JP2015505470A - ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いたターゲット核酸配列の検出（ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴａｒｇｅｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｂｙＰＴＯＣｌｅａｖａｇｅａｎｄＥｘｔｅｎｓｉｏｎ−ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＡｓｓａｙ） - Google Patents

ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いたターゲット核酸配列の検出（ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴａｒｇｅｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｂｙＰＴＯＣｌｅａｖａｇｅａｎｄＥｘｔｅｎｓｉｏｎ−ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＡｓｓａｙ） Download PDF

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Abstract

本発明は、ＰＴＯ切断と伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いたターゲット核酸配列の検出に関するものである。本発明は、ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションしてターゲットシグナルを提供するプローブを使用しない。本発明はターゲット依存的（ｔａｒｇｅｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ）に形成される伸長鎖とハイブリダイゼーションするプローブ（シグナリングオリゴヌクレオチド）を用い、前記伸長鎖は人為的に選択された配列を持つＣＴＯをテンプレートとして合成される。【選択図】図２

Description

本発明は、ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いたターゲット核酸配列の検出に関するものである。
ＤＮＡハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は分子生物学の基本的な過程であり、イオン強度、塩基構成、核酸断片の長さ、ミスマッチの程度及び変性剤の存在によって影響される。ＤＮＡハイブリダイゼーション基盤技術は特定の核酸配列の決定に非常に有用な道具になるはずであり、臨床診断、遺伝子研究及び法医学的な実験分析に明らかに役立つだろう。
しかしながら、ハイブリダイゼーションのみに依存する従来の方法及び過程では、プローブと非ターゲット配列間の非特異的なハイブリダイゼーションによる偽陽性結果が発生する可能性が高い。よって、従来の方法及び過程は、信頼度を改善しなければならない問題点が残っている。
プローブハイブリダイゼーション過程以外にも追加で酵素的反応を用いたいくつかの接近法、例えば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法が提示された。
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法において、ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされた標識プローブは上流プライマー依存的なＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断されて、ターゲット配列の存在を示すシグナルを発生させる（特許文献１〜３）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法は、シグナル発生のための２つの接近法を提示する：重合依存的な切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）及び重合独立的な切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）。重合依存的な切断において、上流プライマーの伸長は必ず核酸ポリメラーゼが標識プローブの５’末端に接触する前に発生しなければならない。伸長反応が進行されながら、ポリメラーゼは標識プローブの５’末端を次第に切断する。重合独立的な切断において、上流プライマー及び標識プローブは非常に近接してターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上流プライマーの３’末端と核酸ポリメラーゼとの結合は上記核酸ポリメラーゼが標識プローブの５’末端に接触するようにして標識が放出される。また、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法は、それの５’末端部位にターゲット配列とハイブリダイゼーションされない５’テール区域を持つ標識プローブが切断されて５’テール区域を含む断片が形成されることを開示している。
ターゲット配列に非相補的な５’テール区域を持つプローブが５’ヌクレアーゼによって切断されて５’テール区域を含む断片が放出されるいくつかの方法が報告された。
例えば、特許文献４は、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断される切断構造を開示している。鋳型に対して非相補的な５’部位及び鋳型に対して相補的な３’部位を含むオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリダイゼーションされ、上流オリゴヌクレオチドは非常に近接して鋳型にハイブリダイゼーションされる切断構造が例示されている。切断構造は５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ又は減少された合成活性を持つ変形ＤＮＡポリメラーゼによって切断されて、鋳型に非相補的な５’部位が放出される。その後、放出された５’部位はヘアピン構造を持つオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションされて切断構造を形成し、これによって漸進的な切断反応が誘導されてターゲット配列が検出される。
特許文献５は、３’末端がブロッキングされた上流オリゴヌクレオチドを持つ切断構造が、５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼによって切断されて非相補的な５’フラップ（ｆｌａｐ）部位が放出され、放出された５’フラップ部位は大きさの分析又は相互作用的な二重標識によって検出される過程を開示している。特許文献６は、検出可能な放出されたフラップが核酸合成依存的な、フラップ媒介連続的な増幅方法によって生成されることを開示している。この方法において、一番目の切断構造から放出されたフラップは、核酸合成依存的な方式で二番目の切断構造を切断して、二番目の切断構造からフラップを放出させ、放出されたフラップを検出する。
液相での蛍光標識プローブのハイブリダイゼーションによって、一種類の蛍光標識を用いても融解曲線分析によって多数のターゲット核酸配列を同時的に検出することができる。しかしながら、相互作用的な二重標識プローブの５’ヌクレアーゼ媒介切断によってターゲット配列を検出する従来の技術は、マルチプレックスターゲット検出で互いに異なるターゲット配列に対して互いに異なる種類の蛍光標識を要し、このような蛍光標識種類の数の限界のため、検出されるターゲット配列の数は制限される。
特許文献７は、ターゲット核酸配列に非相補的な５’部位を持つプローブの切断及びキャプチャ（ｃａｐｔｕｒｅ）プローブのハイブリダイゼーションを用いたターゲット検出方法を開示している。標識は非相補的な５’部位に位置する。ターゲット配列にハイブリダイゼーションされた標識プローブは切断されて断片を放出し、その後、断片はキャプチャープローブにハイブリダイゼーションされてターゲット配列の存在が検出される。この方法において、非切断された／無傷な（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ／ｉｎｔａｃｔ）プローブはキャプチャープローブにハイブリダイゼーションされないことが必須である。このためには、短い長さを持つキャプチャープローブが固相基質上に固定化されなければならない。しかしながら、このような制限は固相基質でのハイブリダイゼーションの効率性を低くし、また反応条件の最適化も難しくする。
したがって、より便利で、信頼性及び再現性のある方式で、ハイブリダイゼーションだけでなく、５’核酸分解切断反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のような酵素的反応によって液相及び固相でターゲット配列、より好ましくは複数のターゲット配列を検出するための新規な接近法に対する開発要求が浮上している。さらに、当業界で標識（特に、蛍光標識）の種類の数に制限されない新規なターゲット検出方法が要求されている。
したがって、従来の技術の短所を克服し、かつ、より便利で信頼でき、再現可能な方式でターゲット核酸配列を検出できる方法に対する開発要求が続いている。
本明細書の全体にかけて多数の引用文献及び特許文献が参照されてその引用が表示されている。引用された文献及び特許の開示内容はその全体が本明細書に参照により組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
米国特許第５，２１０，０１５号 米国特許第５，５３８，８４８号 米国特許第６，３２６，１４５号 米国特許第５，６９１，１４２号 米国特許第７，３８１，５３２号 米国特許第６，８９３，８１９号 米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号
本発明者らは、より改善した正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発すべく鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコルを定立し、この新規なプロトコルによれば、ターゲット検出はプローブのハイブリダイゼーションだけでなく、５’核酸分解切断反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）及び伸長などの酵素的な反応と伸長反応依存的なハイブリダイゼーション反応とを含む。本発明のプロトコルは固相反応だけでなく、液相反応でもよく適用され、より改善した正確性及び便宜性を持って複数のターゲット配列が検出されるようにする。
したがって、本発明の目的は、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列をＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いて検出する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、ＰＣＥ−ＳＨを用いてＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記の実施例、請求の範囲及び図面によってより明らかにされる。
本発明の一様態によれば、本発明は、次のステップを含むＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列をＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いて検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列を、上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、並びにプロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記ＰＴＯの５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ＰＴＯより上流に位置し；
（ｂ） 上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素にステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、上記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記酵素による上記ＰＴＯの切断を誘導して、上記５’タギング部位を含むか又はそれの一部を含む断片を放出し；
（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とキャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、上記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された断片は上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び上記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長されて上記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて伸長二重体を形成し、
（ｅ） 上記伸長鎖とＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、上記ＳＯは上記伸長鎖に相補的な配列を含み、少なくとも１つの標識が結合されており；上記ＳＯは上記伸長鎖とハイブリダイゼーションして検出可能なシグナルを提供し；及び
（ｆ） 上記シグナルを検出するステップであって、上記シグナルの検出は上記伸長鎖の存在を示し、上記伸長鎖の存在は上記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明者らは、より改善した正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発すべく鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコルを定立し、この新規なプロトコルによれば、ターゲット検出はプローブのハイブリダイゼーションだけでなく、５’核酸分解切断反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）及び伸長などの酵素的反応と伸長反応依存的なハイブリダイゼーション反応とを含む。本発明のプロトコルは固相反応だけでなく液相反応でもよく適用され、より改善した正確性及び便宜性を持って複数のターゲット配列が検出されるようにする。
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次のとおりである：
（ａ） 本発明は、ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションしてターゲットシグナルを提供するプローブを使用しない。興味深いことは、本発明は、ターゲット依存的な方式（ｔａｒｇｅｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ）で形成される伸長鎖とハイブリダイゼーションするプローブ（シグナリングオリゴヌクレオチド）を用い、上記伸長鎖は人為的に選択された配列を持つＣＴＯをテンプレートとして合成される。本発明は、１次でターゲット核酸配列を探知するＰＴＯを使用し、２次でターゲット依存的な伸長鎖とハイブリダイゼーションしてシグナルを提供するＳＯを使用するので、特異度を極大化することができ、ターゲット核酸配列と無関係にシグナル発生条件を調節することができて反応条件の設定が容易である。このような特徴は、多様な様相を持つ臨床サンプルで同時多重ターゲットの検出時に、シグナル反応条件を容易に設定し偽陽性シグナルを防止できるようにする。
（ｂ） ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションするプローブを用いる従来の技術において、プローブはターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションしながらターゲット核酸配列の相補的な配列と競争しなければならない。しかしながら、本発明においては、テンプレートであるＣＴＯの量を調節して伸長鎖のみを増幅させることができるので、プローブの効率的なハイブリダイゼーションが可能であり、結局、効果的にターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを得ることができる。
（ｃ） 本発明は、リアルタイムでターゲット核酸配列の存在を検出できるだけでなく、融解曲線分析を通じてターゲット核酸配列の存在を検出することができる。
（ｄ） 伸長鎖とＳＯとのハイブリダイゼーション結果物のＴｍ値はＳＯの配列及び／又は長さによって調節されることができるので、上記ハイブリダイゼーション結果物のＴｍ値は任意に予め決定（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）することができる。このような特徴を利用すれば、（ｉ）本発明は、所定のＴｍ値以外の温度で発生するシグナルは偽陽性シグナルであるので、偽陽性シグナルを区別してターゲット核酸配列を検出することができる。（ｉｉ）上記ハイブリダイゼーション結果物に対するＴｍ値の任意の決定は、少なくとも２種以上のターゲット核酸配列に対するマルチプレックス検出においてより有利である。
（ｅ）プローブ及びターゲット核酸配列のハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）に対する従来の融解曲線分析でのＴｍ値は、ターゲット核酸配列上の配列変異によって影響される。これに対し、本発明において伸長鎖はターゲット核酸配列上の変異配列に関らず一定のＴｍ値を持つため、融解曲線分析で優れた正確度を示す。
（ｆ）ＰＴＯの５’タギング部位、ＣＴＯ及びＳＯの配列はターゲット核酸配列を考慮せずに選択されることができる。よって、ＰＴＯの５’タギング部位、ＣＴＯ及びＳＯに対する配列プールを予めデザインすることができる。ＰＴＯの３’ターゲッティング部位はターゲット核酸配列を考慮して製造すべきであるが、ＣＴＯ及びＳＯの場合は、ターゲット核酸配列の情報又は考慮なしで既存（ｒｅａｄｙ−ｍａｄｅ）の方式で製造することができる。
（ｇ）本発明は、多様な従来の標識されたプローブを適用してターゲット核酸配列を検出することができる。
（ｈ）伸長鎖及びＳＯのハイブリダイゼーション結果物がそれぞれ異なるＴｍ値を持つ場合、同一の蛍光特性のシグナルを提供する標識方法を使用しても、融解曲線分析を通じて同時に少なくとも２種のターゲット核酸配列に対する多重ターゲット核酸配列の検出が可能である。このような長所は、マルチプレックスリアルタイム検出で検出可能な蛍光標識の数の制限によるマルチプレックスの実現の限界を克服することができる。
ＰＣＥ−ＳＨ（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）アッセイで用いられるＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｅｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の図式的構造を示す。好ましくは、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯの３’末端は伸長されることを防止するためにブロッキングされる。 鎖内の相互作用的な二重標識を用いるＰＣＥ−ＳＨアッセイを図式的に示す。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。 単一標識を用いるＰＣＥ−ＳＨアッセイを図式的に示す。ＳＯは単一標識としてレポーター分子を持つ。レポーター分子は一本鎖形態又は二本鎖形態に存在するかによって異なるシグナル強度を示さなければならない。 鎖間の相互作用的な二重標識及び二つのＳＯを用いるＰＣＥ−ＳＨアッセイを図式的に示す。２つのＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうちいずれか１つの標識をそれぞれ含む。 鎖間の相互作用的な二重標識を用いるＰＣＥ−ＳＨアッセイを図式的に示す。ＳＯはレポーター分子を含み、伸長鎖はクエンチャー分子を含む。 鎖間の相互作用的な二重標識を用いるＰＣＥ−ＳＨアッセイを図式的に示す。ＳＯはレポーター分子を含み、伸長鎖は伸長反応中に挿入されるクエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧ残基を含む。 鎖間の相互作用的な二重標識を用いるＰＣＥ−ＳＨアッセイを図式的に示す。ＳＯはレポーター分子を含み、伸長鎖は伸長反応中に挿入されるクエンチャー−ｄＡ残基を含む。 インターカレーティング色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅｓ）を用いるＰＣＥ−ＳＨアッセイを図式的に示す。ＳＯはアクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）を含み、ＳＹＢＲグリーンはドナー（ｄｏｎｏｒ）として用いられる。 ヌクレオチド変異を検出するためのＰＣＥ−ＳＨアッセイを図式的に示す。 ＰＣＥ−ＳＨアッセイを通じてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの遺伝子をリアルタイム検出した結果である。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。 融解分析ステップを含むＰＣＥ−ＳＨアッセイを通じてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの遺伝子を検出した結果である。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。 ＰＣＲ増幅と共にＰＣＥ−ＳＨアッセイを用いてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの遺伝子をリアルタイム検出した結果である。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。 ポストＰＣＲ融解分析ステップを含むＰＣＥ−ＳＨアッセイを通じてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの遺伝子を検出した結果である。ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。 ポストＰＣＲ融解分析ステップを含むＰＣＥ−ＳＨアッセイを通じてターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異を検出した結果である。ＭＴＨＦＲ（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子でＣ６７７Ｔ突然変異が検出された。 上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を用いたＰＣＥ−ＳＨアッセイを通じてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの遺伝子をリアルタイム検出した結果である。 上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を用いた融解分析ステップを含むＰＣＥ−ＳＨアッセイを通じてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの遺伝子を検出した結果である。
本発明は、プローブハイブリダイゼーションによって発生するイベント、すなわちＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の切断と伸長反応及び伸長反応依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション反応を用いて行われ、そこで、「ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）分析」と命名される。
本発明をそれぞれのステップ別に詳細に説明すれば、次のとおりである：
ステップ（ａ）：ターゲット核酸配列と上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びＰＴＯとのハイブリダイゼーション
本発明の方法によれば、まず、上記ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションさせる。
本明細書において用語「ターゲット核酸」、「ターゲット核酸配列」又は「ターゲット配列」は、最終的に検出しようとする配列を意味し、特定のハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅条件でプライマー又はプローブとアニーリング又はハイブリダイゼーションされる。
本明細書において使用される用語「プローブ」は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位又は部位を含む一本鎖の核酸分子である。
本明細書において使用される用語「プライマー」とは、オリゴヌクレオチドを意味するものであって、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、すなわち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在、そして好適な温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用することができる。
好ましくは、プローブ及びプライマーは、デオキシリボヌクレオチドであり、一本鎖である。本発明において用いられるプローブ又はプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰｓ（すなわち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含むことができる。また、プローブ又はプライマーはリボヌクレオチドも含むことができる。
プライマーは重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができる程度の長さを持たなければならない。プライマーの好適な長さは、多数の要素、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）によって決定される。用語「アニーリング」又は「プライミング」は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチド又は核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、上記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて鋳型核酸又はそれの一部分に相補的な核酸分子を形成させる。
本明細書において用語「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」とは、相補的な一本鎖の核酸が二本鎖の核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、２本の核酸鎖間の相補性が完全な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）に起こるか、一部のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こることができる。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、ハイブリダイゼーションの反応条件によって変わることができ、特に温度によって調節されることができる。
上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションは、最適化の手順によって通常決定される好適なハイブリダイゼーションの条件下で行われることができる。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄回数、緩衝液の成分及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、オリゴヌクレオチド（上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ）の長さ及びＧＣ量及びターゲットヌクレオチド配列を含んだ多様な因子によって変わり得る。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドを用いる場合、低い厳しい条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を選択することが好ましい。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）； 及びＭ．Ｌ．Ｍ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．（１９９９）から確認することができる。
用語「アニーリング」と「ハイブリダイゼーション」とは違いがなく、本明細書において混用される。
本発明において用いられるＰＴＯ及び上流オリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む。用語「相補的」とは、所定のアニーリング又は厳しい条件の下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションする程度に充分に相補的であることを意味し、「実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」及び「完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」であることをいずれも包括する意味を有し、好ましくは完全に相補的であることを意味する。
本発明において用いられるＰＴＯの５’タギング部位は、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む。ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のテンプレーティング部位はＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含む。用語「非相補的」とは、所定のアニーリング又は厳しい条件の下でプライマー又はプローブが特定配列に選択的にハイブリダイゼーションされない程度に充分に非相補的であることを意味し、「実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」及び「完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」であることをいずれも包括する意味を有し、好ましくは完全に非相補的であることを意味する。
例えば、ＰＴＯの５’タギング部位を言及しながら使用される用語「非相補的」とは、所定のアニーリング又は厳しい条件の下で上記５’タギング部位がターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションされない程度に充分に非相補的であることを意味し、「実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」及び「完全に非相補的 （ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」であることをいずれも包括する意味を有し、好ましくは完全に非相補的であることを意味する。
本発明において採択される用語「プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）」は、（ｉ）プローブの役割をする３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーション後に後続的にＰＴＯから解離される５’タギング部位を含むオリゴヌクレオチドを意味する。上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位は、必ず５’→３’の順序で位置する。ＰＴＯは図１に例示されている。
好ましくは、３’ターゲッティング部位はターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、５’タギング部位はターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされない厳しい条件の下でステップ（ａ）のハイブリダイゼーションが行われる。
ＰＴＯは特定の長さを要求しない。例えば、ＰＴＯは、１５〜１５０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、２０〜１５０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、３０〜１５０ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、３０〜８０ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、３５〜１００ヌクレオチド、３５〜８０ヌクレオチド、３５〜６０ヌクレオチド、又は３５〜５０ヌクレオチドの長さを持つことができる。ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は、ターゲット配列に特異的に結合することができる限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は１０〜１００ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド又は２０〜３０ヌクレオチドの長さを持つことができる。ＰＴＯの５’タギング部位は、キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）のテンプレーティング部位に特異的に結合して伸長されることができる限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＰＴＯの５’タギング部位は、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド又は１５〜２０ヌクレオチドの長さを持つことができる。
ＰＴＯの３’末端は３’−ＯＨ ターミナル（ｔｅｒｍｉｎａｌ）を持つこともできる。好ましくは、 ＰＴＯの３’末端は「ブロッキング」されてそれの伸長が防止される。
ブロッキングは、従来の方法によって達成されることができる。例えば、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にビオチン、標識、リン酸基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート又はアルカンジオール残基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して行うことができる。または、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか又はジデオキシヌクレオチドのように３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを用いて行うことができる。
または、ＰＴＯはヘアピン構造を持つようにデザインされることができる。
本発明において、上記ＰＴＯの５’タギング部位がターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされないということは、与えられたハイブリダイゼーション条件で上記ＰＴＯの５’タギング部位がターゲット核酸配列と安定的な二本鎖を形成しないということを意味する。本発明の好ましい一実現例によれば、上記ＰＴＯの５’タギング部位がターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされずに一本鎖を形成する。
上流オリゴヌクレオチドはＰＴＯの上流に位置する。
また、ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされた上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
上流オリゴヌクレオチドによるＰＴＯ切断の誘導は、２つの方式で達成されることができる：（ｉ）上流オリゴヌクレオチド伸長独立的な切断の誘導；及び（ｉｉ）上流オリゴヌクレオチド伸長依存的な切断の誘導。
上流オリゴヌクレオチドが５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によって、上記ＰＴＯの切断反応を誘導する程度にＰＴＯに近接している場合、上流オリゴヌクレオチドに結合した上記酵素は伸長反応がなくてもＰＴＯを切断する。一方、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯから離隔している場合、ポリメラーゼ活性を持つ酵素（例えば、鋳型依存的なポリメラーゼ）は、上流オリゴヌクレオチド（例えば、上流プライマー）の伸長を促進させ、伸長産物に結合された５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素はＰＴＯを切断する。
したがって、上流オリゴヌクレオチドは２つの方式でＰＴＯに対して相対的に位置することができる。上流オリゴヌクレオチドは、伸長独立的な方式でＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯに近接した位置に位置することができる。または、上流オリゴヌクレオチドは、伸長依存的な方式でＰＴＯ切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯから離隔した位置に位置することができる。
本明細書において地点（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）又は位置（ｌｏｃａｔｉｏｎｓ）を言及しながら使用される用語「近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）」とは、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’ターゲッティング部位のすぐ近くに位置して切れ目（ｎｉｃｋ）を形成することを意味する。また、上記用語は、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’ターゲッティング部位から１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド又は１〜１５ヌクレオチド離隔して位置することを意味する。
本明細書において地点又は位置を言及しながら使用される用語「離隔（ｄｉｓｔａｎｔ）」とは、伸長反応が起こるのに十分な程度のある位置又は場所を含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは、伸長依存的な方式でＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯから離隔して位置することができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは上流プライマー又は上流プローブである。上流プライマーは伸長独立的な切断の誘導又は伸長依存的な切断に適しており、上流プローブは伸長独立的な切断の誘導に適している。
または、上流オリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’の一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を持つことができる。好ましくは、重なる配列は１〜１０ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは１〜５ヌクレオチド、さらに好ましくは１〜３ヌクレオチドである。上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’の一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を持つ場合、ステップ（ｂ）の切断反応で３’ターゲッティング部位は５’タギング部位とともに部分的に切断される。また、重なる配列は３’ターゲッティング部位の所望の特定位置が切断されるようにする。
本発明の好ましい一実現例によれば、上流プライマーはそれの伸長鎖によって５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記酵素による上記ＰＴＯの切断反応を誘導する。
上流オリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断を誘導してＰＴＯの５’タギング部位又はＰＴＯの５’タギング部位の一部を含む断片が放出される限り、上流オリゴヌクレオチドによる切断反応に係る従来の技術は、本発明に適用されることができる。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、第７，３８１，５３２号及び米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号は本発明に応用することができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記方法は、下流プライマーの存在下で行う。下流プライマーは、ＰＴＯがハイブリダイゼーションされることができるターゲット核酸配列を追加で生成させて本発明の検出敏感度を向上する。
本発明の好ましい一実現例によれば、上流プライマー及び下流プライマーを使用する場合、上記プライマーの伸長のために鋳型依存的なポリメラーゼをさらに使用する。
本発明の好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチド（上流プライマー又は上流プローブ）、下流プライマー及び／又はＰＴＯの５’タギング部位は、本発明者によって開発された二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する。ＤＰＯ構造を有するオリゴヌクレオチドは、従来のプライマー及びプローブに比べてかなり改善したターゲット特異度を示す（参照 ＷＯ２００６／０９５９８１； Ｃｈｕｎなど、Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３５：６ｅ４０（２００７））。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は、本発明者によって開発された変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する。変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造は、従来のプローブに比べてかなり改善したターゲット特異性を示す（参照 ＷＯ２０１１／０２８０４１）。
ステップ（ｂ）：ＰＴＯからの断片の放出
次に、ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させる。上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされた上記ＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記酵素によって切断されて上記ＰＴＯの５’タギング部位を含むか又はそれの一部を含む断片を放出する。
本明細書において使用される用語「ＰＴＯの切断のための条件」とは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によってターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断が発生するのに十分な条件、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、緩衝液、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、そして酵素を意味する。例えば、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素としてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが用いられる場合、ＰＴＯの切断のための条件はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２及び温度を含む。
ＰＴＯがターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位はターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされるが、５’タギング部位はターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされずに一本鎖を形成する（参照：図２）。このように、一本鎖及び二本鎖の構造いずれを含むオリゴヌクレオチドは、当業界に知られている多様な技術によって５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素を用いて切断されることができる。
ＰＴＯの切断位置は、上流オリゴヌクレオチド（上流プローブ又は上流プライマー）の種類、上流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション位置及び切断条件によって多様になる（参照 米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号及び第７，３８１，５３２号又は米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号）。
本発明は、ＰＴＯの切断のために従来に知られている多様な方法を使用することができ、５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出する。
総合すれば、ステップ（ｂ）の切断反応で３つの切断位置があり得る。第一の切断位置は、ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’ターゲッティング部位）及び非ハイブリダイゼーション部位（５’タギング部位）間の結合位置（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）である。第二の切断位置は、ＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’の方向に一部ヌクレオチド離隔した位置である。第二の切断位置は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部（５’ｅｎｄ ｐａｒｔ）に位置することができる。第三の切断位置は、ＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から５’の方向に一部ヌクレオチド離隔した位置である。
本発明の好ましい一実現例によれば、上流プライマーが伸長されながら５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なポリメラーゼによってＰＴＯの切断が開始される位置は、ＰＴＯ及びターゲット核酸配列間の二本鎖が開始される地点又はその開始地点から１〜３ヌクレオチド離隔した位置である。
したがって、本明細書において、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯの切断を言及しながら使用される用語「ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片」は、（ｉ）５’タギング部位、（ｉｉ）５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部及び（ｉｉｉ）５’タギング部位の一部を含む意味で使用される。また、本明細書において用語「ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片」は、「ＰＴＯ断片」と表現される。
本明細書においてＰＴＯの５’タギング部位の一部、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部及びＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のように、ＰＴＯ又はＣＴＯを言及しながら使用される用語「一部（ｐａｒｔ）」とは、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０又は１〜５ヌクレオチドで構成されたヌクレオチド配列を意味し、好ましくは１、２、３又は４ヌクレオチドである。
本明細書の好ましい一実現例によれば、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素は５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼであり、より好ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼである。
本発明の好適な５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼは、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ， Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ， Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。最も好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼである。
または、５’ヌクレアーゼ活性は持つが、重合活性は減少するように変形されたＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
使用されるＦＥＮ（ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ヌクレアーゼは、５’フラップ特異的なヌクレアーゼ（５’ｆｌａｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ）である。
本発明に好適なＦＥＮヌクレアーゼは多様なバクテリア鐘から得たＦＥＮ ヌクレアーゼを含み、これは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ， Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ， Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ， Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｂｒｉｅｒｌｙｉ， Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ， Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ， Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ， Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ， Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｇｎｅｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ 及びＡｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓを含む。
ステップ（ａ）で上流プライマーを用いて行う場合、上記ＰＴＯの切断のための条件は上流プライマーの伸長反応を含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、ステップ（ａ）で上記上流プライマーを用い、上記上流プライマーを伸長するために鋳型依存的なポリメラーゼを使用する。上記鋳型依存的なポリメラーゼは、上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素と同一か異なる酵素であってもよい。
または、ステップ（ａ）で上流プライマーを用い、上記上流プライマーを伸長するために鋳型依存的なポリメラーゼを使用し、上記鋳型依存的なポリメラーゼは上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素と互いに異なる酵素である。
ステップ（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーション
上記ＰＴＯから放出された断片は、キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とハイブリダイゼーションされる。
ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含む。
ＣＴＯはＰＴＯから放出された断片の伸長のための鋳型の役割をする。上記断片はプライマーとしてＣＴＯにハイブリダイゼーションされ、伸長されて二重体を形成する。
テンプレーティング部位はＰＴＯの５’タギング部位と３’ターゲッティング部位に非相補的な配列を持つ限り、いずれの配列でも含むことができる。また、テンプレーティング部位は、ＰＴＯから放出された断片の伸長のためのテンプレート機能ができる限り、いずれの配列でも含むことができる。
上述したように、ＰＴＯの５’タギング部位を持つ断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが好ましい。５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を持つ断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが好ましい。ＰＴＯの５’タギング部位の一部を持つ断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが好ましい。
一方、ＰＴＯの切断位置を予想することでＣＴＯのキャプチャリング部位をデザインすることができる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位が５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインする場合、５’タギング部位の一部を持つ断片又は５’タギング部位を持つ断片はキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされることができ、その後、伸長される。５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む断片が放出される場合、上記断片は５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされたＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされることができ、上記断片の３’末端部位にミスマッチヌクレオチドが存在するにもかかわらず、成功的に伸長されることができる。これはプライマーの３’末端が一部のミスマッチヌクレオチド（例えば、１〜３ミスマッチヌクレオチド）を含むにもかかわらず、プライマーが反応条件によって伸長されることができるからだ。
５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部は上記切断された３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を持つようにデザインすることで、ミスマッチヌクレオチドに係る問題を解決することができる（参照：図１）。
好ましくは、切断された３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のヌクレオチド配列は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位上の予想される切断位置によって選択されることができる。切断された３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のヌクレオチド配列は１〜１０ヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは１〜５ヌクレオチド、さらに好ましくは１〜３ヌクレオチドである。
ＣＴＯの３’末端は断片とのハイブリダイゼーションに含まれない追加的なヌクレオチドを含むことができる。また、ＣＴＯが上記断片と安定してハイブリダイゼーションされる限り、ＣＴＯのキャプチャリング部位は上記断片の一部（例えば、断片の３’末端部位を含む断片の一部）にのみ相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。
本明細書において使用される用語「５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位」は、上述したようにＣＴＯのキャプチャリング部位の多様なデザイン及び構成を含んで説明する。
ＣＴＯは、ヘアピン構造を持つようにデザインされることができる。
ＣＴＯの長さは多様であってもよい。例えば、ＣＴＯは、７〜１０００ヌクレオチド、７〜５００ヌクレオチド、７〜３００ヌクレオチド、７〜１００ヌクレオチド、７〜８０ヌクレオチド、７〜６０ヌクレオチド、７〜４０ヌクレオチド、１５〜１０００ヌクレオチド、１５〜５００ヌクレオチド、１５〜３００ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、２０〜１０００ヌクレオチド、２０〜５００ヌクレオチド、２０〜３００ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、３０〜１０００ヌクレオチド、３０〜５００ヌクレオチド、３０〜３００ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、３０〜８０ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド又は３０〜４０ヌクレオチドの長さを持つことができる。ＣＴＯのキャプチャリング部位は、ＰＴＯから放出された断片に特異的にハイブリダイゼーションされる限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５〜１００ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド又は１５〜２０ヌクレオチドの長さを持つことができる。また、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＰＴＯからの放出断片の伸長反応でテンプレートの機能ができる限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、１〜９００ヌクレオチド、１〜４００ヌクレオチド、１〜３００ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜８０ヌクレオチド、１〜６０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、２〜９００ヌクレオチド、２〜４００ヌクレオチド、２〜３００ヌクレオチド、２〜１００ヌクレオチド、２〜８０ヌクレオチド、２〜６０ヌクレオチド、２〜４０ヌクレオチド、２〜２０ヌクレオチド、５〜９００ヌクレオチド、５〜４００ヌクレオチド、５〜３００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜８０ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、１０〜９００ヌクレオチド、１０〜４００ヌクレオチド、１０〜３００ヌクレオチド、１５〜９００ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド又は１５〜２０ヌクレオチドの長さを持つことができる。
ＣＴＯの３’末端は３’−ＯＨターミナルを持つことができる。好ましくは、ＣＴＯの３’末端はそれの伸長が防止されるようにブロッキングされる。ＣＴＯの非伸長ブロッキングは従来の方法によって達成されることができる。例えば、ブロッキングはＣＴＯの最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にビオチン、標識、リン酸基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート又はアルカンジオール残基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して行うことができる。または、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか又はジデオキシヌクレオチドのように３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを用いて行うことができる。
ＰＴＯから放出された断片はＣＴＯとハイブリダイゼーションされ、断片の伸長に適した形態を提供する。また、非切断ＰＴＯがそれの５’タギング部位を通じてＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされても、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位はＣＴＯにハイブリダイゼーションされず、伸長二重体の形成が防止される。
ステップ（ｃ）でのハイブリダイゼーションは、ステップ（ａ）でのハイブリダイゼーションに関する説明を参照して詳細に説明されることができる。
ステップ（ｄ）：断片の伸長
次に、鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及びステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行う。上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長され、上記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて、伸長二重体を形成する。一方、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた非切断ＰＴＯは伸長されず、伸長鎖を形成しない。
本明細書において使用される用語「伸長二重体」とは、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた断片が鋳型依存的な核酸ポリメラーゼとＣＴＯのテンプレーティング部位を鋳型として用いて伸長される伸長反応によって形成された二重体を意味する。
本明細書において用語「断片」を言及しながら使用される用語「伸長鎖（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ）」は、断片とこれの伸長配列を含む意図で使用された用語である。
本明細書において「用語断片」を言及しながら使用される用語「伸長配列（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、伸長鎖で断片を除いた新しく伸長された配列のみを指し示す意図で使用された用語である。
ステップ（ｄ）で用いられる鋳型依存的な核酸ポリメラーゼはいずれの核酸ポリメラーゼも含まれ、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩの「クレノウ」断片、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましくは、ポリメラーゼは多様なバクテリア鐘から得ることができる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ， Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ 及び Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ， Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ ａｎｄ Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。最も好ましくは、鋳型依存的な核酸ポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼである。
本発明の好ましい一実現例によれば、鋳型依存的な核酸ポリメラーゼは逆転写酵素を含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、ステップ（ｂ）で用いられる５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素と、ステップ（ｄ）の鋳型依存的な核酸ポリメラーゼとは同一の酵素である。より好ましくは、ステップ（ｂ）で用いられる５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素、上流プライマーを伸張するための鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及びステップ（ｄ）の鋳型依存的な核酸ポリメラーゼは、同一の酵素である。
ステップ（ｅ）：伸長鎖とＳＯとのハイブリダイゼーションによるシグナル生成
上記伸長反応に続き、上記ステップ（ｄ）の伸長鎖とＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせる。ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが生成される。シグナルはシグナルの生成又は消滅、又はシグナルの変化（シグナル増加又は減少）を含む。
伸長鎖にハイブリダイゼーションされるＳＯは、上記伸長鎖に相補的な配列を含む。
ＳＯがＰＴＯ断片に該当する部位にのみ相補的な配列を含む場合、下記のシグナリング方法のうち一部の方法では、非切断ＰＴＯとＳＯとのハイブリッドの生成による非ターゲットシグナルが生成されないこともある。
図６に示されるように、伸長鎖に挿入される標識の位置が適宜調節される場合、ＰＴＯ断片にのみ相補的な配列を含む上記ＳＯを使用しても非ターゲットシグナルは生成されないこともある。
一方、ＳＯがＰＴＯ断片にのみ相補的な配列を含む場合、下記のシグナリング方法のうち一部の方法では、非切断ＰＴＯ及び上記ＳＯのハイブリダイゼーションのため非ターゲットシグナルが生成されることができる（例えば、図２のシグナリングシステム）。
非ターゲットシグナルが問題になる場合、ＳＯ部位は新たに合成される伸長配列部位に相補的な配列を含むようにデザインされなければならない。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記ＳＯは上記伸長配列に相補的な配列を含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯの少なくとも一部位は伸長配列に相補的な配列を含む。上記伸長配列に相補的な配列を含むＳＯ部位のヌクレオチドの長さは、少なくとも１、２、３、４、５又は１０個である。
ＳＯ部位が新しく生成された伸長配列の一部と相補的な配列を含むようにデザインすれば、ＳＯと伸長鎖とのハイブリッドのＴｍ値とＳＯと非切断ＰＴＯとのハイブリッドのＴｍ値とは異なる。上記Ｔｍ値の差は、上記２つのハイブリッドから提供されるシグナルを区別できるようにする。例えば、リアルタイム検出時には上記Ｔｍ値を考慮して検出温度を調節して非ターゲットシグナルを除去することができ、又は融解ピーク（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｅａｋ）による融解曲線分析で非ターゲットシグナルを除去することができる。
好ましくは、ＳＯはそれの配列全体的に上記伸長配列に相補的な配列を含む。または、ＳＯは伸長配列に相補的な配列を持つ部位を含むことができる。例えば、ＳＯの一部位は伸長配列に相補的な配列を含み、他の部位は上記断片に相補的な配列を含むことができる。
好ましくは、ＳＯはその配列全体的に上記伸長配列に相補的な配列を含む。
本発明において用いられるＳＯの長さはいずれの長さであってもよい。例えば、５〜１００ヌクレオチド、５〜８０ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド又は２０〜３０ヌクレオチドの長さを持つことができる。
ＳＯはヘアピン構造を持つようにデザインされることができる。
好ましくは、ＳＯは伸長されないようにそれの３’末端がブロッキングされている。
または、ブロッキングされていない−ＯＨ基を有するＳＯは伸長されることができる。
本発明において採択されたシグナリングシステムは、ＳＯのハイブリダイゼーション反応とシグナル生成が関連付けられるようにしたことに特徴がある。すなわち、ＳＯと伸長鎖とがハイブリダイゼーションされると、検出可能なシグナルが提供される。ＳＯと伸長鎖とのハイブリダイゼーション反応は、ターゲット核酸配列が存在してＰＴＯが切断される場合にのみ発生する。そのため、検出可能なシグナルはターゲット核酸配列の存在を示す。よって、要求に応じて、本発明はリアルタイム方式で行うことができる。
ＳＯのハイブリダイゼーション反応とシグナル提供とを直接的に関連付けるために、本発明はＳＯに結合された少なくとも１つの標識を用いる。
本発明の好ましい一実現例によれば、ターゲット核酸配列の存在を示す検出可能なシグナルは、（ｉ）上記ＳＯに結合されている標識、（ｉｉ）上記ＳＯに結合されている標識及びＰＴＯから放出された断片に結合された標識、（ｉｉｉ）上記ＳＯに結合されている標識及びステップ（ｄ）の伸長反応中に上記伸長鎖に挿入される標識又は（ｉｖ）上記ＳＯに結合されている標識及びインターカレーティング色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅｓ）から提供される。
本発明において使用された標識システムは、次のように詳細に記載されることができる：
（ｉ） ＳＯに結合された単一標識
本発明は、単一標識を用いてターゲット核酸配列の存在を示す伸長鎖の形成に対するシグナルを提供することができる（参照：図３）。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯは単一標識が結合されており、上記ステップ（ｅ）で上記ＳＯと上記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、上記単一標識からのシグナルの変化をもたらして上記検出可能なシグナルを提供する。
上記単一標識は、標識が結合されている核酸配列が一本鎖の場合と二本鎖の場合とで互いに異なるシグナルを提供する。上記単一標識は蛍光標識、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識、電気化学的（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）標識及び金属標識を含む。
好ましくは、上記単一標識は、標識が結合されている核酸配列が一本鎖なのか又は二本鎖なのかによって互いに異なる強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の蛍光を提供する。
図３は、単一標識を用いた本発明の好ましい実現例を例示する。図３に示すように、伸長鎖にハイブリダイゼーションされたＳＯに結合された単一標識は、ハイブリダイゼーションされていないＳＯに結合された標識よりも高い蛍光を示す。
単一蛍光標識の蛍光強度の変化（増加又は減少）を測定してターゲット核酸配列の存在を検出する。
本発明において使用される単一蛍光標識の種類及び好ましい結合位置は、米国特許第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号に開示された内容を参照することができる。好ましくは、上記単一蛍光標識は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ及びフルオレセイン基盤標識（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｌａｂｅｌ）を含む。標識されたヌクレオチド残基は、好ましくは５’末端又は３’末端よりも上記オリゴヌクレオチド内部のヌクレオチド残基に位置する。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記ＳＯ上の単一標識は、５’末端又は３’末端から１〜１５ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド又は１〜５ヌクレオチド離隔した位置にあり、より好ましくはＳＯの中央部位に位置する。
本発明において使用された単一蛍光標識は、下記のレポーター分子及びクエンチャー分子に関する文献によって説明されることができる。
（ｉｉ） ＳＯ鎖内（ｉｎｔｒａｓｔｒａｎｄ）の相互作用的な二重標識
相互作用的な標識システムは、ドナー分子及びアクセプター分子間でエネルギーが非放射性（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｌｙ）方式で伝達されるシグナル発生システム（ｓｉｇｎａｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を意味する。相互作用的な標識システムの代表的な例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（ドナー分子）及びクエンチャー分子（アクセプター分子）を含む。ＦＲＥＴで、エネルギー供与体は蛍光性であるが、エネルギー受容体は蛍光性又は非蛍光性であってもよい。相互作用的な標識システムの他の例において、エネルギー供与体は非蛍光性、例えば発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体が蛍光性である。相互作用的な標識システムのまた他の例において、エネルギー供与体は発光性、例えば生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）、電気化学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）であり、エネルギー受容体が蛍光性である。本発明においてドナー分子及びアクセプター分子は、それぞれ上述したレポーター分子及びクエンチャー分子であってもよい。
好ましくは、伸長鎖の生成を示すシグナル（すなわち、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナル）は相互作用的な標識システムによって発生され、より好ましくはＦＲＥＴ標識システム（すなわち、相互作用的な二重標識システム）によって発生される。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識が結合されており、ステップ（ｅ）でＳＯと伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、相互作用的な二重標識からのシグナルの変化をもたらして検出可能なシグナルを提供する。上記ＳＯがハイブリダイゼーションされる前には、上記ＳＯ上の上記レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）に互いに近接するようになって、上記クエンチャー分子が上記レポーター分子からのシグナルをクエンチングし、上記ＳＯがハイブリダイゼーションされれば、上記レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に離隔して上記クエンチャー分子が上記レポーター分子からのシグナルをクエンチングせず、相互作用的な二重標識からのシグナル変化をもたらす。
図２は、相互作用的な二重標識を使用した本発明の好ましい実現例を例示する。ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされたＰＴＯから放出された断片はＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ、伸長されて伸長鎖が生成される。伸長鎖とＳＯとがハイブリダイゼーションすると、ＳＯ上の上記クエンチャー分子が上記レポーター分子からのシグナルをクエンチングせず、上記相互作用的な二重標識からのシグナルの変化（例えば、レポーター分子からのシグナルの増加）をもたらす。一方、ターゲット核酸配列がない場合、ＰＴＯは切断されず、非切断ＰＴＯがＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされるが、伸長されない。ハイブリダイゼーションされていないＳＯに結合されているレポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に互いに近接するようになって、上記クエンチャー分子が上記レポーター分子からのシグナルをクエンチングする。
本明細書において使用される表現「レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に近接した」とは、断片又はＳＯの形態的構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、例えばランダムコイル（ｃｏｉｌ）及びヘアピン構造によってレポーター分子及びクエンチャー分子が三次元的に互いに隣接するようになることを意味する。
本明細書において用語「レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）に離隔」とは、ＳＯが伸長鎖とハイブリダイゼーションされて二本鎖が形成されながら、ＳＯの形態的構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の変化で上記レポーター分子及びクエンチャー分子が三次元的に離隔することを意味する。
本発明の好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子はＳＯの５’末端（又は３’末端）及び３’末端（又は５’末端）に位置する。本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯに結合されたレポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つは５’末端又は５’末端から１〜５ヌクレオチド離隔した位置に位置し、残りの１つはＳＯの形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によってレポーター分子のシグナルをクエンチングする及びクエンチングしない位置に位置する。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯに結合されたレポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つは３’末端又は３’末端から１〜５ヌクレオチド離隔した位置に位置し、残りの１つはＳＯの形態によってレポーター分子のシグナルをクエンチングする及びクエンチングしない位置に位置する。
本発明の好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子は互いに８０ヌクレオチド以内、より好ましくは６０ヌクレオチド以内、さらに好ましくは３０ヌクレオチド以内、更により好ましくは２５ヌクレオチド以内で離隔して位置する。本発明の好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子は少なくとも４ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド離隔する。
本発明において用いられるレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に公知されているいずれの分子でも含むことができる。上記蛍光標識の具体的な例は、次のとおりである：Ｃｙ２ＴＭ （５０６）， ＹＯ−ＰＲＯ ＴＭ −１ （５０９）， ＹＯＹＯ ＴＭ −１ （５０９）， Ｃａｌｃｅｉｎ （５１７）， ＦＩＴＣ （５１８）， ＦｌｕｏｒＸ ＴＭ （５１９）， Ａｌｅｘａ ＴＭ （５２０）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０ （５２０）， Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ＴＭ ５００ （５２２）， Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ＴＭ ４８８ （５２４）， ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＴＭ （５２５）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ ＴＭ （５２７）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３ （５２９）， Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ ＴＭ （５３１）， Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ ＴＭ （５３３）， ＴＯ−ＰＲＯ ＴＭ −１ （５３３）， ＴＯＴＯ１ （５３３）， ＪＯＥ （５４８）， ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０ （５５０）， Ｄｉｌ （５６５）， ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ （５６８）， ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８ （５６８）， ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０ （５７０）， Ｃｙ３ ＴＭ （５７０）， Ａｌｅｘａ ＴＭ ５４６ （５７０）， ＴＲＩＴＣ （５７２）， Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ ＴＭ （５７５）， Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ （５７５）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ （５７５）， Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ ＴＭ （５７６）， Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ （５８０）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ （５８０）， ＴＡＭＲＡ （５８２）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ ＴＭ （５９０）， Ｃｙ３．５ ＴＭ （５９６）， ＲＯＸ （６０８）， Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ ＴＭ （６１５）， Ａｌｅｘａ ＴＭ ５９４ （６１５）， Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）， Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ （６２８）， ＹＯ−ＰＲＯ ＴＭ −３ （６３１）， ＹＯＹＯ ＴＭ −３ （６３１）， Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （６４２）， Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （６４８）， ＴＯ−ＰＲＯ ＴＭ −３ （６６０）， ＴＯＴＯ３ （６６０）， ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５） （６６５）， Ｃｙ５ ＴＭ （６７０）， Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ （６７１）， Ｃｙ５．５ （６９４）， ＨＥＸ （５５６）， ＴＥＴ （５３６）， Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ （４４７）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０ （５４４）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０ （５５９）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０ （５９１）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０ （６１０）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５ （６３７）， ＦＡＭ （５２０）， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ （５２０）， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３ （５２０）， Ｐｕｌｓａｒ ６５０ （５６６）， Ｑｕａｓａｒ ５７０ （６６７）， Ｑｕａｓａｒ ６７０ （７０５） 及びＱｕａｓａｒ ７０５ （６１０）。カッコの数字はナノメートル単位で表示した発光最大波長である。好ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ又はフルオレセイン基盤標識（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｌａｂｅｌ）を含む。
好適なレポーター−クエンチャー対は多くの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｉｔｏｒｓ， ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．， ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７０）； Ｂｅｒｌｍａｎ， ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ， ２ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， ＣＯＬＯＵＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６）； Ｂｉｓｈｏｐ， ｅｄｉｔｏｒ， ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ （Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９７２）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， １９９２）； Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ， ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９４９）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒ． Ｐ．， ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ， Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．， １９９６； 米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。
本発明において広範囲な波長又は特定波長の蛍光をクエンチングすることができる非蛍光ブラッククエンチャー分子（又はダーククエンチャー分子）が使用されることができるということも注目に値する。例えば、ＢＨＱ及びＤＡＢＣＹＬがある。
ＳＯに適用されたＦＲＥＴ標識でレポーターはＦＲＥＴのドナーを含み、クエンチャーはＦＲＥＴの他のパートナー（アクセプター）を含む。例えば、フルオレセイン色素はレポーターとして使用され、ローダミン色素はクエンチャーとして使用される。
（ｉｉｉ） 鎖間（ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ）の相互作用的な二重標識
鎖間の相互作用的な二重標識を使用する実現例において、伸長鎖はレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうち１つを有し、クエンチャー分子及びＳＯは相互作用的な二重標識のうち残りの１つを有する。
鎖間の相互作用的な二重標識を使用する実現例は、次の３つの方式によって行われることができる：
第一の方式によれば、ＳＯは相互作用的な二重標識のレポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つの標識を含み、上記ＰＴＯから放出された断片は上記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち残りの１つの標識を含み、上記伸長鎖は上記ＰＴＯから放出された断片に由来する標識を含み；上記ＳＯと上記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、上記相互作用的な二重標識からのシグナルの変化をもたらして検出可能なシグナルを提供する（参照：図５）。
ＳＯに結合される標識はレポーター分子又はクエンチャー分子であってもよく、断片に結合された標識はクエンチャー分子又はレポーター分子であってもよい。
ＰＴＯの切断位置を考慮してＰＴＯ上の標識位置を決定することで、ＰＴＯ断片上に標識を存在させることができる。
ＳＯとのハイブリダイゼーションでＳＯに結合された標識と相互作用してシグナル変化を誘導する限り、標識はＰＴＯ断片のいずれの位置（例えば、ＰＴＯのタギング部位）にも結合することができる。ＰＴＯ断片とのハイブリダイゼーションでＰＴＯ断片に結合された標識と相互作用してシグナル変化を誘導する限り、標識はＳＯのいずれの位置（例えば、ＳＯの５’末端）にも結合することができる。
第二の方式によると、ＳＯは相互作用的な二重標識のレポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つの標識を含み、上記ＣＴＯのテンプレーティング部位は第１の非天然型塩基を有するヌクレオチドを含み、上記ステップ（ｄ）の伸長反応は上記第１の非天然型塩基と特異的な結合親和性を持つ第２の非天然型塩基及び上記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち残りの１つの標識を持つヌクレオチドの存在下で行われ、これによって上記伸長鎖に標識が挿入され；上記ＳＯと上記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、上記相互作用的な二重標識からのシグナルの変化をもたらして検出可能なシグナルを提供する（参照：図６）。
本明細書において使用された用語「非天然型塩基」とは、水素結合塩基対を形成することができるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）のような天然型塩基（ｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ）の誘導体を意味する。本明細書において使用された用語「非天然型塩基」は、母化合物（ｍｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）である天然型塩基と異なる塩基対パターンを持つ塩基を含み、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、第５，９６５，３６４号、第６，００１，９８３号及び第６，０３７，１２０号に記載されたとおりである。非天然型塩基間の塩基対は天然型塩基と類似に２つ又は３つの水素結合を含む。非天然型塩基間の塩基対も特定の方式で形成される。
非天然型塩基の特定の例として、次の塩基の塩基対の組み合わせを含む： ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ、ｉｓｏ−ｄＣ／ｉｓｏ−ｄＧ、Ｋ／Ｘ、Ｈ／Ｊ、及びＭ／Ｎ（参照： 米国特許第７，４２２，８５０号）。
伸長過程で挿入される標識は、好ましくはヌクレオチド、より好ましくはヌクレオシド三リン酸に結合される。上記標識は、好ましくはヌクレオシド三リン酸の塩基に結合される。
例示された実施例は図６を参照して説明する。上記断片はＣＴＯとハイブリダイゼーションされ、上記ＣＴＯは非天然型塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＧ）と特異的な結合親和性を持つ非天然型塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＣ）を含むヌクレオチドを含む。伸長はクエンチャーで標識されたｉｓｏ−ｄＧを持つヌクレオチドの存在下で行われる。伸長反応で、クエンチャーを含むｉｓｏ−ｄＧを持つヌクレオチドは、ｉｓｏ−ｄＣを持つヌクレオチドの反対側に挿入される。次に、レポーター分子が標識されたＳＯがクエンチャー分子−ｉｓｏ−ｄＧを含む伸長鎖にハイブリダイゼーションされると、伸長鎖にあるクエンチャーがＳＯにあるレポーターのシグナルをクエンチングしてシグナル変化をもたらし、このシグナル変化は検出可能なシグナルを提供する。
相互作用的な二重標識の１つはＳＯに結合され、残りの１つは伸長反応中に反応液から伸長鎖に挿入される。
ＳＯに結合される標識はレポーター分子又はクエンチャー分子であってもよく、伸長鎖に挿入される標識はクエンチャー分子又はレポーター分子であってもよい。
ＳＯとのハイブリダイゼーションでＳＯに結合された標識と相互作用してシグナル変化を誘導する限り、伸長鎖に挿入される標識は伸長鎖のいずれの位置（例えば、伸長鎖の３’末端）にも結合することができる。伸長鎖とのハイブリダイゼーションで伸長鎖に挿入された標識と相互作用してシグナル変化を誘導する限り、標識はＳＯのいずれの位置（例えば、ＳＯの５’末端）にも結合することができる。
第三の方式によると、ＳＯは相互作用的な二重標識のレポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つの標識を含み、ステップ（ｄ）の伸長反応は上記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち残りの１つの標識を持つヌクレオチドの存在下で行われ、これによって上記伸長鎖に標識が挿入され；上記ＳＯと上記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは上記相互作用的な二重標識からのシグナルの変化をもたらして検出可能なシグナルを提供する（参照：図７）。
ＳＯに結合される標識はレポーター分子又はクエンチャー分子であってもよく（好ましくはレポーター分子）、伸長鎖に挿入される標識はクエンチャー分子又はレポーター分子であってもよい（好ましくはクエンチャー分子）。
（ｉｖ） ２つのＳＯを用いた相互作用的な二重標識
二つのＳＯを用いた相互作用的な二重標識の実現例において、本発明の方法は、追加でＳＯをもう１つ含み、上記追加されたＳＯは上記伸長鎖に相補的な配列を含み、上記２つのＳＯは上記伸長鎖に近接してハイブリダイゼーションされ；上記２つのＳＯはそれぞれ相互作用的な二重標識のレポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つの標識を含み、上記２つのＳＯと上記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、上記相互作用的な二重標識からのシグナルの変化をもたらして検出可能なシグナルを提供する（参照：図４）。
好ましくは、上記２つのＳＯのうち少なくとも１つのＳＯは伸長反応で新しく生成された伸長配列とハイブリダイゼーションされる部位を含む。
２つのＳＯを用いた相互作用的な二重標識の原理は次のとおりである：ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされたＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ伸長されて伸長鎖を形成する。次に、２つのＳＯは上記伸長鎖とハイブリダイゼーションされる。ハイブリダイゼーションで２つのＳＯは互いに近接して伸長鎖とハイブリダイゼーションされるため、２つのＳＯにあるレポーター分子及びクエンチャー分子は隣接して、上記クエンチャー分子が上記レポーター分子から出るシグナルをクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）するようにして、結果として相互作用的な二重標識からシグナルの変化（例えば、レポーター分子からのシグナルの増加）をもたらす。一方、ターゲット核酸配列がない場合、ＰＴＯは切断されず、非切断ＰＴＯはＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされるが、伸長されない。ハイブリダイゼーションされていない２つのＳＯにあるレポーター分子及びクエンチャー分子は、互いに離隔してレポーター分子からシグナルを発生させる。
本発明の好ましい一実現例によれば、伸長鎖にハイブリダイゼーションされてクエンチャー分子がレポーター分子からシグナルをクエンチングできるようにする限り、２つのＳＯは伸長鎖のいずれの位置にもハイブリダイゼーションされることができる。好ましくは、すぐ隣接するか、１〜５ヌクレオチド離隔して位置することができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、２つのＳＯが伸長鎖に隣接してハイブリダイゼーションされる場合、クエンチャー分子がレポーター分子からシグナルをクエンチングできるようにする限り、レポーター分子及びクエンチャー分子は２つのＳＯのいずれの位置にも結合することができる。例えば、１つのＳＯの５’末端又は５’末端から１〜５ヌクレオチド離隔した位置にレポーター分子又はクエンチャー分子が結合され、他のＳＯの３’末端又は３’末端から１〜５ヌクレオチド離隔した位置にクエンチャー分子又はレポーター分子が結合されることができる。
（ｖ） インターカレーティング色素を用いたＦＲＥＴ標識
本発明によれば、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）シグナリングはインターカレーティング色素を用いて達成することができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯはＦＲＥＴのアクセプターを含み、上記ステップ（ｅ）のハイブリダイゼーションはインターカレーティング色素の存在下で行い；上記ＳＯと上記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、上記ＳＯの上記アクセプターからのシグナル変化をもたらして検出可能なシグナルを提供する（参照：図８）。
本発明において使用されるインターカレーティング色素の例は、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ， ＰＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＢＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＳＹＴＯＴＭ４３， ＳＹＴＯＴＭ４４， ＳＹＴＯＴＭ４５， ＳＹＴＯＸＴＭＢｌｕｅ， ＰＯＰＯＴＭ−１， ＰＯＰＯＴＭ−３， ＢＯＢＯＴＭ−１， ＢＯＢＯＴＭ−３， ＬＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＪＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＹＯ−ＰＲＯＴＭ１， ＴＯ−ＰＲＯＴＭ１， ＳＹＴＯＴＭ１１， ＳＹＴＯＴＭ１３， ＳＹＴＯＴＭ１５， ＳＹＴＯＴＭ１６， ＳＹＴＯＴＭ２０， ＳＹＴＯＴＭ２３， ＴＯＴＯＴＭ−３， ＹＯＹＯＴＭ３， ＧｅｌＳｔａｒＴＭ及びチアゾールオレンジ（ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅ）を含む。上記インターカレーティング色素は、二本鎖の核酸分子に特異的に挿入されてシグナルを発生させる。
インターカレーティング色素を用いたＦＲＥＴ標識の原理は次のとおりである：ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされたＰＴＯから放出された断片は、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ伸長されて伸長鎖を形成する。次に、アクセプターが標識されたＳＯは伸長鎖とハイブリダイゼーションされて二本鎖の核酸分子を形成し、インターカレーティング色素は上記二本鎖の核酸分子に結合する。ドナーを励起する光を照射すれば、ドナー分子として作用するインターカレーティング色素からアクセプターにエネルギーが転移され、アクセプターからのシグナル変化をもたらして検出可能なシグナルを提供する。一方、ターゲット核酸配列がない場合には、このようなＦＲＥＴ現象が発生せず、結果としてシグナル変化がない。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯに結合されるアクセプターは上述した多様な単一蛍光標識を含むが、これに限定されるものではない。
標識は公知の方法によってＳＯ又はＰＴＯに連結されることができる。好ましくは、標識は少なくとも３個の炭素原子を含むスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）（例えば、３−カーボンスペーサー、６−カーボンスペーサー又は１２−カーボンスペーサー）を媒介にＳＯ又はＰＴＯに連結される。
本発明において使用されるＳＯは、ハイブリダイゼーションによってシグナルを提供するいずれの形態のプローブを含み、例えば、次のとおりである：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎＴＭ （ＵＳ ５，９２５，５１７）， ＨｙｂｅａｃｏｎｓＴＭ （Ｄ． Ｊ． Ｆｒｅｎｃｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ （２００１） １３， ３６３ ３７４ ａｎｄ ＵＳ ７，３４８，１４１）， Ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ， ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ ｐｒｏｂｅ （ＵＳ ５，８７６，９３０）， ＬＵＸＴＭ （Ｉ． Ａ． Ｎａｚａｒｅｎｋｏ， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００２， ３０：２０８９−２０９５．及びＵＳ ｐａｔ ｎｏ． ７，５３７，８８６）及び Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ （Ｂｅｒｎａｒｄ ＰＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０００， ４６， １４７−１４８ ａｎｄ Ｄｅｅｐｔｉ Ｐａｒａｓｈａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ １２４， ｒｅｖｉｅｗ ａｒｔｉｃｌｅ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００６ ３８５−３９８）。
ステップ（ｆ）：ターゲットシグナルの検出
最終的に、ステップ（ｅ）で提供される検出可能なシグナルを検出するステップであって、上記シグナルの検出は伸長鎖の存在を示し、上記伸長鎖の存在は上記ターゲット核酸配列の存在を示す。
上述したように、ＳＯのハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション結果物の標識からのシグナリングと連動してターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する。よって、本発明はリアルタイムで検出できるシグナルを提供する標識を使用する場合、本発明はリアルタイム方式で行うことができる。
または、本発明において用いられる標識は、ハイブリダイゼーション結果物の融解又はハイブリダイゼーション結果物の融解及びハイブリダイゼーション過程で検出可能なシグナルを提供することができるので、融解分析を通じてターゲットシグナルを検出することができる。
本発明において使用された用語「融解分析」とは、伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを伸長二重体の融解を通じて得ることを意味し、２つの異なる温度でシグナルを測定する方法、融解曲線分析、融解パターン分析を含む。好ましくは、融解分析は融解曲線分析である。
例えば、ＳＯと伸長鎖との二重体が融解される場合、一本鎖ＳＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）に互いに近接して上記クエンチャー分子は上記レポーター分子からのシグナルをクエンチングし、シグナルの変化をもたらすことで検出可能なシグナルを提供する。一方、ＳＯ及び伸長鎖が再度ハイブリダイゼーションされて二重体を形成する場合、ＳＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に互いに離隔し、上記クエンチャー分子は上記レポーター分子からシグナルをクエンチングしないことを誘導し、シグナルの変化をもたらすことで検出可能なシグナルを提供する（参照：図２）。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＰＴＯ断片の伸長鎖の存在はＳＯと伸長鎖との二重体のＴｍ値を用いた融解曲線分析を通じて検出する。
ＳＯと伸長鎖との二重体のＴｍ値を用いて分析する場合、ＳＯと伸長鎖との間のハイブリダイゼーション結果物の分離なしで均一アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）が可能な標識（例えば、蛍光標識）を使用することが好ましい。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯと伸長鎖との間のハイブリダイゼーション結果物は、上記ＰＴＯ断片の配列及び／又は長さ、上記ＣＴＯの配列及び／又は長さ、上記ＳＯの配列及び／又は長さ、及びこれらの組み合わせによって調節されるＴｍ値を持つ。
例えば、ＳＯ配列のミスマッチ程度を調節してハイブリダイゼーション結果物のＴｍ値を調節することができる。又は、ＳＯの長さを調節してハイブリダイゼーション結果物のＴｍ値を調節することができる。
好ましくは、本発明の方法は、ステップ（ｅ）のハイブリダイゼーション結果物を融解させるか又は融解後にハイブリダイゼーションさせることで、ステップ（ｅ）及び（ｆ）の間に検出可能なシグナルを提供するステップをさらに含み、上記ステップ（ｆ）は上記シグナルを検出して伸長鎖の存在を検出する。
または、本発明は、ステップ（ｆ）後にステップ（ｅ）でのハイブリダイゼーション結果物を融解させるか又は融解後にハイブリダイゼーションさせて検出可能なシグナルの提供及び検出ステップをさらに含み、これにより伸長鎖の存在をもう一度検出する。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＰＴＯ断片の伸長鎖の存在はハイブリダイゼーション曲線分析（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）で検出する。
用語「Ｔｍ」は融解温度を意味する。上記融解温度は、二本鎖の核酸分子ポピュレーション（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の半分が一本鎖に解離される温度である。Ｔｍ値はハイブリダイゼーションされるヌクレオチドの長さ及びＧ／Ｃ含量によって決定される。Ｔｍ 値はＷａｌｌａｃｅ ｒｕｌｅ（Ｒ．Ｂ． Ｗａｌｌａｃｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：３５４３−３５４７（１９７９））及びｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ法（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ． Ｊｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５：３５５５ ３５６２（１９９６））； Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２４：４５０１−４５０５（１９９６））のような公知の方法によって計算されることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明のＴｍ値は実際に使用する反応条件下でのＴｍ値を意味する。
融解曲線又はハイブリダイゼーション曲線は従来の技術、例えば、米国特許第６，１７４，６７０号及び第５，７８９，１６７号、Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖなど、Ｇｅｎｅ １８８： ４５（１９９７）； Ｋｏｃｈｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １９：３４３（２００２）； Ｌｉｖｅｈｉｔｓなど， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄｙｎａｍ． １１：７８３（１９９４）； 及び Ｈｏｗｅｌｌなど、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８７（１９９９）で説明するとおり得ることができる。例えば、融解曲線又はハイブリダイゼーション曲線は、ハイブリダイゼーション厳格度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）のパラメータに対する出力シグナル（ｏｕｔｐｕｔ ｓｉｇｎａｌ）の変化のグラフィックプロット（ｇｒａｐｈｉｃ ｐｌｏｔ）又はディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）で構成されることができる。出力シグナルはハイブリダイゼーションパラメータに対して直接にプロッティングすることができる。典型的に、融解曲線又はハイブリダイゼーション曲線は、例えば、Ｙ軸には二重体構造の程度（すなわち、ハイブリダイゼーション程度）を示す蛍光が、Ｘ軸にはハイブリダイゼーションパラメータがプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）された出力シグナルを持つ。
蛍光 ｖｓ． 温度の一次導関数（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）のプロット、すなわち、蛍光 ｖｓ． 温度（ｄＦ／ｄＴ ｖｓ． Ｔ）又は（−ｄＦ／ｄＴ ｖｓ． Ｔ）で変化率プロットは融解ピークを提供する。
伸長鎖の生成は伸長鎖の大きさによって検出されることができる。伸長鎖とハイブリダイゼーションされたＳＯは、伸長鎖のサイズで伸長鎖を検出できる検出可能なシグナルを提供する。例えば、伸長鎖の生成をゲル電気泳動及びポリアクリルアミドゲル電気泳動のような多様な電気泳動法で検出する場合、上記伸長鎖とハイブリダイゼーションされたＳＯは伸長鎖の存在を示すシグナルをゲルマトリックス上に提供する。好ましくは、上記ＳＯは単一蛍光標識されたものを使用する。
ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰｓから構成されることができる。または、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯは、修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、参照 ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／２０７０２号）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ， 参照 ＰＣＴ出願第ＷＯ９８／２２４８９号、第ＷＯ９８／３９３５２号及び第ＷＯ９９／１４２２６号）を含むことができる。ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯは、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含むことができる。用語「ユニバーサル塩基」とは、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基それぞれに対してほとんど区別なく塩基対を形成できることを意味する。
上述したように、ＰＴＯは、ＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’方向に離隔した一位置で切断されることができる。上記切断位置は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置することができる。ＰＴＯ断片がＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む場合、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部にハイブリダイゼーションされるＣＴＯの位置は、ユニバーサル塩基、縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又はそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、ＰＴＯがＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’方向に１つのヌクレオチドだけ離隔した一位置で切断されると、上記ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのためにＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部はユニバーサル塩基を含むことが有利である。仮に、ＰＴＯがＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’方向に２つのヌクレオチドだけ離隔した一位置で切断されると、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端は縮重配列を含み、それの３’方向に隣接したヌクレオチドはユニバーサル塩基を含むのが有利である。このように、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の多様な位置でＰＴＯの切断が起こる場合、ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮重配列を用いるのが有用である。また、上流プライマー伸長依存的な切断誘導下で、同一の５’タギング部位を持つＰＴＯを複数のターゲット核酸配列スクリーニングに用いる場合、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部が互いに異なるＰＴＯ断片を生成することができる。このような場合、ユニバーサル塩基及び縮重配列はＣＴＯに有用に使用される。ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮重配列を用いる戦略は、複数のターゲット核酸配列のスクリーニングのために一つのタイプのＣＴＯ又は最小限のタイプのＣＴＯを使用することにする。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明の方法は、ステップ（ｄ）と（ｅ）との間に変性ステップをさらに含む。ステップ（ｄ）で形成された伸長二重体は、一本鎖形態に変性された後、ＳＯとハイブリダイゼーションされる。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明の方法は、繰り返しサイクル（ｒｅｐｅａｔｉｎｇ ｃｙｃｌｅ）の間に変性過程を含んでステップ（ａ）〜（ｆ）の全部又は一部を繰り返し行うことをさらに含む。例えば、本発明の方法は、繰り返しサイクルの間に変性過程を含んでステップ（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｄ）、（ａ）〜（ｅ）又は（ａ）〜（ｆ）を繰り返し行うことをさらに含む。このような繰り返しによって、ターゲット核酸配列及び／又はターゲットシグナルを増幅させることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明は繰り返しサイクルの間に変性過程を含んでステップ（ａ）〜（ｅ）を繰り返し行い、ステップ（ｅ）のハイブリダイゼーション結果物を融解させるか又は融解後にハイブリダイゼーションさせて検出可能なシグナルを提供するステップをさらに含み、上記ステップ（ｆ）はシグナルを検出して伸長鎖の存在を検出する。
変性は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリオキサール処理、酵素的方法（例、ヘリカーゼ作用）及び結合タンパク質を含む公知の技術を通じて行うことができるが、これに限定されるものではない。例えば、変性は８０〜１０５℃の温度範囲で熱処理して達成されることができる。上述した変性の一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）に開示されている。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明は、一連の融解分析を行ってターゲット核酸配列を定性的又は定量的に検出することができる。
より好ましくは、本発明は、（ｉ）伸長鎖生成のために繰り返しサイクルの間に変性過程を含む（ａ）〜（ｄ）ステップを繰り返すステップ；（ｉｉ）ＳＯと伸長鎖とのハイブリダイゼーション結果物の融解分析を行うステップ；及び（ｉｉｉ）上記ステップ（ｉ）と（ｉｉ）を少なくとも２回以上繰り返すステップを含む。この場合、融解分析はある間隔（ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ）を持って少なくとも２回繰り返し行われる。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記（ａ）〜（ｄ）ステップの繰り返し回数は任意に調節されることができる。一連の融解分析を行うにあたって、ある１つの融解分析のために行われる（ａ）〜（ｄ）ステップの繰り返し回数は、他の１つの融解分析のために行われる（ａ）〜（ｄ）ステップの繰り返し回数と同一か異なっていてもよい。
上記（ａ）〜（ｄ）ステップの繰り返しは、伸長鎖生成に関する一例であることは当業者に明確である。例えば、本発明は、ステップ（ａ）〜（ｂ）を繰り返し、ステップ（ｃ）及び（ｄ）を行って伸長鎖を生成した後、融解分析を行うことができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、ステップ（ａ）〜（ｆ）は１つの反応容器又は別途の反応容器で行う。例えば、ステップ（ａ）〜（ｂ）、（ｃ）〜（ｄ）又は（ｅ）〜（ｆ）は別途の反応容器で行われることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、ステップ（ａ）〜（ｂ）及び（ｃ）〜（ｆ）は、反応条件（特に、温度）によって１つの反応容器で同時に又は別途に行われることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、ステップ（ａ）〜（ｂ）は変性過程を含んで繰り返し行われる。
繰り返し過程において上流オリゴヌクレオチドとして上流プライマーが使用される場合、本発明の方法は、下流プライマーの存在下で行い、好ましくはＰＣＲ方法によって行う。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明において少なくとも２回の融解分析はターゲット核酸配列の定量分析を可能にする。
融解分析を通じて得られた融解ピークの面積及び高さは伸長二重体の量に影響され、これはターゲット核酸配列の最初量に関する情報を提供する。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明は、（ｉ）繰り返しサイクルの間に変性過程を含んで（ａ）〜（ｄ）ステップを繰り返すことで伸長鎖の数を増加させるステップ；（ｉｉ）ＳＯと伸長鎖とのハイブリダイゼーション結果物に対する融解分析を行うステップ；及び（ｉｉｉ）上記ステップ（ｉ）と（ｉｉ）を少なくとも２回繰り返すステップを含む。所定の閾値以上の融解ピーク面積及び／又は高さが到達される融解分析のサイクル数を測定することで、ターゲット核酸配列の量を決定することができる。
または、ターゲット核酸配列の定量は、伸長鎖の量を増加させるための繰り返しサイクル数に関する融解分析情報（例えば、ピークの面積又は高さ）をプロッティングすることで達成することができる。
本発明においては検出及び／又は増幅しようとするターゲット核酸配列が全てのＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を含んで、ある特定の配列又は長さを持つように要求しない。
ｍＲＮＡを初期物質として用いる場合、アニーリングステップ実施の以前に逆転写ステップが必須であり、これの詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋなど， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）； 及びＮｏｏｎａｎ， Ｋ． Ｆ． など、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０３６６ （１９８８）に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマー又はｍＲＮＡにハイブリダイゼーションされるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが用いられることができる。
検出及び／又は増幅できるターゲット核酸配列はある天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸又はウイロイド核酸もいずれも含む。
本発明によって検出できるターゲット核酸配列は、多様な核酸配列、例えば、ゲノム内の配列、人為的に分離されるか断片化された配列及び合成配列（例えば、ｃＤＮＡ配列及びバーコード配列）を含む。例えば、ターゲット核酸配列はＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）のための核酸マーカー配列を含む。ＩＰＣＲはＰＣＲと共に核酸マーカー配列及び抗体間のコンジュゲートを使用し、これはタンパク質を含んだ多様な種類のターゲットを検出するのに広く適用される（Ｓａｎｏなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ｐｐ：１２０−１２２（１９９２）、米国特許第５，６６５，５３９号、Ｎｉｅｍｅｙｅｒなど、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３ ｐｐ：２０８−２１６（２００５）、米国出願公開番号第２００５／０２３９１０８号及びＹｅなど、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２ ｐｐ：７９６−８００（２０１０））。
また、本発明はヌクレオチド変異の検出に有用である。好ましくは、ターゲット核酸配列はヌクレオチド変異を含む。本明細書において使用される用語「ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」とは、連続的なＤＮＡセグメント又は配列が類似するＤＮＡセグメントで特定位置のＤＮＡ配列での全ての単一又は複数のヌクレオチド置換、欠失、又は挿入を意味する。このような連続的なＤＮＡセグメントは１つの遺伝子又は１つの染色体のある他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）又は多型対立遺伝子変異（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）であってもよい。例えば、本発明によって検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、突然変異、欠失、挿入、置換及び転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を含む。ヌクレオチド変異の例示は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性に係る変異及びがん発生の原因になる変異を含む。本明細書において使用される用語「ヌクレオチド変異」は、ＤＮＡ分子の特定位置でのある変異を含む。すなわち、用語「ヌクレオチド変異」は、ＤＮＡ分子の特定位置での野生型及びそれのある変異型を含む。
ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異を検出する本発明において、使用されるプライマー又はプローブがターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つ場合、上記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列はマッチングテンプレート（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と表現される。使用されるプライマー又はプローブがターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して非相補的な配列を持つ場合、ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列はミスマッチングテンプレート（ｍｉｓｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と表現される。
ヌクレオチド変異の検出において、上流プライマーの３’末端はターゲット核酸配列のヌクレオチド変異位置の向かい側に位置するようにデザインすることができる。本発明の好ましい一実現例によれば、上流プライマーの３’末端はターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つ。ヌクレオチド変異に相補的な配列を持つ上流プライマーの３’末端はマッチングテンプレートにアニーリングされ伸長されてＰＴＯ切断を誘導する。その結果形成されたＰＴＯ断片はＣＴＯとハイブリダイゼーションされて伸長され、ＳＯとハイブリダイゼーションされてターゲットシグナルを提供する。一方、上流プライマーの３’末端がミスマッチングテンプレートでヌクレオチド変異にミスマッチされる場合、上流プライマーがミスマッチングテンプレートにハイブリダイゼーションされる場合にも、伸長反応のためにプライマーの３’末端のアニーリングが必須な条件の下では伸長されず、よって、ターゲットシグナルは発生されない。
または、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を持つＰＴＯのハイブリダイゼーションに依存的なＰＴＯの切断反応を用いることができる。例えば、調節された条件下で、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を持つＰＴＯは、マッチングテンプレートとハイブリダイゼーションされ、次に切断される。その結果形成されたＰＴＯ断片はＣＴＯとハイブリダイゼーションされて伸長され、ＳＯとハイブリダイゼーションされてターゲットシグナルを提供する。一方、調節された条件下で、上記ＰＴＯはヌクレオチド変異部位に非相補的な配列を持つミスマッチングテンプレートとハイブリダイゼーションされず、上記ＰＴＯは切断されない。好ましくは、このような場合、ＰＴＯでヌクレオチド変異に相補的な配列はＰＴＯの３’ターゲッティング部位の中央に位置する。
または、ヌクレオチド変異検出のために、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部をターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に位置させ、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を持つ（参照：図９）。
５’末端部位にヌクレオチド変異区別部位を含むプローブがミスマッチテンプレートとハイブリダイゼーションされる場合、５’末端部位は特定の条件下で一本鎖を形成することができる。上記プローブはＰＴＯに該当すると言える。シグナルは本発明の方法によって提供されることができる。このような接近は、プローブのヌクレオチド変異区別サイト（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）に対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列を検出するのに用いられることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明において使用されるターゲット核酸配列は前増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である。前増幅された核酸配列の利用は、本発明のターゲット検出の敏感度及び特異性を顕著に増加させることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記方法は、下流プライマーの存在下で行われる。
本発明の長所は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を同時に（マルチプレックス）検出することができるということである。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のターゲット核酸配列を検出するために行われる。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のターゲット核酸配列を検出するために行われ、上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のオリゴヌクレオチドを含み、ＰＴＯは少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のＰＴＯを含み、ＣＴＯは少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のＣＴＯを含み、ＳＯは少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のＳＯを含み、少なくとも２種のターゲット核酸配列が存在する場合、上記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列に相応する少なくとも２種のターゲットシグナル（検出可能なシグナル）を提供する。
少なくとも２つのＰＴＯの５’タギング部位は互いに同一の配列を持つことができる。例えば、本発明がターゲット核酸配列のスクリーニングのために行われる場合、ＰＴＯの５’タギング部位は同一の配列を持つことができる。
また、一種類のＣＴＯは多数のターゲット核酸配列を検出するのに使用されることができる。例えば、上記５’タギング部位に同一の配列を持つＰＴＯがターゲット核酸配列スクリーニングに使用される場合、一種類のＣＴＯが使用されることができる。
融解曲線分析で少なくとも２種のターゲット核酸配列を同時に検出するために本発明が行われる場合、少なくとも２種の上記ターゲット核酸配列に相応する上記ステップ（ｅ）のハイブリダイゼーション結果物は、互いに異なるＴｍ値を有し、これにより単一標識（例えば、ＦＡＭ）を使用しても少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出することができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯ／伸長鎖のハイブリッドのＴｍ値はＳＯの配列及び／又は長さ、ＳＯにハイブリダイゼーションされる伸長鎖部位の配列及び／又は長さ、又はこれらの組み合わせによって調節されることができる。特に、マルチプレックス検出で生成された伸長鎖が上記種類のＳＯとハイブリダイゼーションされる場合、ＳＯとハイブリダイゼーションされる伸長鎖の部位が互いに異なる配列を持つようにデザインされると、上記伸長鎖とＳＯとのハイブリッドのＴｍ値は互いに異なる。よって、一種類のＳＯを使用する場合でも、マルチプレックス検出が可能である。
本発明は、マイクロアレイのような固体上で行われることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明は固相で行われ、ＣＴＯ又はＳＯはそれの５’末端又は３’末端を通じて固相基質上に固定される。
固相反応のために、ＣＴＯ又はＳＯは５’末端又は３’末端（好ましくは３’末端）を通じて固相基質の表面に直接又は間接（好ましくは間接）に固定化される。また、上記ＣＴＯ又はＳＯは、共有又は非共有結合方式で固相基質の表面上に固定化されることができる。上記固定化されたＣＴＯ又はＳＯが固相基質上に間接的に固定化される場合、適当なリンカーが用いられる。本発明において使用されるリンカーは、固相基質表面上にプローブを固定化するのに用いるいずれのリンカーも含むことができる。例えば、アミン基を持つアルキル又はアリール化合物、又はチオール基を持つアルキル又はアリール化合物がリンカーとしてＣＴＯ又はＳＯ固定化に用いられることができる。また、ポリ（Ｔ）テール又はポリ（Ａ）テールがリンカーとして用いられることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明において使用される固相基質はマイクロアレイである。本発明において反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に公知されているいずれのものでも用いることができる。本発明の全ての過程、すなわち、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション、切断、伸長、融解及び蛍光検出はマイクロアレイで行われる。マイクロアレイ上に固定化された上記ＣＴＯ又はＳＯは、ハイブリダイゼーション可能なアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）の役割をする。マイクロアレイを作製するための固相基質は、金属（例えば、金、金と銅の合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコーン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウエハ、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、カーボン、カーボンナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これに限定されるものではない。本発明の多数の固定化されたＣＴＯ又はＳＯは、固相基質上の１つのアドレス可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）な部位又は２つ又はそれ以上のアドレス可能な部位に固定化されることができ、固相基質は２〜１，０００，０００個のアドレス可能な部位を含むことができる。フォトリトグラフィー、インクジェット、機械的なマイクロスポッティング及びこれと類似する方法のような従来の作製技術を通じて、アレイ又は特定応用のためのアレイを生産するために固定化されたＣＴＯ又はＳＯが作製（ｆａｂｒｉｃａｔｅ）されることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、固相基質の表面上に固定化されたＳＯは相互作用的な二重標識を含む。
本発明においてＰＴＯ断片は、ターゲット核酸とハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断によって生成され、アニーリングされた後、ＣＴＯ上で伸長されて結果として伸長鎖を生成する。
伸長鎖の数を増加させるために、追加的なＰＴＯを用いた追加的な５’ヌクレアーゼ切断反応によって、ＣＴＯ上で伸長可能な追加的な断片を提供することができる。上記追加的なＰＴＯは、（ｉ）伸長鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）伸長鎖には非相補的であるが、ＣＴＯのキャプチャリング部位には相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含む。
好ましくは、上記追加的なＰＴＯは、伸長鎖にハイブリダイゼーションされるＳＯの下流に位置する。上記ＳＯは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による追加的なＰＴＯ切断を誘導する。ＳＯの３’末端が伸長可能な場合、ＳＯの伸長鎖は上記追加的なＰＴＯの切断を誘導する。
上記好ましい実現例は、追加的な断片形成が伸長鎖の形成に依存的な特徴を示す。
または、上記追加的な断片は、次の追加的なＰＴＯの使用によって提供されることができる。上記追加的なＰＴＯは、（ｉ）ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）ＣＴＯのテンプレーティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含み、ＣＴＯのキャプチャリング部位に相補的な配列を含む５’タギング部位を含む。
ターゲット核酸配列の増幅を伴う好ましい実現例
好ましくは、本発明は、ターゲット核酸配列を合成することができる上流プライマー及び下流プライマーで構成されたプライマー対を用いてターゲット核酸配列を同時に増幅する。
本発明の他の一様態によれば、本発明は、次のステップを含むＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列をＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いて検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列を、上流プライマーと下流プライマーとを含むプライマー対、並びにプロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記上流プライマーと下流プライマーはそれぞれ上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記ＰＴＯの５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；上記ＰＴＯは上流プライマーと下流プライマーとの間に位置し；上記ＰＴＯは伸長されないようにそれの３’末端がブロッキングされており；
（ｂ） 上記ＰＴＯの切断及び上記プライマーの伸長のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的な核酸ポリメラーゼにステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、上記ＰＴＯが上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされると、上記上流プライマーは伸長され、上記伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記鋳型依存的な核酸ポリメラーゼによる上記ＰＴＯの切断を誘導して、上記ＰＴＯの５’タギング部位を含むか又はそれの一部を含む断片を放出し；
（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とキャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、上記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された断片は上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び上記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長されて上記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて伸長二重体を形成し、
（ｅ） 上記伸長鎖とＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、上記ＳＯは上記伸長鎖に相補的な配列を含み、少なくとも１つの標識が結合されており；上記ＳＯは上記伸長鎖とハイブリダイゼーションして検出可能なシグナルを提供し；及び
（ｆ） 上記シグナルを検出するステップであって、上記シグナルの検出は上記伸長鎖の存在を示し、上記伸長鎖の存在は上記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の好ましい実現例は上述された本発明の各ステップを行うため、これら間で共通する内容は本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明の方法は、繰り返しサイクルの間に変性過程を含んでステップ（ａ）〜（ｆ）の全部又は一部を繰り返し行うことをさらに含む。例えば、上記方法は、さらに繰り返しサイクルの間に変性過程を含んでステップ（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｄ）又は（ａ）〜（ｆ）を繰り返し行う。上記反応の繰り返しはターゲット核酸配列の増幅を伴う。好ましくは、上記増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号に記載されたＰＣＲによって行われる。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列の検出のために行われる。
上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性に基づくＰＣＥ−ＳＨを用いるターゲットの検出
本発明は、上流オリゴヌクレオチドを使用せずに行われることができる。
本発明のまた他の様態によれば、本発明は次のステップを含むＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列をＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いて検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列を、プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
（ｂ） 上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素にステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、上記ＰＴＯは５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記酵素によって切断されて上記ＰＴＯの５’タギング部位を含むか又はそれの一部を含む断片を放出し；
（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とキャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、上記ＣＴＯは、３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された断片は上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び上記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長されて上記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて伸長二重体を形成し、
（ｅ） 上記伸長鎖とＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、上記ＳＯは上記伸長鎖に相補的な配列を含み、少なくとも１つの標識が結合されており；上記ＳＯは上記伸長鎖とハイブリダイゼーションして検出可能なシグナルを提供し；及び
（ｆ） 上記シグナルを検出するステップであって、上記シグナルの検出は上記伸長鎖の存在を示し、上記伸長鎖の存在は上記ターゲット核酸配列の存在を示す。
ターゲット核酸配列の増幅及び上記ＰＴＯの切断効率を考慮するとき、本発明のＰＣＥ−ＳＨは、好ましくは上流オリゴヌクレオチドを使用して行う。
ＰＣＥ−ＳＨを用いたヌクレオチド変異の検出
本発明のまた他の一様態によれば、本発明は、次のステップを含むターゲット核酸配列内のヌクレオチド変異をＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いて検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列を、上流オリゴヌクレオチド、並びにプロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位、及び（ｉｉｉ）ターゲット核酸でヌクレオチド変異に相補的な配列を含むヌクレオチド変異区別サイト（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を含み；上記ヌクレオチド変異区別サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置し、上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ＰＴＯの上流に位置し；上記上流オリゴヌクレオチド又はこれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯ切断を誘導し；
（ｂ） 上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素にステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、上記ＰＴＯが上記ヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１の初期切断位置から切断を誘導すると、第１断片を放出し；上記ＰＴＯが上記ヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列と二本鎖を形成せず、第１の初期切断位置の下流に位置する第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出し；上記第２断片は追加的な３’末端部位を含み、これは第２断片を第１断片と異ならせ；
（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とキャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、上記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ） 上記ＰＴＯの５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された第１断片又は第２断片は上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び上記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、上記第１断片がＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされると、上記第１断片は伸長されて上記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成され；上記第２断片がＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされると伸長されず；
（ｅ） 上記伸長鎖とＳＯとをハイブリダイゼーションさせるステップであって、上記ＳＯは上記伸長鎖に相補的な配列を含み、少なくとも１つの標識が結合されており；上記ＳＯは上記伸長鎖とハイブリダイゼーションして検出可能なシグナルを提供し；及び
（ｆ） 上記シグナルを検出するステップであって、上記シグナルの検出は、上記ＰＴＯのヌクレオチド区別部位に相補的なヌクレオチド変異の存在を示す。
本発明者らは関心のあるヌクレオチド変異の存在又は不在に依存的に上記プローブ切断位置が調節されることができ、互いに異なる位置で切断されて放出された上記断片が人為的なテンプレート上での伸長可能性によって区分されるということを見出した。
本発明は、プローブのハイブリダイゼーション；ＰＴＯの切断及び伸長；ヌクレオチド変異依存的な伸長鎖の生成；及びシグナリングオリゴヌクレオチドを用いた伸長鎖の検出の連続的なステップを用いる。よって、ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによる変異検出（Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＶＤ−ＰＣＥ−ＳＨ）と命名した。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明によって検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰのような単一ヌクレオチドによる変異である。
本発明においてＰＴＯのヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列は「マッチテンプレート」と記載する。ＰＴＯのヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列は「ミスマッチテンプレート」と記載する。
本発明の好ましい一実現例において、ヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異に関連して使用される用語「非相補的」は、挿入又は欠失による非相補性を含む。
本発明のＶＤ−ＰＣＥ−ＳＨは、特定のヌクレオチド変異に対するＰＴＯ選択性のために、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイトを持つＰＴＯを使用する。上記ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列（すなわち、マッチテンプレート）とハイブリダイゼーションされると、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はマッチテンプレートと二本鎖を形成する。一方、上記ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列（すなわち、ミスマッチテンプレート）とハイブリダイゼーションされると、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はミスマッチテンプレートと二本鎖を形成しない。
このように関心のあるヌクレオチド変異に対する異なるハイブリダイゼーションパターンはＰＴＯの初期切断位置での差を提供し、これによって２種のＰＴＯ断片が生成され、関心のあるヌクレオチド変異の存在有無によってシグナル差が発生するということは注目に値する。
第１断片はＰＴＯ及びマッチングテンプレートのハイブリッドの切断によって生成され、第２断片はＰＴＯ及びミスマッチングテンプレートのハイブリッドの切断によってそれぞれ生成される。上記第２断片は追加的な３’末端の部位を含み、これは第２断片を第１断片と異ならせる。
第１断片又は第２断片の生成は、ＣＴＯ上の伸長反応によって検出されることができる。
通常、プライマーの３’末端の一部及びテンプレートのハイブリダイゼーションは厳しい条件でのプライマー伸長に非常に重要である。本発明において第１断片及び第２断片はそれぞれＣＴＯの同一位置にハイブリダイゼーションされる。上述したように、第１断片に比べて、第２断片は追加的な３’末端の部位を含む。ハイブリダイゼーション条件及び第２断片の追加的な３’末端部位の向かい側のＣＴＯ配列を調節することで、上記第１断片のみを伸長させることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記第２断片がＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされる場合、ＣＴＯが上記第２断片の上記追加的な３’末端部位とハイブリダイゼーションされず、上記第２断片の伸長が防止されるようにＣＴＯの配列を選択する。
本発明の好ましい一実現例によれば、第２断片の追加的な３’末端部位の向かい側のＣＴＯの配列は、上記追加的な３’末端部位に非相補的である。
上記第１断片の伸長による伸長鎖の生成は、上述したＳＯを使用して検出することができる。
ヌクレオチド変異検出のために５’ヌクレアーゼ活性を用いる従来の技術によると、使用されたプローブのハイブリダイゼーションはプローブの全体配列によって影響を受けるか決定される。このような従来の技術において、プローブデザイン及び作製、そして反応条件の最適化は容易ではなく、これはヌクレオチド変異の存在に依存するプローブのハイブリダイゼーションが単一ヌクレオチドの差によって主に決定されるからだ。
ＶＤ−ＰＣＥ−ＳＨによれば、ヌクレオチド変異区別サイトはプローブのハイブリダイゼーション関与部位の５’末端の一部に位置し、これはハイブリダイゼーション条件の最適化を便利にする。また、ＶＤ−ＰＣＥ−ＳＨはプローブの全体配列よりはプローブの一部の部位を通じてヌクレオチド変異を区別して検出し、ＳＮＰのような単一ヌクレオチドによる差も正確に検出することができる。
ＳＮＰに対する向かい側の配列に隣接したプローブ配列がプローブのハイブリダイゼーションに大きな影響を及ぼすということが当業界に知られている。従来のプローブは一般にそれらの中央部位にＳＮＰに対する向かい側の配列を持つ。この点で従来のプローブは、ハイブリダイゼーションに関与するＳＮＰ周辺の配列を選択することができない。従来の技術はＳＮＰ周辺の配列のため、深刻な限界点を有する。
本発明のＶＤ−ＰＣＥ−ＳＨアッセイをそれぞれのステップ別に詳細に説明すれば、次のとおりである：
本発明のＶＤ−ＰＣＥ−ＳＨアッセイは上述したＰＣＥ−ＳＨアッセイの１つであるので、これらの間で共通する内容は本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
ステップ（ａ）：ターゲット核酸配列と上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯとのハイブリダイゼーション
本発明の方法によれば、まず、ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯとハイブリダイゼーションさせる。
ヌクレオチド変異検出に使用されるＰＴＯは、（ｉ）プローブの役割をする３’ターゲッティング部位；（ｉｉ）ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位；及び（ｉｉｉ）ターゲット核酸上のヌクレオチド変異に相補的な配列を含み、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイトを含む。５’タギング部位はターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされた後、ＰＴＯから核酸分解切断（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）方式で解離される。上記ＰＴＯで５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位は必ず５’→３’の順序で位置する。ＰＴＯは図９に例示されている。
ＰＴＯはヌクレオチド変異に相補的な配列を含むヌクレオチド変異区別サイトを含み、ヌクレオチド変異区別サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置する。
ＰＴＯが変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列と二本鎖を形成する。ＰＴＯが変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列と二本鎖を形成しない。このように、関心のあるヌクレオチド変異の明らかなハイブリダイゼーションパターンがＰＴＯの初期切断位置での差を提供し、これによって２種のＰＴＯ断片が生成され、関心のあるヌクレオチド変異の存在有無によってシグナル差が発生する。また、変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチドを持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は一本鎖を形成する（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ−ｆｏｒｍｉｎｇ）上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部と記載することができる。
上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置したヌクレオチド変異区別サイトは、ヌクレオチド変異に相補的な配列を含む。例えば、検出されるヌクレオチド変異がＳＮＰの場合、ヌクレオチド変異区別サイトは上記ＳＮＰに相補的なヌクレオチドを含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記ヌクレオチド変異区別サイトは、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端から１０ヌクレオチド、より好ましくは８ヌクレオチド、さらに好ましくは６ヌクレオチド、更により好ましくは４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド又は１ヌクレオチド離隔した位置以内に位置する。好ましくは、ヌクレオチド変異区別サイトはＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端に位置する。
プローブのヌクレオチド変異区別サイト又はターゲット配列上のヌクレオチド変異サイトを言及しながら使用される用語「サイト（ｓｉｔｅ）」は、単一ヌクレオチドだけでなく多数のヌクレオチドも含む。
好ましくは、ステップ（ａ）でハイブリダイゼーションは、３’ターゲッティング部位はターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、５’タギング部位はターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされない厳しい条件下で行われる。
ステップ（ｂ）：ＰＴＯからの断片の放出
次に、ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素にステップ（ａ）の結果物を接触させる。
ＰＴＯが上記変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列（すなわち、マッチテンプレート）にハイブリダイゼーションされ、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列と二本鎖を形成して第１の初期切断位置から切断を誘導すると、第１断片を放出する（参照：図９）。
ＰＴＯが上記変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列（すなわち、ミスマッチテンプレート）にハイブリダイゼーションされ、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列と二本鎖を形成しなくて第１の初期切断位置の下流に位置した第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出する。上記第２断片は追加的な３’末端部位を含み、これは第２断片を第１断片と異ならせる（図９）。
試料内にターゲット核酸配列が存在しない場合、ＰＴＯ切断が発生しない。
このように、ターゲット核酸配列上の関心のあるヌクレオチド変異の存在有無による切断位置の差及び生成されたＰＴＯ断片の差は異なる伸長パターンを示し、ターゲット核酸配列上のヌクレオチド変異を区別して検出できるようにする。
上流プライマー伸長による切断位置は、一般に５’→３’の方向に一本鎖及び二本鎖を含む構造内の二本鎖（すなわち、分岐位置（ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ））開始ヌクレオチド又は開始ヌクレオチドから１〜２ヌクレオチド離隔した位置に位置する。切断反応によって５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の一部を含む断片が生成される。本発明が上流オリゴヌクレオチド伸長独立的な切断誘導によって行われると、ＰＴＯの切断位置は上流オリゴヌクレオチドの位置によって調節される。
本明細書においてＰＴＯを言及しながら使用される用語「第１の初期切断位置（ａ ｆｉｒｓｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）」とは、変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列にＰＴＯがハイブリダイゼーションされる場合、一番目に切断されるＰＴＯの切断位置を意味する。本明細書においてＰＴＯを言及しながら使用される用語「第２の初期切断位置（ａ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）」とは、変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列にＰＴＯがハイブリダイゼーションされる場合、一番目に切断されるＰＴＯの切断位置を意味する。
本発明において使用された「第１断片（ａ ｆｉｒｓｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、第１の初期切断位置で切断によって生成された断片を意味する。「第１断片」は「第１セグメント（ａ ｆｉｒｓｔ ｓｅｇｍｅｎｔ）」及び「ＰＴＯ第１断片（ａ ＰＴＯ ｆｉｒｓｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」と入れ替えて使用することができる。用語「第２断片（ａ ｓｅｃｏｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、第２の初期切断位置で切断によって生成された断片を意味する。「第２断片」は「第２セグメント（ａ ｓｅｃｏｎｄ ｓｅｇｍｅｎｔ）」及び「ＰＴＯ第２断片（ａ ＰＴＯ ｓｅｃｏｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」と入れ替えて使用することができる。
好ましくは、上記第１断片及び第２断片は、それぞれ５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む。
上記切断は、用いられる切断方法によって上記第１の初期切断位置（又は第２の初期切断位置）の切断以後にも連続して起こることができる。例えば、上流プライマーの伸長とともに５’ヌクレアーゼ切断反応を用いる場合、初期切断位置及びこれに連続した配列が切断される。上流プローブを使用する場合、切断反応は上記プローブが位置した地点から離れている特定位置で起こり、上記切断反応は上記位置でのみ起こり、連続した切断は起こらない。
本発明の好ましい一実現例によれば、上流プライマー伸長に依存的な初期切断位置は５’→３’の方向に二本鎖の開始ヌクレオチド（すなわち、分岐位置（ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ））に位置することができる。
図９に示すように、上記ヌクレオチド変異区別サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の５’末端に位置する。このような場合に第１の初期切断位置は、５’→３’の方向に３’ターゲッティング部位の５’末端の一部にすぐ隣接して位置する。すなわち、上記第１の初期切断位置は、３’方向にヌクレオチド変異区別サイトにすぐ隣接して位置する。第２の初期切断位置は通常、ヌクレオチド変異区別サイトから３’方向に１ヌクレオチド離隔した位置に位置する。
上記ヌクレオチド変異区別サイトが３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の５’末端から１ヌクレオチド離隔して位置する場合、第１の初期切断位置は５’方向にヌクレオチド変異区別サイトにすぐ隣接して位置する。第２の初期切断位置は通常、ヌクレオチド変異区別サイトから３’方向に１ヌクレオチド離隔した位置に位置する。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記５’末端の一部は部分的に非ハイブリダイゼーション配列（又は非塩基対配列）を含む。上記ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、上記５’末端の一部に非ハイブリダイゼーション配列を導入することは上記５’末端の一部が一本鎖を形成するようにすることに非常に有用である。また、非ハイブリダイゼーション配列の導入は第２の初期切断位置を調節できるようにする。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は、ヌクレオチド変異区別サイトから１〜１０ヌクレオチド（より好ましくは１〜５ヌクレオチド）離隔した位置以内に位置した非塩基対部分（ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を含む。ＰＴＯが変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、上記非塩基対部分は、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部がターゲットヌクレオチド配列と二本鎖を形成することを防止する。
非塩基対部分（例えば、ミスマッチヌクレオチド）の利用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別能力を向上する。
本発明の好ましい一実現例によれば、ヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列にＰＴＯがハイブリダイゼーションされる場合、非塩基対部分は、５’末端の一部がターゲット核酸配列と二本鎖を形成することを抑制しない。
本発明の好ましい一実現例によれば、非塩基対部分は、第１の初期切断位置及び第２の初期切断位置間の距離を拡大させる。
好ましくは、非塩基対部分はヌクレオチド変異区別サイトの下流に位置する。
例えば、非塩基対部分であるミスマッチヌクレオチドが３’方向にヌクレオチド変異区別サイトから２ヌクレオチド離隔した部位に導入される場合、第２の初期切断位置はヌクレオチド変異区別サイトから２ヌクレオチド離隔した位置に調整される。ミスマッチヌクレオチドを使用しない場合、第２の初期切断位置はヌクレオチド変異区別サイトから１ヌクレオチド離隔した位置に位置する。すなわち、非塩基対部分は第１の初期切断位置及び第２の初期切断位置間の距離を拡大させる。
非塩基対部分は、ターゲット核酸配列の間に塩基対を形成しないいずれの部分も含む。好ましくは、非塩基対部分は、（ｉ）人為的なミスマッチ塩基、塩基対ができないように修飾された非塩基対塩基又はユニバーサル塩基を含むヌクレオチド、（ｉｉ）塩基対を形成できないように修飾された非塩基対ヌクレオチド又は、（ｉｉｉ）非塩基対形成化合物（ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）である。
例えば、非塩基対部分は、アルキレン基、リボフラノシルナフタレン、デオキシリボフラノシルナフタレン、メタリン酸塩、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合及びアリールホスホロアミダート結合を含む。従来のカーボンスペーサーもまた非塩基対部分として用いられる。非塩基対部分としてのユニバーサル塩基はＰＴＯの切断位置を調整するのに有用である。
デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５’−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含む塩基対は天然型塩基間の結合力より低い結合力を有し、ユニバーサル塩基は特定のハイブリダイゼーション条件下で非塩基対部分として用いられることができる。
５’末端の一部に導入した非塩基対部分は、好ましくは１〜１０個の部分、より好ましくは１〜５個の部分、さらに好ましくは１〜２個の部分を持つ。５’末端の一部の多数の非塩基対部分は連続的又は不連続的に存在することができる。好ましくは、非塩基対部分は２〜５個の連続的な部分を持つ。
好ましくは、非塩基対部分は非塩基対形成化合物である。
本発明の好ましい一実現例によれば、ヌクレオチド変異区別サイト及びＰＴＯの非塩基対部分は、３’ターゲッティング部位の５’末端から１０ヌクレオチド（より好ましくは８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド又は１ヌクレオチド、さらに好ましくは１ヌクレオチド）離隔した位置以内に位置する。
または、切断反応は上記第１の初期切断位置でのみ行われることができる。例えば、上流プローブが使用され、上記切断反応は上記プローブが位置した地点から離れている特定の位置で起こる場合には、ＰＴＯがマッチテンプレートとハイブリダイゼーションされるとき第１の初期切断位置でのみ切断反応が起こることができる。ＰＴＯとミスマッチテンプレートとがハイブリダイゼーションされる場合、分岐位置（ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ、第２の初期切断位置）は上流プローブから遠く離れているから切断されることができない。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＰＴＯとミスマッチテンプレートとがハイブリダイゼーションされる場合、第２の初期切断位置は一本鎖及び二本鎖を含む構造で二本鎖の開始位置（すなわち、分岐位置）を含む。
一実現例によれば、ＰＴＯはブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による切断に対して耐性を持つ少なくとも１個のヌクレオチドを含むブロッカー部位を持ち、上記ブロッカー部位は第２の初期切断位置に位置する。上記ブロッカー部位は第２の初期切断位置における切断及び連続的な切断を防止する。
ブロッカー部位に含まれるブロッカーの個数は制限されず、好ましくは１〜１０ブロッカー、より好ましくは２〜１０ブロッカー、さらに好ましくは３〜８ブロッカー、最も好ましくは３〜６ブロッカーである。プローブに存在するブロッカーは連続的又は不連続的な方式で存在することができ、好ましくは連続的な方式である。ブロッカーとしてのヌクレオチド、すなわち５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を持つ骨格を含むヌクレオチドは、当業界に知られているいずれのものも含む。例えば、上記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート結合、ホスホネート結合、ホスホロアミダート結合及び２’−炭水化物修飾を含む。本発明のより好ましい実現例によれば、５’→３’エキソヌクレアーゼに対して耐性を持つ骨格を含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合、アリールホスホロアミダート結合、ホスホロセレナート結合、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−Ｏ−アリル修飾、２’−Ｏ−ブチル修飾、α−アノメリックオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）修飾である。
ステップ（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーション
ＰＴＯから放出された断片はＣＴＯとハイブリダイゼーションされる。
第１断片及び第２断片は通常、ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションできる配列を含み、それによって第１断片及び第２断片のうち１つはＣＴＯとハイブリダイゼーションされる。
ミスマッチテンプレートとハイブリダイゼーションされて生成される第２断片は、マッチテンプレートとハイブリダイゼーションされて生成される第１断片と違って、追加的な３’末端部位を含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記第２断片がＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされる場合、ＣＴＯが上記第２断片の上記追加的な３’末端部位とハイブリダイゼーションされず、上記第２断片の伸長が防止されるようにＣＴＯの配列を選択する。例えば、ＣＴＯの配列は第２断片の追加的な３’末端部位の向かい側にミスマッチヌクレオチドを持つように選択されることができる。または、ユニバーサル塩基はミスマッチヌクレオチドの代わりに使用されることができる。
第１の初期切断位置（又は第２の初期切断位置）はある条件では固定されておらず、多数であってもよい。例えば、初期切断位置が５’→３’の方向に一本鎖及び二本鎖を含む構造で、二本鎖（すなわち、分岐位置）の開始ヌクレオチド及び開始ヌクレオチドから１〜２ヌクレオチド離隔した位置に位置することができる。このような場合、好ましくは、ＣＴＯの配列は、本発明において第１の初期切断によって放出される断片のうち最も短い断片が選択的に伸長されてヌクレオチド変異の存在を示す伸長鎖を生成するように選択される。
ステップ（ｄ）：切断断片の伸長
ＣＴＯのキャプチャリング部位と第１断片とがハイブリダイゼーションされると、上記断片は伸長されてＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成される。第２断片がＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされる場合、上記第２断片は伸長されない。
通常、プライマーの伸長はプライマーの３’末端の一部とテンプレートとのハイブリダイゼーションによって調節されることができる。プライマーの配列及び反応条件（例えば、アニーリング温度）を調節することで、３’末端の一部に１〜３ミスマッチヌクレオチドを持つプライマーの伸長を可能にすることができる。または、プライマーの伸長は、プライマーがターゲット配列に完全に相補的な配列を持つときにのみ可能になるようにすることができる。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＣＴＯの配列は、第１断片又は第２断片のうちいずれか１つが選択的に伸長されるように選択される。
本発明の好ましい一実現例によれば、断片の伸長は、断片の３’末端の一部に一つのミスマッチでも存在する場合には伸長されない条件下で行われる。
ステップ（ｅ）：伸長鎖とＳＯとのハイブリダイゼーションによるシグナル生成
上記伸長反応に続き、上記伸長鎖とＳＯとをハイブリダイゼーションさせる。ＰＴＯのヌクレオチド区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異の存在を示すシグナルが生成される。
伸長鎖及びＳＯのハイブリダイゼーションと標識システム及びシグナル生成に関する詳細な内容は、上述した内容によって説明される。
ステップ（ｆ）：シグナルの検出
最終的に、ステップ（ｅ）で提供される検出可能なシグナルを検出するステップであって、上記シグナルの検出は、伸長鎖の存在及びＰＴＯのヌクレオチド区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異の存在を示す。
シグナル検出に関する詳細な内容は、上述した内容によって説明される。
一実現例によれば、本発明は、上流オリゴヌクレオチドに助けられることなくヌクレオチド変異を検出することができる。本発明は、上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素を使用する。ターゲット核酸配列の増幅、反応条件及び５’ヌクレアーゼ活性を考慮するとき、本発明は、好ましくは上流オリゴヌクレオチドを使用して行い、より好ましくは上流プライマーを使用して行う。
ターゲット検出のためのキット
本発明の他の様態によれば、本発明は次を含むＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列をＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いて検出するためのキットを提供する：
（ａ） プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位はターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされず；
（ｂ） 上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ＰＴＯより上流に位置し；上記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による上記ＰＴＯの切断を誘導して上記ＰＴＯの５’タギング部位を含むか又はそれの一部を含む断片を放出し；
（ｃ） キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）；上記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、上記ＰＴＯから放出された断片は上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長されて上記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて伸長二重体を形成し；
（ｄ） ＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；上記ＳＯは上記伸長鎖に相補的な配列を含み、少なくとも１つの標識が結合されており；上記ＳＯは上記伸長鎖とハイブリダイゼーションして検出可能なシグナルを提供する。
本発明のキットは、上述した本発明の検出方法を行うためのものであって、これらの間で共通する内容は本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯの少なくとも一部位は上記伸長配列に相補的な配列を含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、本発明のキットは、（ｉ）上記ＳＯに結合されている標識、（ｉｉ）上記ＳＯに結合されている標識及びＰＴＯから放出された断片に結合された標識の組み合わせ、（ｉｉｉ）上記ＳＯに結合されている標識及び上記伸長鎖に挿入される標識の組み合わせ又は（ｉｖ）上記ＳＯに結合されている標識及びインターカレーティング色素の組み合わせを含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識が結合されている。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯは単一標識が結合されている。
本発明の好ましい一実現例によれば、キットは追加でＳＯをもう１つ含み、上記追加されたＳＯは上記伸長鎖に相補的な配列を含み、上記２つのＳＯは上記伸長鎖に近接してハイブリダイゼーションされ；上記２つのＳＯはそれぞれ相互作用的な二重標識のレポーター分子及びクエンチャー分子のうちいずれか１つの標識を含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯは相互作用的な二重標識のレポーター分子及びクエンチャー分子のうちいずれか１つの標識を含み、上記ＰＴＯから放出された断片は上記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち残りの１つの標識を持つ。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯは相互作用的な二重標識のレポーター分子及びクエンチャー分子のうちいずれか１つの標識を持ち、上記ＣＴＯのテンプレーティング部位は第１の非天然型塩基を有するヌクレオチドを含み、上記キットは、上記第１の非天然型塩基と特異的な結合親和性を持つ第２の非天然型塩基及び上記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち残りの１つの標識を持つヌクレオチドをさらに含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯは相互作用的な二重標識のレポーター分子及びクエンチャー分子のうちいずれか１つの標識を持ち、上記キットは、上記レポーター分子及びクエンチャー分子のうち残りの１つの標識を持つヌクレオチドをさらに含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＳＯはＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）のアクセプターを含み、上記キットはインターカレーティング色素をさらに含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、ＰＴＯ、ＣＴＯ及び／又はＳＯは、伸長されないようにそれの３’末端がブロッキングされている。
本発明の好ましい一実現例によれば、上記上流オリゴヌクレオチドは上流プライマー又は上流プローブである。
本発明の好ましい一実現例によれば、キットは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素をさらに含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、キットは、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、上記上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、上記ＰＴＯは少なくとも２種のＰＴＯを含み、上記ＣＴＯは少なくとも２種のＣＴＯを含み、上記ＳＯは少なくとも２種のＳＯを含む。
本発明の好ましい一実現例によれば、キットは下流プライマーをさらに含む。
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１：ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ； ＰＣＥ−ＳＨ）アッセイの評価
新規なＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ； ＰＣＥ−ＳＨ）アッセイを、（ｉ）指定（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）温度でリアルタイム検出又は（ｉｉ）融解分析方式で行って、ターゲット核酸配列を検出できるかを実験した（参照：図２）。
５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは上流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長のために使用した。
ＰＴＯ及びＣＴＯは標識せず、３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドをターゲットテンプレートとして用いた。ＳＯは５’末端に蛍光レポーター標識分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）を含み、３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）を含む。
本実施例において使用された合成テンプレート、上流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＮＧ−ＣＴＯ ５’−ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＮＧ−ＳＯ−１ ５’−［ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０］ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧ［ＢＨＱ−２］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’タギング部位を示す。）
１−１． 指定温度でリアルタイム検出
２ｐｍｏｌｅのＮＧ遺伝子に対する合成テンプレート（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、１０ｐｍｏｌｅの上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、５ｐｍｏｌｅのＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、０．５ｐｍｏｌｅのＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、０．５ｐｍｏｌｅのＳＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、そして１０μＬの２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ｆｉｎａｌ， ２００μＭ ｄＮＴＰｓ， ２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２， １．６ＵのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）を含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分変性させた後、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返した。発生されたシグナルの検出は、毎サイクルごとにハイブリダイゼーションステップ（６０℃）で行った。検出温度は伸長鎖−ＳＯハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）が二本鎖形態を維持できる範囲で決定した。
図１０Ａに示すように、蛍光シグナルはテンプレートが存在する場合に検出された。テンプレート、ＰＴＯ、ＣＴＯ又はＳＯがない場合、シグナルは検出されなかった。
１−２．融解分析
実施例１−１の反応後、反応混合物を５５℃に冷やし、５５℃で３０秒維持した後、５５℃から８５℃まで徐々に加熱して融解曲線を得た。温度が増加する間、連続的に蛍光を測定して伸長鎖−ＳＯハイブリッドの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図１０Ｂに示すように、テンプレートが存在する場合には、伸長鎖−ＳＯハイブリッドの予測されるＴｍ値（６８．５℃）でピークが検出された。テンプレート、ＰＴＯ、ＣＴＯ又はＳＯがない場合には、ピークが観察されなかった。
実施例２：ＰＣＥ−ＳＨアッセイを用いたターゲット核酸配列の検出
ＰＣＥ−ＳＨアッセイが、（ｉ）リアルタイムＰＣＲ方式又は（ｉｉ）ポストＰＣＲ融解分析方式でターゲット核酸配列を検出できるかを追加で実験した。
５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは上流プライマーと下流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長のために使用した。
ＰＴＯ及びＣＴＯは標識せず、３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。ＮＧ遺伝子のゲノムＤＮＡはターゲットテンプレートとして使用した。ＳＯは５’末端に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）を含み、３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）を含む。
本実施例において使用された上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＮＧ−ＣＴＯ ５’−ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＮＧ−ＳＯ−１ ５’−［ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０］ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧ［ＢＨＱ−２］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング部位を示す。）
２−１．ＰＣＲ中の指定温度でリアルタイム検出
１００ｐｇのＮＧのゲノムＤＮＡ、１０ｐｍｏｌｅの上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、１０ｐｍｏｌｅの下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、５ｐｍｏｌｅのＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、０．５ｐｍｏｌｅのＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、０．５ｐｍｏｌｅのＳＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、そして１０μＬの２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ｆｉｎａｌ， ２００μＭ ｄＮＴＰｓ， ２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２， １．６ＵのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）を含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分変性させた後、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を５０回繰り返した。シグナルの検出は毎サイクルごとにハイブリダイゼーションステップ（６０℃）で行った。検出温度は伸長鎖−ＳＯハイブリッドが二本鎖形態を維持できる範囲で決定した。
図１１Ａに示すように、蛍光シグナル（Ｃｔ： ３０．３４）はテンプレートが存在する場合に検出された。テンプレートがない場合、シグナルは検出されなかった。
２−２．ポストＰＣＲ融解分析
実施例２−１の反応後、反応混合物を５５℃に冷やし、５５℃で３０秒維持した後、５５℃から８５℃まで徐々に加熱して温度が増加する間、連続的に蛍光を測定して伸長鎖−ＳＯハイブリッドの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図１１Ｂに示すように、テンプレートが存在する場合、伸長鎖−ＳＯハイブリッドの予測されるＴｍ値（６８．５℃）でピークが観察された。テンプレートがない場合、ピークは観察されなかった。
実施例３：ＰＣＥ−ＳＨを用いたターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異の識別
ＰＣＥ−ＳＨを通じてターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異を識別できるかを追加で実験した。
５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは上流プライマーと下流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長のために使用した。ＰＴＯ及びＣＴＯは標識せず、３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。ＭＴＨＦＲ遺伝子のＣ６７７Ｔ変異に対するヒトゲノムＤＮＡの野生型（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）（Ｃ）、ヘテロ型（ｈｅｔｅｒｏ−ｔｙｐｅ）（Ｃ／Ｔ）及び変異型（ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ）（Ｔ）をターゲット核酸として使用した。ＳＯは、５’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）を含み、３’末端に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）を含む。
ＰＴＯ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）及びＣＴＯ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）は野生型の検出に使用され、ＰＴＯ−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）及びＣＴＯ−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）は変異型の検出に使用された。野生型遺伝子が存在する場合、ＣＴＯ−１をテンプレートとして伸長鎖（以下、「野生型伸長鎖」）が生成された。変異型遺伝子が存在する場合、ＣＴＯ−２をテンプレートとして伸長鎖（以下、「変異型伸長鎖」）が生成された。融解分析を通じて伸長鎖とＳＯとのハイブリッドを検出するにあたって、１種類のＳＯを使用した場合にも２種類の伸長鎖を別個に検出可能である。例えば、ＳＯとハイブリダイゼーションされる部位でそれぞれ異なる配列を持つように伸長鎖をデザインすれば、ハイブリッドは異なるＴｍ値を持つので、伸長鎖の生成を区別して検出することができる。
本実施例において使用された上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯの配列は次のとおりである：
Ｍ６７７−Ｆ ５’−ＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＩＩＩＩＩＡＡＧＣＡＣＴＴＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｍ６７７−Ｒ ５’ −ＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＡＧＡＴＩＩＩＩＩＧＧＡＣＧＡＴＧＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
Ｍ６７７−ＰＴＯ−１ ５’−ＣＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＣＴ“Ｃ”ＣＧＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧＣＴ［Ｓｐａｃｅｒ Ｃ３］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Ｍ６７７−ＰＴＯ−２ ５’−ＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＣＧＴ“Ａ”ＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧ［Ｓｐａｃｅｒ Ｃ３］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
Ｍ６７７−ＣＴＯ−１ ５’−ＴＣＣＧＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＴＣＧＡＧＡＧＧＧＴＴＧＣＣＴＧＧＧ［Ｓｐａｃｅｒ Ｃ３］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Ｍ６７７−ＣＴＯ−２ ５’−ＴＣＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡＣＧＡＣＧＣＣＴＴＣＧＡＴＡＣＧＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧ［Ｓｐａｃｅｒ Ｃ３］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）
Ｍ６７７−ＳＯ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＣＣＧＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＴＣＧＡ［ＣＡＬ Ｒｅｄ ６１０］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
（Ｉ：デオキシイノシン）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング部位を示す。）
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９における“Ｃ”、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０における“Ａ”はＭＴＨＦＲ遺伝子のＣ６７７Ｔ変異位置の配列を示す。）
３０ｎｇのＭＴＨＦＲ（Ｃ６７７Ｔ）野生型（Ｃ）、ヘテロ型（Ｃ／Ｔ）又は変異型（Ｔ）のヒトゲノムＤＮＡ、１０ｐｍｏｌｅの上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、１０ｐｍｏｌｅの下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、各５ｐｍｏｌｅのＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９及び１０）、各０．１ｐｍｏｌｅのＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１及び１２）、０．５ｐｍｏｌｅのＳＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、そして１０μＬの２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ｆｉｎａｌ， ２００μＭ ｄＮＴＰｓ， ２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２， １．６ＵのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）を含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分変性させた後、９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を４０回繰り返した。反応後、反応混合物を４５℃に冷やし、４５℃で３０秒維持した後、４５℃から８５℃まで徐々に加熱して融解曲線を得た。温度が増加する間、連続的に蛍光を測定して伸長鎖−ＳＯハイブリッドの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図１２に示すように、野生型テンプレートが存在する場合、野生型伸長鎖−ＳＯハイブリッドの予測されるＴｍ値（７１．０℃）でピークが観察された。変異型テンプレートが存在する場合、変異型伸長鎖−ＳＯハイブリッドの予測されるＴｍ値（５５．５℃）でピークが検出された。ヘテロ型テンプレートが存在する場合、７１．０℃（野生型）及び５５．５℃（変異型）でピークが観察された。何のテンプレートもない場合には、ピークは観察されなかった。
実施例４：ＰＴＯの上流オリゴヌクレオチド独立的な切断を用いるＰＣＥ−ＳＨの評価
上流オリゴヌクレオチドを使用せずにＰＣＥ−ＳＨアッセイを（ｉ）指定温度でリアルタイム検出又は（ｉｉ）融解分析方式で行って、ターゲット核酸配列を検出できるかを追加で実験した。
５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長のために使用した。
ＰＴＯ及びＣＴＯは標識せず、３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドをターゲットテンプレートとして使用した。ＳＯは５’末端に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）を含み、３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）を含む。
本実施例において使用された合成テンプレート、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＳＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＮＧ−ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＮＧ−ＣＴＯ ５’−ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＮＧ−ＳＯ−１ ５’−［ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０］ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧ［ＢＨＱ−２］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’タギング部位を示す。）
４−１．指定温度でリアルタイム検出
２ｐｍｏｌｅのＮＧ遺伝子に対する合成テンプレート（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、５ｐｍｏｌｅのＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、０．５ｐｍｏｌｅのＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、０．５ｐｍｏｌｅのＳＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、そして１０μＬの２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ｆｉｎａｌ， ２００μＭ ｄＮＴＰｓ， ２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２， １．６Ｕの Ｈ−Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）を含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分変性させた後、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返した。発生されたシグナルの検出は毎サイクルごとにハイブリダイゼーションステップ（６０℃）で行った。検出温度は伸長鎖−ＳＯハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）が二本鎖形態を維持できる範囲で決定した。
図１３Ａに示すように、蛍光シグナルはテンプレートが存在する場合に検出された。テンプレートがない場合、シグナルは検出されなかった。
４−２．融解分析
実施例４−１の反応後、反応混合物を５５℃に冷やし、５５℃で３０秒維持した後、５５℃から８５℃まで徐々に加熱して融解曲線を得た。温度が増加する間、連続的に蛍光を測定して伸長鎖−ＳＯハイブリッドの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図１３Ｂに示すように、テンプレートが存在する場合、伸長鎖−ＳＯハイブリッドの予測されるＴｍ値（６８．５℃）でピークが観察された。テンプレートがない場合にはピークは観察されなかった。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、本発明の範囲がこれに制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれの等価物によって定義されると言える。

Claims (45)

  1. 次のステップを含むＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列をＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いて検出する方法：
    （ａ） 前記ターゲット核酸配列を、上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、並びにプロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；前記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記ＰＴＯの５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ＰＴＯより上流に位置し；
    （ｂ） 前記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素にステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、前記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ前記酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、前記ＰＴＯの５’タギング部位を含むか又はそれの一部を含む断片を放出し；
    （ｃ） 前記ＰＴＯから放出された前記断片とキャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された断片は前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
    （ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び前記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた前記断片は伸長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて伸長二重体を形成し、
    （ｅ） 前記伸長鎖とＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、前記ＳＯは前記伸長鎖に相補的な配列を含み、少なくとも１つの標識が結合されており；前記ＳＯは前記伸長鎖とハイブリダイゼーションして検出可能なシグナルを提供し；及び
    （ｆ） 前記シグナルを検出するステップであって、前記シグナルの検出は前記伸長鎖の存在を示し、前記伸長鎖の存在は前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
  2. 前記ＳＯの少なくとも一部位は、前記伸長配列に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記検出可能なシグナルは、（ｉ）前記ＳＯに結合されている標識、（ｉｉ）前記ＳＯに結合されている標識及び前記ＰＴＯから放出された断片に結合された標識、（ｉｉｉ）前記ＳＯに結合されている標識及びステップ（ｄ）の伸長過程で前記伸長鎖に挿入される標識又は（ｉｖ）前記ＳＯに結合されている標識及びインターカレーティング色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅ）から提供されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識が結合されており、前記ステップ（ｅ）で前記ＳＯと前記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的な二重標識からのシグナルの変化をもたらして検出可能なシグナルを提供することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＳＯは単一標識が結合されており、前記ステップ（ｅ）で前記ＳＯと前記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、前記単一標識からのシグナルの変化をもたらして前記検出可能なシグナルを提供することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 前記単一標識は単一蛍光標識であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 前記方法は追加でＳＯをもう１つ含み、前記追加されたＳＯは前記伸長鎖に相補的な配列を含み、前記２つのＳＯは前記伸長鎖に近接してハイブリダイゼーションされ；前記２つのＳＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうちいずれか１つの標識をそれぞれ含み、前記２つのＳＯと前記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的な二重標識からのシグナルの変化をもたらして検出可能なシグナルを提供することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 前記ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうちいずれか１つの標識を持ち、前記ＰＴＯから放出された断片は前記相互作用的な二重標識のうち残りの１つの標識を持ち、前記伸長鎖は前記ＰＴＯから放出された断片に由来する標識を持ち；前記ＳＯと前記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的な二重標識からのシグナルの変化をもたらして検出可能なシグナルを提供することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 前記ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうちいずれか１つの標識を持ち、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は第１の非天然型塩基を有するヌクレオチドを含み、前記ステップ（ｄ）の伸長反応は、前記第１の非天然型塩基と特異的な結合親和性を持つ第２の非天然型塩基及び前記相互作用的な二重標識のうち残りの１つの標識を持つヌクレオチドの存在下で行われ、これによって前記伸長鎖に標識が挿入され；前記ＳＯと前記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的な二重標識からのシグナルの変化をもたらして検出可能なシグナルを提供することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  10. 前記ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうちいずれか１つの標識を持ち、前記ステップ（ｄ）の伸長反応は前記相互作用的な二重標識のうち残りの１つの標識を持つヌクレオチドの存在下で行われ、これによって前記伸長鎖に標識が挿入され；前記ＳＯと前記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的な二重標識からのシグナルの変化をもたらして検出可能なシグナルを提供することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 前記ＳＯはＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）のアクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）を含み、前記ステップ（ｅ）のハイブリダイゼーション反応はインターカレーティング色素の存在下で行い；前記ＳＯと前記伸長鎖との間のハイブリダイゼーションは、前記ＳＯに結合された前記アクセプターからのシグナル変化をもたらして検出可能なシグナルを提供することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  12. 前記ＰＴＯ、ＣＴＯ及び／又はＳＯは、伸長されないようにそれの３’末端がブロッキングされていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  13. 前記上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  14. 前記上流オリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ前記酵素によって前記ＰＴＯの切断反応を誘導する程度に前記ＰＴＯに近接していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  15. 前記上流プライマーは、それの伸長鎖によって５’ヌクレアーゼ活性を持つ前記酵素による前記ＰＴＯの切断反応を誘導することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  16. 前記ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端部位は、前記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の一部の配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  17. 前記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の一部の配列に相補的なヌクレオチド配列は、１〜１０個のヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  18. 前記方法は、前記ステップ（ｅ）及びステップ（ｆ）の間にステップ（ｅ）でのハイブリダイゼーション結果物を融解させるか又は融解後にハイブリダイゼーションさせて検出可能なシグナルを提供するステップをさらに含み、前記ステップ（ｆ）は、前記シグナルを検出して伸長鎖の存在を検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  19. 前記方法は、前記ステップ（ｆ）後にステップ（ｅ）でのハイブリダイゼーション結果物を融解させるか又は融解後にハイブリダイゼーションさせて検出可能なシグナルを提供するステップをさらに含み、前記シグナルを検出して伸長鎖の存在をもう一度検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  20. 前記伸長鎖の存在は、融解曲線分析（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）又はハイブリダイゼーション曲線分析（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって検出することを特徴とする請求項１８から１９のいずれかに記載の方法。
  21. 前記ステップ（ｄ）と（ｅ）との間に変性ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  22. 前記ステップ（ａ）〜（ｆ）の全体又は一部を変性を含んで繰り返しさらに行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  23. 前記方法は、前記ステップ（ａ）〜（ｅ）を変性を含んで繰り返し行い、ステップ（ｅ）のハイブリダイゼーション結果物を融解させるか又は融解後にハイブリダイゼーションさせて検出可能なシグナルを提供するステップをさらに含み、前記ステップ（ｆ）は、前記シグナルを検出して伸長鎖の存在を検出することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１つの反応容器で行うか又は前記ステップ（ａ）〜（ｆ）中の一部は別途の反応容器で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  25. 前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するための方法であって、前記上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは少なくとも２種のＣＴＯを含み、前記ＳＯは少なくとも２種のＳＯを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  26. 前記ステップ（ａ）で前記上流オリゴヌクレオチドは上流プライマーであり、前記ステップ（ｂ）で上流プライマーを伸長するために鋳型依存的な核酸ポリメラーゼを使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  27. 前記ターゲット核酸配列はヌクレオチド変異を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  28. 前記方法は、下流プライマーの存在下で行うことを特徴とする請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
  29. 次のステップを含むＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列をＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いて検出する方法：
    （ａ） 前記ターゲット核酸配列を、上流プライマー及び下流プライマーを含むプライマー対、並びにプロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；前記上流プライマー及び下流プライマーはそれぞれ前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；前記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記ＰＴＯの５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；前記ＰＴＯは前記上流プライマー及び下流プライマーの間に位置し；前記ＰＴＯは伸長されないようにそれの３’末端がブロッキングされており；
    （ｂ） 前記ＰＴＯの切断及びプライマー伸長のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的な核酸ポリメラーゼにステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、前記ＰＴＯが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされると、前記上流プライマーは伸長され、前記伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ前記鋳型依存的な核酸ポリメラーゼによる前記ＰＴＯの切断を誘導して、前記ＰＴＯの５’タギング部位を含むか又はそれの一部を含む断片を放出し；
    （ｃ） ステップ（ｂ）で前記ＰＴＯから放出された前記断片とキャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された断片は前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
    （ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び前記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた前記断片は伸長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて伸長二重体を形成し、
    （ｅ） 前記伸長鎖とＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、前記ＳＯは前記伸長鎖に相補的な配列を含み、少なくとも１つの標識が結合されており；前記ＳＯは前記伸長鎖とハイブリダイゼーションして検出可能なシグナルを提供し；及び
    （ｆ） 前記シグナルを検出するステップであって、前記シグナルの検出は前記伸長鎖の存在を示し、前記伸長鎖の存在は前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
  30. 次のステップを含むＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列をＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いて検出する方法：
    （ａ） 前記ターゲット核酸配列を、プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；前記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記ＰＴＯの５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
    （ｂ） 前記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素にステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、前記ＰＴＯは５’ヌクレアーゼ活性を持つ前記酵素によって切断されて前記ＰＴＯの５’タギング部位を含むか又はそれの一部を含む断片を放出し；
    （ｃ） 前記ＰＴＯから放出された前記断片とキャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された断片は前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
    （ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び前記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた前記断片は伸長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて伸長二重体を形成し、
    （ｅ） 前記伸長鎖とＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、前記ＳＯは前記伸長鎖に相補的な配列を含み、少なくとも１つの標識が結合されており；前記ＳＯは前記伸長鎖とハイブリダイゼーションして検出可能なシグナルを提供し；及び
    （ｆ） 前記シグナルを検出するステップであって、前記シグナルの検出は前記伸長鎖の存在を示し、前記伸長鎖の存在は前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
  31. 次のものを含むＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列をＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＰＣＥ−ＳＨ）を用いて検出するためのキット：
    （ａ） プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＰＴＯ）；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；前記ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記ＰＴＯの５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
    （ｂ） 上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ＰＴＯより上流に位置し、前記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、前記ＰＴＯの５’タギング部位を含むか又はそれの一部を含む断片を放出し；
    （ｃ） キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ： ＣＴＯ）；前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むか又はそれの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位それぞれに非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、前記ＰＴＯから放出された断片はＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた前記断片は伸長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成されて伸長二重体を形成し；及び
    （ｄ） ＳＯ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；前記ＳＯは前記伸長鎖に相補的な配列を含み、少なくとも１つの標識が結合されており；前記ＳＯは前記伸長鎖とハイブリダイゼーションして検出可能なシグナルを提供する。
  32. 前記ＳＯの少なくとも一部位は前記伸長配列に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  33. 前記キットは、（ｉ）前記ＳＯに結合されている標識、（ｉｉ）前記ＳＯに結合されている標識及びＰＴＯから放出された断片に結合された標識、（ｉｉｉ）前記ＳＯに結合されている標識及び伸長過程で前記伸長鎖に挿入される標識又は（ｉｖ）前記ＳＯに結合されている標識及びインターカレーティング色素を含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  34. 前記ＳＯは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識が結合されていることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  35. 前記ＳＯは単一標識が結合されていることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  36. 前記キットは追加でＳＯをもう１つ含み、前記追加されたＳＯは前記伸長鎖に相補的な配列を含み、前記２つのＳＯは前記伸長鎖に近接してハイブリダイゼーションされ；前記２つのＳＯはそれぞれレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうちいずれか１つの標識を含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  37. 前記ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうちいずれか１つの標識を持ち、前記ＰＴＯから放出された断片は前記相互作用的な二重標識のうち残りの１つの標識を持つことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  38. 前記ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうちいずれか１つの標識を持ち、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は第１の非天然型塩基を有するヌクレオチドを含み、前記キットは、前記第１の非天然型塩基と特異的な結合親和性を持つ第２の非天然型塩基及び前記相互作用的な二重標識のうち残りの１つの標識を持つヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  39. 前記ＳＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうちいずれか１つの標識を持ち、前記キットは前記相互作用的な二重標識のうち残りの１つの標識を持つヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  40. 前記ＳＯはＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）のアクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）を含み、前記キットはインターカレーティング色素をさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  41. 前記ＰＴＯ、ＣＴＯ及び／又はＳＯは、伸長されないようにそれの３’末端がブロッキングされていることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  42. 前記上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブであることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  43. 前記キットは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素をさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  44. 前記キットは少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するためのキットであり、前記上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは少なくとも２種のＣＴＯを含み、前記ＳＯは少なくとも２種のＳＯを含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  45. 前記キットは下流プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項３１から４４のいずれかに記載のキット。
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