaktivitet etter forlengelse av oppstrøms primer er et start-punkt for dobbelttråden mellom PTOen og målnukleinsyresekvensen eller et sete 1 -3 nukleotider fra startpunktet.

I denne sammenheng, termen som anvendes heri «et fragment omfattende 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen» i forbindelse med spalting av PTOen av enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet anvendes for å omfatte (i) 5'-taggingporsjonen, (ii) 5'-taggingporsjonen og 5'-endedelen av 3'-målporsjonen og (iii) en del av 5'-taggingporsjonen. I denne søknad, termen «et fragment omfattende 5'-taggingporsjonen» eller «en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen» kan også beskrives som «PTO-fragment».

Termen «del» anvendt i forbindelse med PTO eller CTO så som del av 5'-taggingporsjonen av PTOen, 5'-endedelen av 3'-målporsjonen av PTOen og 5'-endedelen av fangeporsjonen av CTOen refererer til en nukleotidsekvens sammensatt av 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 eller 1-5 nukleotider, fortrinnsvis 1, 2, 3 eller 4 nukleotider.

I samsvar med en foretrukket utførelse, enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet er DNA polymerase som har en 5'-nukleaseaktivitet eller FEN-nuklease, mer foretrukket en termostabil DNA polymerase som har 5'-nukleaseaktivitet eller FEN-nuklease.

En egnet DNA polymerase som har 5'-nukleaseaktivitet ifølge oppfinnelsen er en termostabil DNA polymerase oppnådd fra en rekke bakteriearter inkluderende Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus flliformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus spedes Z05, Thermus spedes sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus og Aquifex aeolieus. Mer foretrukket, den termostabile DNA polymerase er Taq polymerase.

Alternativt, foreliggende oppfinnelse kan benytte DNA-polymeraser som har 5'-nukleaseaktivitet modifisert til å ha mindre polymeraseaktiviteter.

FEN (flap endonuklease) nuklease anvendt er en 5' flap-spesifikk nuklease.

FEN-nukleasen egnet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter FEN-nuklease oppnådd fra en rekke bakterielle arter, inkluderende Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus handleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix og Archaeaglobus veneficus.

Idet oppstrømsprimeren anvendes i trinn (a) er det foretrukket at betingelsene for spalting av PTOen omfatter ekstensjonsreaksjon av oppstrøms primeren.

I samsvar med en foretrukket utførelse, oppstrømsprimeren som anvendes i trinn (a) en templatavhengig polymerase anvendes for ekstensjon av oppstrøms primeren. Den templatavhengige polymerase kan være identisk til eller forskjellig fra enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet.

Valgfritt, oppstrøms primeren som anvendes i trinn (a), en templatavhengig polymerase anvendes for ekstensjon av oppstrøms primer og den templatavhengige polymerase er forskjellig fra enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet.

Trinn (c): Hybridisering av fragmentet frigjort fra PTOen med CTO.

Fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med en CTO (fange og templatoligonukleotid).

CTOen omfatter i en 3' til 5' retning (i) en fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen og (ii) en templatporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5'-taggingporsjonen og 3'-målporsjonen av PTOen.

CTOen er fungerende som en templat for ekstensjon av fragmentet frigjort fra PTOen. Fragmentet som fungerer som en primer hybridiseres med CTOen og forlenges for å danne en forlenget dupleks.

Templatporsjonen kan omfatte enhver sekvens så lenge den er ikke-komplementær til 5'-taggingporsjonen og 3'-målporsjonen av PTOen. Videre, templatporsjonen kan omfatte enhver sekvens så lenge den kan fungere som en templat for ekstensjon av fragmentet frigjort fra PTOen.

Som beskrevet over, idet fragmentet har 5'-taggingporsjonen av PTOen frigjort, er det foretrukket at fangeporsjonen av CTOen er konstruert til å omfatte en nukleotidsekvens, komplementær til 5'-taggingporsjonen. Idet fragmentet som har 5'-taggingporsjonen og en 5'-endedel av 3'-målporsjonen frigjort, er det foretrukket at fangeporsjonen av CTOen er konstruert til å omfatte en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen og 5'-endedelen av 3'-målporsjonen. Idet fragmentet som har en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen frigjort er det foretrukket at fangeporsjonen av CTOen er konstruert til å omfatte en nukleotidsekvens komplementær til den del av 5' taggingporsjonen.

Videre, det er mulig å konstruere fangeporsjonen av CTOen med antesiperte spaltingsseter av PTOen. For eksempel, idet fangeporsjonen av CTOen er konstruert til å omfatte en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen, kan hver av fragmentene ha en del av 5'-taggingporsjonen eller fragmenter som har 5'-taggingporsjonen kan være hybridisert med fangeporsjonen og deretter forlenges. Idet fragmentet som omfatter 5'-taggingporsjonen og en 5'-endedel av 3'-målporsjonen frigjøres, kan den hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen konstruert til å omfatte en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen og deretter med suksess forlenges selv om mismatch-nukleotider foreligger ved 3'-endeporsjonen av fragmentet. Dette er fordi primere kan forlenges avhengig av reaksjonsbetingelser selv om dets 3'-ende inneholder noen mismatch-nukleotider (for eksempel 1-3 mismatch-nukleotider).

Idet fragmentet som omfatter 5'-taggingporsjonen og en 5'-endedel av 3'-målporsjonen frigjøres, kan 5'-endedelen av fangeporsjonen av CTOen konstrueres til å ha en nukleotidsekvens komplementær til den spaltede 5'-endedel av 3'-målporsjonen, og dermed unngår man problemene assosiert med mismatch-nukleotider (se fig 1).

Fortrinnsvis, nukleotidsekvensen av 5'-endedelen av fangeporsjonen av CTOen komplementær til den spaltede 5'-endedel av 3'-målporsjonen kan velges avhengig av antesiperte spaltingsseter på 3'-målporsjonen av PTOen. Det er foretrukket at nukleotidsekvensen av 5'-endedelen av fangeporsjonen av CTOen komplementær til den spaltede 5'-endedel av 3'-målporsjonen 1-10 nukleotider, mer foretrukket 1-5 nukleotider, enda mer foretrukket 1-3 nukleotider.

3'-enden av CTOen kan omfatte ytterligere nukleotider som ikke er involvert i hybridisering med fragmenter. Videre, fangeporsjonen av CTOen kan omfatte en nukleotidsekvens som er komplementær kun til en del av fragmentet (for eksempel en del av fragmentet som inneholder dets 3'-endeporsjon) så lenge den stabilt hybridiserer med fragmentet.

Termen anvendt «fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen» er beskrevet heri for å omfatte forskjellige konstruksjoner og sammensetninger av fangeporsjonen av CTOen som beskrevet ovenfor.

CTOen kan være konstruert til å ha en hårnålsstruktur.

Lengden av CTOen kan variere bredt. For eksempel, CTOen er 7 til 1000 nukleotider, 7-500 nukleotider, 7-300 nukleotider, 7-100 nukleotider, 7-80 nukleotider, 7-60 nukleotider, 7-40 nukleotider, 15-1000 nukleotider, 15-500 nukleotider, 15-300 nukleotider, 15-100 nukleotider, 15-80 nukleotider, 15-60 nukleotider, 15-40 nukleotider, 20-1000 nukleotider, 20-500 nukleotider, 20-300 nukleotider, 20-100 nukleotider, 20-80 nukleotider, 20-60 nukleotider, 20-40 nukleotider, 30-1000 nukleotider, 30-500 nukleotider, 30-300 nukleotider, 30-100 nukleotider, 30-80 nukleotider, 30-60 nukleotider eller 30-40 nukleotider i lengde.

Fangeporsjonen av CTOen kan ha enhver lengde så lenge den er spesifikt hybridisert med fragmentet frigjort fra PTOen. For eksempel, fangeporsjonen av CTOen er 5-100 nukleotider, 5-60 nukleotider, 5-40 nukleotider, 5-30 nukleotider, 5-20 nukleotider, 10-100 nukleotider, 10-60 nukleotider, 10-40 nukleotider, 10-30 nukleotider, 10-20 nukleotider, 15-100 nukleotider, 15-60 nukleotider, 15-40 nukleotider, 15-30 nukleotider eller 15-20 nukleotider i lengde. Templatporsjonen av CTOen kan ha enhver lengde så lenge den fungerer som et templat i forlengelse av fragmentet frigjort fra PTOen. For eksempel, templatporsjonen av CTOen er 1-900 nukleotider, 1-400 nukleotider, 1-300 nukleotider, 1-100 nukleotider, 1-80 nukleotider, 1-60 nukleotider, 1-40 nukleotider, 1-20 nukleotider, 2-900 nukleotider, 2-400 nukleotider, 2-300 nukleotider, 2-100 nukleotider, 2-80 nukleotider, 2-60 nukleotider, 2-40 nukleotider, 2-20 nukleotider, 5-900 nukleotider, 5-400 nukleotider, 5-300 nukleotider, 5-100 nukleotider, 5-80 nukleotider, 5-60 nukleotider, 5-40 nukleotider, 5-30 nukleotider, 10-900 nukleotider, 10-400 nukleotider, 10-300 nukleotider, 15-900 nukleotider, 15-100 nukleotider, 15-80 nukleotider, 15-60 nukleotider, 15-40 nukleotider eller 15-20 nukleotider i lengde.

3'-enden av CTOen kan ha en 3'-OH-terminal. Fortrinnsvis, 3'-enden av CTOen blokkeres for å hindre dets forlengelse. Den ikke-forlengbare blokkering av CTOen kan oppnås i samsvar med konvensjonelle metoder. For eksempel, blokkeringen kan utformes ved å tilsette til 3'-hydroksylgruppen av den siste nukleotid av CTOen en kjemisk enhet så som biotin, markører, en fosfatgruppe, alkylgruppe, ikke-nukleotid linker, fosforotioat eller alkandiol. Alternativt, blokkeringen kan utføres ved å fjerne 3'-hydroksylgruppen av den siste nukleotid eller anvende et nukleotid med ingen 3'-hydroksylgruppe så som dideoksynukleotid.

Fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med CTOen, og tilveiebringer en form egnet i forlengelse av fragmentet.

Selv om en ikke-oppkuttet PTO også hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen gjennom dets 5'-taggingporsjon, så vil dets 3'-målporsjon ikke hybridiseres til CTOen som hindrer dannelse av en forlenget dupleks.

Hybridiseringen i trinn (c) kan beskrives i detalj med henvisning til beskrivelsene i trinn (a).

Trinn (d): Ekstensjon av fragmentet.

Ekstensjonsreaksjonen utføres ved anvendelse av resultanten av trinn (c) og templatavhengig nukleinsyrepolymerase. Fragmentet hybridisert med fangeporsjonen av CTOen forlenges for å danne en forlenget tråd omfattende en forlenget sekvens komplementær til templatporsjonen av CTOen, og danner dermed en forlenget dupleks. I motsetning, ikke-spaltet PTO hybridisert med fangeporsjonen av CTOen forlenges ikke slik at ingen forlenget tråd dannes.

Termen anvendt heri «forlenget dupleks» angir en dupleks dannet med ekstensjonsreaksjon hvor fragmentet hybridisert med fangeporsjonen av CTOen forlenges ved anvendelse av templatporsjonen av CTOen som et templat og templatavhengig nukleinsyrepolymerase.

Termen anvendt heri «forlenget tråd» i forbindelse med fragmentet betyr en sekvens sammensatt av fragmentet og dets forlengede sekvens.

Termen anvendt heri «forlenget sekvens» i forbindelse med fragmentet betyr kun en nylig forlenget sekvens som er en porsjon av den forlengede tråd med unntak av fragmentet.

Templatavhengig nukleinsyrepolymerase anvendt i trinn (d) kan inkludere enhver nukleinsyrepolymerase, for eksempel Klenow-fragment av E. coli DNA polymerase I, en termostabil DNA polymerase og bakteriofag T7 DNA polymerase. Fortrinnsvis, polymerasen er en termostabil DNA polymerase som kan oppnås fra en rekke bakterielle arter, inkluderende Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus spedes Z05, Thermus spedes sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus( Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus og Aquifex aeolieus. Mest foretrukket, den templatavhengige nukleinsyrepolymerase er Taq polymerase.

I samsvar med foretrukket utførelse, templatavhengig nukleinsyrepolymerase inkluderer en revers transkriptase.

I samsvar med en foretrukket utførelse, enzymet som har 5'nukleaseaktivitet anvendt i trinn (b) er identisk til den templatavhengige nukleinsyrepolymerase anvendt i trinn (d). Mer foretrukket, enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet anvendt i trinn (b) den templatavhengige nukleinsyrepolymerase anvendt for ekstensjon av oppstrøms primer og templatavhengig nukleinsyrepolymerase anvendt i trinn (d) er identiske med hverandre.

Trinn (e): Signalgenerering med hybridisering mellom den forlengede tråd og SO.

Etter ekstensjonsreaksjonen hybridiseres den forlengede tråd med et signaleringsoligonukleotid (SO). Signalet som indikerer nærvær av målnukleinsyresekvensen tilveiebringes. Signalene inkluderer en signalgenerering eller utslipps lokking, eller signalforandring (signaløkning eller reduksjon).

SOen som hybridiseres med den forlengede tråd omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd.

Idet SOen omfatter en komplementær sekvens kun til PTO-fragmentet, kan et ikke-målsignal ikke genereres på grunn av hybridisering til ikke-oppkuttet PTO og SOen i noen av signaleringssystemene beskrevet heri nedenfor.

Idet posisjonen av inkorporerte markører i den forlengede tråd som illustrert i fig 6 hensiktsmessig justeres, kan et ikke-målsignal ikke genereres selv om det anvendes SO omfattende en komplementær sekvens kun til PTO-fragmentet.

I mellomtid, hvor SOen omfatter en komplementær sekvens kun til PTO-fragmentet, kan et ikke-målsignal genereres på grunn av hybridisering av ikke-oppkuttet PTO og SOen i noen av signaleringssystemene beskrevet heri nedenfor (for eksempel signaliseringssystemet ifølge fig 2).

Idet ikke-målsignalet blir problematisk, bør en andel av SOen konstrueres til å omfatte en komplementær sekvens til en porsjon av den forlengede sekvens som nylig er syntetisert.

I samsvar med en foretrukket utførelse, SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede sekvens.

I samsvar med en foretrukket utførelse, minst en porsjon av SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede sekvens. Porsjonen av SOen omfattende en komplementær sekvens til den forlengede sekvens er minst 1, 2, 3, 4, 5 eller 10 nukleotider i lengde.

Idet en porsjon av SOen er konstruert til å omfatte en komplementær sekvens til en porsjon av den forlengede sekvens som nylig er syntetisert, blir Tm-verdien av hybridiseringsresultanten av SOen og den forlengede tråd forskjellig fra hybridiseringsresultanten av SOen og den ikke-oppkuttede PTO. Forskjellene i Tm-verdier sikrer differensierte signaler fra de to hybridiseringsresultanter. For eksempel, ikke-målsignaler kan ikke ekskluderes i en sanntidsdeteksjon ved å justere temperatur for deteksjon ved vurdering av Tm-verdier, eller i en smeltekurveanalyse av smeltetopper.

Fortrinnsvis, SOen kan omfatte gjennom dets hele sekvens en komplementær sekvens til den forlengede sekvens. Alternativt, SOen kan omfatte en porsjon som har en komplementær sekvens til den forlengede sekvens. For eksempel, en porsjon av SOen kan omfatte en komplementær sekvens til den forlengede sekvens og den andre porsjon kan omfatte en komplementær sekvens til fragmentet.

Fortrinnsvis, SOen omfatter gjennom dets hele sekvens en komplementær sekvens til den forlengede sekvens.

SOen kan ha enhver lengde, for eksempel 5-100 nukleotider, 5-80 nukleotider, 5-60 nukleotider, 5-40 nukleotider, 5-20 nukleotider, 5-10 nukleotider, 10-100 nukleotider, 10-80 nukleotider, 10-60 nukleotider, 10-40 nukleotider, 10-30 nukleotider, 10-20 nukleotider, 15-100 nukleotider, 15-80 nukleotider, 15-60 nukleotider,

15-40 nukleotider, 15-30 nukleotider, 15-20 nukleotider, 20-100 nukleotider, 20-80 nukleotider, 20-60 nukleotider, 20-40 nukleotider eller 20-30 nukleotider.

SOen kan ha en hårnålsstruktur.

Fortrinnsvis, 3'-enden av SOen blokkeres for å hindre dets forlengelse. Alternativt, SOen som har en ikke-blokkert 3'-OH-ende kan forlenges.

Signalsystemet tilpasset foreliggende oppfinnelse effektueres med assosiasjon av signalgenerering med hybridisering av SOen. Med andre ord, ved hybridisering av SOen med den forlengede tråd, tilveiebringes et detekterbart signal. Hybridisering av SOen med den forlengede tråd foregår kun idet målnukleinsyresekvensen foreligger og PTOen spaltes. Derfor, det detekterbare signal indikerer nærvær av målnukleinsyresekvensen. I denne forbindelse, dersom ønskelig, kan foreliggende oppfinnelse utføres på en sanntids måte.

For direkte å assosiere hybridiseringen av SOen med signaler, anvender foreliggende oppfinnelse minst en markør koblet til SOen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, det detekterbare signal som indikerer nærvær av målnukleinsyresekvensen tilveiebringes av (i) markøren koblet til SOen, (ii) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og en markør koblet til fragmentet fra PTOen, (iii) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og en markør som skal inkorporeres inn i den forlengede tråd under ekstensjonsreaksjonen av trinn (d) eller (iv) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og et interkalerende fargestoff.

Merkesystemene som er nyttige ifølge oppfinnelsen vil bli beskrevet i detalj som følger:

(i) Enkeltmarkør koblet til SOen.

Foreliggende oppfinnelse kan tilveiebringe signal for dannelse av den forlengede tråd som indikerer nærvær av målnukleinsyresekvensen ved anvendelse av en enkelt markør (se fig 3).

I samsvar med en foretrukket utførelse, SOen merket med en enkelt markør og hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd i trinn (e) inkluderer forandring i signal fra enkeltmarkøren for å tilveiebringe det detekterbare signal.

Enkeltmarkøren som anvendes heri må være i stand til å tilveiebringe et forskjellig signal avhengig av dets nærvær på en dobbelttråd eller enkelttråd. Enkeltmarkøren inkluderer en fluoriserende markør, en luminescens markør en kjemiluminiscens markør, en elektrokjemisk markør og en metallmarkør.

Fortrinnsvis, enkeltmarkøren inkluderer en fluoriserende markør som tilveiebringer signaler av forskjellig intensitet avhengig av om den er koblet til en dobbelttråd eller enkelttråd nukleinsyre.

Fig 3 illustrerer en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse som anvender en enkelt markør. Som illustrert i fig 3, enkeltfluoressens markøren koblet til SOen hybridisert med den forlengede tråd oppviser mer intens fluoressens enn koblet til SOen som ikke er hybridisert.

Forandringene (økning eller reduksjon) i fluoressensintensitet av enkeltfluoressensmarkører måles for å detektere nærvær av målnukleinsyresekvensen.

Typene og foretrukne bindingsseter av enkeltfluoressensmarkører anvendt i denne oppfinnelse er beskrevet i US patenter nr. 7537886 og 7348141, hvis beskrivelser inkorporeres heri med referanse i sine helheter. Fortrinnsvis, enkeltfluoressensmarkører inkluderer JOE, FAM, TAMRA, ROX og fluoresin basert markør. Den merkede nukleotidenhet er foretrukket posisjonert som indre nukleotid-enheter innen oligonukleotidet i stedet for ved 5'-enden eller 3'-enden.

I samsvar med en foretrukket utførelse, enkeltmarkøren på SOen er lokalisert ved 1-15 nukleotider, 1-10 nukleotider eller 1-5 nukleotider fra dets 5'-ende eller dets 3'-ende. Mer foretrukket, enkelt-markøren er lokalisert i midtporsjonen av SOen.

Enkeltfluoressensmarkører nyttige ifølge foreliggende oppfinnelse kan beskrives med referanse til beskrivelser for reporter- og cancermolekyler som angitt nedenfor.

(ii) Intratråd interaktiv dobbeltmarkør koblet til SO.

Det interaktive markørsystem er et signalgenereringssystem hvor energi passerer ikke-radioaktivt mellom et donormolekyl og et akseptormolekyl. En representant for det interaktive markørsystem, inkluderer FRET (fluoressensresonans energioverføring) merkesystem et fluoriserende reportermolekyl (donormolekyl) og et quenchermolekyl (akseptormolekyl). I FRET, er energidonoren fluoriserende, men energiakseptoren kan være fluorescent eller ikke fluorescent. I en annen form av interaktive markørsystemer er energidonoren ikke-fluorescent, for eksempel en kromofor, og energiakseptoren er fluorescent. I en ytterligere form av interaktive markørsystemer, er energidonoren luminescens, for eksempel bioluminisent, kjemiluminisent, elektrokjemiluminisent og akseptaren er fluorescent. Donormolekylene og akseptormolekylene kan beskrives som et reportermolekyl og et quenchermolekyl i foreliggende oppfinnelse, respektivt.

Fortrinnsvis, signalet som indikerer dannelse av den forlengede tråd (det vil si nærvær av målnukleinsyresekvensen) genereres ved interaktive markørsystemer, mer foretrukket FRET-markørsystem (det vil si interaktivt dobbeltmarkørsystem).

I samsvar med foretrukket utførelse, SOen markert med en interaktiv dobbeltmarkør omfattende et reportermolekyl og et quenchermolekyl og hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd i trinn (i) inkluderer forandring i signal fra den interaktive dobbeltmarkør for å tilveiebringe det detekterbare signal. Før hybridisering av SOen, er reportermolekylene og quenchermolekylene på SOen konformasjonsmessig tilgrensende til hverandre for å muliggjøre at quenchermolekylene quencher signalene fra reportermolekylene. Ved hybridisering er reportermolekylene og quenchermolekylene på SOen konformasjonsmessig separert for å muliggjøre at quenchermolekylet ikke quencher signaler fra reportermolekylene, og forårsaker forandringer i signaler fra den interaktive dobbelmarkør.

Fig 2 representerer en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse som anvender en interaktiv dobbelmarkør. Fragmentet frigjort fra PTOen hybridisert med målnukleinsyresekvensen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen og forlenges for å danne den forlengede tråd. Ved hybridisering av den forlengede tråd med SOen, blir reportermolekylet og quenchermolekylet på SOen komforma-sjonsmessig separert for å muliggjøre at quenchermolekylet ikke-quencher signalet fra reportermolekylet, som gir opphav til forandringer i signaler fra den interaktive dobbelmarkør (for eksempel økning i signalet fra reportermolekylene). I motsetning, i det målnukleinsyresekvensen ikke foreligger, vil spalting av PTOen ikke forekomme. Den ikke-oppkuttete PTO forlenges ikke idet den hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen. Reportermolekylet og quenchermolekylet på SOen som ikke er involvert i hybridiseringen er konformasjonsmessig tilgrensende til hverandre og muliggjør at quenchermolekylet quencher signalet fra reportermolekylet.

Uttrykket som anvendes heri «reportermolekylet og quenchermolekylet er konformasjonsmessig tilgrensende» betyr at reportermolekylet og quenchermolekylet er tredimensjonale tilgrensende til hverandre med en konformasjonsstruktur av fragmentet eller SO så som vilkårlig queiling eller hårnålsstruktur.

Uttrykket anvendt her «reportermolekylet og quenchermolekylet er konformasjonsmessig separert» betyr at reportermolekylet og quenchermolekylet er tredimensjonalt separert med forandring av en konformasjonsstruktur av SO ved dannelse av en dobbelttråd ved hybridisering med den forlengede tråd.

I samsvar med en foretrukket utførelse, reportermolekylet og quenchermolekylet er posisjonert ved 5'-enden (eller 3'-enden) og 3'-enden (eller 5'-enden) av SOen. I samsvar med en foretrukket utførelse, er et av reportermolekylene og quenchermolekylet på SOen lokalisert ved dets 5'-ende eller ved 1-5 nukleotider fra dets 5'-ende og den andre er lokalisert for å quenche eller ikke-quenche signaler fra reportermolekylet avhengig av konformasjonen av SO.

I samsvar med en foretrukket utførelse, en av reportermolekylene og quenchermolekylet på SOen er lokalisert ved dets 3'-ende eller ved 1-5 nukleotider fra dets 3'-ende og den andre er lokalisert for å quenche og ikke-quenche signaler fra reportermolekylet avhengig av konformasjon av SOen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, reportermolekylet og quenchermolekylet er posisjonert ikke mer enn 80 nukleotider, mer foretrukket ikke mer enn 60 nukleotider, enda mer foretrukket ikke mer enn 30 nukleotider, enda mer foretrukket ikke mer enn 25 nukleotider fra hverandre. I samsvar med en foretrukket utførelse, reportermolekylet og quenchermolekylet er separert med minst 4 nukleotider, mer fortrinnsvis minst 6 nukleotider, enda mer foretrukket minst 10 nukleotider, enda mer foretrukket minst 15 nukleotider.

Reportermolekylet og quenchermolekylet nyttige ifølge foreliggende oppfinnelse kan inkludere ethvert molekyl kjent innen fagfeltet. Eksempler på slike er: Cy2™ (506), YO-PRO™-l (509), YOYO™-l (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™

(527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-!

(533), T0T01 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red

(628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOT03 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5

(694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM

(520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) og Quasar 705 (610). Tallene i parentes er maksimum emisjonsbølgelengder i nanometer. Fortrinnsvis, reportermolekylet og quenchermolekylet inkluderer JOE, FAM, TAMRA, ROX og fluoresinbasert markør.

Egnete par av reporter-quenchere er beskrevet i en rekke publikasjoner som følger:

Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2<nd>Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes og Research Chemicals, 6,h Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996) U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

Det skal bemerkes at et ikke-fluorescerende svart cancermolekyl (eller mørkt quenchermolekyl) er i stand til å quenche en fluoressens av et bredt spekter av bølgelengder eller en spesifikk bølgelengde kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på slike er BHQ og DABCYL.

I FRET-markøren tilpasset til SOen, omfatter reporteren en donor av FRET og quencheren omfatter den andre partner (akseptor av FRET). For eksempel, Et fluoriserende fargestoff anvendes som reporter og et rodaminfargestoff som quencher.

(iii) Intertråd interaktiv dobbelmarkør.

I utførelsen som anvender intratråd interaktiv dobbelmarkør, har den forlengede tråd en av en interaktiv dobbelmarkør omfattende et reportermolekyl og et quenchermolekyl og SOen har den andre av den interaktive dobbelmarkør.

Utførelsen som anvender intratråd interaktiv dobbelmarkør kan utføres i samsvar med følgende tre tilnærminger: I samsvar med første metode, SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl og en interaktiv dobbelmarkør, fragmentet fra PTOen omfatter den andre markør blant reportermolekylet og quenchermolekylet; den forlengede tråd omfatter markøren som har sitt opphav i fragmentet fra PTOen, og hvor hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd inkluderer forandringer i signaler fra den interaktive dobbelmarkør for å tilveiebringe det detekterbare signal (se fig 5).

En markør koblet til SOen kan være enten et reportermolekyl eller et quenchermolekyl, og en markør til fragmentet kan være enten et quenchermolekyl eller et reportermolekyl.

Markeringssetet på PTOen bestemmes ved vurdering av dets spaltingssete, slik at PTO-fragmentet kan ha markøren.

Markøren kan være koblet til ethvert sete (for eksempel taggingporsjonen av PTOen) på PTO-fragmentet, så lenge den interagerer med markøren til SOen ved hybridisering med SOen for å indusere forandring i signaler. Markøren kan være koblet til ethvert sete (for eksempel 5'-enden av SOen) på SOen, så lenge den interagerer med markøren på PTO-fragmentet ved hybridisering med PTO-fragmentet for å indusere forandring i signaler.

I samsvar med en andre metode, SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør, og templatporsjonen av CTOen omfatter et nukleotid som har en første ikke-naturlig base; hvor ekstensjonsreaksjonen i trinn (d) utføres i nærvær av et nukleotid som har både en andre ikke-naturlig base med en spesifikk bindingsaffinitet til den første ikke-naturlige base og den andre blant reportermolekylet og quenchermolekylet, for dermed å inkorporere markøren inn i den forlengede tråd; hvor hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd induserer forandring i signal fra den interaktive dobbelmarkør for å tilveiebringe det detekterbare signal (se fig 6).

Termen anvendt heri «ikke-naturlig base» refererer til derivater av naturlige baser så som adenin (A), guanin (G), tymin (T), cytosin (C) og Urasil (U), som er i stand til å danne hydrogenbindende basepar. Termen anvendt heri «ikke-naturlig base» inkluderer baser som har forskjellige baseparringsmønstre fra naturlige baser som morforbindelser, som beskrevet for eksempel i US patenter nr. 5432272, 5965364, 6001983 og 6037120. Baseparringen mellom ikke-naturlig base involverer to eller tre hydrogenbindinger som naturlig base. Baseparringen mellom ikke-naturlige baser utføres på en spesifikk måte.

Spesifikke eksempler på ikke-naturlige baser inkluderer følgende baser i baseparkombinasjoner: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J, og M/N (se US patent nr. 7422850).

Markøren inkorporert under ekstensjonen er fortrinnsvis koblet til et nukleotid, mer fortrinnsvis til en nukleosid trifosfat. Fortrinnsvis, markøren er bundet til en base av et nukleosid trifosfat.

Den eksemplifiserte utførelse er beskrevet med henvisning til fig 6. Fragmentet hybridiseres med CTOen med en nukleotid som har en ikke-naturlig base (for eksempel iso-dC) med en spesifikk bindingsaffinitet til en ikke-naturlig base (for eksempel iso-dG). Ekstensjonen utføres i nærvær av et nukleotid som har iso-dG merket med en quencher for å danne den forlengede tråd. I ekstensjonsreaksjonen, nukleotidet som har iso-dG med en quencher inkorporeres i et motsatt sete til nukleotidet som har iso-dC. Etter hybridiseringen av den forlengede tråd som inneholder quencher iso-dG med SOen merket med en reporter, så vil quencheren på den forlengede tråd quenche signalet fra reporteren på SOen for å indusere forandringer i signal, og tilveiebringe det detekterbare signal.

En av den interaktive dobbelmarkør er koblet til SOen og den andre er inkorporert inn i den forlengede tråd fra en reaksjonsløsning under ekstensjonsreaksjonen.

En markør koblet til SOen kan enten være et reportermolekyl eller et quenchermolekyl, og en markør inkorporert inn i den forlengede tråd kan enten være et quenchermolekyl eller et reportermolekyl.

Markøren inkorporert inn i den forlengede tråd kan være koblet til ethvert sete på den forlengede tråd (for eksempel 3'-enden av den forlengede tråd), så lenge den interagerer med markøren til SOen ved hybridisering med SOen for å indusere forandringer i signaler. Markøren kan være koblet til ethvert sete (for eksempel 5'-enden av SOen) på SOen, så lenge den interagerer med markøren inkorporert inn i den forlengede tråd ved hybridisering med den forlengede tråd for å indusere forandring i signaler.

I samsvar med den tredje metode, SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør, og ekstensjonsreaksjonen i trinn (d) utføres i nærvær av et nukleotid som har den andre blant reportermolekylet og quenchermolekylet, og dermed inkorporerer markøren inn i den forlengede tråd; hvor hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd induserer forandring i signalet fra den interaktive dobbelmarkør for å tilveiebringe det detekterbare signal (se fig 7).

En markør koblet til SOen kan være enten et reportermolekyl eller et quenchermolekyl (fortrinnsvis reportermolekyl), og en markør inkorporert inn i den forlengede tråd kan være enten et quenchermolekyl eller et reportermolekyl (fortrinnsvis quenchermolekyl).

(iv) Interaktiv dobbelmarkør som anvender to Soer.

I en utførelse av den interaktive dobbelmarkør som anvender to SOer, anvender metoden ifølge foreliggende oppfinnelse en ytterligere SO som omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd, hvor de to SOer hybridiseres med den forlengede tråd på en tilgrensende måte, de to SOer omfatter hver en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbel-markør; og hybridiseringen mellom de to SOer og den forlengede tråd induserer forandring i signal fra den interaktive dobbelmarkør for å tilveiebringe det detekterbare signal (se fig 4).

Fortrinnsvis, minst en av de to SOer omfatter en porsjon hybridisert til en nylig forlenget sekvens i ekstensj onsreaksj onen.

Prinsippet som legger til grunn for ytelsen av denne utførelse av den interaktive dobbelmarkør som anvender to SOer er som følger: fragmenter frigjort fra PTOen hybridisert med målnukleinsyresekvensen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen og forlenges for å danne den forlengede tråd. Deretter, de to SOer hybridiseres med den forlengede tråd. I hybridiseringen, siden de to SOer er tilgrensende hybridisert med den forlengede tråd, er reportermolekylene og quenchermolekylene på de to SOer tilgrensende til hverandre for å muliggjøre at quenchermolekylet kan quenche signalet fra reportermolekylet, resulterende i forandring i signaler fra den interaktive dobbelmarkør (for eksempel økning i signal fra reportermolekylene). I motsetning, idet målnukleinsyresekvensen ikke foreligger, vil spalting av PTOen ikke forekomme. Den ikke-oppkuttede PTO forlenges ikke idet den er hybridisert med fangeporsjonen av CTOen. Reportermolekylet og quenchermolekylet på de to SOer ikke involvert i hybridiseringen separeres fra hverandre for å generere signaler fra reportermolekylene.

I samsvar med foretrukket utførelse, de to SOer kan hybridiseres med ethvert sete for den forlengede tråd så lenge deres hybridisering med den forlengede tråd muliggjør at quenchermolekylet kan quenche signalet fra reportermolekylet. Fortrinnsvis, de to SOer er posisjonert på en umiddelbar tilgrensende måte eller 1-5 nukleotider fra hverandre.

I samsvar med foretrukket utførelse, hvor de to SOer kan være tilgrensende hybridisert med den forlengede tråd, kan reportermolekylet og quenchermolekylet være koblet til ethvert sete av de to SOer så lenge quenchermolekylet quencher signalet fra reportermolekylet. For eksempel, reportermolekylet eller quenchermolekylet er koblet til 5'-enden av en SO eller 1-5 nukleotider fra dets 5'-ende, og quenchermolekylet eller reportermolekylet til 3'-enden av den andre SO eller 1-5 nukleotider fra dets 3'-ende.

(v) FRET-merking ved anvendelse av interkalerende fargestoff.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse, en FRET (fluorescens resonans energioverføring) signalering blir praktisk ved anvendelse av interkalerende fargestoff.

I samsvar med foretrukket utførelse, SOen omfatter en akseptor av et FRET og hybridiseringen i trinn (e) utføres i nærvær av et interkalerende fargestoff; hvor hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd induserer forandring i signaler fra akseptaren av SOen for å tilveiebringe det detekterbare signal (se fig 8).

Eksemplifiserte interkalerende fargestoff nyttige i denne oppfinnelse inkluderer

SYBR™ Green I, PO-PRO™-l, BO-PRO™-l, SYTO™43, SYTO™44, SYTO™45, SYTOX™Blue, POPO™-l, POPO™-3, BOBO™-l, BOBO™-3, LO-PRO™-l, JO-PRO™-l, YO-PRO™l, TO-PR0™1, SYT0™11, SYTO™13, SYTO™15, SYTO™16, SYTO™20, SYTO™23, TOTO™-3, YOYO™3, GelStar™ og tiazol oransje. Det interkalerende fargestoff som interkalerer spesifikt inn i dobbeltrådet nukleinsyremolekyler for å generere signaler.

Prinsippet som ligger til grunn for ytelsen av denne utførelse av FRET-markering ved anvendelse av interkalerende fargestoff er som følger: Fragmentet frigjort fra PTOen hybridisert med målnukleinsyresekvensen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen og forlenges for å danne den forlengede tråd. Deretter, SOen merket med akseptaren hybridiseres med den forlengede tråd for å danne en dobbelttrådet nukleinsyremolekyl og deretter bindes de interkalerende fargestoff til den dobbeltrådete nukleinsyremolekyl. Energioverføringen foregår fra de interkalerende fargestoff som fungerer som et donormolekyl til akseptaren ved bestråling for donoreksitasjon og induserer forandringer i signalet fra akseptaren for å tilveiebringe det detekterbare signal. I motsetning, FRET-fenomen foregår ikke i fravær av målnukleinsyresekvensen, og resulterer i ingen signalforandring.

I samsvar med en foretrukket utførelse, akseptaren koblet til SOen inkluderer forskjellige enkelt - fluorescerende markører beskrevet ovenfor, men ikke begrenset til disse.

En markør kan være koblet til SOen eller PTOen med konvensjonelle metoder. Fortrinnsvis, den er koblet til SOen eller PTOen gjennom en spacer inneholdende minst tre karbonatomer, for eksempel 3-karbonspacer, 6. karbonspacer eller 12 karbonspacer.

SOen som er nyttig ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer enhver probe i stand til å tilveiebringe signaler avhengig av hybridisering, for eksempel

Molecular beacon™ (US Pat. No. 5,925,517), Hybeacons™ (D. J. French, et al, Molecular og Cellular Probes (2001) 13, 363-374 og US Pat. No. 7,348,141), Dual-labeled, self-quenched probe (US Pat. No. 5,876,930), LUX™ (I. A. Nazarenko, et al. Nucleic Acids Res 2002, 30:2089-2095. og US Pat. No. 7,537,886) og Hybridization probe (Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148 og Deepti Parashar et al., Indian J Med Res 124, review article October 2006 385-398).

Trinn (f): Deteksjon av målsignal.

Til slutt, det detekterbare signal tilveiebrakt i trinn (e) detekteres, hvorved deteksjon av signalet indikerer nærvær av den forlengede tråd og nærvær av målnukleinsyresekvensen.

Som diskutert ovenfor, hybridiseringshendelsen av SOen er synkronisert med signaleringshendelsen fra markøren av hybridiseringsresultanten for å tilveiebringe signaler som indikerer målnukleinsyresekvensen. I denne sammenheng, foreliggende oppfinnelse kan utføres på en sanntids-måte ved anvendelse av markører som tilveiebringer signaler som kan detekteres i sanntid.

Alternativt, deteksjon av målsignalene kan utføres med en smelteanalyse på grunn av at markørene som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse er i stand til å tilveiebringe detekterbare signaler under smelting av hybridiseringsresultanten eller smelting og hybridisering av hybridiseringsresultanten. Termen som anvendes heri «smelteanalyser» betyr en fremgangsmåte hvor et målsignal som indikerer nærvær av den forlengede dupleks oppnås med smelting av den forlengede dupleks, inkluderende en metode for å måle signaler ved to forskjellige temperaturer, smeltekurveanalyse, smeltemønster-analyse og smeltetoppanalyse. Fortrinnsvis, smelteanalysene er en smeltekurveanalyse.

For eksempel, idet dupleksen mellom SOen og den forlengede tråd smeltes, er reportermolekylet og quenchermolekylet på den enkelttrådete SO konformasjonsmessig tilgrensende til hverandre og muliggjør at quenchermolekylet quencher signalet fra reportermolekylet, slik at forandring i signaler induseres til å gi det detekterbare signal. Videre, idet SOen og den forlengede tråd rehybridiseres for å danne en dupleks, så blir reportermolekylet og quenchermolekylet på SOen konformasjonsmessig separert for å muliggjøre at quenchermolekylet ikke-quencher signalet fra reportermolekylet, slik at forandring i signaler induseres for å gi det detekterbare signal, (se fig 2).

I samsvar med foretrukket utførelse, nærvær av den forlengede tråd av PTO-fragmentet detekteres med en smeltekurveanalyse som anvender Tm-verdier av dupleksen mellom SOen og den forlengede tråd.

Idet Tm-verdier av dupleksen mellom SOen og den forlengede tråd anvendes for analyser, er det foretrukket å anvende markører (for eksempel fluorescerende markører) som muliggjør homogene analyser uten separasjon av hybridiseringsresultanten mellom SOen og den forlengede tråd.

I samsvar med foretrukket utførelse, hybridiseringsresultanten mellom SOen og den forlengede tråd har Tm-verdier som kan justeres med sekvens og/eller lengde av PTO-fragmentet, sekvens og/eller lengde av CTOen, sekvens og /eller lengde av SOen og deres kombinasjon.

For eksempel, Tm-verdier av hybridiseringsresultanten kan justeres ved å justere mismatch grad av sekvensen av SOen. Videre, ved å justere lengde av SO, kan også Tm-verdier av hybridiseringsresultanten justeres.

Fortrinnsvis, foreliggende metode omfatter videre trinnene å tilveiebringe et detekterbart signal mellom trinnene (e) og (f) ved å smelte hybridiseringsresultanten av trinn (e) eller ved å smelte og hybridisere hybridiseringsresultanten av trinn (e); hvor trinn (f) utføres ved å detektere signalet for å bestemme nærvær av den forlengede tråd.

Alternativt, foreliggende metode omfatter ytterligere trinnet å tilveiebringe og detektere et detekterbart signal etter trinn (f) ved smelting av hybridiseringsresultanten av trinn (e) eller ved smelting og hybridisering av hybridiseringsresultanten av trinn (e), hvor nærvær av den forlengede tråd bestemmes en gang til.

I samsvar med foretrukket utførelse, nærvær av den forlengede tråd av PTO-fragmentet detekteres med en hybridiseringskurveanalyse.

Termen anvendt heri «Tm» refererer til en smeltetemperatur hvorved halve populasjonen av dobbelt-trådete nukleinsyremolekyler er dissosiert til enkelttrådede molekyler. Tm-verdien bestemmes med lengde og G/C-innhold av nukleotidene som er hybridisert. Tm-verdien kan beregnes med konvensjonelle metoder så som Wallace rule (R.B. Wallace, et al., Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) og nearest-neighbor method (SantaLucia J. Jr., et al., Biochemistry, 35:3555-3562(1996)); Sugimoto N., et al, Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996)).

I samsvar med foretrukket utførelse, Tm-verdien refererer til aktuelle Tm-verdier under reaksjonsbetingelser faktisk praktisert.

Smeltekurven eller hybridiseringskurven kan oppnås med konvensjonelle teknologier, for eksempel, som beskrevet i U.S. Pat Nos. 6,174,670 og 5,789,167, Drobyshev et al, Gene 188: 45(1997);

Kochinsky og Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); Livehits et al J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); og Howell et al Nature Biotechnology 17:87(1999). For eksempel, en smeltekurve eller hybridiseringskurve kan bestå av et grafisk plott eller fremvisning av en variasjon av utgangssignaler med parameteren for hybridiseringsstringens. Utgangssignalene kan plottes direkte mot hybridi-seringsparameterne. Typisk, en smeltekurve eller hybridiseringskurve vil ha utgangssignalene, for eksempel fluoressens, som indikerer graden av dupleksstruktur (det vil si graden av hybridisering) plottet på y-aksen, og hybridiseringsparameteren på x-aksen.

Et plott av første derivat av fluoressens vs temperatur, det vil si et plott av graden av forandring i fluoressens vs temperatur (dF/dT vs. T) eller (-dF/dT vs. T) gir smeltetoppen.

Dannelse av den forlengede tråd kan detekteres på størrelsen av den forlengede tråd. SOen hybridisert med den forlengede tråd tilveiebringer et detekterbart signal for deteksjon av den forlengede tråd basert på størrelsen av den forlengede tråd. For eksempel, idet dannelse av den forlengede tråd detekteres med forskjellige elektroforesemetoder så som gelelektroforese og polyakrylamidgelelektroforese, så tilveiebringer SOen hybridisert med den forlengede tråd et signal på en gelmatriks som indikerer nærvær av den forlengede tråd. Fortrinnsvis, SOen med en enkelt fluorescent markør anvendes.

PTO, CTO og SO kan utgjøres av naturlig forekommende dNMPer. Alternativt, PTO, CTO og SO kan være dannet av modifiserte nukleotid- eller ikke-naturlige nukleotider så som PNA (peptid nukleinsyre, se PCT publikasjonsnummer WO 92/20702) og LNA (låst nukleinsyre, se PCT publikasjonsnummer WO 98/22489, WO 98/39352 og WO 99/14226). PTO, CTO og SO kan omfatte universelle baser så som deoksyinosin, inosin, l-(2'-deoksy-beta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol og 5-nitroindoe. Termen «universell base» refererer til en som er i stand til å danne basepar med hver av de naturlige DNA/RNA-baser uten å diskriminere mellom disse.

Som beskrevet over, PTOen kan spaltes ved sete lokalisert i en 3'-retning fra 3'-enden av 5'-taggingporsjonen av PTOen. Spaltingssetet kan være lokalisert ved 5'-endedelen av 3'-målporsjonen av PTOen. I det PTO-fragmentet omfatter 5'-endedelen av 3'-målporsjonen av PTOen, kan et sete av CTOen hybridisert med 5'-endedelen av 3'-målporsjonen omfatte en universell base, degenerert sekvens eller deres kombinasjon. For eksempel, dersom PTO er spaltet ved et sete lokalisert i en nukleotid i en 3'-retning fra 3'-enden av 5'-taggingporsjonen av PTOen, er det fordelaktig at 5'-endedelen av fangeporsjonen av CTOen omfatter en universell base for hybridisering med nukleotidet. Dersom PTOen spaltes ved et sete lokalisert to nukleotider i en 3'-retning fra 3'-enden av 5'-taggingporsjonen av PTOen, er det fordelaktig at 5'-enden av fangeporsjonen av CTOen omfatter en degenerert sekvens og dets 3'-retning tilgrensende nukleotidet omfatter en universell base. Som sådan, hvor spaltingen av PTO foregår ved forskjellige seter av 5'-endedelen av 3'-målporsjonen, så er anvendelse av universelle baser og degenererte sekvenser i CTOen nyttig. I tillegg, idet PTOene som har de samme 5'-taggingporsjoner anvendes for screening av multiple målnukleinsyresekvenser under oppstrøms primer ekstensjonsavhengig spaltingsinduksjon, kan PTO-fragmenter som har forskjellige 5'-endedeler av 3'-målporsjonen genereres. I slike tilfeller benyttes vanligvis universelle baser og degenererte sekvenser i CTOen. Strategiene som anvender universelle baser og degenererte sekvenser i CTOen sikrer anvendelse av en type eller minimalt antall typer CTO for screening av multiple målnukleinsyresekvenser.

I samsvar med en foretrukket utførelse, foreliggende fremgangsmåte omfatter ytterligere trinnet å denaturere mellom trinnene (d) og (e). Den forlengede dupleks som dannes i trinn (d) denatureres til en enkelt trådform og hybridiseres deretter med SOen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, fremgangsmåten omfatter ytterligere å repetere alle eller noen av trinnene (a) - (f) med denaturering mellom repeterende sykluser. For eksempel, fremgangsmåten omfatter videre å repetere trinnene (a)-(b), (a)-(d) eller (a)-(f) med denaturering mellom repeterende sykluser. Denne repetisjon muliggjør mangfoldiggjøring av målnukleinsyresekvensen og/eller målsignalet.

I samsvar med en foretrukket utførelse, foreliggende oppfinnelse omfatter videre å repetere trinnene (a)-(e) med denaturering mellom repeterende sykluser, og smelting av hybridiseringsresultanten av trinn (e) eller smelting og hybridisering av hybridiseringsresultanten (e) for å tilveiebringe et detekterbart signal; hvor trinn (f) utføres med å detektere signalet for å bestemme nærvær av den forlengede tråd.

Denatureringen kan utføres med konvensjonelle teknologier, inkluderende men ikke begrenset til; varming, alkalibehandling, formamid, urea og glykoksalbehandling, enzymatiske metoder (for eksempel virkning av helikase, og bindingsproteiner). For eksempel kan smelting oppnås ved å oppvarme ved temperatur i området fra 80 °C til 105 °C. Generelle metoder for å utføre denne behandling tilveiebringes i Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001).

I samsvar med en foretrukket utførelse, foreliggende oppfinnelse kan utføres med en serie smelteanalyser for kvalitativt og kvantitativt detektere målnukleinsyresekvensen.

Mer foretrukket, foreliggende oppfinnelse omfatter (i) å repetere trinnene (a)-(d) med denaturering mellom repeterende sykluser for å danne den forlengede tråd, (ii) utføre en smelteanalyse av hybridiseringsresultanten av SOen og den forlengede tråd og (iii) repetere trinnene (i) og (ii) minst to ganger. I en slik tilnærming utføres smelteanalysene repeterende minst to ganger i et visst intervall.

I samsvar med en foretrukket utførelse, antallet repetisjoner av trinnene (a)-(d) kan valgfritt kontrolleres. Ved utføring av en serie smelteanalyser kan antallet repetisjoner av trinnene (a)-(d) for en kjøring av en smelteanalyse være den samme eller forskjellige fra antallet repetisjoner av trinnene (a)-(d) for en annen kjøring av smelteanalyser.

Det vil forstås av den fagkyndige innen fagfeltet at repetisjon av trinnene (a)-(d) er et illustrerende eksempel for dannelse av den forlengede tråd. For eksempel, foreliggende oppfinnelse kan utføres med å repetere trinnene (a)-(b), og utføre trinnene (c) og (d) for å danne den forlengede tråd etterfulgt av utføring av en smelteanalyse.

I samsvar med en foretrukket utførelse, trinnene (a)-(f) utføres i et reaksjonskar eller i separate reaksjonskar. For eksempel, trinnene (a)-(b), (c)-(d) eller (e) - (f) kan utføres i separate reaksjonskar.

I samsvar med en foretrukket utførelse, trinnene (a)-(b) og (c)-(f) kan være samtidige eller separate selv i et reaksjonskar som avhenger av reaksjonsbetingelser (spesielt temperatur).

I samsvar med en foretrukket utførelse, trinnene (a)-(b) repeteres med denaturering.

Idet oppstrøms primer anvendes som oppstrøms oligonukleotid i repetisjonsprosessen, så utføres foreliggende fremgangsmåte fortrinnsvis i nærvær av en nedstrøms primer, fortrinnsvis med PCR.

I samsvar med en foretrukket utførelse, minst to smelteanalyser i foreliggende oppfinnelse muliggjør kvantitativt detektering av målnukleinsyresekvensen.

Arealet og høyden av en smeltetopp oppnådd med en smelteanalyse er avhengig av mengden av den forlengede dupleks, og gir informasjon på den innledende mengde av målnukleinsyresekvensen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, foreliggende oppfinnelse omfatter (i) å øke antallet av den forlengede tråd med repetisjon av trinnene (a)-(d) med denaturering mellom repeterende sykluser, (ii) utføre en smelteanalyse for hybridiseringsresultanten mellom SOen og den forlengede tråd og (iii) repetere trinnene (i) og (ii) minst to ganger. Mengden av målnukleinsyresekvensen kan måles ved å bestemme et syklusantall av smelteanalysene hvorved en forutbestemt terskelverdi over arealene og/eller høydene av smeltetoppene som oppnås nås.

Alternativt, kvantifisering av målnukleinsyresekvensen kan utføres ved å plotte smalteanalyse-informasjon (for eksempel arealet eller høyden av toppene) mot syklusantall for repetisjon for økning i mengden av den forlengede tråd.

Den foreliggende oppfinnelse krever ikke at målnukleinsyresekvensen som skal detekteres og/eller mangfoldiggjøres har noen bestemt sekvenslengde, inkluderende enhver DNA (gDNA og cDNA og RNA-molekyler).

Hvor en mRNA benyttes som utgangsmateriale, så er et trinn med revers transkripsjon nødvendig før man utføres annealingstrinnet, og detaljer for dette kan finnes i Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); og Noonan, K. F. et al, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988). For revers transkripsjon kan en vilkårlig heksamer eller en oligonukleotid dT primer som kan hybridiseres til mRNA benyttes.

Målnukleinsyresekvensene som kan detekteres og/eller mangfoldiggjøres inkluderer enhver naturlig forekommende prokaryot, eukaryot (for eksempel protozoaner og parasitter, fungi, gjær, høyere planter, lavere og høyere dyr, inkluderende pattedyr og mennesker,) og virus (for eksempel herpesvirus, HIV, influensavirus, Epstein-Barr virus, hepatitt virus, polio virus, etc.) eller viroide nukleinsyrer.

Målnukleinsyresekvensen som kan detekteres med foreliggende oppfinnelse inkluderer et bredt spekter av nukleinsyresekvenser, for eksempel sekvenser i et genom, artifisielt isolerte eller fragmenterte sekvenser og syntetiserte sekvenser (for eksempel cDNA-sekvenser og barcode sekvenser). For eksempel, målnukleinsyresekvensen inkluderer nukleinsyremarkørsekvenser for immuno-PCR (IPCR). IPCR benytter konjugatet mellom nukleinsyremarkørsekvenser og antistoff sammen med PCR, som er bredt anvendt for å detektere de forskjellige typer mål, inkluderende proteiner Sano et al., Science 258 pp:120-122(1992), U.S. Pat. No. 5,665,539, Niemeyer et al, Trends in Biotechnology 23 pp:208-216(2005), U.S. Pat. Pub. No. 2005/0239108 og Ye et al., Journal of Environmental Science 22 pp:796-800(2010)).

Foreliggende oppfinnelse er også nyttig i deteksjon av en nukleotidvariasjon. Fortrinnsvis, målnukleinsyresekvensen omfatter en nukleotidvariasjon. Termen «nukleotidvariasjon» anvendt heri refererer til enhver enkelt eller multippel nukleotidsubstitueringer, deleteringer eller innsettinger i en DNA-sekvens ved en bestemt lokalisasjon blant kontigøse DNA-segmenter som ellers er like i sekvens. Slike kontigøse DNA-segmenter inkluderer et gen eller enhver annen del av et kromosom. Disse nukleotidvariasjoner kan være mutanter eller polymorfe allele variasjoner. For eksempel, en nukleotidvariasjon detektert med foreliggende oppfinnelse inkluderer SNP (enkelt nukleotid polymorfisme), mutasjon, delesjon, innskudd, substitusjon og translokalisasjon. Eksemplifisert nukleotidvariasjon inkluderer et antall variasjoner i et humant gjennom (for eksempel variasjoner i MTHFR (metylentetrahydrofolat reduktase) gen), variasjoner involvert i medikamentresistens av patogener og tumorgenese-forårsakende variasjoner. Termen «nukleotidvariasjon» anvendt heri inkluderer enhver variasjon ved en bestemt lokalisasjon i et DNA-molekyl.

Med andre ord, termen «nukleotidvariasjon» inkluderer en villtype og alle dets mutanttyper ved en bestemt lokalisasjon i et DNA-molekyl.

I foreliggende oppfinnelse for deteksjon av en nukleotidvariasjon i en målnukleinsyresekvens, hvor primere eller prober som anvendes har en komplementær sekvens til nukleotidvariasjonen i målnukleinsyresekvensen, beskrives målnukleinsyresekvensen inneholdende nukleotidvariasjonen heri som et matchende templat. Hvor primere eller prober som anvendes har en ikke-komplementær sekvens til nukleotidvariasjonen i målnukleinsyresekvensen, beskrives målnukleinsyresekvensen som inneholder nukleotidvariasjonen heri som en mismatching-templat.

For deteksjon av nukleotidvariasjoner, kan 3'-enden av oppstrøms primeren konstrueres til å være motsatt til et sete av en nukleotidvariasjon i målnukleinsyresekvensen. I samsvar med en foretrukket utførelse, 3'-enden av oppstrøms primeren har en komplementær sekvens til nukleotidvariasjonen i målnukleinsyresekvensen. 3'enden av oppstrøms primeren som har en komplementær sekvens til nukleotidvariasjonen i målnukleinsyresekvensen anneales til matching templat og forlenges for å indusere spalting av PTOen. Det resulterende PTO-fragment hybridiseres med CTOen, forlenges og hybridiseres med SOen for å tilveiebringe målsignalet. I motsetning, hvor 3'-enden av oppstrøms primer er mismatchet til en nukleotidvariasjon i et mismatching templat, så vil den ikke forlenges under betingelser der annealing av 3'-enden av primere er essensiell for ekstensjon selv idet oppstrøms primeren er hybridisert med mismatching templat, og resulterer dermed i ingen generering av målsignalet.

Alternativt, det er mulig å anvende PTO-spalting avhengig av hybridisering av at PTO har en komplementær sekvens til en nukleotid variasjon i en målnukleinsyresekvens. For eksempel, under kontrollerte betingelser, en PTO som har en komplementær sekvens til nukleotidvariasjonen i målnukleinsyresekvensen hybridiseres med matching templat og spaltes. Det resulterende PTO-fragment hybridiseres med CTOen, forlenges og hybridiseres med SOen for å tilveiebringe målsignaler. Dersom, under de samme kontrollerte betingelser, PTOen ikke hybridiseres med et mismatchingstemplat som har ikke-komplementær sekvens i nukleotidvariasjonsposisjonen, oppnår man ingen spalting. Fortrinnsvis, i dette tilfellet, er den komplementære sekvens til nukleotidvariasjonen i PTOen posisjonert i midten av 3'-målporsjonen av PTOen.

Alternativt, det er foretrukket at 5'-endedelen av 3'-målporsjonen av PTOen er posisjonert til en nukleotidvariasjon i målnukleinsyresekvensen for deteksjon av nukleotidvariasjonen og 5'-endedelen av 3'-målporsjonen av PTOen har en komplementær sekvens til nukleotidvariasjonen i målnukleinsyresekvensen (se fig 9).

Idet en probe har ved dets 5'-endeporsjon en nukleotidvariasjon diskriminerende porsjon hybridiseres med et mismatch templat, kan dets 5'-endeporsjon danne en enkelttråd under en bestemt betingelse. Proben kan korrespondere til en PTO. Signalet kan genereres med foreliggende fremgangsmåte. Denne tilnærming kan anvendes i deteksjon av målnukleinsyresekvens som har en nukleotid variasjon som er ikke-komplementær til nukleotidvariasjons diskriminerings sete i probene.

I samsvar med en foretrukket utførelse, målnukleinsyresekvensen anvendt med foreliggende oppfinnelse er en pre-mangfoldiggjort nukleinsyresekvens. Anvendelse av pre-mangfoldiggjorte nukleinsyresekvenser muliggjør signifikant å øke sensitiviteten og spesifisiteten av måldeteksjon ifølge foreliggende oppfinnelse.

I samsvar med en foretrukket utførelse, fremgangsmåten utføres i nærvær av en nedstrøms primer.

Fordelene med foreliggende oppfinnelse kan utheves i simultan (multipleks deteksjon av minst to målnukleinsyresekvenser).

I samsvar med en foretrukket utførelse, fremgangsmåten utføres for å detektere minst to typer, (mer foretrukket minst tre typer, enda mer foretrukket minst fire typer) målnukleinsyresekvenser.

I samsvar med en foretrukket utførelse, fremgangsmåten utføres for å detektere minst to typer (mer foretrukket minst tre typer, enda mer foretrukket minst fire typer) av målnukleinsyresekvensene; hvor oppstrøms oligonukleotid omfatter minst to typer (mer foretrukket minst tre typer, enda mer foretrukket minst fem typer) oligonukleotider, PTOen omfatter minst to typer (mer foretrukket minst tre typer, enda mer foretrukket minst fem typer) PTOer, CTOen omfatter minst to typer (fortrinnsvis minst tre typer, mer foretrukket minst fem typer) av CTOen, og SOen omfatter minst to typer (fortrinnsvis minst tre typer, mer foretrukket minst fem typer) av SOen; hvor, idet minst to typer av målnukleinsyresekvensene foreligger, tilveiebringer metoden minst to typer målsignaler (de detekterbare signaler), korresponderende til de i det minste to typer målnukleinsyresekvenser.

5'-taggingporsjonene av de minst to PTOer kan ha en identisk sekvens med hverandre. For eksempel, idet foreliggende oppfinnelse utføres for screening av målnukleinsyresekvenser, kan 5'-taggingporsjonen av PTOene ha identiske sekvenser.

Videre, en enkelt type av CTOen kan anvendes for deteksjon av et flertall målnukleinsyresekvenser. For eksempel, idet PTOene har en identisk sekvens i deres 5'-taggingporsjoner benyttet for screening av målnukleinsyresekvenser kan en enkelt type av CTOen anvendes.

Idet foreliggende oppfinnelse utføres for samtidig å detektere minst to typer målnukleinsyresekvenser med smeltekurveanalyser og hybridiseringsresultanten i trinn (e) korresponderer til de i det minste to typer av målnukleinsyresekvenser som har forskjellige Tm-verdier fra hverandre, er det mulig å detektere minst to typer målnukleinsyresekvenser selv ved anvendelse av en enkelt type av en markør (for eksempel 5).

I samsvar med en foretrukket utførelse, Tm-verdien av hybridet av SO/forlenget tråd kan justeres med sekvensen og/eller lengden av SOen, sekvensen og eller lengden av en porsjon av den forlengede tråd som skal hybridiseres med SOen, eller kombinasjoner derav. Nærmere bestemt, idet de forlengede tråder dannet med foreliggende multipleks deteksjon hybridiseres med en enkelt type av SO, er Tm-verdiene av hybridene mellom de forlengede tråder og Soene forskjellig fra hverandre dersom porsjonene av de forlengede tråder som skal hybridiseres med Soene er konstruert til å ha forskjellige sekvenser fra hverandre. Derfor, multipleks deteksjon kan bli praktisk selv ved anvendelse av en enkelt type SO.

Den foreliggende oppfinnelse kan utføres på en fast fase så som et mikroarray.

I samsvar med en foretrukket utførelse, foreliggende oppfinnelse utføres på fastfase og CTOen eller SOen immobiliseres gjennom dets 5'-ende eller 3'-ende på faststoff substratet.

For faststoff fasereaksjonen, immobiliseres CTOen eller SOen direkte eller indirekte (fortrinnsvis indirekte) gjennom dets 5'-ende eller dets 3'-ende (fortrinnsvis 3'-enden) på overflaten av faststoff substratet.

Videre, CTOen eller SOen kan immobiliseres på overflaten av faststoff substratet på en kovalent eller ikke-kovalent måte. Der hvor immobiliserte CTOer eller SOer immobiliseres direkte på overflaten av faststoff substratet kan egnede linkere benyttes. Linkere som er nyttige ifølge oppfinnelsen kan inkludere enhver linker som benyttes for probeimmobilisering på overflaten av faststoff substratet. For eksempel, alkyl- eller arylforbindelser med aminfunksjonalitet, eller alkyl- eller arylforbindelser med tiolfunksjonalitet fungerer som linkere for CTO- eller SO-immobilisering. I tillegg, poly(T)-hale eller poly(A)-hale kan fungere som linkere.

I samsvar med en foretrukket utførelse, faststoff substratet anvendt i foreliggende oppfinnelse er et mikroarray. Mikroarrayet tilveiebringer et reaksjonsmiljø med denne oppfinnelse som inkluderer enhver av de kjente innen fagfeltet. Alle prosesser av foreliggende oppfinnelse, det vil si hybridisering til målnukleinsyresekvenser, spalting, forlengelse, smelting og fluoressensdeteksjon, utføres på mikroarrayet. De immobiliserte CTOer eller SOer på mikroarrayet fungerer som hybridiserbare array elementer. Faststoffase substratet for å fremstille mikroarray inkluderer men er ikke begrenset til metaller (for eksempel gull, legeringer av gull og kobber, aluminium), metalloksid, glass, kjeramiske, kvarts, selicium, semikonductor, Si/Si02-brikker, germanium, galiumarsenid, karbon, karbonnanorør, polymerer (for eksempel polystyren, polyetylen, polypropylen og polyakrylamid), sefarose, agarose, og kolloider. Et flertall immobiliserte CTOer eller SOer ifølge oppfinnelsen kan immobiliseres på en adresserbar region eller to eller flere adresserbare regioner på et faststoff substrat som kan omfatte 2-1000 000 adresserbare regioner. Immobiliserte CTOer eller SOer kan fremstilles for å produsere et array eller flere array foren gitt applikasjon med konvensjonelle fremstillingsteknologier så som fotolitografi, ink-jetting, mekanisk mikrospotting og derivater derav.

I samsvar med en foretrukket utførelse, en SO immobilisert på overflaten av faststoff substratet har en interaktiv dobbelmarkør.

I foreliggende oppfinnelse produseres et PTO-fragment med spalting av PTOen hybridisert med målnukleinsyren og den anneales til å forlenges på CTOen, resulterende i dannelse av en forlenget tråd.

Det er også mulig å tilveiebringe ytterligere fragmenter som kan forlenges på CTOen for å forsterke antallet av de forlengede tråder med en ytterligere 5'-nukleasespaltingsreaksjon ved anvendelse av en ytterligere PTO som omfatter (i) en 3'-målporsjon omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens som er komplementær til den forlengede tråd og (ii) en 5'-taggingporsjon omfattende en nukleotidsekvens som er ikke-komplementær til den forlengede tråd men komplementær med fangeporsjonen av CTOen.

Fortrinnsvis, den ytterligere PTO er lokalisert nedstrøms av SOen som hybridiserer til den forlengede tråd. SOen induserer spalting av en ytterligere PTO av et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet. Idet 3'-enden av SO kan forlenges, så induserer SOens forlengede spalting av den ytterligere PTO.

Den ovenfor foretrukne utførelse har den egenskap at dannelsen av ytterligere fragmenter er avhengig av dannelse av en forlenget tråd.

Alternativt, de ytterligere fragmenter kan tilveiebringes ved anvendelse av en ytterligere PTO som omfatter (i) en 3'-målporsjon omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til templatporsjonen av CTO og (ii) en 5'-taggingporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til templatporsjonen av CTO men komplementær til fangeporsjonen av CTOen.

Foretrukken utførelse med mangfoldiggj øring av en målnukleinsyresekvens.

Fortrinnsvis, foreliggende oppfinnelse utføres samtidig med mangfoldiggjøring av en målnukleinsyresekvens ved anvendelse av et primerpar sammensatt av en oppstrøms primer og en nedstrøms primer i stand til å syntetisere målnukleinsyresekvensen.

I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for å detektere en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyrer med en PCE-SH (PTO Cleavage og ekstensjonsavhengig signalerings oligonukleotid hybridisering) analyse omfattende: (a) hybridisere målnukleinsyresekvensen med et primerpar omfattende en oppstrøms primer og en nedstrøms primer og en PTO (Probing og tagging oligonukleotid); hvor hver av nevnte oppstrøms primer og nedstrøms primer omfatter en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensene; PTOen omfatter (i) en 3'-målporsjon omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen og (ii) en 5'-målporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen; hvor 3'-målporsjonen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5'-målporsjonen ikke-hybridiseres med målnukleinsyresekvensen; hvor PTOen er lokalisert mellom oppstrøms primer og nedstrøms primer; hvor PTOen blokkeres ved dets 3'-ende for å hindre dets forlengelse; (b) sette resultanten fra trinn (a) i forbindelse med en templatavhengig nukleinsyrepolymerase som har en 5'-nukleaseaktivitet under betingelser for ekstensjon av primere og for spalting av PTOen; hvor, idet PTOen er hybridisert med målnukleinsyresekvensen, oppstrøms primeren forlenges og den forlengede tråd induserer spalting av PTOen med en templatavhengig nukleinsyrepolymerase som har 5'-nukleaseaktivitet slik at spaltingen frigjør et fragment omfattende 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen; (c) hybridisere fragmentet frigjort fra PTOen med en fange og templatoligonukleotid (CTO); hvor CTOen omfatter i en 3' til 5' retning (i) en fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen eller en del av 5' taggingporsjonen av PTOen og (ii) en

templatporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5' taggingporsjonen og 3'-målporsjonen av PTOen; hvor fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen; (d) utføre en ekstensjonsreaksjon ved anvendelse av resultanten fra trinn (c) og en templatavhengig nukleinsyrepolymerase; hvor fragmentet hybridisert med fangeporsjonen av CTOen forlenges for å danne en forlenget tråd omfattende en forlenget sekvens komplementær til templatfunksjonen av CTOen, og dermed danne en forlenget dupleks; (e) hybridisere den forlengede tråd med et signalerende oligonukleotid (SO); hvor SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd og med minst en markør; hvor SOen tilveiebringer et detekterbart signal med hybridisering med den forlengede tråd; og (f) detektere signalet, hvorved deteksjon av signalet indikerer nærvær av den forlengede tråd og nærvær av målnukleinsyresekvensen.

Siden den foretrukne utførelse av foreliggende oppfinnelse følger trinnene med foreliggende fremgangsmåte beskrevet over, så vil felles beskrivelse derimellom utelates for å unngå unødvendig overflødighet som fører til kompleksitet med beskrivelsen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, fremgangsmåten omfatter ytterligere å repetere alle eller noen av trinnene (a)-(f) med denaturering mellom repeterende sykluser. For eksempel, fremgangsmåten omfatter ytterligere å repetere trinnene (a)-(b), (a)-(d) eller (a)-(f) med denaturering mellom repeterende sykluser. Reaksjonsrepetisjonen utføres ved mangfoldiggjøring av målnukleinsyresekvensen. Fortrinnsvis, mangfoldiggjøringen utføres i samsvar med PCR (polymerase kjedereaksjon) som er beskrevet i U.S. Pat. Nos. 4683195, 4683202 og 4800159.

I samsvar med en foretrukket utførelse, fremgangsmåten utføres for å detektere minst to typer målnukleinsyresekvenser.

Måldeteksjonsprosess med PCE-SH analyse basert på oppstrøms oligonukleotid uavhengig 5'-nukleaseaktivitet.

Den foreliggende oppfinnelse kan utføres uten anvendelse av oppstrøms oligonukleotider.

I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for å detektere en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyrer med en PCE-SH (PTO spalting og ekstensjonsavhengig signalerings oligonukleotid hybridisering) analyse, omfattende:

(a) hybridisere målnukleinsyresekvensen med en probing og målrettet oligonukleotid (PTO), hvor PTOen omfatter (i) en 3'-målporsjon omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen og (ii) en 5'-taggingporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen; hvor 3'.-målporsjonen av PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5'-taggingporsjonen ikke-hybridiseres med målnukleinsyresekvensen; (b) sette resultanten fra trinn (a) i forbindelse med et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet under betingelser for spalting av PTOen; hvor PTOen spaltes med enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet slik at spaltingen frigjør et fragment omfattende 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen; (c) hybridisere fragmentet frigjort fra PTOen med en fange og templatoligonukleotid (CTO); hvor CTOen omfatter en 3' til 5'-retning (i) en fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen og (ii) en templatporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5'-taggingporsjonen og 3'-målporsjonen av PTOen; hvor fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen; (d) utføre en ekstensjonsreaksjon ved anvendelse av resultanten fra trinn (c) og en templatavhengig nukleinsyrepolymerase; hvor fragmentet hybridisert med fangeporsjonen av CTOen forlenges for å danne en forlenget tråd omfattende en forlenget sekvens komplementær til templatporsjonen av CTOen, og dermed danne en forlenget dupleks; (e) hybridisere den forlengede tråd med et signalerende oligonukleotid (SO); hvor SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd og med minst en markør; SO tilveiebringer et detekterbart signal med hybridisering med den forlengede tråd; og (f) detektere signalet; hvorved deteksjon av signalet indikerer nærvær av den forlengede tråd og nærvær av målnukleinsyresekvensen.

Når man vurderer mangfoldiggjøring av målnukleinsyresekvensene og spaltingseffektivitet av PTOen, så utføres PCE-SH-analysen ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis ved anvendelse av oppstrøms oligonukleotider.

Nukleotidvariasjons deteksjonsprosess med en PCE-SH-analyse.

I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for å detektere en nukleotidvariasjon på en målnukleinsyresekvens med en PCE-SH (PTO spalting og ekstensjonsavhengig signalerende oligonukleotid hybridisering) analyse, omfattende: (a) hybridisere målnukleinsyresekvensen med en oppstrøms oligonukleotid og en probe og måloligonukleotid (PTO); hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid omfatter en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen; PTOen omfatter (i) en 3'-målporsjon omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens som er komplementær til målnukleinsyresekvensen, (ii) en 5'-taggingporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen, og (iii) et nukleotid variasjons diskriminerende sete, omfattende en komplementær sekvens til nukleotidvariasjonen på målnukleinsyren, posisjonert på en 5'-endedel av 3'-målporsjonen; hvor 3'-målporsjonen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5' målporsjonen ikke-hybridiseres med målnukleinsyresekvensen; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid er lokalisert oppstrøms av PTOen; nevnte oppstrøms oligonukleotid eller dets forlengede tråd induserer spalting av PTOen med et enzym som har 5'-nukleaseaktivitet; (b) sette resultanten fra trinn (a) i forbindelse med et enzym som har 5'-nukleaseaktivitet under betingelser og spalting av PTOen; hvor, idet PTOen er hybridisert med målnukleinsyresekvensen som har nukleotidvariasjonen som er komplementær til nukleotidvariasjonens diskriminerings sete, og 5'-endedelen av 3'-målporsjonen danner en dobbelttråd med målnukleinsyresekvensen, å indusere spalting fra et første innledende spaltingssete, og et første fragment frigjøres; hvor, idet PTOen er hybridisert med en målnukleinsyresekvens som har en nukleotidvariasjon som er ikke-komplementær til nukleotidvariasjons diskriminerings sete, og 5'-endedelen av 3'-målporsjonen ikke danner en dobbelttråd med målnukleinsyresekvensen, å indusere spalting fra et andre innledende spaltingssete lokalisert nedstrøms for det første innledende sete, hvor et andre fragment frigjøres; hvor nevnte andre fragment omfatter en ytterligere 3'-endeporsjon som muliggjør at det andre fragment er forskjellig fra det første fragment; (c) hybridisere fragmentet frigjort fra PTOen med en fange- og templat oligonukleotid (CTO); hvor CTOen omfatter 3'-til 5'-retning (i) en fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen og (ii) en templatporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5'-taggingporsjonen og 3'-målporsjonen av PTOen; hvor det første fragment eller det andre fragment frigjort fra PTOen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen; (d) utføre en ekstensjonsreaksjon ved anvendelse av resultanten fra trinn (c) og en templatavhengig nukleinsyrepolymerase; hvor, idet det første fragment er hybridisert med fangeporsjonen av CTOen, så forlenges det for å danne en forlenget tråd omfattende en forlenget sekvens som er komplementær til templatporsjonen av CTOen; hvor, idet det andre fragment hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen, så forlenges det ikke; (e) hybridisere den forlengede tråd med et signalerings oligonukleotid (SO), hvor SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd og med minst en markør; SOen tilveiebringer et detekterbart signal med hybridisering med den forlengede tråd; og (f) detektere signalet; hvorved deteksjon av signalet indikerer nærvær av nukleotidvariasjonen komplementær til nukleotid diskriminerings setet i PTOen.

Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har funnet at probespaltingssetet kan justeres avhengig av de aktuelle nukleotidvariasjoner og at fragmentene som frigjøres med spalting i forskjellige seter kan skilles ut fra evnen til ekstensjon på et artifisielt templat.

Foreliggende oppfinnelse benytter suksessive hendelser etterfulgt av probehybridisering, spalting av PTOen og ekstensjon; dannelse av en nukleotid variasjonsavhengig forlenget tråd; og deteksjon av den forlengede tråd ved anvendelse av et signalerings oligonukleotid. Derfor er den gitt navnet VD-PCE-SH (Variasjonsdeteksjon med PTO spalting og ekstensjonsavhengig signalerings oligonukleotid hybridisering) analyse.

I samsvar med en foretrukket utførelse, nukleotidvariasjonen detektert med foreliggende oppfinnelse er en variasjon med et enkelt nukleotid så som SNP.

I foreliggende søknad, en målnukleinsyresekvens som har en nukleotidvariasjon komplementær til nukleotidvariasjons diskrimineringssetet av PTOen er også beskrevet som «match templat». En målnukleinsyresekvens som har en nukleotidvariasjon ikke-komplementær til nukleotidvariasjons diskrimineringssetet PTOen er også beskrevet som «mismatch templat».

I samsvar med en foretrukket utførelse, termen «ikke-komplementær» i forbindelse med en nukleotidvariasjon ikke-komplementær til nukleotidvariasjons diskrimineringssetet anvendes heri for å omfatte ikke-komplementaritet på grunn av innskudd eller delesjon. VD-PCE-SH-analysen ifølge foreliggende oppfinnelse anvender PTOen som har nukleotidvariasjons diskrimineringssetet posisjonert på 5'-endedelen av 3'-målporsjonen på selektivitet av PTOen til en spesifikk nukleotidvariasjon. Idet PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen (det vil si match templat) som har nukleotidvariasjon komplementær til nukleotidvariasjons diskrimineringssetet, danner 5 '-endedelen av 3'-målporsjonen en dobbelttråd med match templat; imidlertid, idet PTOen hybridiseres med en målnukleinsyresekvens (det vil si mismatch templat) som har en nukleotidvariasjon ikke-komplementær til nukleotidvariasjons diskrimineringssetet, så vil 5'-endedelen av 3'-målporsjonen ikke danne en dobbelttråd med mismatch templat.

Det skal bemerkes at slike distinkte hybridiseringsmønstre på nukleotidvariasjonen av interesse er ansvarlig for forskjeller i innledende spaltingsseter på PTOen, og produserer dermed to typer PTO-fragmenter for å gi signaldifferensiering avhengig av nærvær av den aktuelle nukleotidvariasjon.

Et første fragment genereres med spalting av hybrid mellom PTOen og matchende templat og et andre fragment genereres med spalting av hybrid mellom PTOen og mismatching templat, respektivt. Det andre fragment omfatter en ytterligere 3'-endeporsjon som gjør at det andre fragment blir forskjellig fra det første fragment.

Produksjon av enten det første fragment eller det andre fragment kan distinktivt detekteres med en ekstensjonsreaksjon på CTOen.

Generelt, hybridiseringen mellom en 3'-endedel av primere og en templat er svært avgjørende for forlengelse av primere i en stringent betingelse. I foreliggende oppfinnelse, hybridiseres det første fragment og det andre fragment hver med det samme sete av CTOen. Som beskrevet over, det andre fragment omfatter den ytterligere 3'-endeporsjon sammenlignet med det første fragment. Ved å justere hybridiseringsbetingelsene og en sekvens av CTOen på motsatt side til den ytterligere 3'-endeporsjon av det andre fragment, tillattes det kun at det første fragment forlenges.

I samsvar med en foretrukket utførelse, CTOen har en sekvens valgt slik at CTOen ikke hybridiseres med en ytterligere 3'-endeporsjon av det andre fragment for å hindre at det andre fragment blir forlenget idet det andre fragment hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, sekvensen av CTOen motsatt den ytterligere 3'-endeporsjonen av det andre fragment er ikke-komplementær til den ytterligere 3'-endeporsjonen.

Produksjonen av den forlengede tråd med ekstensjon av det første fragment kan detekteres ved anvendelse av SO som foreliggende oppfinnelse beskrevet over.

I samsvar med konvensjonelle teknologier som anvender 5'-nukleaseaktiviteter for deteksjon av nukleotidvariasjoner, så er hybridisering av prober anvendt for å bestemme eller påvirkes av en hel sekvens av en probe. I slike konvensjonelle teknologier er probedesign og konstruksjon, og optimalisering av reaksjonsbetingelser svært vanskelige idet hybridisering av prober er avhengig av nærvær av nukleotidvariasjoner utfordrende på grunn av i hovedsak å bli bestemt av forskjell med kun en nukleotid.

I samsvar til VD-PCE-SH-analysen, et nukleotid variasjons diskriminerings sete er posisjonert på en 5'-endedel av en hybridiserings involverende del av prober, som muliggjør optimalisering av hybridiseringsbetingelser til å være hensiktsmessig. I tillegg, VD-PCH-SH-analysen detekterer differensielt en nukleotidvariasjon med en lokal porsjon av prober i stedet for en hel sekvens av prober, slik at forskjellene med selv en nukleotid så som SNPen kan nøyaktig detekteres.

Det er blitt vist for den fagkyndige innen feltet at en probesekvens tilgrensende til en sekvens motsatt til en SNP i ekstrem grad påvirker probehybridisering. De konvensjonelle prober har en sekvens motsatt til en SNP generelt i deres midtre porsjon. I denne henseende kan de konvensjonelle prober ikke selektere en omgivende sekvens rundt en SNP involvert i hybridisering. De konvensjonelle teknologier har alvorlige begrensninger på grunn av omgivende sekvenser til SNPer. VD-PCE-SE-analysen ifølge oppfinnelsen vil bli beskrevet i mer detalj som følger: Siden VD-PCE-SH-analysen ifølge oppfinnelsen er en av applikasjonene av PCE-SH analysen beskrevet over, så utelates felles beskrivelser dem imellom for å unngå overflødighet noe som fører til kompleksitet av denne beskrivelse.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse, en målnukleinsyresekvens hybridiseres først med en oppstrøms oligonukleotid og en PTO.

PTOen anvendt i deteksjon av nukleotidvariasjon omfatter (i) en 3'-målporsjon som fungerer som en probe, (ii) en 5'-målporsjon med en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen, og (iii) en nukleotidvariasjons diskrimineringssete, omfattende en komplementær sekvens til nukleotidvariasjonen på målnukleinsyren, posisjonert på en 5'-endedel av 3' målporsjonen. 5'-målporsjonen er nukleolytisk frigjort fra PTOen etter hybridisering med målnukleinsyresekvensen. 5'-taggingporsjonen og 3'-målporsjonen i PTOen må posisjoneres i en 5' til 3' rekkefølge. PTOen er skjematisk illustrert i fig 9.

PTOen som omfatter nukleotidvariasjons diskrimineringssetet omfatter en komplementær sekvens til nukleotidvariasjonen posisjonert på en 5'-endedel av 3'-målporsjonen.

Idet PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen som har nukleotidvariasjonen komplementær til variasjons diskrimineringssetet, så danner 5'-endedelen av 3'-målporsjonen en dobbelttråd med målnukleinsyresekvensen. Idet PTOen hybridiseres med en målnukleinsyresekvens som har en nukleotidvariasjon ikke-komplementær til variasjons diskrimineringssetet, så danner ikke 5'-endedelen av 3'-målporsjonen en dobbelttråd med målnukleinsyresekvensen.

Slike distinkte hybridiseringsmønstre på nukleotidvariasjonen som er av interesse er ansvarlig for forskjellene i spaltingsseter av PTOen, og produserer dermed to typer PTO-fragmenter som gir signaldifferensiering avhengig av nærvær av den aktuelle nukleotidvariasjon. 5'-endedelen av 3' målporsjonen av PTOen kan også beskrives som en enkelttråd-dannende 5'-endeporsjon av 3'-målporsjonen av PTOen idet den er hybridisert med en målnukleinsyresekvens som har en nukleotidvariasjon som er ikke-komplementær til variasjons diskrimineringssetet.

Nukleotidvariasjonsdiskrimineringssetet posisjonert på en 5'-endedel av 3'-målporsjonen av PTOen omfatter en komplementær sekvens til nukleotidvariasjonen. For eksempel, idet en nukleotidvariasjon som skal detekteres er en SNP, så omfatter nukleotidvariasjons diskrimineringssetet en komplementær nukleotid til SNPen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, nukleotidvariasjons diskrimineringssetet er lokalisert innen 10 nukleotider, mer foretrukket 8 nukleotider, enda mer foretrukket 6 nukleotider, enda mer foretrukket 4 nukleotider, 3 nukleotider, 2 nukleotider eller 1 nukleotid fra 5' enden av 3'-målporsjonen av PTOen. Fortrinnsvis, nukleotidvariasjons diskrimineringssetet er lokalisert ved 5'-enden av 3'-målporsjonen av PTOen.

Termen «setet» med referanse til enten nukleotidvariasjons diskrimineringssetet av prober eller nukleotidvariasjon setet på målsekvenser anvendes heri for å omfatte ikke kun en enkelt nukleotid men også et flertall av nukleotider.

Fortrinnsvis, hybridiseringen i trinn (a) utføres med stringente betingelser slik at 3'-målporsjonen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5'-målporsjonen ikke hybridiseres med målnukleinsyresekvensen.

Trinn (b): Frigivelse av et fragment fra PTOen.

Deretter settes resultanten fra trinn (a) i forbindelse med et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet under betingelser for spalting av PTOen.

Idet PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen (det vil si match templat) som har nukleotidvariasjonen komplementær til variasjonsdiskrimineringssetet, og 5'-endedelen av 3'-målporsjonen danner en dobbelttråd med målnukleinsyresekvensen for å indusere spalting fra et første innledende spaltingssete så frigjøres et første fragment (se fig 9).

Idet PTOen hybridiseres med en målnukleinsyresekvens (det vil si mismatch templat) som har en nukleotidvariasjon ikke-komplementær til variasjonsdiskrimineringssetet, og 5'-endedelen av 3'-målporsjonen ikke danner en dobbelttråd med målnukleinsyresekvensen for å indusere spalting fra et andre innledende spaltingssete lokalisert nedstrøms for det første innledende spaltingssete, så frigjøres et andre fragment; og hvor det andre fragment omfatter en ytterligere 3'-endeporsjon som muliggjør at det andre fragment er forskjellig fra det første fragment (se fig 9).

Idet målnukleinsyresekvensen ikke foreligger i en prøve, så vil spalting av PTOen ikke forekomme.

Som sådan, forskjeller i spaltingsseter og typer av PTO-fragmenter generert resulterer i forskjellige ekstensjonsmønstre avhengig av nærvær og fravær av den aktuelle nukleotidvariasjon på målnukleinsyresekvensen, som bidrar til differensiert deteksjon av nuklein variasjon på målnukleinsyresekvensen.

Et spaltingssete med ekstensjon av oppstrøms primere er generelt posisjonert i en 5' til 3' retning ved et innledende nukleotid av en dobbelttråd (det vil si bifurkasjonssete) i strukturer som inkluderer en enkelt tråd og en dobbelt tråd eller ved 1 -2 nukleotider fra det innledende nukleotid. Med spaltingsreaksjonen produseres fragmenter som omfatter 5'-taggingporsjonen og en del av 3'-målporsjonen. Idet foreliggende oppfinnelse utføres med oppstrøms oligonukleotid ekstensjonsuavhengig spaltingsinduksjon, kan spaltingssetet av PTOen justeres med lokalisasjon av oppstrøms oligonukleotider.

Termen anvendt heri «et første innledende spaltingssete» i forbindelse med PTOen betyr et spaltingssete av PTOen som først spaltes idet PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen som har nukleotidvariasjonen komplementær til variasjonsdiskrimineringssetet. Termen anvendt heri «et andre innledende spaltingssete» i forbindelse med PTOen betyr at et spaltingssete av PTOen først spaltes idet PTOen hybridiseres med en målnukleinsyresekvens som har en nukleotidvariasjon ikke-komplementær til variasjonsdiskrimineringssetet.

Termen anvendt heri «en første fragment» refererer til et fragment produsert ved spalting av det første innledende spaltingssete. Termen anvendes om hverandre med «et første fragment» og «en PTO første fragment». Termen heri «et andre fragment» refererer til et fragment produsert ved spalting av det andre innledende spaltingssete. Termen anvendes om hverandre med «et andre fragment» og «et PTO andre fragment».

Fortrinnsvis, det første fragment og det andre fragment omfatter hver 5'-taggingporsjon eller en del av 5 '-taggingporsj onen.

Spaltingen kan suksessivt forekomme etter spalting av det første innledende spaltingssete eller det andre innledende spaltingssetet avhengig av spaltingsmetoder som anvendes. For eksempel, idet en 5'-nuklease spaltingsreaksjon sammen med ekstensjon av oppstrøms primere anvendes, så spaltes det innledende spaltingssetet og dets suksessive sekvens. Idet en oppstrøms probe anvendes og spaltingsreaksjonen foregår ved et sete i en avstand fra et lokalisasjonssete på proben, kan spaltingsreaksjonen foregå kun ved setet og spalting ved suksessive seter vil ikke forekomme.

I samsvar med en foretrukket utførelse, et innledende spaltingssete avhengig av ekstensjon av opp-strømsprimere kan være posisjonert i en 5' til 3'-retning ved et innledende nukleotid i en dobbelttråd (det vil si bifurkasjonssete).

Som vist i fig 9 som representerer et eksempel av foreliggende oppfinnelse, nukleotidvariasjons diskrimineringssetet er posisjonert til 5'-enden av 5'-endedelen av 3' målporsjonen. I et slikt tilfelle er det første innledende spaltingssetet posisjonert umiddelbart tilgrensende, i en 5' til 3'-retning, til 5'-endedelen av 3'-målporsjonen. Med andre ord, det første innledende spaltingssetet er posisjonert umiddelbart tilgrensende, i en 3'-retning til nukleotidvariasjons diskrimineringssetet. Det andre innledende spaltingssetet er generelt posisjonert en nukleotid i avstand, i en 3'-retning, fra nukleotidvariasjons diskrimineringssetet.

Idet nukleotidvariasjons diskrimineringssetet er posisjonert med en nukleotid fra 5'-enden av 5'-endedelen av 3'-målporsjonen, så er det første innledende spaltingssetet posisjonert umiddelbart tilgrensende, i en 5'-retning til nukleotidvariasjonssetet. Det andre innledende spaltingssetet er generelt posisjonert en nukleotid i avstand, i en 3'-retning, fra nukleotidvariasjons diskrimineringssetet.

I samsvar med en foretrukket utførelse, 5'-endedelen kan partielt omfatte en ikke-hybridiserbar sekvens (eller en ikke-baseparrende sekvens). Introduksjon av en ikke-hybridiserbar sekvens i 5'-endedelen er svært fordelaktig over enkelttråd dannelse av 5'-endedelen idet PTOen hybridiseres med en målnukleinsyresekvens som har en nukleotidvariasjon ikke-komplementær til nukleotidvariasjons diskrimineringssetet. I tillegg, introduksjon av en ikke-hybridiserbar sekvens muliggjør at det andre innledende spaltingssetet justeres.

I samsvar med en foretrukket utførelse, 5'-endedelen av 3'-målporsjonen av PTOen omfatter en ikke baseparrende enhet lokalisert innen 1-10 nukleotider (mer foretrukket 1-5 nukleotider) fra nukleotidvariasjons diskrimineringssetet. Den ikke-baseparrende enhet hindrer at 5'-endedelen av 3'-målporsjonen for å danne en dobbelttråd med målnukleotidsekvensen idet PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen som har nukleotidvariasjon ikke-komplementær til variasjonsdiskrimineringssetet.

Anvendelse av den ikke-baseparrende enhet (for eksempel mismatch nukleotid) forsterker diskrimineringspotensialet av PTOen i forhold til nukleotidvariasjonen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, den ikke baseparrende enhet inhiberer ikke dannelse av en dobbelttråd mellom 5'-endedelen og målnukleinsyresekvensen idet PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen som har nukleotidvariasjonen komplementær til nukleotidreaksjons diskrimineringssetet. 1 samsvar med en foretrukket utførelse, den ikke-baseparrende enhet utvider avstanden mellom det første innledende spaltingssetet og det andre innledende spaltingssetet.

Fortrinnsvis, den ikke-baseparrende enhet er lokalisert nedstrøms for nukleotidvariasjons diskrimineringssetet.

For eksempel, idet en mismatch nukleotid som en ikke-baseparrende enhet introduseres i en posisjon 2 nukleotider i avstand, i en 3'-retning, fra nukleotidvariasjons diskrimineringssetet, så justeres det andre innledende spaltingssetet til en posisjon 2 nukleotider fra nukleotidvariasjons diskrimineringssetet. I tilfeller det det ikke anvendes mismatch nukleotid, så er det andre innledende spaltingssetet posisjonert 1 nukleotid fra nukleotidvariasjons diskrimineringssetet. Det vil si, den ikke-baseparrende enhet kan utvide avstanden mellom det første innledende spaltingssetet og det andre innledende spaltingssetet.

Den ikke-baseparrende enhet inkluderer enhver enhet som ikke danner et basepar mellom målnukleinsyresekvenser. Fortrinnsvis, den ikke-baseparrende enhet er (i) et nukleotid som omfatter en artifisiell mismatch-base, en ikke-baseparrende base modifisert til å være ikke i stand til å baseparre eller en universell base, (ii) en ikke-baseparrende nukleotid modifisert til å være ikke i stand til baseparring, eller (iii) en ikke-baseparrende kjemisk forbindelse.

For eksempel, en ikke-baseparrende enhet inkluderer alkylengruppe, ribofuranocyl, naftalen, deoksyrobofuranocylnaftalen, metafosfat, fosforotioat lenke, alkylfosfortriester kobling, arylfosfortriester binding, alkylfosfonat binding, arylfosfonat binding, hydrogenfosfonat binding, alkylfosforamidat binding og arylfosforamidat binding. Konvensjonelle karbonspacere anvendes også som ikke-baseparrings enheter. Universelle baser som ikke-baseparrings enheter er nyttige i å justere spaltingsseter av PTOen.

Idet basepar som inneholder universalbaser så som deoksyinosin, l-(2-deoksybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol og 5-nitroindol har en lavere bindingsstyrke enn de med naturlige baser, så kan universelle baser benyttes som ikke-baseparrende enheter under visse lokaliseringsbetingelser.

Den ikke-baseparrende enhet introdusert inn i 5'-endedelen har fortrinnsvis 1-10, mer foretrukket 1-5, enda mer foretrukket 1-2 enheter. Et flertall ikke-baseparrende enheter i 5'-endedelen kan foreligge i en konsekutiv eller intermittent måte. Fortrinnsvis, den ikke-baseparrende enhet har 2-5 konsekutive enheter.

Fortrinnsvis, den ikke-baseparrende enhet er en ikke-baseparrende kjemisk forbindelse.

I samsvar med en foretrukket utførelse, nukleotidvariasjons diskrimineringssetet og den ikke-baseparrende enhet er lokalisert innen 10 nukleotider (mer foretrukket 8 nukleotider, 7 nukleotider, 6 nukleotider, 5 nukleotider, 4 nukleotider, 3 nukleotider, 2 nukleotider eller 1 nukleotid, enda mer foretrukket 1 nukleotid) fra 5'-enden av 3'-målporsjonen.

Alternativt, spaltingsreaksjonen kan utføres kun ved det første innledende spaltingssetet og ikke ved det andre innledende spaltingssetet. For eksempel, hvor en oppstrøms probe anvendes og spaltingsreaksjonen foregår ved et sete i avstand fra lokalisasjonssetet av proben, kan spaltingsreaksjonen foregå kun ved det første innledende spaltingssetet idet PTOen hybridiseres med match templat. Idet PTOen hybridiseres med mismatch templat kan bifurkasjonssetet (det andre innledende spaltingssetet) ikke spalte på grunn av en lang avstand fra oppstrøms proben.

I samsvar med en foretrukket utførelse, i det PTOen hybridiseres med mismatch templat, omfatter det andre innledende spaltingssetet et innledende sete av en dobbelttråd (det vil si bifurkasjonssetet) i strukturer som inkluderer en enkelttråd og en dobbelttråd.

I samsvar med en utførelse, PTOen har en blokkeringsporsjon inneholdende som en blokkerer minst en nukleotid som er resistent til spalting av enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet og blokkeringsporsjonen er posisjonert ved det andre innledende spaltingssetet.

Blokkeringsporsjonen hindrer spalting av det andre innledende spaltingssetet og påfølgende spaltinger. Antallet blokkeringer inneholdt i blokkeringsporsjonen trenger ikke være begrenset, og er fortrinnsvis l-10,mer foretrukket 2-10, enda mer foretrukket 2-8, mest foretrukket 3-6 blokkeringer. Blokkeringene som foreligger i probene kan være i en kontinuerlig eller intermittent måte, fortrinnsvis en kontinuerlig måte. Nukleotider som blokkerere med en backbone som er resistent til 5' til 3'-eksonukleaseaktivitet inkluderer enhver av de som er kjent for den fagkyndige innen feltet. For eksempel, de inkluderer forskjellige fosforotioat bindinger, fosfolat bindinger, fosforoamidat bindinger og to karbohydratmodifiseringer. I samsvar med en mer foretrukket utførelse, nukleotider som har en backbone som er resistent til 5' til 3'-eksonuklease inkluderer fosforotioatbinding, alkylfosfortriester binding, arylfosfortriester binding, alkylfosfonatbinding, arylfosfonat binding, hydrogenfosfonat binding, alkylfosforoamidat binding, arylfosforoamylat binding, fosforoselat binding, 2-O-aminopropyl modifisering, Z-O-alkylmodifisering, 2-O-allyl modifisering, 2-O-butyl modifisering, a-anomerisk oligodeoksynukleotid og l-(4'-tio-|3-D-ribofuranosyl) modifisering.

Trinn (c): Hybridisering av fragmentet frigjort fra PTOen med CTO.

Fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med en CTO (fange og templat oligonukleotid).

Det første fragment og det andre fragment har felles en hybridiserbar sekvens med fangeporsjonen av CTOen og således blir en av den hybridisert med CTOen.

Det andre fragment produsert idet det blir hybridisert med mismatch templat omfatter en ytterligere 3'-endeporsjon som er forskjellig fra det første fragment produsert idet det blir hybridisert med match templat.

I samsvar med en foretrukket utførelse, CTOen har en sekvens valgt slik at CTOen ikke hybridiseres med den ytterligere 3'-endeporsjon av det andre fragment for å hindre at det andre fragment blir forlenget idet det andre fragment er hybridisert med fangeporsjonen av CTOen. For eksempel, sekvensen av CTOen kan være valgt slik at CTOen har en mismatch nukleotid(er) motsatt til den ytterligere 3'-endeporsjon av det andre fragment. Alternativt, universelle baser kan anvendes i stedet for mismatch nukleotidet.

Det første innledende spaltingssete (eller det andre innledende spaltingssetet) kan eller trenger ikke være fiksert men har i stedet multiple i en tilstand. For eksempel, individuelle spaltingsseter kan være posisjonert i en 5'-til 3'-retning ved et innledende nukleotid av en dobbelttråd (det vil si bifurkasjonssetet) i strukturer inkluderende en enkelttråd og en dobbelttråd og 1 -2 nukleotider fra det innledende nukleotid. I et slikt tilfelle, fortrinnsvis, velges sekvensen av CTOen slik at det korteste fragment frigjort av det innledende spaltingssetet selektivt forlenges ifølge oppfinnelsen for å generere den forlengede tråd som indikerer nærvær av nukleotidvariasjonen.

Trinn (d): Ekstensjon av fragment.

Idet det første fragment hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen forlenges det for å danne den forlengede tråd omfattende en forlenget sekvens komplementær til templatporsjonen av CTOen. Idet det andre fragment hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen, så vil det ikke forlenges.

Generelt, ekstensjon av primere kan reguleres med hybridisering mellom en 3'-endedel av primerne og et templat. Ved å justere primersekvensene og reaksjonsbetingelser (for eksempel annealings temperatur), er ekstensjonen av primere som har ved deres 3'-endedel 1-3 mismatch nukleotider tillatt. Alternativt, ekstensjon av primerne kan tillates kun idet de har en perfekt komplementær sekvens til målsekvensen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, sekvensen av CTOen er valgt slik at enten det første fragment eller det andre fragment selektivt forlenges.

I samsvar med en foretrukket utførelse, ekstensjon av fragmentet utføres under betingelser slik at ekstensjon ikke foregår selv idet en enkelt mismatch foreligger ved 3'-endedelen av fragmentet.

Etter ekstensjonsreaksjonen hybridiseres den forlengede tråd med et signaloligonukleotid (SO). Signalene indikerer at nærvær av nukleotidvariasjonen komplementær til nukleotid diskriminasjons-setet av PTOen tilveiebringes.

Detaljer for hybridisering mellom den forlengede tråd og SOen, merkesystemer og signalgenerering vil bli beskrevet med referanse til beskrivelsene angitt over.

Trinn (f): Deteksjon av signal.

Til slutt, det detekterbare signal tilveiebrakt i trinn (e) detekteres, hvorved deteksjon av signalet indikerer nærvær av den forlengede tråd og nærvær av nukleotidvariasjonen komplementær til nukleotid diskrimineringssetet av PTOen.

Detaljer på deteksjon av signaler vil bli beskrevet med referanse til beskrivelsene angitt over.

I samsvar med en utførelse, foreliggende oppfinnelse for nukleotidvariasjon deteksjon kan utføres uten hjelp av oppstrøms oligonukleotider.

Enzymer som har oppstrøms oligonukleotid-uavhengig 5'-nukleaseaktivitet anvendes. Ved vurdering av mangfoldiggjøring av målnukleinsyresekvenser, reaksjonsbetingelser og 5' nukleaseaktivitet, foreliggende oppfinnelse utføres perfekt ved anvendelse av oppstrøms oligonukleotider, mer foretrukket oppstrøms primere.

Kit for måldeteksjon.

I et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringes et kit for deteksjon av en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyre med en PSE-SH (PTO spalting og ekstensjonsavhengig signalerings oligonukleotid hybridisering)-analyse, omfattende: (a) en probe og målrettings oligonukleotid (PTO); hvor PTOen omfatter (i) en 3'-målrettingsporsjon omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen og (ii) en 5'-målrettingsporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen; hvor 3'-målrettingsporsjonen av PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5'-målrettingsporsjonen ikke-hybridiseres med målnukleinsyresekvensen; (b) en oppstrøms oligonukleotid omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid er lokalisert oppstrøms for PTOen; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid eller dets forlengede tråd induserer spalting av PTOen med et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet slik at spaltingen frigjør et fragment omfattende 5'-målrettingsporsjonen eller en del av 5'-målrettingsporsjonen av PTOen; (c) en fange og templat oligonukleotid (CTO); hvor CTOen omfatter en 3'-til 5'-retning (i) en fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen og (ii) en templatporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5'-taggingporsjonen og 3'-målrettingsporsjonen av PTOen; hvor fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen; hvor fragmentet hybridisert med fangeporsjonen av CTOen forlenges for å danne en forlenget tråd omfattende en forlenget sekvens komplementær til templatporsjonen av CTOen, og danner dermed en forlenget dupleks; og (d) et signalerings oligonukleotid (SO); hvor SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd og minst en markør; SOen tilveiebringer et detekterbart signal med hybridisering med den forlengede tråd.

Siden kittet ifølge oppfinnelsen er konstruert for å utføres deteksjonsmetoden ifølge oppfinnelsen beskrevet over, så vil felles beskrivelse mellom disse utelates for å unngå unødvendig overflødighet som fører til kompleksitet av beskrivelsen.

I samsvar med en foretrukket utførelse, minst en porsjon av SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede sekvens.

I samsvar med en foretrukket utførelse, kitet omfatter (i) markør koblet til SOen, (ii) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og en markør koblet til fragmentet fra PTOen, (iii) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og en markør som skal inkorporeres inn i den forlengede tråd, eller (iv) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og et interkalerende fargestoff.

I samsvar med en foretrukket utførelse, SOen merkes med en interaktiv dobbelmarkør omfattende et reportermolekyl og et quenchermolekyl.

I samsvar med en foretrukket utførelse, SOen merkes med en enkeltmarkør.

I samsvar med en foretrukket utførelse, kittet omfatter ytterligere en ytterligere SO som omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd, hvor de to SOer hybridiseres med den forlengede tråd på e tilgrensende måte, hvor de to SOer hver omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør.

I samsvar med en foretrukket utførelse, SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør og fragmentet fra PTOen omfatter den andre markør blant reportermolekylet og quenchermolekylet.

I samsvar med en foretrukket utførelse, SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør og templatporsjonen av CTOen omfatter et nukleotid som har en første ikke-naturlig base; hvor kittet ytterligere omfatter et nukleotid som har både en andre ikke-naturlig base med en spesifikk bindingsaffinitet til den første ikke-naturlige base og det andre blant reportermolekylet og quenchermolekylet.

I samsvar med en foretrukket utførelse, SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør, og kittet omfatter ytterligere et nukleotid som har den andre blant reportermolekylene og quenchermolekylene.

I samsvar med en foretrukket utførelse, SOen omfatter en akseptor av en FRET (fluoressens sonans energioverføring) og kittet omfatter videre et interkalerende fargestoff.

I samsvar med en foretrukket utførelse, PTOen, CTO og/eller SO blokkeres ved dets 3'-ende for å hindre dets forlengelse.

I samsvar med en foretrukket utførelse, oppstrøms oligonukleotid er en oppstrøms primer eller en oppstrøms probe.

I samsvar med en foretrukket utførelse, kitet omfatter videre et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet.

I samsvar med en foretrukket utførelse, kittet er for deteksjon av minst to typer målnukleinsyresekvenser; hvor oppstrøms oligonukleotid omfatter minst to typer oligonukleotider, PTOen omfatter minst to typer av PTOene, CTOen omfatter minst to typer av CTOene og SOen omfatter minst to typer av SOene.

I samsvar med en foretrukket utførelse, kittet omfatter videre en nedstrøms primer.

Trekkene og fordelen med foreliggende oppfinnelse summeres som følger:

(a) Den foreliggende oppfinnelse anvender ikke prober som skal hybridiseres med målnukleinsyresekvensene for å tilveiebringe målsignaler. Interessant, foreliggende oppfinnelse anvender prober (signaloligonukleotider) som skal hybridiseres med den forlengede tråd dannet på en målavhengig måte hvor den forlengede tråd syntetiseres ved anvendelse av CTOen artifisielt valgt som templat. Den foreliggende oppfinnelse benytter først PTOen for å probe målnukleinsyresekvenser og deretter SOen for å tilveiebringe signaler med hybridisering med målavhengig forlenget tråd, og bidrar til en drastisk økning i spesifisiteten og mye bedre hensiktsmessighet i å bestemme reaksjonsbetingelser ved å justere betingelser for signalgenerering uavhengig av målnukleinsyresekvensene. Slike egenskaper muliggjør at betingelser for signalgenerering enklere kan etableres i samtidig multipleks måldeteksjon i forskjellige kliniske prøver og falske positive signaler hindres. (b) I konvensjonelle teknologier som anvender prober som skal hybridiseres med målnukleinsyresekvensene hybridiseres probene med målnukleinsyresekvensene i konkurranse med komplementære sekvenser av målnukleinsyresekvensene. Imidlertid, foreliggende oppfinnelse er i stand til å mangfoldiggjøre kun den forlengede tråd ved anvendelse av en kontrollert mengde av CTOen som et templat og sikrer derfor effektiv hybridisering av prober, og gjør det mulig og effektiv gi signaler som indikerer nærvær av målnukleinsyresekvensen. (c) Foreliggende oppfinnelse kan detektere nærvær av målnukleinsyresekvenser i sanntids måte eller med en smelteanalyse. (d) Tm-verdien av hybridiseringsresultanten mellom den forlengede tråd og SOen kan justeres med en sekvens og/eller lengde av SOen og derfor vilkårlig pre-bestemmes. Ved anvendelse av en slik egenskap, (i) foreliggende oppfinnelse kan detektere målnukleinsyresekvenser med differensierende falske positive signaler på grunn av at signalene generert med temperaturer andre enn de pre-bestemte Tm-verdier korresponderer til falske positive signaler, (ii) Den vilkårlige bestemmelse av Tm-verdiene av hybridiseringsresultanten blir mer fordelaktig i multipleks deteksjon for minst to typer målnukleinsyresekvenser. (e) Tm-verdien av konvensjonelle smeltekurveanalyser av hybridet mellom en probe og en målnukleinsyresekvens påvirkes av en sekvensvariasjon på målnukleinsyresekvensen. Imidlertid, en forlenget tråd ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en konstant Tm-verdi uavhengig av sekvensvariasjon på målnukleinsyresekvensene, som sikrer utmerket nøyaktighet i smeltekurveanalyser. (f) Det skal bemerkes av sekvensene av 5'-målrettingsporsjonen av PTOen, CTOen og SOen kan velges uten å vurdere målnukleinsyresekvensene. Dette gjør det mulig å pre-designe en samling av sekvenser for 5'-målrettingsporsjonen av PTOen. CTOen og SOen. Selv om 3'-målrettingsporsjonen av PTOen må fremstilles ved vurdering av målnukleinsyresekvensene, kan CTOen og SOen fremstilles på en forhåndsbestemt måte uten å vurdere eller ha kunnskap til målnukleinsyresekvensene. (g) Et bredt spekter av konvensjonelle merkeprober kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse for måldeteksjon. (h) Idet hybridiseringsresultantene mellom de forlengede tråder og SOene har forskjellige Tm-verdier fra hverandre, kan minst to målnukleinsyresekvenser detekteres med smeltekurveanalyser selv ved anvendelse av et merkesystem som tilveiebringer signaler med de samme fluoressens karakteristika. Denne fordel muliggjør at man er fri fra de begrensninger som er assosiert med antallet detekterbare fluoressens markører i multipleks sanntidsdeteksjon.

Den foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet i ytterligere detalj ved hjelp av eksempler. Det er åpenbart for de fagkyndige innen feltet at disse eksempler er tiltenkt å være konkrete illustrerende og at rammen av foreliggende oppfinnelse som angitt i de medfølgende patentkrav ikke er begrenset til eller med eksempler.

Eksempler.

Eksempel 1: Evaluering av PTO-spalting og ekstensjonsavhengig signalerings oligonukleotid hybridisering (PCE-SO) analyse.

En ny analyse, PTO-spalting og ekstensjonsavhengig signalerings oligonukleotid hybridisering (PCE-SH) analyse ble vurdert for deteksjon av målnukleinsyresekvensen i (i) sanntidsdeteksjon med en forutbestemt temperatur eller (ii) smelteanalysemåte (se fig 2).

Taq DNA polymerase som har en '-nukleaseaktivitet ble anvendt for ekstensjon av oppstrøms primer, spalting av PTOen og ekstensjon av PTO-fragment.

PTO og CTO har ingen markør. PTO og CTO blokkeres med en karbonspacer ved deres 3'-ende. Det syntetiske oligonukleotid for Neisseria gonorrhoeae (NG) genet ble anvendt som et måltemplat. Signaleringsoligonukleotid (SO) har et fluorescerende reportermolekyl (CAL Fluor Red 610) ved dets 5'-ende og har et quencher molekyl (BHQ-2) ved dets 3'-ende.

Sekvensene av syntetisk templat, oppstrøms primer, PTO, CTO og SO anvendt i dette eksempel er:

1- 1. Sanntids deteksjon ved en forutbestemt temperatur.

Reaksjonen ble utført i finalt volum på 20 ul inneholdende 2 pmol syntetisk templat (SEQ ID NO 1) for NG-gen, 10 pmol oppstrøms primer (SEQ ID NO:2), 5 pmol PTO (SEQ ID NO: 3), 0,5 pmol CTO (SEQ ID NO: 4), 0,5 pmol SO (SEQ ID NO: 5) og 10 ul 2X Master Mix inneholdende 2,5 mM MgCl2,200 uM dNTPer og 1,6 enheter H- Taq DNA polymerase (Solgent, Korea); røret som inneholder reaksjonsblandingen ble plassert i en sanntids termocycler (CFX96, Bio-Rad); reaksjonsblandingen ble denaturert i 15 min ved 95 °C og underlagt 30 sykluser av 30 sec ved 95 °C, 60 sec ved 60 °C og 30 sec ved 72 °C. Deteksjon av det genererte signal ble utført ved hybridiseringstrinnet (60 °C) i hver syklus. Deteksjonstemperaturen ble bestemt i en slik grad at den forlengede tråd-SO-hybridet opprettholder en dobbelttrådet form.

Som vist i fig 10 A, fluoressens signalet ble detektert i nærvær av templatet. Intet signal ble detektert i fravær av templat, PTO, CTO eller SO.

1- 2. Smelteanalyser.

Etter reaksjonen i eksempel 1-1 ble smeltekurve oppnådd ved å avkjøle reaksjonsblandingen til 55 °C, holde den ved 55 °C i 30 sec, og oppvarme langsomt ved 55 °C til 85 °C. Fluoressens ble målt kontinuerlig under temperaturøkningen for å monitorere dissosiering av den forlengede tråd-SO-hybrid. Smeltetopp ble avledet fra smeltekurvedataene.

Som vist i fig 10 B, en topp ved 68,5 °C korresponderende til den forventede Tm-verdi av den forlengede tråd-SO-hybrid ble det detektert i nærvær av templatet. Ingen topp ble detektert i fravær av templat, PTO, CTO eller SO.

Eksempel 2: Deteksjon av en målnukleinsyresekvens ved anvendelse av PCE-SH-analysen.

Vi undersøkte videre om PCE-SH-analysen kan detektere en målnukleinsyresekvens i (i) sanntids PCR måte eller (ii) post-PCR smelteanalyse måte.

Taq DNA polymerase som har 5'-nukleaseaktivitet ble anvendt for ekstensjon av oppstrøms primer og nedstrøms primer, spalting av PTO og ekstensjon av PTO-fragment.

PTO og CTO har ingen markør. PTO og CTO blokkeres med en karbonspacer ved deres 3'-ende. Genomisk DNA av NG-genet ble anvendt som et måltemplat. SO har et fluorescerende reportermolekyl (CAL Fluor Red 610) ved dets 5'-ende og har et quencher molekyl (BHQ-2) ved dets 3'-ende. Sekvensene av oppstrøms primer, nedstrøms primer, PTO, CTO og SO anvendt i dette eksempelet er:

2- 1. Sanntidsdeteksjon ved en forutbestemt temperatur under PCR

Reaksjonen ble utført i finalt volum på 20 ul inneholdende 100 pg genomisk DNA av NG, 10 pmol oppstrøms primer (SEQ ID NO: 2), 10 pmol nedstrøms primer (SEQ ID NO: 6), 5 pmol PTO (SEQ ID NO: 3), 0,5 pmol CTO (SEQ ID NO: 4), 0,5 pmol SO (SEQ ID NO: 5) og 10 ul 2X Master Mix inneholdende 2,5 mM MgCU, 200 uM dNTPer og 1,6 enheter K- Taq DNA polymerase (Solgent, Korea); og røret som inneholdt reaksjonsblandingen ble plassert i en sanntids termocycler (CFX96, Bio-Rad); reaksjonsblandingen ble denaturert i 15 min ved 95 °C og underlagt 50 sykluser av 30 sec ved 95 °C, 60 sec ved 60 °C og 30 sec ved 72 °C. Deteksjon av signalet ble utført ved hybridiseringstrinnet (60 °C) av hver syklus. Deteksjonstemperaturen ble bestemt i den grad at den forlengede tråd-SO-hybrid opprettholder en dobbelttrådet form.

Som vist i fig 11 A, fluoressens signalet (Ct: 30.34) ble detektert i nærvær av templatet. Intet signal ble detektert i fravær av templatet.

2- 2. Post- PCR smelteanalyser

Etter reaksjonen i eksempel 2-1, ble smeltekurven oppnådd ved å avkjøle reaksjonsblandingen til 55 °C, holde den ved 55 °C i 30 sec, og varme langsomt fra 55 °C til 85 °C. Fluoressens ble målt kontinuerlig under temperaturøkningen for å monitorere dissosiering av en forlenget tråd-SO-hybrid. Smeltetoppen ble avledet fra smeltekurvedataene.

Som vist i fig 1 IB, en topp ved 68,5 °C korresponderende til den forventede Tm-verdi av den forlengede tråd-SO-hybrid ble detektert i nærvær av templatet. Ingen topp ble detektert i fravær av templat.

EKSEMPEL 3: diskriminering av en enkelt nukleotidvariasjon for en målnukleinsyresekvens ved anvendelse av PCE-SH

Vi undersøkte videre om PCE-SH-analysen kan diskriminere e enkelt nukleotidvariasjon på en målnukleinsyresekvens.

Taq DNA polymerase som har en 5'-nukleaseaktivitet ble anvendt for ekstensjon av oppstrøms primer og nedstrøms primer, spalting av PTO og ekstensjon av PTO-fragmentet. PTO og CTO har ingen markør. PTO og CTO blokkeres med en karbonspacer ved deres 3'-ende. Villtype (C), heterotype (C/T) og mutant-type (T) av humant genomisk DNA for C677T mutasjon av MTHFR-genet ble anvendt so målnukleinsyrer. SO har et quencher molekyl (BHQ-2) ved dets 5'-ende og har et fluoressens reportermolekyl (CAL Fluor Red 610) ved dets 3'-ende.

PTO-l(SEQ ID NO:9) og CTO-1 (SEQ ID NO:l 1) ble anvendt for å detektere villtype, og PTO-2(SEQ ID NO:10) og CTO-2(SEQ ID NO:12) ble anvendt for å detektere mutant typen. Idet villtype genet var foreliggende, ble den forlengede tråd (heretter benevnt som «villtype forlenget tråd») dannet ved anvendelse av CTO-1 som et templat. I det tilfellet at mutant type genet var foreliggende, ble den forlengede tråd (heretter nevnt som mutant type forlenget tråd») dannet ved anvendelse av CTO-2 som templat. Ved deteksjon av hybridiseringsproduktene mellom de forlengede tråder og SOene ved smelteanalyse kan de to typer forlengede tråder differensielt detekteres ved anvendelse av en type SO. For eksempel, idet de forlengede tråder er konstruert til å ha forskjellige sekvenser fra hverandre i en porsjon som skal hybridiseres med SOene, så har hybridiseringsproduktene forskjellig Tm-verdier, noe som muliggjør å differensielt detektere dannelse av de forlengede tråder.

Sekvensene for oppstrøms primer, nedstrøms primer, PTO, CTO og SO anvendt i dette eksempel er:

(Uthevet bokstav indikerer sekvensen ved C677T mutasjonssetet av MTHFR-genet).

Reaksjonen ble utført i finalt volum på 20 ul inneholdende 30 ng MTHFR (C677T) vill (C), hetero (C/T) eller mutant (T) type human genomisk DNA, 10 pmol oppstrøms primer (SEQ ID NO: 7), 10 pmol nedstrøms primer (SEQ ID NO: 8), hver 5 pmol av PTOer (SEQ ID NO: 9 og 10), hver 0,1 pmol av CTOer (SEQ ID NO: 11 og 12), 0,5 pmol SO (SEQ ID NO: 13) og 10 ul 2X Master Mix inneholdende 2,5 mM MgCl2, 200 uM dNTPer og 1,6 enheter K- Taq DNA polymerase (Solgent, Korea); hvor røret inneholdende reaksjonsblandingen ble plassert i en sanntids termocycler (CFX96, Bio-Rad); reaksjonsblandingen ble denaturert i 15 min ved 95 °C og underlagt 40 sykluser i 30 sec ved 95 °C, 60 sec ved 55 °C og 30 sec ved 72 °C. Etter reaksjonen ble smeltekurven oppnådd ved avkjøling av reaksjonsblandingen til 45 °C, holde denne ved 45 °C i 30 sec, og oppvarmet langsomt ved 45 °C til 85 °C. Fluoressens ble målt kontinuerlig under temperaturøkningen for å monitorere dissosiasjonen av en forlenget tråd-SO-hybrid. Smeltetoppen ble avledet fra smeltekurvedata.

Som vist i fig 12, en topp ved 71,0°C korresponderende til den forventede Tm-verdi av villtype forlenget tråd-SO-hybrid ble detektert i nærvær av villtype templat. En topp ved 55,5 °C korresponderende til den forventede T-m verdi av mutant type forlenget tråd-SO-hybrid ble detektert i nærvær av mutant type templat. En topp ved 71,0 °C (villtype) og en topp ved 55,5°C (mutant type) ble detektert i nærvær av hetero type templat. Ingen topp ble detektert i fravær av templatet. EKSEMPEL 4: Evaluering av PCE-SH-analyse ved anvendelse av oppstrøms oligonukleotid uavhengig spalting av PTO.

PCE-SH-analysen ble videre evaluert for deteksjon av en målnukleinsyresekvens uten anvendelse av oppstrøms oligonukleotid i (i) sanntids deteksjon ved en forutbestemt temperatur eller (ii) smelteanalyse måte.

Taq DNA polymerase som har 5'-nukleaseaktivitet ble anvendt for spalting av PTOen, og ekstensjon av PTO-fragmentet.

PTO og CTO har ingen markør. PTO og CTO er blokkert med en karbonspacer ved deres 3'-ende. Det syntetiske oligonukleotid for Neisseria gonorrhoeae (NG) genet ble anvendt som en måltemplat. SO har et fluoriserende reportermolekyl (CAL Fluor Red 610) ved dets 5'-endeog har et quencher molekyl (BHQ-2) ved dets 3'-ende.

Sekvensene for syntetiske templat, PTO, CTO og SO anvendt i dette eksempel er:

4- 1. Sanntidsdeteksjon ved en forutbestemt temperatur.

Reaksjonen ble utført i finalt volum av 20 ul inneholdende 2 pmol syntetisk templat (SEQ ID NO: 1) for NG gen, 5 pmol PTO (SEQ ID NO: 3), 0,5 pmol CTO (SEQ ID NO: 4), 0,5 pmol SO (SEQ ID NO: 5) og 10 ul 2X Master Mix inneholdende 2,5 mM MgCl2, 200 uM dNTPer og 1,6 enheter H- Taq DNA polymerase (Solgent, Korea); røret som inneholdt reaksjonsblandingen ble plassert i sanntids termocycler (CFX96, Bio-Rad); reaksjonsblandingen ble denaturert i 15 min ved 95 °C og underlagt 30 sykluser av 30 sec ved 95 °C, 60 sec ved 60 °C og 30 sec ved 72 °C. Deteksjon av det genererte signal ble utført ved hybridiseringstrinn (60 °C) av hver syklus. Deteksjonstemperaturen ble bestemt i en slik grad at den forlengede tråd-SO-hybrid opprettholder en dobbelttrådet form.

Som vist i fig 13A, fluoressens signalet ble detektert i nærvær av templat. Intet signal ble detektert i fravær av templat.

4- 2. Smelteanal<y>se

Etter reaksjonen i eksempel 4-1, ble smeltekurver oppnådd ved avkjøling av reaksjonsblandingen til 55 °C, holde den ved 55 °C i 30 sec, og oppvarme langsomt ved 55 °C til 85 °C. Fluoressens ble målt kontinuerlig under temperaturøkningen for å monitorere dissosiering av den forlengede tråd-SO-hybrid. Smeltetopp ble bestemt fra smeltekurvedata.

Som vist i fig 13B, en topp ved 68,5 °C korresponderende til den forventede Tm-verdi av den forlengede tråd-SO-hybrid ble detektert i nærvær av templat. Ingen tipp ble detektert i fravær av templat.

Idet man har beskrevet den foretrukne utførelse av foreliggende oppfinnelse skal det forstås at varianter og modifikasjoner som faller innenfor rammen av oppfinnelsen vil være åpenbare for den fagk<y>ndige, og at rammen for foreliggende oppfinnelse bestemmes av de medfølgende krav og deres ekvivalenter.

Claims

1. Fremgangsmåter for å detektere en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyrer med en PSE-SH (PTO Spalting og ekstensjonsavhengig signaleringsoligonukleotid hybridisering) analyse,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: (a) hybridisere målnukleinsyresekvensen med en oppstrøms oligonukleotid og en probe og målrettingsoligonukleotid (PTO); hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid omfatter en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen; PTOen omfatter (i) en 3'-målrettingsporsjon omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen og (ii) en 5'-taggingporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen; hvor 3'-målrettingsporsjonen av PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5'-taggingporsjonen ikke-hybridiseres med målnukleinsyresekvensen; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid er lokalisert oppstrøms av PTOen; (b) sette resultanten fra trinn (a) i forbindelse med et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet under betingelser for spalting av PTOen; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid eller dets forlengede tråd induserer spalting av PTOen med et enzym som har 5' nukleaseaktivitet slik at spaltingen frigjør et fragment omfattende 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen; (c) hybridisere fragmentet frigjort fra PTOen med en fange og templat oligonukleotid (CTO); hvor CTOen omfatter i en 3'-til 5'-retning (i) en fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen og (ii) en templatporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5'-taggingporsjonen og 3'-målrettingsporsjonen av PTOen; hvor fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen; (d) utføre en ekstensjonsreaksjon ved anvendelse av resultanten fra trinn (c) og en templatavhengig nukleinsyrepolymerase; hvor fragmentet hybridisert med fangeporsjonen av CTOen forlenges for å danne en forlenget tråd omfattende en forlenget sekvens komplementær til templatporsjonen av CTOen, og dermed dannende en forlenget dupleks; (e) hybridisere den forlengede tråd med et signalerings oligonukleotid (SO); hvor SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd og minst en markør; hvor SOen tilveiebringer et detekterbart signal med hybridisering med den forlengede tråd; og (f) detektere signalet; hvorved deteksjon av signalet indikerer nærvær av den forlengede tråd og nærvær av målnukleinsyresekvensen.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat minst en porsjon av SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede sekvens.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat det detekterbare signal tilveiebringes av (i) markøren koblet til SOen, (ii) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og en markør koblet til fragmentet fra PTOen, (iii) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og en markør som skal inkorporeres inn i den forlengede tråd under ekstensjonsreaksjonen i trinn (d), eller (iv) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og et interkalerende fargestoff.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat Soen merkes med en interaktiv dobbelmarkør omfattende et reportermolekyl og et quenchermolekyl og at hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd i trinn (e) induserer forandring i signal fra den interaktive dobbelmarkør for å tilveiebringe det detekterbare signal.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat SOen merkes med en enkeltmarkør og hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd i trinn (e) induserer forandring i signal fra enkeltmarkøren for å tilveiebringe det detekterbare signal.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5,karakterisert vedat enkeltmarkøren er en enkelt fluoressensmarkør.

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten anvender en ytterligere SO omfattende en komplementær sekvens til den forlengede tråd, hvor de to SOer hybridiseres med den forlengede tråd på en tilgrensende måte, de to SOer hver omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør; og hybridiseringen mellom de to SOer og den forlengede tråd induserer forandring i signal fra den interaktive dobbelmarkør for å tilveiebringe det detekterbare signal.

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat SOen omfatter en markør samt et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør, fragmentet fra PTOen omfatter den andre markør blant reportermolekylene og quenchermolekylet; den forlengede tråd omfatter markøren som har sitt opphav i fragmentet fra PTOen, og hvor hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd induserer forandring i signal fra den interaktive dobbeltmarkør for å tilveiebringe det detekterbare signal.

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat at SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbeltmarkør, og templatporsjonen av CTOen omfatter et nukleotid som har en første ikke-naturlig base; hvor ekstensjonsreaksjonen i trinn (d) utføres i nærvær av et nukleotid som har både en andre ikke-naturlig base med en spesifikk bindingsaktivitet til den første ikke-naturlige base og den andre blant reportermolekylene og quenchermolekylet, og inkorporerer dermed markøren inn i den forlengede tråd; hvor hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd induserer forandring i signalet fra den interaktive dobbeltmarkør for å tilveiebringe det detekterbare signal.

10. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl som en interaktiv dobbeltmarkør, og ekstensjonsreaksjonen i trinn (d) utføres i nærvær av et nukleotid som har det andre blant reportermolekylene og quenchermolekylene, dermed inkorporeres markøren inn i den forlengede tråd; hvorved hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd induserer forandring i signal fra den interaktive dobbeltmarkør for å tilveiebringe det detekterbare signal.

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat SOen omfatter en akseptor av en FRET (fluoressens resonans energioverføring) og hybridisering i trinn (e) utføres i nærvær av et interkalerende fargestoff; hvor hybridiseringen mellom SOen og den forlengede tråd induserer forandring signal fra akseptoren av SOen for å tilveiebringe det detekterbare signal.

12. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat PTOen, CTOen og/eller SOen blokkeres ved dets 3'-ende for å hindre dets forlengelse.

13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte oppstrøms oligonukleotid er en oppstrøms primer eller en oppstrøms probe.

14. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte oppstrøms oligonukleotid er lokalisert tilgrensende til PTOen i en slik grad av oppstrøms oligonukleotid induserer spalting av PTOen med enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet.

15. Fremgangsmåte i samsvar med krav 13,karakterisert vedat nevnte oppstrøms primer induseres gjennom dets forlengede tråd og spalting av PTOen av enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet.

16. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat fangeporsjonen av CTOen omfatter ved dets 5'-endedel en nukleotidsekvens so er komplementær til en del av 3'-målrettingsporsjonen av PTOen.

17. Fremgangsmåte i samsvar med krav 16,karakterisert vedat nukleotidsekvensen komplementær til den del av 3'-målrettingsporsjonen av PTOen er 1-10 nukleotider i lengde.

18. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter trinnet å tilveiebringe et detekterbart signal mellom trinnene (e) og (f) ved å smelte hybridiseringsresultanten i trinn (e) eller ved å smelte eller hybridisere hybridiseringsresultanten i trinn (e); hvor trinn (f) utføres ved å detektere signalet for å bestemme nærvær av den forlengede tråd.

19. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter trinnet å tilveiebringe og detektere et detekterbart signal etter trinn (f) ved smelting av hybridiseringsresultanten fra tinn (e) eller ved smelting og hybridisering av hybridiseringsresultanten fra trinn (e), hvorved nærvær av den forlengede tråd bestemmes en gang til.

20. Fremgangsmåte i samsvar med krav 18 eller 19,karakterisert vedat nærvær av den forlengede tråd bestemmes ved smeltekurveanalyse eller en hybridiseringskurveanalyse.

21. Fremgangsmåte i samsvar med kravl,karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter trinnet å denaturere mellom trinnene (d) og (e).

22. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter å repetere alle eller noen av trinnene (a)-(f) med denaturering mellom repeterende sykluser.

23. Fremgangsmåte i samsvar med krav 22,karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter å repetere trinnene (a)-(e) med denaturering mellom repeterende sykluser, og smelte hybridiseringsresultanten fra trinn (e) eller smelte og hybridisere hybridiseringsresultanten fra trinn (e) for å tilveiebringe et detekterbart signal; hvor trinn (f) utføres ved å detektere signaler for å bestemme nærvær av den forlengede tråd.

24. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat trinnene (a)-(f) utføres i reaksjonskar eller noen av trinnene (a)-(f) utføres i separate reaksjonskar.

25. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten utføres for å detektere minst to typer målnukleinsyresekvenser; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid omfatter minst to typer oligonukleotider, PTOen omfatter minst to typer PTOer, CTOen omfatter minst to typer CTOer og SOen omfatter minst to typer SOer.

26. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte oppstrøms oligonukleotid i trinn (a) er en oppstrøms primer og trinn (b) anvender en templatavhengig nukleinsyrepolymerase for ekstensjon av oppstrøms primere.

27. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat målnukleinsyresekvensen omfatter en nukleotidvariasjon.

28. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1 -27,karakterisert vedat fremgangsmåten utføres i nærvær av en nedstrøms primer.

29. Fremgangsmåte for deteksjon av målnukleinsyresekvens på en DNA eller en blanding av nukleinsyrer med en PCE-SH (PTO spalting og ekstensjonsavhengig signalerings oligonukleotid hybridisering) analyse,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: (a) hybridisere målnukleinsyresekvensen med et primerpar omfattende en oppstrøms primer og en nedstrøms primer og en PTO (Probe og tagging oligonukleotid); hvor hver av nevnte oppstrøms primer og nedstrøms primer omfatter en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensene; PTOen omfatter (i) en 3'-målrettingsporsjon omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen og (ii) en 5'-taggingporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen; hvor 3'-målrettingsporsjonen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5'-taggingporsjonen ikke hybridiseres med målnukleinsyresekvensen; PTOen er lokalisert mellom oppstrøms primer og nedstrøms primer; og PTOen er blokkert ved dets 3'-ende for å hindre dets forlengelse; (b) sette resultanten for trinn (a) i forbindelse med en templatavhengig nukleinsyrepolymerase som har 5'-nukleaseaktivitet under betingelser for ekstensjon av primere og for spalting av PTOen; hvor, idet PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen, oppstrøms primer forlenges og den forlengede tråd induserer spalting av PTOen med templatavhengig nukleinsyrepolymerase som har 5'- nukleaseaktivitet slik at spaltingen frigjør et fragment omfattende 5' taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen; (c) hybridisere fragmentet frigjort fra PTOen med en fange og templatoligonukleotid (CTO); hvor CTOen omfatter en 3'-til 5'-retning (i) en fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen og (ii) en templatporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5'-taggingporsjonen og 3'-målrettingsporsjonen av PTOen; hvor fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen; (d) utføre en ekstensjonsreaksjon ved anvendelse av resultanten fra trinn (c) og templatavhengig nukleinsyrepolymerase; hvor fragmentet hybridisert mede fangeporsjonen av CTOen forlenges for å danne en forlenget tråd omfattende en forlenget sekvens komplementær til templatporsjonen av CTOen, og dermed danne en forlenget dupleks; (e) hybridisere den forlengede tråd med et signaleringsoligonukleotid (SO); hvor SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd og minst en markør; SOen tilveiebringer et detekterbart signal ved hybridisering med den forlengede tråd; og (f) detektere signalet; hvorved deteksjon av signalet indikerer nærvær av den forlengede tråd og nærvær av målnukleinsyresekvensen.

30. Fremgangsmåte for å detektere en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyrer med en PSE-SH (PTO spalting og ekstensjonsavhengig signalerings oligonukleotid hybridisering) analyse),karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: (a) hybridisere målnukleinsyresekvensen med en probe og målrettings oligonukleotid (PTO); hvor PTOen omfatter (i) en 3'-målrettingsporsjon omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen og (ii) en 5'-taggingporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen; hvor 3'-målrettingsporsjonen av PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5'-taggingporsjonen ikke-hybridiseres med målnukleinsyresekvensen; (b) sette resultanten fra trinn (a) i forbindelse med et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet under betingelser for spalting av PTOen; hvor PTOen spaltes med enzymet som har 5'-nukleaseaktivitet slik at spaltingen frigjør et fragment omfattende 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen; (c) hybridisere fragmentet frigjort fra PTOen med en fange og templatoligonukleotid (CTO); hvor CTOen omfatter en 3'-til 5' retning (i) en fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen og (ii) en templatporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5'-taggingporsjonen og 3'-målrettingsporsjonen av PTOen; hvor fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen; (d) utføre en ekstensjonsreaksjon ved anvendelse av resultanten fra trinn (C) og en templatavhengig nukleinsyrepolymerase; hvor fragmentet hybridisert med fangeporsjonen av CTOen forlenges for å danne en forlenget tråd omfattende en forlenget sekvens komplementær til templatporsjonen av CTOen, og dermed danne en forlenget dupleks; (e) hybridisere den forlengede tråd med et signalerende oligonukleotid (SO); hvor SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd og minst en markør; SOen tilveiebringer et detekterbart signal med hybridisering med den forlengede tråd; og (f) detektere signalet; hvor deteksjon av signalet indikerer nærvær av den forlengede tråd og nærvær av målnukleinsyresekvensen.

31. Kitt for å detektere en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyrer med en PSE-SH (PTO spalting og ekstensjonsavhengig signalerende oligonukleotid hybridisering) analyse,karakterisert vedat kittet omfatter: (a) en probe og målrettingsoligonukleotid (PTO); hvor PTOen omfatter (i) en 3'-målrettingsporsjon omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen og (ii) en 5'-taggingporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til målnukleinsyresekvensen; hvor 3'-målrettingsporsjonen av PTOen hybridiseres med målnukleinsyresekvensen og 5'-taggingporsjonen ikke-hybridiseres med målnukleinsyresekvensen; (b) en oppstrøms oligonukleotid omfattende en hybridiserende nukleotidsekvens komplementær til målnukleinsyresekvensen; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid er lokalisert oppstrøms for PTOen; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid eller dets forlengede tråd induserer spalting av PTOen med et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet slik at spaltingen frigjør et fragment omfattende 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen; (c) en fange og templatoligonukleotid (CTO); hvor CTOen omfatter en 3'-til 5'-retning (i) en fangeporsjon omfattende en nukleotidsekvens komplementær til 5'-taggingporsjonen eller en del av 5'-taggingporsjonen av PTOen og (ii) en templatporsjon omfattende en nukleotidsekvens ikke-komplementær til 5'-taggingporsjonen og 3'-målrettingsporsjonen av PTOen; hvor fragmentet frigjort fra PTOen hybridiseres med fangeporsjonen av CTOen; hvor fragmentet hybridisert med fangeporsjonen av CTOen forlenges for å danne en forlenget tråd omfattende en forlenget sekvens komplementær til templatporsjonen av CTOen, og dermed danne en forlenget dupleks; og (d) et signalerende oligonukleotid (SO); hvor SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede tråd og minst en markør; SOen tilveiebringer et detekterbart signal med hybridisering med den forlengede tråd.

32. Kitt i samsvar med krav 31,karakterisert vedat minst en porsjon av SOen omfatter en komplementær sekvens til den forlengede sekvens.

33. Kitt i samsvar med krav 31,karakterisert vedat kitet omfatter (i) markøren koblet til SOen, (ii) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og en markør koblet til fragmentet fra PTOen, (iii) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og en markør som skal inkorporeres inn i den forlengede tråd, og (iv) en kombinasjon av markøren koblet til SOen og et interkalerende fargestoff.

34. Kitt i samsvar med krav 31,karakterisert vedat SOen er merket med en interaktiv dobbelmarkør omfattende et reportermolekyl og et quenchermolekyl.

35. Kitt i samsvar med krav 31,karakterisert vedat SOen er merket med en enkelt markør.

36. Kitt i samsvar med krav 31,karakterisert vedat kitet ytterligere omfatter en ytterligere SO omfattende en komplementær sekvens til den forlengede tråd, de to SOer hybridiseres med den forlengede tråd på en tilgrensende måte, de to SOer hver omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør.

37. Kitt i samsvar med krav 31,karakterisert vedat SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør og fragmentet fra PTOen omfatter den andre markør blant reportermolekylet og quenchermolekylet.

38. Kitt i samsvar med krav 31,karakterisert vedat SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør og templatporsjonen av CTOen omfatter et nukleotid som har en første ikke-naturlig base; hvor kitet videre omfatter et nukleotid som har både en andre ikke-naturlig base med en spesifikk bindingsaffinitet til den første ikke-naturlige base og den andre blant reportermolekylet og quenchermolekylet.

39. Kitt i samsvar med krav 31,karakterisert vedat SOen omfatter en markør blant et reportermolekyl og et quenchermolekyl av en interaktiv dobbelmarkør, og kitet omfatter videre et nukleotid som har den andre blant reportermolekylet og quenchermolekylet.

40. Fremgangsmåte i samsvar med krav 31,karakterisert vedat SOen omfatter en akseptor av en FRET (fluoressens resonans energioverføring) og kittet ytterligere omfatter et interkalerende fargestoff.

41. Kit i samsvar med krav 31,karakterisert vedat ved at PTOen, CTOen og/eller SOen er blokkert ved dets 3'-ende for å hindre dets forlengelse.

42. Kit i samsvar med krav 31,karakterisert vedat nevnte oppstrøms oligonukleotid er en oppstrøms primer eller en oppstrøms probe.

43. Kit i samsvar med krav 31,karakterisert vedat kittet ytterligere omfatter et enzym som har en 5'-nukleaseaktivitet.

44. Kit i samsvar med krav 31,karakterisert vedat kittet er for deteksjon av minst to typer målnukleinsyresekvenser; hvor nevnte oppstrøms oligonukleotid omfatter minst to typer oligonukleotider, PTOen omfatter minst to typer av PTOene, CTOene omfatter minst to typer av CTOene og SO omfatter minst to typer av SOene.

45. Kit i samsvar med ethvert av kravene 31-44,karakterisert vedat kittet ytterligere omfatter en nedstrøms primer.