JP6074036B2 - 拡大された基質範囲を有する新規のdnaポリメラーゼ - Google Patents
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Description
本発明のDNAポリメラーゼの逆転写酵素活性を、RNA鋳型を用いて経時的なdNTPsの変換を測定することにより測定した。
本発明のKlenTaqDNAポリメラーゼの熱安定性は、特定の時間で95℃で該KlenTaqDNAポリメラーゼをインキュベートし、該インキュベーションの後にそれらの活性を測定することにより測定された。
野生型KlenTaq,KlenTaq M1, KlenTaq M747K及び本発明のKlenTaq DNAポリメラーゼの逆転写酵素活性を、鋳型としてRNAを用い、プライマーとしてDNAを用いてプライマー伸長実験で比較した。
リアルタイムRT−PCR試験を、野生型KlenTaq,KlenTaq M1, KlenTaq M747K, KlenTaq M1/M747K及びKlenTaqD9を用いて行った。
野生型Taq, Taq M1, Taq M747K, Taq M1/M747K及びTaqD9の逆転写酵素活性を、鋳型としてRNAを用い、プライマーとしてDNAを用いてプライマー伸長試験で比較した。
リアルタイムRT−PCR試験を、野生型Taq, Taq M1, Taq M747K,Taq M1/M747K及びTaq D9を用いて行った。
Taq M1/M747K及びTaq D9のヌクレアーゼ活性を、野生型Taq,Taq M1及びTaqM747Kのヌクレアーゼ活性と比較した。安定DNAヘアピン構造及び相補的放射性ラベル基質を用いた。これらの2つのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、基質オリゴヌクレオチドの切断が生じるずれた5’末端及び解かれた3’プライマー末端を残す。この基質の切断を、異なる時点(0、5、15、30、60分)で測定した。反応混合液には、50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH4)2SO4, 0.1%Tween 20, 2.5 mM MgCl2, 50 nMの各dNTP, 150nM 22-nt基質(5’-d(CCCCCC CCC CTC ATA CGT ACA C)-3’), 225 nM鋳型(5’-d(GTGTAC GTA TGA TCA TGC AGG TAG CCG ATG AAC TGG TCG AAA GAC CAG TTC ATC GGC TAC CTGCAT GAT)-3’)及び150 nMのそれぞれのTaq DNAポリメラーゼを含有させた。反応混合液を30℃でインキュベートした。
核酸塩基での修飾をもつ2’‐デオキシヌクレオシドの許容性を野生型KlenTaq,KlenTaq M1, KlenTaq M747K, KlenTaq M1/M747K及びKlenTaqD9を用いたプライマー伸長試験で試験した。
Claims (17)
- 野生型Thermus aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼ(SEQ ID NO: 1)のアミノ酸配列においてS515R、I638F及びM747Kの変異の全てを含む、野生型TaqDNAポリメラーゼ由来のDNAポリメラーゼ。
- 前記SEQ ID NO: 1のアミノ酸の位置293〜832の配列に対応するアミノ酸配列において前記変異の全てを有するアミノ酸配列を含む請求項1に記載のDNAポリメラーゼ。
- SEQIDNO: 2に示すアミノ酸配列において前記変異の全てを有するアミノ酸配列を含む
請求項2に記載のDNAポリメラーゼ。 - 前記SEQ ID NO: 1においてL322M、L459M、S739G、E773G及びL789Fからなる群から選択される1つ又はそれ以上の変異をさらに含むアミノ酸配列を含む請求項1〜3のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ。
- 前記SEQ ID NO: 1においてL459Mの変異を含むアミノ酸配列を含む請求項4に記載のDNAポリメラーゼ。
- 前記SEQ ID NO: 1においてL322M及びL459Mの変異を含むアミノ酸配列を含む請求項4に記載のDNAポリメラーゼ。
- 前記SEQ ID NO: 1においてL322M、L459M及びE773Gの変異を含むアミノ酸配列を含む請求項4に記載のDNAポリメラーゼ。
- 前記SEQ ID NO: 1においてL322M、L459M、S739G及びE773Gの変異を含むアミノ酸配列を含む請求項4に記載のDNAポリメラーゼ。
- SEQ ID NOs: 3〜12のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含む請求項1に記載のDNAポリメラーゼ。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
- 請求項10に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項11に記載のベクター、又は請求項10に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼと適切な鋳型とを共にインキュベートするステップを含むDNA分子の製造方法。
- 前記方法は、RNA分子からcDNAへの逆転写と、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による前記cDNAの増幅とを1つのステップで行うための方法であり、
前記ステップは、前記RNA分子を請求項1〜9のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼと共にインキュベートすることを含み、
前記逆転写及び増幅の両方は、前記DNAポリメラーゼにより進められる請求項13に記載の方法。 - 前記方法は、修飾型ヌクレオチドを含むDNA分子の生成のための方法であり、
前記修飾型ヌクレオチドの存在下で請求項1〜9のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼと適切な鋳型分子とを共にインキュベートするステップを含む請求項13に記載の方法。 - DNA分子の生成のための請求項1〜9のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼの使用。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼを含むキット。
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