JP2004305219A - 核酸の測定方法に用いる核酸プローブおよびデータを解析する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定する核酸の新規測定法、該法を用いたリアルタイム定量的PCR法、及び該PCR法で得られるデーターの解析の際、アニーリング反応時の蛍光強度値を、変性反応時のもので補正する過程を有するデータ解析法を提供する。
【選択図】 なし
Description
(1)ドットブロッテング法
この方法は、標的核酸と当該核酸プローブをメンブラン上でハイブリダイゼーションさせた後、未反応の核酸プローブを洗い流し、標的核酸とハイブリダイゼーションした核酸プローブに標識された蛍光色素分子のみの蛍光強度を測定するものである。
この方法は、インターカレーターと称されるある種の蛍光色素が核酸の二重鎖内にはまりこんだときに、強く発光するのでその発光の増加量を測定する方法である。その蛍光色素として、例えば、エチジウムブロマイド(非特許文献2)、SYBR R グリーン(Green) I(非特許文献3)を挙げることができる。
この方法で使用する核酸プローブは、核酸プローブの一端にレポーター色素、他端にクエンチャー色素が標識さている。そしてその両端部は塩基配列において互いに相補性があるので、プローブ全体としてhairpin stemを形成するように塩基配列が設計されている。その構造のために液中に浮遊している状態では、Forster共鳴エネルギーのため、レポーター色素の発光は、クエンチャー色素により抑制されている。しかし、標的核酸にハイブリダイゼーションするとhairpin stem構造が壊れるために、レポーター色素とクエンチャー色素の距離が大きくなるので、Forster共鳴エネルギーの移動が起こらなくなる。そのために、レポーター色素の発光が起こるようになる。
デービスは、オリゴヌクレオチドの3’末端に蛍光色素を、炭素原子18個を有するスペサーを介して結合したプローブを作成した。これをフローサイトメトリーに適用した。3’末端に蛍光色素を直接に結合した場合より、ハイブリダイゼーションした場合、10倍の蛍光強度が得られることを報告した。
これらの方法は、核酸の各種測定方法、HISH方法(fluorescent in situ hybridization assays)、PCR方法、LCR方法(ligase chain reaction)、SD方法( strand displacement assays)、競合的ハイブリダイゼーション方法(competitive hybridization)などに適用されてめざましい発展をとげている。
1)蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法において、上記核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、上記核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法、また、
2)蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部において、当該プローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした末端塩基から1ないし3塩基離れて、標的核酸の塩基配列にG(グアニン)が少なくとも1塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ、または、 蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが、標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部分においてハイブリダイゼーションの塩基対がG(グアニン)とC(シトシン)のペアーを少なくも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ、また、それらのプローブを用いる核酸測定方法、また、
4)標的核酸若しくは遺伝子の多型または/および変異を解析若しくは測定する測定キットにおいて、前記2)に記載の核酸プローブを含有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または/および変異を解析若しくは測定する測定キット、また、
7)前記5)に記載の補正処理過程をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、
9)前記1)、2)、8)に記載の核酸測定方法を用いるHISH(fluorescent in situ hybridization assays)方法、また、
11)前記1)、2)に記載の核酸測定方法を用いるPCR方法、また、
12)前記11)に記載のPCR方法によって得られるデータ解析方法、また、
13)前記11)に記載のPCR方法を用いる核酸の融解曲線解析方法、また、
14)前記12)と13)を融合させた解析方法、また、
15)前記11)、12)、13)又は14)に記載の解析方法により解析する手段を有するPCRの測定及び/又は解析装置、また、
17)前記12)、又は14)に記載のデータ解析方法を利用することを特徴とする核酸の定量方法、また、
18)前記15)に記載のPCRの測定及び/又は解析装置を用いる核酸の測定方法、また、
19)前記16)に記載の記録媒体を用いることを特徴とする核酸の測定方法、を提供する。
1)前記のように本発明の核酸測定方法、本発明のプローブ及びデバイスを用いると、測定系から未反応の核酸プローブを除く等の操作をすることがないので、標的核酸を短時間でかつ簡便に測定できる。また、複合微生物系又は共生微生物系に適用すると、当該系における特定菌株の存在量を特異的かつ短時間に測定できる。また、本発明は標的核酸若しくは遺伝子のSNPなどの多型または変異などの解析若しくは測定する簡便な方法を提供している。
2)また、本発明の定量的PCR方法は、次のような効果を有する。
a.TaqDNAポリメラーゼによる標的核酸の増幅に阻害的に作用する因子が添加されていないことから、従来公知の特異性のある通常のPCRと同様の条件で定量的PCRを行うことができる。
b.また、PCRの特異性を高く保つことができるので、プライマーダイマーの増幅が遅くなることから、従来公知の定量的PCRと比較すると定量限界が約1オーダー低くなる。
c.複雑な核酸プローブを用意する必要がないので、それに要する時間と費用が節約できる。
d.標的核酸の増幅効果も大きく、増幅過程をリアルタイムでモニタリングすることができる。
3)また、リアルタイム定量的PCR方法で得られたデーターを解析する際、本発明のデーター解析方法を用いて、未知核酸コピー数の核酸試料について核酸のコピー数を求める検量直線を作成すると、検量線の相関係数は従来の方法により得られたものに較べて格段に高い。それで、本発明のデーター解析方法を用いると核酸の正確なコピー数を求めることができる。
4)また、本発明のリアルタイム定量的PCR方法によって得られたデーターの解析方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その解析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的PCRの測定若しくは解析装置を用いると、相関係数の高い検量直線を自動的に作成することができる。
5)また、本発明の新規な核酸の融解曲線の分析方法を用いると、精度の高い、核酸のTm値を求めることができる。更に、当該方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その分析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的PCRの測定若しくは解析装置を用いると、正確なTm値を求めることができる。
本発明において、DNA、RNA、cDNA、mRNA、rRNA、XTPs、dXTPs、NTPs、dNTPs、核酸プローブ、ヘルパー核酸プローブ(又は核酸ヘルパープローブ、又は単にヘルパープローブ)、ハイブリダイズ、ハイブリダイゼーション、インターカレーター、プライマー、アニーリング、伸長反応、熱変性反応、核酸融解曲線、PCR、RT−PCR、RNA−primed PCR、Stretch PCR、逆PCR、Alu配列を利用したPCR、多重PCR、混合プライマーを用いたPCR、PNAを用いたPCR法、ハイブリダイゼーション方法(hybridization assays)、HISH(fluorescent in situ hybridization assays)方法、PCR方法(polymerase chain assays )、LCR方法(ligase chain reaction)、 SD方法(strand displacement assays)、競合的ハイブリダイゼーション方法( competitive hybridization)、DNAチップ、核酸検出用(遺伝子検出用)デバイス,SNP(スニップ:一塩基置換多型)、複合微生物系等の用語は、現在、分子生物学、遺伝子工学、微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
本発明の第一の特徴は、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる標的核酸の測定方法において、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに生ずる、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することにある。
蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法とは、ハイブリダイゼーション方法(hybridization assays)、HISH方法(fluorescent in situ hybridization assays)、PCR方法(polymerase chain assays)、LCR方法(ligase chain reaction)、SD方法(strand displacement assays)、 競合的ハイブリダイゼーション方法(competitive hybridization)などのことをいう。これらの方法では、蛍光色素で標識された核酸プローブを加えた後、標的核酸にハイブリダイゼーションしなかった未反応の当該核酸プローブの蛍光色素を測定系から洗浄等の方法で除去し、標的核酸にハイブリダイゼーションした当該核酸プローブに標識された蛍光色素を当該プローブから直接的に、又は当該プローブに間接的な手段を施して(例えば、酵素を作用させたりして)、発光させて、その発光量を測定する方法である。本発明はこのような複雑な操作をしないで目的核酸を測定することに特徴がある。
(1)当該プローブにハイブリダイゼーションした標的核酸の末端塩基部から1ないし3塩基離れて、標的核酸の塩基配列にG(グアニン)がすくなとも1塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されいる塩基配列、
(2)プローブの末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッド複合体の塩基対がG(グアニン)とC(シトシン)のペアーを少なくとも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されている塩基配列、が好ましい。
以上のようにして本発明の核酸プローブが調製できるが、好ましいプローブの形態は、3’又は5’末端が蛍光色素が標識されたものであり、その標識されている末端の塩基がG又はCであるものである。5’末端が標識され、3’末端が標識されていない場合、3’末端のリボース又はデオキシリボースの3’位CのOH基をリン酸基等、また3’末端のリボースの2’位CのOH基をリン酸基等で修飾してもよく何ら制限されない。
それで本発明は、標的核酸若しくは遺伝子の多型(polymorphism)または/および変異(mutation)を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法を提供する。
この場合、塩基配列の異なる多くの本発明のプローブを、個別に同一固体表面上に結合していデバイスをつくることにより、同時に多種遺伝子を検出定量できる。
このデバイスにおいては、プローブ毎に、前記固体のプローブを結合したと反対側の面に少なくとも一つの温度センサーとヒーターが設け、そのプローブを結合した前記固体の領域が最適温度条件になるように温度調節され得るように設計されているのが好適である。
蛍光色素で標的核酸を標識するには、例えば、特定mRNAを標的とした場合、次のstepsを取る:(1)細胞から抽出されたmRNA全部を抽出する。(2)それから、逆転写酵素(reverse transcriptase)を用いて、蛍光色素で修飾されヌクレオサイドをとり込ませながらcDNAを合成する。本発明ではこのような操作は必要がない。
以下に測定法を述べる。
本発明の測定方法において、先ず、測定系に前記の核酸プローブを添加し、標的核酸にハイブリダイゼーションさせる。その方法は、通常の既知方法で行なうことができる(Analytical Biochemistry、 183巻、 231〜244頁、 1989年; Nature Biotechnology、 14巻、 303〜308頁、 1996年; Applied and Environmental Microbiology、 63巻、 1143-1147頁、 1997年)。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、塩濃度が0〜2モル濃度、好ましくは0.1〜1.0モル濃度、pHは6〜8、好ましくは6.5〜7.5である。
前記のようにして、本発明において核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせる。そして、ハイブリダイゼーションの前後で、蛍光色素の発光量を蛍光光度計で測定し、発光の減少量を計算する。その減少量の大きさは標的核酸量と比例するので、標的核酸の量を求めることができる。
a)FISH方法に適用した場合
即ち、本発明は色々の種類の微生物若しくは他の動物や植物が混在していて、相互に単離できない微生物系(複合微生物系、共生微生物系)の細胞内若しくは細胞のホモジネート等の核酸測定に好適に適用できる。ここでいう微生物とは一般的にいう微生物のことで、特に限定されるものではない。例えば、真核微生物、原核微生物、その他、マイコプラズマ、ウイルス、リッケチャ等を挙げることができる。そして、特定配列を有する核酸とは、これらの微生物系において、例えば、どのように活躍しているのか調べたい菌株の細胞に特異性を有する塩基配列をもつ核酸のことである。例えば、特定菌株の5SrRNA、16SrRNA若しくは23SrRNA又はそれらの遺伝子DNAの特定配列である。
前記のような条件で核酸プローブを特定菌株の5SrRNA、16SrRNA若しくは23SrRNA又はそれの遺伝子DNAにハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後の複合微生物系又は共生微生物系の蛍光色素の発光の減少量を測定する。
PCR methodsであればどのような方法でも適用できるのであるが、リアルタイム定量的PCR方法に適用する場合を以下に記す。
即ち、リアルタイム定量的PCR方法において、本発明の特定の核酸プローブを用いてPCRを行い、反応前後の蛍光色素の発光の減少をリアルタイムで測定するものである。
本発明のPCRとは各種方法のPCRを意味するものである。例えば、RT−PCR、RNA−primed PCR、Stretch PCR、逆PCR、Alu配列を利用したPCR、多重PCR、混合プライマーを用いたPCR、PNAを用いたPCR法等をも含む。また、定量的とは、本来の定量測定の他に、検出程度の定量測定をも意味するものとする。
(1)5’末端部、好ましくは5’末端が、本発明の実施に有用な蛍光色素で標識され、標的核酸に当該末端部においてハイブリダイゼーションしたとき、当該プローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした5’末端の塩基部分から1〜3塩基5’側に離れて、標的核酸の塩基配列にG(グアニン)が少なくとも1塩基以上存在するように、塩基配列が設計されている。
(2)前記(1)のプローブの内、3’末端が蛍光色素で標識されているプローブ。
(4)3’末端部、好ましくは3’末端が、本発明の蛍光色素で標識され、3’末端の塩基がG又はCであるもの、または3’末端のリボースの2’位のOH基がリン酸基等で修飾されいるもの。
(5)前記(1)のプローブのうち、5’末端部、好ましくは5’末端が、本発明の蛍光色素で標識されているもの。
(6)5’末端部、好ましくは5’末端が、本発明の実施に有用な蛍光色素で標識され、5’末端の塩基がG又はCであるもの。
この場合、当該プローブが標的核酸とハイブリダイゼーションしたときのそのハイブリダイゼーション物のTmが、プライマーのハイブリダイゼーション物のTm値の±15℃、好ましくは±5℃の範囲になるように、(2)、(3)、(4)のプローブの塩基配列が設計されることが望ましい。プローブのTm値が、プライマーのTm値−5℃、特に−15℃未満であると、プローブがハイブリダイゼーションしないために、蛍光色素の発光の減少は起こらない。反対にプライマーのTm値+5℃、特に+15℃を超えると、プローブが目的としない標的核酸ともハイブリダイゼーションするので、プローブの特異性が失われる。
この場合、本発明のプローブの塩基配列を、SNP(スニップ;一塩基置換多型)を含む領域と相補的な配列にすることで、PCR終了後、その核酸の本発明のプローブから解離曲線を解析することにより、その解離曲線の違いからSNPの検出ができる。本発明のプローブの配列としては、SNPを含む配列と相補的な塩基配列を使用すれば、プローブ配列とSNPを含む配列との解離曲線より得られるTm値は、SNPを含まない配列との解離曲線から得られるTm値より高くなる。
リアルタイム定量的PCR方法は、現在、PCRを行わせる反応装置、蛍光色素の発光を検出装置、ユーザーインターフェース、即ち、データー解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体(別称:Sequence Detection Software System)、及びそれらを制御し、データー解析するコンピュータから構成される装置で、リアルタイムで測定されている。それで、本発明の測定もこのような装置で行われる。
第一の特徴は、リアルタイム定量的PCR方法で得られたデーターを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、各サイクルにおける前記の結合したもの、あるいは前記のハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程、即ち、補正演算処理過程である。
また、「前記の結合したもの、あるいは前記のハイブリダイズしたものが解離したときの反応系」とは、PCRの各サイクルにおける核酸の熱変性の反応系、具体的には、例えば、反応温度90〜100℃、好ましくは94〜96℃のときのものである。
fn=fhyb,n/fden,n 〔数式1〕
fn=fden,n/fhyb,n 〔数式2〕
〔式中、
fn:〔数式1〕あるいは〔数式2〕により算出されたnサイクルにおける補正演算処理値、
fhyb,n:nサイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値、
fden,n:nサイクルにおける、前記の結合したもの、あるいはハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値〕。
尚、本過程においては、本過程で得られた補正演算処理値若しくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び/又は印字する過程を含むものである。
Fn=fa/fn 〔数式4〕
〔式中、
Fn:nサイクルにおける、〔数式3〕あるいは〔数式4〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率、
fn:〔数式1〕あるいは〔数式2〕による補正演算処理値
fa:〔数式1〕あるいは〔数式2〕による補正演算処理値で、fnの変化が観察される以前の任意のサイクル数のものであるが、通常は、例えば、10〜40サイクルのもの、好適には15〜30サイクルのもの、より好適には20〜30サイクルのものが採用される。〕。
尚、本過程においては、本過程で得られた算出値、比較値若しくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び/又は印字する過程を含むものであるが、〔数式1〕あるいは〔数式2〕による補正演算処理値については、それらの過程は含むものであっても、含まないものであってもよい。
31)〔数式3〕あるいは〔数式4〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデーターを用いて、〔数式5〕、〔数式6〕あるいは〔数式7〕による演算処理する過程、
logb(Fn)、ln(Fn) 〔数式5〕
logb{(1−Fn)×A}、ln{(1−Fn)×b} 〔数式6〕
logb{(Fn−1)×A}、ln{(Fn−1)×A} 〔数式7〕
A、b:任意の数値、好ましくは整数値、より好ましくは自然数である。そして、A=100、b=10のときは、{(Fn−1)×A}は百分率(%)を表す。
Fn:〔数式3〕あるいは〔数式4〕により算出されたnサイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化率〕、
32)前記31)の演算処理値が一定値に達したサイクル数を求める演算処理過程、
33)既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過程、
34)未知試料におけるPCR開始時の標的核酸のコピー数を求める演算処理過程、
を有するデータ解析方法である。そして、31)→32)→33)→34)の順からなる過程が好適である。
尚、〔数式1〕あるいは〔数式2〕による補正演算処理値、〔数式3〕あるいは〔数式4〕による算出処理値は、各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び/又は印字されても、されなくてもよいので、それらの過程は必要に応じて追加すればよい。
即ち、本発明のPCR法により増幅された核酸について、低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げる過程(例えば、50℃から95℃まで)、この過程において、短い時間間隔(例えば、0.2℃〜0.5℃間隔)で蛍光強度を測定する過程、測定結果を時間毎にデスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の融解曲線を表示する過程、この融解曲線を一次微分する過程、その値(−dF/dT、F:蛍光強度、T:時間)を微分値としてデスプレー上に表示する過程、その微分値から変曲点を求める過程からなる、解析方法である。本発明においては、蛍光強度は温度が上がるごとに増加する。本発明においては、各サイクルにおける核酸伸長反応時、好ましくはPCR反応終了時の蛍光強度値を熱変性反応時の蛍光強度値を用いて割る演算処理する過程を上記の過程に追加することにより、より好ましい結果が得られる。
実施例1
大腸菌(Escherichia coli)の16SrRNAの核酸塩基配列にハイブリダイゼーションする、即ち、(3')CCGCTCACGCATC(5')の塩基配列を有する核酸プローブの調製を以下の通りに行った。
溶出ソルベントA:0.05N TEAA 5%CH3CN
溶出ソルベントB(グラジエント(gradient)用):0.05N
TEAA 40%CH3CN
カラム:CAPCEL PAK C18; 6×250mm
溶出速度:1.0ml/min
温度:40℃
検出:254nm
殺菌したニュウトリエントブロス(NB)(Difco社製)液体培地50ml(組成:NB、0.08g/100ml)を含有する200ml容の三角フラスコを用いて、大腸菌JM109株を37℃で一晩振蘯培養した。次に、本培養液に99.7%エタノールを当量添加した。このエタノール添加培養液2mlを2.0ml容量のエッペンドルフ遠心チューブで遠心分離し、菌体を得た。30mMリン酸緩衝液(ソーダ塩)(pH:7.2)100μlで菌体を一回洗浄した。菌体を130mMのNaCl含有の前記リン酸緩衝液100μlに懸濁した。当該懸濁液を氷冷中で40分間超音波処理し(出力:33w、発振周波数:20kHz、発振法:0.5秒発振、0.5秒休止)、ホモジネートを作製した。
核酸プローブの調製:大腸菌JM109株の23SrRNAにハイブリダイゼーションする(5')CCCACATCGTTTTGTCTGGG(3')の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオチドの3’位炭素のOH基に、−(CH2)7−NH2を結合したものを、実施例1と同様にメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社(Midland Certified Reagent Company、米国)から購入した。更に、実施例1と同様にモレキュラープローブ(Molecular Probes)社からフロオ・リポーターキット(FluoReporter Kit) F-6082 (ボデピーFLのプロピオン酸サクシニミジルエステル(BODIPY FL propionic acid succinimidyl ester)の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット)を購入した。当該キットを前記オリゴヌクレオチドに作用させて、ボデピーFLで標識した核酸プローブを合成した。得られた合成物を実施例1と同様に精製して、最初のオリゴヌクレオチド原料2mMより25%の収率でボデピーFLで標識した核酸プローブを得た。
実施例2で得られた大腸菌JM109株の菌体に実施例2と同一の培地及び培養条件で調製したシュウドモナス・プウシモビルス 421Y株(Pseudomonas paucimobilis)(現在名:スフィンゴモナス・プウシモビルス)(FERM P-5122)の菌体をOD660値で大腸菌JM109株と同濃度混合し、複合微生物系を調製した。得られた混合液(大腸菌JM109株の菌体濃度は実施例2と同一)について実施例2と同じ方法によりホモジネートを調製した。実施例3で調製した核酸プローブを用いて、励起光を543nm、また、測定蛍光色を569nmにする以外は、実施例2と同様な実験を行った結果、実施例2と同様な結果を得た。
蛍光消光現象における標的核酸の塩基選択性、即ち、本発明の塩基特異性を検討した。下記に示す標的合成デオキシリボオリゴヌクレオチド(30mer)のpoly a〜jの10種類をDNA合成機ABI394(Perkin Elmer社製、米国)で調製した。
上記の合成DNAに対応するプライマーDNAの5’末端のリン酸基に、−(CH2)6−NH2を結合したものをメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社(Midland Certified Reagent Company、米国)から購入した。更に、モレキュラープローブ(Molecular Probes)社からフロオ・リポーターキット(FluoReporter Kits)F−6082(ボデピーFLのプロピオン酸サクシニジルエステル(BODIPY FL propionic acid succinidyl esters)の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット)を購入した。当該キットを前記購入のプライマーDNAに作用させて下記のボデピーFLで標識した本発明のプローブprobe a〜d、及びf〜hのを合成した。そして対応する合成デオキシリボオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の発光がどの程度減少するかを下記の条件下に調べ、本発明のプローブの特異性を検討した。
合成DNA 320nM(終濃度)
核酸プローブ 80nM(終濃度)
NaCl 50mM(終濃度)
MgCl2 1mM(終濃度)
トリス−塩酸緩衝液(pH=7.2) 100mM(終濃度)
ミリQ純水 1.6992ml
終全量 2.0000ml
(2)ハイブリダイゼーションの温度:51℃
(3)測定条件:
励起光 :543nm
測定蛍光色 :569nm
下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プローブを調製した。標的核酸内のG及び本発明の核酸プローブ内のGの数の影響について、前記実施例と同様にして調べた。
下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プローブを調製した。標的核酸内の塩基種及び本発明の核酸プローブ内の塩基種の影響について、前記実施例と同様にして調べた。
本発明の核酸プローブに標識する色素の種類について、前記実施例と同様にして調べた。なお、本発明のプローブは、前記実施例7のプローブzを、また、標的核酸は前記実施例7のオリゴヌクレオチドzを用いた。
その結果を、表4に示した。表から分かるように、本発明に用いる蛍光色素として好適なものは、FITC、 BODIPY FL、 BODIPY FL/C3、 6-joe、TMRなどを挙げることができる。
核酸プローブの調製:大腸菌JM109株の16SrRNAの1156塩基目から1190塩基の塩基配列に相当するKYM−7株の16SrRNA塩基配列に特異的にハイブリダイゼーションする(5')CAT CCC CAC CTT CCT CCC AGT TGA CCC CGG CAG TC(3')(35塩基対)の塩基配列をもち、1〜16及び25〜35塩基目がデオキシリボヌクレオチド、17〜24塩基目が2’位炭素のOH基をアミノ基で修飾したリボオリゴヌクレオチドからなり、5’末端のリン酸基のOH基を-(CH2)7-NN2で修飾しを結合したものを、実施例1と同様にメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社(Midland Certified Reagent Company、米国)から購入した。更に実施例1と同様にモレキュラープローブ(Molecular Probes)社からフロオ・リポーターキット(FluoReporter Kits) F-6082 (ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステル(BODIPY FL/ C6 propionic acid succinimidyl ester)の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット)を購入した。当該キットを前記オリゴヌクレオチドに作用させて、ボデピーFL/C6で標識した核酸プローブを合成した。得られた合成物を実施例1と同様に精製して、最初のオリゴヌクレオチド原料2mMより23%の収率でボデピーFL/C6で標識した核酸プローブを得た。このプローブを35塩基鎖2-O-Meプローブと名づけた。
反応条件:
16SrRNA: 10.0 nM
プローブ: 25nM
緩衝液: 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウム、8.5%
リチウムドデシルサルファイト、pH 5.1
温度: 70℃
前記の16SrRNAにハイブリダイゼーションする下記の本発明のプローブ及びヘルパープローブを前記と同様にして調製した。そして下記の条件にて、本発明の2'-O-Meプローブの効果、当該プローブの塩基鎖の長さの影響、及びヘルパープローブの効果について検討した。その結果を図3のA、B、C、Dに示した。図から、本発明の2'-O-Meプローブがハイブリダイゼーション効率に寄与していることが分かる。また、2'-O-Meプローブの塩基鎖が短い場合にヘルパープローブがハイブリダイゼーション効率を高めるのに役立っている。
2)前記1)と同じ35塩基鎖2'-O-Meプローブと同じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されているプローブ(35塩基鎖DNA プローブ)、
3)前記1)の35塩基鎖2-O-Meプローブと同じ塩基配列であるが、5’末端から8塩基分、3’末端から10塩基分のヌクレオチドを削除したプローブ(17塩基鎖2-O-Me プローブ)、
4)前記2)の33塩基鎖DNAプローブと同じ塩基配列であるが、3’末端から16塩基分のヌクレオチドを削除したプローブ(17塩基鎖DNAプローブ)、
6)前記リバース型ヘルパープローブの中央8塩基分のOH基をメチル基で修飾したヘルパープローブ(リバース型 2-O-Meヘルパープローブ)
7)前記フォワード型ヘルパープローブの塩基配列と同じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキヌクレオチドで構成されているヘルパープローブ(ファワード型 DNA ヘルパープローブ)
8)前記リバース型ヘルパープローブの塩基配列と同じ塩基配列であるが、デオキリボヌクレオチドがで構成されているヘルパープローブ(リバース型 DNA ヘルパープローブ)
9)(5')GUGACGGUCACUAUUUGACCUCCUUCCACCCC(3')なる塩基配列を有するリボオリゴヌクレオチド(35塩基リボオリゴヌクレオチド)、
10)(5')GUGACGGUCACUAUUUG(3')なる塩基配列を有するリボオリゴヌクレオチド(17塩基鎖リボオリゴヌクレオチド)、
16SrRNA: 10nM
プローブ: 25nM
ヘルパープローブ: 1μM
緩衝液: 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウム、
8.5% リチウムドデシルサルファイト、pH 5.1
温度:
・35塩基鎖リボオリゴヌクレオチド2-O-Meプローブ使用の場合:
70℃
・17塩基鎖リボオリゴヌクレオチド2−O−Meプローブまたは
33塩基鎖リボオリゴヌクレオチドDNAプローブ:65℃
・17塩基鎖リボオリゴヌクレオチドDNAプローブ:50℃
0.1〜10nMの範囲の前記rRNAを95℃で5分間加熱後、予め下記反応条件においた反応液に添加し、1000秒後、蛍光強度の減少をパーキンエルマーLS-50Bを使用して測定した。その結果を図4に示した。図から検量線は0.1〜10nMにおいて直線性を示すことが分かる。
反応条件:
33塩基鎖リボオリゴヌクレオチド2-O-Meプローブ: 1.0〜25nM
緩衝液: 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウム、
8.5% リチウムドデシルサルファイト、
pH 5.1
温度: 70℃
セルロモナス(Cellulomonas)sp.KYM-7(FERM P-16806)及びアグロバクテリウム(Agrobacterium) sp. KYM-8(FERM P-11358)の各々のrRNAにハイブリダイゼーションする本発明のプローブ35〜36塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド 2-O-Meプローブを前記と同様にして調製した。各プローブの塩基配列は下記の通りである。
(5')CAT CCC CAC CTT CCT CCG AGT TGA CCC CGG CAG TC(3')(アンダーライン部分がメチル基で修飾されている。)。
アグロバクテリウム sp. KYM-8(FERM P-11358)のrRNA測定のための36塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド2−O−Meプローブ:
(5')CAT CCC CAC CTT CCT CTC GGC TTA TCA CCG GCA GTC(3')(アンダーライン部分がメチル基で修飾されている。)。
図から分かるように、各菌株のrRNAの動態は全 rRNAの動態と一致した。また、各菌株のrRNAの合計量は全rRNAと一致した。このことは、本発明方法はFISH方法において有効な方法になることを示している。
KH2PO4,2.0;MgSO4・7H2O ,0.2;NaCl,0.1; (NH4)2SO4;0.1.
培地100mlを500ml容のコニカルフラスコに分注し、該フラスコを120℃で10分間、オートクレーブ釜を用いて殺菌した。
33塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド2−O−Meプローブ: 1.0〜10nM
緩衝液: 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウム、
8.5% リチウムドデシルサルファイト、pH 5.1
温度: 70℃
実施例13
下記に示した塩基配列をもつ4種類のオリゴヌクレオチドを前記実施例5のDNA合成機を用いて合成した。また、前記実施例5と同様にして、下記の塩基配列の本発明の核酸プローブを合成した。該プローブと各々のオリゴヌクレオチドを溶液中でハイブリダイゼーションさせた後、蛍光強度の変化から1塩基置換の評価ができるかどうか検討した。本発明の核酸プローブの塩基配列は、標的オリゴヌクレオチドの3’末端にGが存在する場合に、100%マッチするように設計されている。ハイブリダイゼーション温度は、プローブと標的オリゴヌクレオチドの全塩基対(base-pairs)が100%ハイブリダイゼーションできる40℃に設定した。プローブ及び標的オリゴヌクレオチドの濃度、緩衝液の濃度,蛍光測定装置、蛍光測定条件、実験操作などは、前記実施例5と同様である。
以上の結果より、標的核酸が2本鎖の場合、G→A、G←A、C→T、C←T、G→C、G←Cの置換を検出できることが明らかになった。
図6に本発明のDNAチップのモデルを図示した。先ず、実施例13で調製した本発明のプローブ、3'TTTTTTTTGGGGGGGGC5'BODIPY FL/C6の3’末端の3’位のOHにアミノ基を導入したもの、また、スライドガラスを反応基としてエポキシ基を有するシランカップリン剤でスライドガラスの表面を処理したものを用意する。上記の本発明のプローブを含む溶液をDNAチップ作成装置GMSTM417ARRAYER(TAKARA)で該スライドガラス上にスポットする。そうすると、3’末端で発明のプローブがガラス面に結合する。該スライドガラスを密閉容器内に4時間位おき反応を完結させる。そして該スライドガラスを0.2%SDS溶液、水に1分程度交互に2回づつ漬ける。更にホウ素溶液(水300mlにNaBH41.0gを溶かしたもの。)に5分位つける。95℃の水に2分つけてから、素早く0.2%SDS溶液、水に1分程度交互に2回づつ漬けて試薬を洗い流す。室温で乾燥する。このようにして本発明のDNAチップが調製される。
更に、各スポットのガラスの下面に図のような微小な温度センサーとヒータを設けることにより、高性能な本発明のDNAチップを作成することができる。
このDNAチップを用いて標的核酸若しくは遺伝子を測定する場合を説明する。該プローブに標的核酸若しくは遺伝子がハイブリダイゼーションしていないときは、又はハイブリダイゼーションしても本発明の蛍光色素標識末端でGCペアーを形成しないとき、若しくは当該プローブと標的核酸しくは遺伝子とがハイブリダイゼーションした末端塩基部分から1ないし3塩基離れて、標的核酸若しくは遺伝子の塩基配列にG(グアニン)が少なくとも1ないし3塩基存在しないときは、蛍光強度に変化ない。しかし、ハイブリダイゼーションすると蛍光強度が減少する。この蛍光強度はDNAチップ解析装置GMSTM418アレースキャナー(Array Scanner)(TAKARA)を使用して測定できる。
実施例15
大腸菌のゲノムDNAにおける16SrRNA遺伝子を標的核酸として、当該核酸の増幅のための(BODIPY FL/C6で標識した)プライマーを調製した。
溶出ソルベントA:0.05N TEAA 5%CH3CN
溶出ソルベントB(グラジエント(gradient)用):0.05N TEAA
40%CH3CN
カラム:CAPCEL PAK C18 ;6×250mm
溶出速度:1.0ml/min
温度:40℃
検出:254nm
プライマー2(Eu500R/forward:フォワード型)の調製:(5')CCAGCAGCCGCGGTAATAC(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドの5’末端に蛍光色素(BODIPY FL/C6)で標識したプライマー2を実施例13と同様にして収率50%で調製した。
殺菌したニュトリエントブロス(NB)(Difco社製)液体培地5ml(組成:NB、0.08g/100ml)を含有する試験管を用いて、大腸菌JM109株を37℃で一晩振蘯培養した。培養液1.5mlを1.5ml容量の遠心チューブで遠心分離し、菌体を得た。この菌体から、DNeasy Tissue Kit(キアゲン社、ドイツ国)を用いてゲノムDNAを抽出した。その方法は本キットのプロトコルに従った。その結果、17ng/μlのDNA溶液を得た。
上記の大腸菌のゲノムDNA、プライマー1及び/又はプライマー2を使用して、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のライトサイクラーTMシステム(LightCyclerTM System)を用いて常法通りにPCR反応を行った。操作は当該システム機器の手順書に従った。
また、上記システムにおいてPCRは、当該手順書に記されている核酸プローブ(FRET現象を利用する二個のプローブ)と通常のプライマー(蛍光色素で標識されていない通常のプライマー)の代りに本発明プライマー1及び/又は2を用いる以外は当該手順書通りに行った。
大腸菌ゲノムDNA溶液 3.5μl(終濃度0〜6ng/20μl)
(終コピー数0〜2.4・106個)
プライマー溶液 0.8μl(終濃度0.08μM)
Taq溶液 10.0μl
ミリQ純水 5.7μl
全容量 20.0μl
尚、標的核酸である大腸菌16SrDNAは、図7の説明欄に示される実験区の濃度で、また、プライマーは、同様に図7の注に示される実験区のプライマー1及び/又は2の組合せで実験を行った。
Taq 溶液 96.0μl
ミリQ純水 68.2μl
Taq DNA ポリメラーゼ溶液 24.0μl
Taq スタート(start) 3.8μl
変性(denaturation) 初期:95℃、120秒
再:95℃、 0秒
アニーリング(annealing)条件 57℃、5秒
測定は、ライトサイクラーTMシステムを用いて行った。その際、該システムにあるF1〜3の検出器にうち、F1の検出器を用い、その検出器のゲインは10、励起強度は75に固定した。
図9は、サイクル数を関数として、大腸菌16SrDNAのコピー数を表現した大腸菌16SrDNAの検量線である。相関係数は0.9973で、極めてよい相関を示した。
以上の結果から分かるように、本発明の定量的PCR方法を用いると標的核酸の当初のコピー数を測定できるようになる。即ち、標的核酸の測定ができる。
実施例18においては、本発明のプローブをプライマーとしてPCRを行ったが、本実施例では従来法に用いるFRET現象を利用する二個のプローブの代わりに本発明のプローブを用いて下記の条件で本発明のPCRを行った。
a)標的核酸:大腸菌の16S-rDNA
b)使用プライマー:
・フォワードプライマー E8F: (3')AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(5')
・リバースプライマー E1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT(5')
c)使用プローブ: BODIPY FL-(3')CCTTCCCACATCGTTT(5')
d)使用PCR測定機器:ライトサイクラーTMシステム
e)PCRの条件:
変性反応:95℃ for 0秒 (60秒間、95℃)
アニーリング反応: 50℃ for 5秒
核酸伸長反応: 72℃ for 70秒
全サイクル数: 70サイクル
g)反応液の組成:
反応液の全量:20 μl
DNA ポリメラーゼの量 (TaKaRa Ex taq): 0.5U
Taq スタート(抗体): 0.3μl
プライマーの濃度: 0.2μM (双方とも)
プローブの濃度: 0.05 μM
MgCl2 濃度: 2 mM
BSA(bovine serum albumin)濃度:0.25 mg/ml
dNTPs濃度: 2.5 mM (各ヌクレオチドについて).
以上の結果から分かるように、本発明の定量的PCR方法を用いると標的核酸の当初のコピー数を測定できるようになる。即ち、標的核酸の測定ができる。
実施例20
ヒトゲノムDNA(ヒトβ−グロビン(globin)(TaKaRaカタログ商品番号 9060)(TaKaRa株式会社製)(以下、ヒトゲノムDNAという。)を標的核酸として、当該核酸の増幅のためのボデピー FL/C6で標識したプライマーを調製した。
溶出ソルベントA:0.05N TEAA 5%CH3CN
溶出ソルベントB(グラジエント(gradient)用):0.05N
TEAA 40%CH3CN
カラム:CAPCEL PAK C18;6×250mm
溶出速度:1.0ml/min
温度:40℃
検出:254nm
プライマーKM29(フォワード型)の調製:(5')GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドを実施例18と同様に合成した。
上記のヒトゲノムDNA、プライマーKM38+C及びプライマーKM29を使用して、ライトサイクラー TMシステムを用いてPCR反応を行い、各サイクル毎の蛍光強度を測定した。
尚、本比較実施例のPCRは、前記に説明した蛍光色素色素で標識したプライマーを用いるものであり、蛍光発光の増加でなく、減少を測定する新規なリアルタイム定量的PCR方法である。データー解析用ソフトウエアは当該システムのものを用いて行った。上記システムにおいてPCRは、当該手順書に記されている核酸プローブ(FRET現象を利用する二個のプローブ)と通常のプライマー(蛍光色素で標識されていない通常のプライマー)の代りに本発明プライマーKM38+C及びKM29を用いる以外は当該装置の手順書通りに行った。
ヒトゲノムDNA 1.0μl(最終濃度1〜10000コピー)
プライマー溶液 4.0μl(最終濃度0.1μM)
Taq溶液 10.0μl
ミリQ純水 5.0μl
全容量 20.0μl
尚、ヒトゲノムDNAは、図11の説明欄に示される実験区の濃度で実験を行った。MgCl2の最終濃度は2mMであった。
Taq 溶液 96.0μl
ミリQ純水 68.2μl
Taq DNA ポリメラーゼ 24.0μl
Taq スタート 3.8μl
変性反応初期 :95℃、60秒
再変性反応 :95℃、10秒
アニーリング反応 :60℃、5秒
DNA伸長反応 :72℃、17秒
測定は、ライトサイクラーTMシステムを用いて行った。その際、該システムにあるF1〜3の検出器にうち、F1の検出器を用い、その検出器のゲインは10、励起強度は75に固定した。
(b)10サイクル目の蛍光強度値を1として各サイクルの蛍光強度値を換算する過程、即ち、下記の〔数式8〕による計算をする過程、
Cn=Fn(72)/F10(72) 〔数式8〕
ただし、Cn=各サイクル値の換算値、Fn(72)=各サイクルの72℃の蛍光強度値、F10(72)=10サイクル目の72℃の蛍光強度値。
(c)前記(b)の過程で得られた換算値を、各サイクル数に対してプロットし、デスプレー上に表示及び/又は印字する過程、
〔数式9〕
Fdn =log10{100−Cn×100)}
Fdn =2log10{1−Cn}
ただし、Fdn=蛍光強度変化率(減少率、消光率)、Cn=〔数式8〕で得られた値。
(e)前記(d)の過程で得られた換算値を、各サイクル数に対してプロットし、デスプレー上に表示及び/又は印字する過程、
(g)前記(f)の過程で計算した値をX軸に、反応開始前のコピー数をY軸にプロットしたグラフを作成する過程、
(h)前記(g)の過程で作成したグラフをデスプレー上に表示及び/又は印字する過程、
(j)前記(h)の過程で描かれた直線の相関係数又は関係式を計算する過程、(i)前記(j)の過程で計算された計算値又は関係式をデスプレー上に表示及び/又は印字する過程。
図12は、上記(b)の過程で処理されたデーターを印字した(前記(c)過程)したものである。即ち、10サイクル目の蛍光強度値を1として換算
し、その換算値をサイクル数に対してプロットしたものである。
図13は、前記(d)の過程で処理したデーターを印字した(前記(e)過程)ものである。即ち、図12の各プロット値から蛍光強度の減少率(消光率)を計算して、各計算値を各サイクル数に対してプロットしたものである。
PCRは比較実験例1と同様に行った。
データー処理は、比較実験例1の(b)の過程の前に下記の(a)の過程をおき、(b)、(d)の過程を以下のように変更する以外は比較実験例1と同様な過程で行った。
(a)各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プライマーとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値(即ち、核酸伸長反応時(72℃)の蛍光強度値)を、増幅した核酸が核酸プライマーとハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値(即ち、核酸熱変性反応時(95℃)の蛍光強度値)で割る補正演算処理過程、即ち、実測の蛍光強度値を〔数式1〕で補正した。
fn=fhyb,n/fden,n 〔数式1〕
[式中、fn=サイクルの蛍光強度の補正値、fhyb,n=各サイクルの72℃の蛍光強度値、fden,n=各サイクルの95℃の蛍光強度値]
得られた値を各サイクル数にプロットしたのが図15である。
Fn=fn/f25 〔数式10〕
[式中、Fn=各サイクルの演算処理値、fn=〔数式1〕で得られた各サイクルの値、f25=〔数式1〕で得られた値で、サイクル数が25回目のもの]。
〔数式10〕は〔数式3〕において、a=25とした場合におけるものである。
log10{(1−Fn)×100} 〔数式11〕
[式中、Fn=[数式10]で得られた値]。
〔数式11〕は〔数式6〕において、b=10、A=100とした場合におけるものである。
図16は、前記(a)及び(b)の過程で処理された値をサイクル数に対してプロットし、印字したものである。
図17は、図16で得られた値について前記(d)の過程で計算された値を、サイクル数に対してプロットし、印字したものである。
本発明の新規なPCR法により増幅された核酸について、51)低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げるあるいは下げる過程(例えば、50℃から95℃まで)、52)前記51)過程において、短い時間間隔(例えば、0.2℃〜0.5℃間隔)で蛍光強度を測定する過程、53)前記52)過程の測定結果を時間毎にデスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の融解曲線を表示する過程、54)前記53)過程の融解曲線を一次微分する過程、55)前記54)過程の微分値(−dF/dT、F:蛍光強度、T:時間)をデスプレー上に表示する過程、56)前記55)から得られる微分値から変曲点を求める過程からなるソフトウエアを作成し、前記本発明のデーター解析用ソフトウエアに合体した。当該データー解析用ソフトウエアを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体をインストールした前記ライトサイクラーTMシステムを用いて本発明の新規リアルタイム定量的PCR反応を行い、核酸融解曲線の分析を行った。本発明においては、蛍光強度は温度が上がるごとに増加する。
1)前記のように本発明の核酸測定方法、本発明のプローブ及びデバイスを用いると、測定系から未反応の核酸プローブを除く等の操作をすることがないので、標的核酸を短時間でかつ簡便に測定できる。また、複合微生物系又は共生微生物系に適用すると、当該系における特定菌株の存在量を特異的かつ短時間に測定できる。また、本発明は標的核酸若しくは遺伝子のSNPなどの多型または変異などの解析若しくは測定する簡便な方法を提供している。
2)また、本発明の定量的PCR方法は、次のような効果を有する。
a.TaqDNAポリメラーゼによる標的核酸の増幅に阻害的に作用する因子が添加されていないことから、従来公知の特異性のある通常のPCRと同様の条件で定量的PCRを行うことができる。
b.また、PCRの特異性を高く保つことができるので、プライマーダイマーの増幅が遅くなることから、従来公知の定量的PCRと比較すると定量限界が約1オーダー低くなる。
c.複雑な核酸プローブを用意する必要がないので、それに要する時間と費用が節約できる。
d.標的核酸の増幅効果も大きく、増幅過程をリアルタイムでモニタリングすることができる。
3)また、リアルタイム定量的PCR方法で得られたデーターを解析する際、本発明のデーター解析方法を用いて、未知核酸コピー数の核酸試料について核酸のコピー数を求める検量直線を作成すると、検量線の相関係数は従来の方法により得られたものに較べて格段に高い。それで、本発明のデーター解析方法を用いると核酸の正確なコピー数を求めることができる。
4)また、本発明のリアルタイム定量的PCR方法によって得られたデーターの解析方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その解析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的PCRの測定若しくは解析装置を用いると、相関係数の高い検量直線を自動的に作成することができる。
5)また、本発明の新規な核酸の融解曲線の分析方法を用いると、精度の高い、核酸のTm値を求めることができる。更に、当該方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その分析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的PCRの測定若しくは解析装置を用いると、正確なTm値を求めることができる。
Claims (27)
- 下記の(1)〜(7)の何れか1項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
(1)蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部において、当該プローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした末端塩基から1ないし3塩基離れて、標的核酸の塩基配列にG(グアニン)が少なくとも1塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ。
(2)核酸プローブが3’末端において蛍光色素で標識されている前記(1)に記載の核酸測定用核酸プローブ。
(3)核酸プローブが5’末端において蛍光色素で標識されている前記(1)に記載の核酸測定用核酸プローブ。
(4)蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが、標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部分においてハイブリダイゼーションの塩基対がG(グアニン)とC(シトシン)のペアーを少なくも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ。
(5)核酸プローブの3’末端塩基がGまたはCで、かつ3’末端が蛍光色素で標識されている前記(4)に記載の核酸測定用核酸プローブ。
(6)核酸プローブの5’末端塩基がGまたはCで、かつ5’末端が蛍光色素で標識されている前記(4)に記載の核酸測定用核酸プローブ。
(7)核酸プローブが、3’末端のリボース若しくはデオキシリボースの3’炭素の水酸基、または3’末端のリボースの3’炭素の水酸基がリン酸化されている前記(3)または(6)に記載の核酸測定用核酸プローブ。 - 下記の(8)〜(10)の何れか1項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
(8)核酸測定用核酸プローブのオリゴリボヌクレオチドが、2−o−メチルオリゴリボヌクレオチド(2−o−methyloligoribonucleotide)、PNA、または、他の化学的に修飾した核酸である前記(1)〜(7)の何れか1項に記載の核酸測定用核酸プローブ。
(9)核酸測定用核酸プローブのオリゴリボヌクレオチドが、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドを含むチメリックオリゴヌクレオチド(chimeric oligonucleotide)である前記(1)〜(7)の何れか1項に記載の核酸測定用核酸プローブ。
(10)リボヌクレオチドが、2−o−メチルオリゴリボヌクレオチドである前記(9)に記載の核酸測定用核酸プローブ。 - 標的核酸または遺伝子の多型(polymorphism)または/および変異(mutation)を解析若しくは測定する方法において、請求項1に記載の(1)〜(7)、及び請求項2に記載の(8)〜(10)の何れか1項に記載の核酸プローブを標的核酸または遺伝子にハイブリダイゼーションさせ、蛍光強度の変化量を測定することを特徴とする標的核酸または遺伝子の多型または/および変異を解析若しくは測定する方法。
- 標的核酸または遺伝子の多型または/および変異を解析若しくは測定する測定キットにおいて、請求項1に記載の(1)〜(7)、及び請求項2に記載の(8)〜(10)の何れか1項に記載の核酸プローブを含有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または/および変異を解析若しくは測定するキット。
- 請求項3に記載の方法により得られるデータを解析する方法において、標的核酸または遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正処理する過程を有することを特徴とする標的核酸または遺伝子の多型または/および変異を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法。
- 標的核酸または遺伝子の多型または/および変異を解析若しくは測定する測定装置において、請求項5に記載のデータ解析方法を実施するための手段を有することを特徴とする標的核酸または遺伝子の多型または/および変異を解析若しくは測定する測定装置。
- 請求項5に記載の補正処理過程をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体。
- ハイブリダイゼーション反応前にハイブリダイゼーション反応実施のためのハイブリダイゼーション反応系にヘルパープローブを添加する下記に記載の核酸測定方法。
核酸測定方法:請求項2に記載の(8)〜(10)の何れか1項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法。 - PCR方法において、請求項1に記載の(1)、(2)、(4)、(5)、(7)、及び請求項2に記載の(8)〜(10)の何れか1項に記載の核酸プローブを用いて反応を行い、核酸伸長反応時当該プローブがポリメラーゼにより分解除去されている反応系または核酸変性反応時若しくは核酸変性反応が完了している反応系の蛍光強度値と標的核酸若しくは増幅標的核酸が該核酸プローブとハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者からの蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするPCR方法で増幅された核酸の測定方法。
- PCR方法において、請求項1に記載の(3)または(6)に記載の核酸プローブをプライマーとして反応を行い、当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸がハイブリダイズしていない反応系の蛍光強度値と該核酸プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸とハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者の蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするPCR方法で増幅された核酸の測定方法。
- PCR方法がリアルタイム定量的PCR方法である請求項9または10に記載のPCR方法で増幅された核酸の測定方法。
- 下記の何れか1項に記載の核酸測定方法で得られたデーターを解析する方法において、標的核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値により補正することを特徴とする核酸測定方法のためのデータ解析方法。
(11)請求項1に記載の(1)〜(7)の何れか1項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
(12)請求項2に記載の(8)〜(10)の何れか1項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
(13)ハイブリダイゼーション反応前にハイブリダイゼーション反応実施のためのハイブリダイゼーション反応系にヘルパープローブを添加する前記(12)に記載の核酸測定方法。
(14)標的核酸をその高次構造が十分に破壊されるに適した条件で加熱処理後、核酸プローブと標的核酸をハイブリダイゼーションさせる前記(12)に記載の核酸測定方法。
(15)標的核酸がRNAである前記(11)、(12)、(13)、(14)の何れか1項に記載の核酸測定方法。
(16)下記(a)〜(d)の何れか1項に記載の核酸測定用デバイスを用いて標的核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
(a)請求項1に記載の(1)〜(7)、及び請求項2に記載の(8)〜(10)の何れか1項に記載の核酸プローブ、または一つの分子内に二つの異なった蛍光色素を有し、標的核酸にハイブリダイゼーションしていないときは、二つの蛍光色素の相互作用により消光若しくは発光しているが、標的核酸にハイブリダイゼーションすると発光若しくは消光するように設計された構造をもつ核酸プローブを固体支持体表面に結合させ、それに標的核酸をハイブリダイゼーションさせて標的核酸を測定することができるようにしたことを特徴とする核酸測定用デバイス。
(b)前記(a)に記載の核酸測定用デバイスにおいて、核酸プローブが固体支持体表面にアレー状に配列、結合させた核酸測定用デバイス(チップ)。
(c)固体支持体表面に結合させられた核酸プローブ毎に、反対側の表面に少なくとも一つの温度センサーとヒーターが設置され、核酸プローブ結合領域が最適温度条件になるように温度調節され得る前記(a)、または前記(b)に記載の核酸測定用デバイス。
(d)核酸プローブを蛍光色素で標識していない端部で固体支持体表面に結合させた前記(a)〜(c)の何れか1項に記載の核酸測定用デバイス。
(17)前記(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)の何れか1項に記載の核酸の測定方法において、標的核酸が、純粋分離して得た微生物由来、または動物由来であることを特徴とする核酸の測定方法。
(18)標的核酸が、複合微生物系、または共生微生物系の細胞内若しくは細胞のホモジネートの核酸である前記(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)の何れか1項に記載の核酸の測定方法。
(19)PCR方法において、請求項1に記載の(1)、(2)、(4)、(5)、(7)、請求項2に記載の(8)〜(10)の何れか1項に記載の核酸プローブを用いて反応を行い、核酸伸長反応時当該プローブがポリメラーゼにより分解除去されている反応系または核酸変性反応時若しくは核酸変性反応が完了している反応系の蛍光強度値と標的核酸若しくは増幅標的核酸が該核酸プローブとハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者からの蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするPCR方法で増幅された核酸の測定方法。
(20)PCR方法において、請求項1に記載の(3)または(6)に記載の核酸プローブをプライマーとして反応を行い、当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸がハイブリダイズしていない反応系の蛍光強度値と該核酸プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸とハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者の蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするPCR方法で増幅された核酸の測定方法。
(21)PCR方法がリアルタイム定量的PCR方法である前記(19)または(20)に記載のPCR方法で増幅された核酸の測定方法。 - 請求項11に記載のリアルタイム定量的PCR方法で得られたデーターを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、各サイクルにおける前記の結合したもの、あるいは前記のハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程(以下、補正演算処理過程という。)を有することを特徴とするリアルタイム定量的PCR方法のためのデータ解析方法。
- 請求項13に記載の補正演算処理過程が、次の〔数式1〕あるいは〔数式2〕によるものである請求項11に記載のリアルタイム定量的PCR方法のためのデータ解析方法。
fn=fhyb,n/fden,n 〔数式1〕
fn=fden,n/fhyb,n 〔数式2〕
〔式中、
fn:〔数式1〕あるいは〔数式2〕により算出されたnサイクルにおける補正演算処理値、
fhyb,n:nサイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値、
fden,n:nサイクルにおける、前記の結合したもの、あるいはハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値〕。 - 請求項11に記載のリアルタイム定量的PCR方法で得られたデーターを解析する方法において、各サイクルにおける〔数式1〕あるいは〔数式2〕における補正演算処理値を次の〔数式3〕あるいは〔数式4〕に代入し、各サイクルにおける各サンプル間の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、それらを比較することを特徴とするリアルタイム定量的PCR方法のためのデータ解析方法。
Fn=fn/fa 〔数式3〕
Fn=fa/fn 〔数式4〕
〔式中、
Fn:nサイクルにおける、〔数式3〕あるいは〔数式4〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率、
fn:〔数式1〕あるいは〔数式2〕による補正演算処理値
fa:〔数式1〕あるいは〔数式2〕による補正演算処理値で、fnの変化が観察される以前の任意のサイクル数のもの〕。 - 請求項11に記載のリアルタイム定量的PCR方法で得られたデーターを解析する方法において、
1)〔数式3〕あるいは〔数式4〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデーターを用いて、〔数式5〕、〔数式6〕あるいは〔数式7〕による演算処理する過程、
logb(Fn)、ln(Fn) 〔数式5〕
logb{(1−Fn)×A}、ln{(1−Fn)×A} 〔数式6〕
logb{(Fn−1)×A}、ln{(Fn−1)×A} 〔数式7〕
〔式中、
A、b:任意の数値、
Fn:〔数式3〕あるいは〔数式4〕により算出されたnサイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化率〕、
2)前記1)の演算処理値が一定値に達したサイクル数を求める演算処理過程、
3)既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過程、
4)未知試料におけるPCR開始時の標的核酸のコピー数を求める演算処理過程、
を有することを特徴とするリアルタイム定量的PCR方法のためのデータ解析方法。 - 標的核酸について請求項1に記載の(1)〜(7)、及び請求項2に記載の(8)〜(10)の何れか1項に記載の核酸プローブを用いてPCR方法を行い、増幅核酸について核酸の融解曲線の分析を行ってTm値を求めることを特徴とする核酸の融解曲線の分析方法。
- 標的核酸について請求項1に記載の(3)または(6)に記載の核酸プローブをプライマーとして用いてPCR方法を行い、その増幅核酸について核酸の融解曲線の分析を行ってTm値を求めることを特徴とする核酸の融解曲線の分析方法。
- 請求項13〜16の何れか1項に記載のリアルタイム定量的PCR方法のためのデーター解析方法において、請求項17および/または18に記載の核酸の融解曲線の新規分析方法により、核酸の融解曲線を分析する過程、即ち、本発明のPCR方法により増幅された核酸について、低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げる過程、この過程において、時間間隔で蛍光強度を測定する過程、測定結果を時間毎にデスプレー上に表示する過程(核酸の融解曲線を表示する過程)、この融解曲線を一次微分する過程、その値(−dF/dT、F:蛍光強度、T:時間)を微分値としてデスプレー上に表示する過程、その微分値から変曲点を求める過程、を有することを特徴とするリアルタイム定量的PCR方法のためのデーター解析方法。
- 請求項13に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項14に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項15に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項16に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項17に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、を有することを特徴とするリアルタイム定量的PCRの測定および/または解析装置。
- 請求項13に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項14に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項15に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項16に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項19に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程を、コンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体。
- 核酸定量方法において、請求項13〜16、19の何れか1項に記載のリアルタイム定量的PCR方法のためのデータ解析方法を利用することを特徴とする核酸の定量方法。
- 核酸定量方法において、請求項20に記載の装置を利用することを特徴とする核酸の定量方法。
- 核酸定量方法において、請求項21に記載のコンピュータ読取可能な記録媒体を用いることを特徴とする核酸の定量方法。
- 標的核酸をその高次構造が十分に破壊されるに適した条件で加熱処理後、核酸プローブと標的核酸をハイブリダイゼーションさせる請求項2に記載の核酸測定方法。
- ハイブリダイゼーション反応系にヘルパープローブを添加してなる請求項4に記載のキット。
- 標的核酸がRNAである請求項1、2、8、25の何れか1項に記載の核酸測定方法。
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