JP6074036B2

JP6074036B2 - 拡大された基質範囲を有する新規のｄｎａポリメラーゼ

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Publication number: JP6074036B2
Application number: JP2015525745A
Authority: JP
Inventors: マルクス，アンドレアス; ブラッター，ニーナ
Original assignee: ウニベルジテーツコンスタンツ
Priority date: 2012-08-08
Filing date: 2012-08-08
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2032-08-08
Also published as: JP2015528281A; US9631183B2; US20150267182A1; WO2014023318A1; EP2882852B1; EP2882852A1

Description

本発明は、改善された逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性等の拡大された基質範囲、並びに修飾ヌクレオチドの組み込み及び延長のための改善された活性を示すＤＮＡポリメラーゼに関する。特に、本発明は、野生型アミノ酸配列においてＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ及びＭ７４７Ｋの変異を含む野生型Thermusaquaticus（Ｔａｑ）ポリメラーゼに由来するＤＮＡポリメラーゼに関する。さらに、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクター又は核酸を含む宿主細胞、該ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ分子を生成するための方法、該ＤＮＡポリメラーゼを含むキット、及びそれらの使用に関する。

広く普及し、確立されたＲＮＡ分子の検出のための技術は、いわゆる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡは、そのＤＮＡ相補鎖（相補的ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）に逆転写され、その後、生じたｃＤＮＡは、ＰＣＲを用いて増幅される。ＲＴ−ＰＣＲは、低い又は極めて低いコピー数のＲＮＡ分子の検出のための高感度の技術を提供する。それは、例えば遺伝性疾患の診断、細胞若しくは組織における特定のＲＮＡ分子の量の測定、又はインフルエンザウィルスＡ若しくはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）等のＲＮＡウィルスの研究に用いられる。

ＲＴ−ＰＣＲ技術の他の重要な用途は、例えば食品媒介性の微生物等の雑菌の検出である。食品媒介性の病原体の感染は、今日における最も深刻な公衆衛生被害に属する。世界的な旅行及び貿易の増大により、危険な病原体が広がるリスクが一貫して増大している。その対抗策として、食品の生産及び処理における微生物学的品質管理方法は、ますます重要となっている。従って、より速く、より強力であり、より信頼でき、より選択的な微生物の検出及び特徴付けのための方法が、最も関心が持たれ且つ最も重要である。

従来の微生物の検出方法は、例えば、後にそれぞれの微生物の生化学的及び／又は血清学的同定が続くような、疑いがあるコロニー又はサンプルの培養を含む。これらの方法は、所定の微生物の検出感度の欠損及び検出能力の欠如等のいくつかの重大な欠点を示すため、極めて少量の微生物の検出を可能とするＰＣＲによる微生物の特定のゲノム配列の検出が広範に用いられている。しかしながら、それぞれの方法は、まだいくつかの欠点を有している。例えば、特異性の欠陥は、宿主細胞ＤＮＡ等の非細菌ＤＮＡのバックグラウンドで細菌ＤＮＡの検出を妨げる。さらに、そのような方法は、生存微生物と死滅微生物との識別を可能としない。従って、生存している微生物にのみ存在する特定のｍＲＮＡ分子の検出のためのＲＴ−ＰＣＲは、微生物の検出のための魅力的な代替手段として出現している。しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲ技術は、まだ所望の選択性及び感度を欠いていることが多く、改善の余地があり、さらなる発展を必要とする。

本技術分野において周知である多くのＲＴ−ＰＣＲ技術は、２つの異なる酵素、すなわち、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するための逆転写酵素、及びその後の該ｃＤＮＡの増幅のためのＤＮＡポリメラーゼの使用に基づくものである。これらの技術は、逆転写後のＲＮＡ切断又は異なるバッファーの添加等の逆転写と増幅との間にサンプルの操作を必要とすることが多い。これらのサンプル操作は、時間及び労力が多くかかるのみならず、サンプルのコンタミネーションのリスクが生じる。

残念ながら、逆転写酵素は、ＤＮＡポリメラーゼほどの耐熱性を有していないことが多く、適用温度範囲が制限される。従って、本技術分野において周知の逆転写酵素は、第１ストランドｃＤＮＡを合成するために高温で用いられない場合が多い。従って、二次構造を有するＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、顕著に阻害され得る。ＤＮＡポリメラーゼ活性に加えて逆転写酵素活性を有するThermusthermophilus由来のＤＮＡポリメラーゼ（Tth ポリメラーゼ）の使用は、２つの異なる酵素の必要性を取り除き、高温における逆転写の可能性を提供する。しかしながら、Tthポリメラーゼは、逆転写のためにＭｎ^２＋イオンの存在が必要である。それにもかかわらず、ＤＮＡ増幅の際の該イオンの存在は望まれない。従って、それぞれの技術は、逆転写とＤＮＡ増幅との間に、例えばＥＤＴＡ等のキレート剤の添加等のサンプル操作のステップを必要とする。従って、１つの酵素を用いるＲＴ−ＰＣＲ技術は、逆転写と増幅との間にサンプル操作を必要とし、ハイスループットフォーマットでの使用が制限され、サンプルのコンタミネーションの更なる原因となる。

ＲＴ−ＰＣＲ技術に用いるための逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有する更なる酵素が開発されている。これらは、野生型Taqポリメラーゼに対して、L322M、L459M、S515R、I638F、S739G及びE773Gの変異を有するＭ１ポリメラーゼ等のTaqポリメラーゼ由来の酵素を含む。しかしながら、このポリメラーゼは、例えばその酵素活性及び熱安定性等に関して、さらなる改善の余地を未だ残している。

従って、鋳型としてＲＮＡを許容できる能力を有し、増大された逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有する改善された酵素の必要性がある。それぞれの酵素は、さらに、ＰＣＲに用いられる温度範囲内で改善された熱安定性を示すべきであり、それは高温でのみ除かれ得る強い二次構造を有するＲＮＡ分子の検出を可能とし得る。

色素又は親和性タグ等の広い修飾を用いて機能化された多くの２’−デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）は、ＤＮＡポリメラーゼの基質となる。そのような修飾型ｄＮＴＰｓ及び鋳型を受け入れるためのＤＮＡポリメラーゼの能力は、次世代シークエンシングアプローチ、単分子シークエンシング、例えばマイクロアレイ分析のためのＤＮＡのラベル化及びＰＣＲ増幅、ＤＮＡ接合、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的発生）によるアプタマー等のリガンドのインビトロ選択を含む多くの重要な生物工学的適用に利用される。さらに、化学的に導入された機能と組み合わせてＤＮＡの内在特性を用いることは、核酸ベースのハイブリッド材料の新たな分類への入口を提供する。それにもかかわらず、本技術分野に周知のＤＮＡポリメラーゼは、より多くの周知で、未だ確立されていない修飾型ヌクレオチドをＤＮＡに組み込むための増大された活性を示すための更なる最適化を未だ必要とする。

興味深いKlen TaqM747Kポリメラーゼは、ＤＮＡ損傷を回避するための高い性能を有する野生型Taqポリメラーゼに対してM747Kの変異を含ませたものとして報告されている。

従って、本発明の基礎となる技術的課題は、上記有利な特性を有する新規の酵素を提供することにある。

上記技術的課題の解決は、特許請求の範囲に特徴付けられた実施形態により達成される。

特に、第１の態様において、本発明は、野生型Thermusaquaticus (Taq)ＤＮＡポリメラーゼ由来のＤＮＡポリメラーゼに関し、これは、野生型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列(SEQID NO: 1)においてＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ及びＭ７４７Ｋの変異のうちの少なくとも１つを含むものである。

本発明のＤＮＡポリメラーゼの特に好ましい実施形態において、該ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列(SEQID NO: 1)においてＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ及びＭ７４７Ｋの３つ全ての変異を含む。このＤＮＡポリメラーゼは、以下「Ｃ１２ＤＮＡポリメラーゼ」ということもある。

本明細書で用いられる「ＤＮＡポリメラーゼ」の用語は、例えば翻訳語プロセシング等の自然プロセス、又は化学修飾等の非自然プロセスにより修飾されたＤＮＡポリメラーゼを含む。そのような修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、又はＮ若しくはＣ末端で起こり得る。修飾は、例えばアセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビン、ヘム基、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、環化、ジスルフィド架橋、メチル化、脱メチル化、シスチン結合、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、及びｔＲＮＡを介するアミノ酸の付加を含む。

本明細書で用いられる「野生型Ｔａｑポリメラーゼ由来」の表現は、上記の変異の少なくとも１つがあるという条件で本発明のＤＮＡポリメラーゼが野生型Ｔａｑポリメラーゼと実質的に同一である事実に関する。しかしながら、該表現は、そのＤＮＡポリメラーゼが上記の変異の少なくとも１つがあり、逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を維持することを条件として、そのアミノ酸配列が野生型Ｔａｑポリメラーゼのアミノ酸配列に対して１つ又はそれ以上の更なるアミノ酸置換、欠失又は付加を有するＤＮＡポリメラーゼをも含む。特に、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、上記変異の少なくとも１つがあるという条件で、SEQID NO: 1に対して７０％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９２％を超える、９４％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、又は９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、SEQID NO: 1に示すようなアミノ酸配列において上記変異の少なくとも１つを含む配列を有する。他の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、SEQID NO: 1のアミノ酸位置２９３〜８３２に対応するアミノ酸配列であり、その配列において上記変異の少なくとも１つを有する配列を含む。さらなる実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、Klen TaqＤＮＡポリメラーゼとして知られるSEQ IDNO: 2に示されるようなアミノ酸配列であり、その配列において上記変異の少なくとも１つを含む配列を含む。これに関して、SEQID NO: 2のアミノ酸位置１〜５４０は、SEQID NO: 1のアミノ酸位置２９３〜８３２に対応し、すなわちKlen TaqＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑポリメラーゼのＣ末端断片である。

本明細書で用いられるような変異の表記法は、本技術分野に周知の標準的な表記法である。一例を挙げると、変異Ｓ５１５Ｒは、５１５の位置における変異であり、セリン（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）に置換された変異である。

本明細書で用いられる「SEQID NO: 1において」の表現は、本願で述べた全ての変異がSEQID NO: 1で得られるＴａｑポリメラーゼの野生型配列において見られるものであるということを意味する。一例を挙げると、本発明に係るＤＮＡポリメラーゼは、SEQID NO: 1におけるＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ及びＭ７４７Ｋの変異を含むSEQID NO: 2に示されるアミノ酸配列を有し得る。これらの変異は、ＤＮＡポリメラーゼの事実上のアミノ酸配列の２２３、３４６及び４５５の位置に実際にある。しかしながら、それらの変異は、全ての変異がSEQID NO: 1において見られるものであるため、Ｓ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ及びＭ７４７Ｋと示される。

好ましい実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、SEQID NO: 1におけるＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ及びＭ７４７Ｋの３つ全ての変異と、SEQID NO: 1におけるＬ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ、Ｅ７７３Ｇ及びＬ７８９Ｆからなる群から選択される１つ又は複数の変異とを含む。本発明のＤＮＡポリメラーゼの特定の実施形態は、SEQID NO: 1におけるＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ及びＭ７４７Ｋの上記変異を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ１２ＤＮＡポリメラーゼ）、これらの変異とさらに（ｉ）SEQID NO: 1におけるＬ４５９Ｍの変異（Ｄ９ＤＮＡポリメラーゼ）、（ｉｉ）SEQID NO: 1におけるＬ３２２Ｍ及びＬ４５９Ｍの変異（Ｆ４ＤＮＡポリメラーゼ）、（ｉｉｉ）SEQID NO: 1におけるＬ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ及びＥ７７３Ｇの変異（Ｅ９ＤＮＡポリメラーゼ）、又は（ｉｖ）SEQID NO: 1におけるＬ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ及びＥ７７３Ｇの変異（Ｍ１／Ｍ７４７ＫＤＮＡポリメラーゼ）をさらに含むＤＮＡポリメラーゼを含む。以下、これらのＤＮＡポリメラーゼは、例えば「Ｄ９ＤＮＡポリメラーゼ」、又は全長ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ由来の場合「ＴａｑＤ９」、又はＴａｑＤＮＡポリメラーゼのKlenTaq断片由来の場合「KlenTaqＤ９」と示される。

特定の好ましい実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、SEQID NO: 3 (KlenTaq C12 ＤＮＡポリメラーゼ), SEQ ID NO: 4 (KlenTaqD9ＤＮＡポリメラーゼ),SEQ ID NO: 5 (KlenTaq F4ＤＮＡポリメラーゼ), SEQ ID NO: 6 (KlenTaqE9ＤＮＡポリメラーゼ),SEQ ID NO: 7 (KlenTaq M1/M747KＤＮＡポリメラーゼ), SEQ IDNO: 8 (Taq C12ＤＮＡポリメラーゼ), SEQ ID NO: 9 (Taq D9ＤＮＡポリメラーゼ),SEQ ID NO: 10 (Taq F4ＤＮＡポリメラーゼ), SEQ ID NO: 11 (Taq E9ＤＮＡポリメラーゼ),又はSEQID NO: 12 (Taq M1/M747KＤＮＡポリメラーゼ)に示されるようなアミノ酸配列を含む、又はそのようなアミノ酸配列からなる。

さらなる態様において、本発明は、本発明に係るＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。

他の態様において、本発明は、本発明に係る核酸を含むベクターに関する。本明細書で用いられる「ベクター」の用語は、細胞に核酸を輸送するための媒体に関する。特に、該用語は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター及び人工染色体を含み、プラスミドベクターが特に好ましい。好ましくは、プラスミドベクターは、原核細胞又は真核細胞における本発明のＤＮＡポリメラーゼの発現に適するものである。それぞれのプラスミドベクターは、本技術分野に周知である。

さらなる態様において、本発明は、本発明のベクター及び／又は核酸を含む宿主細胞に関する。本発明のＤＮＡポリメラーゼの組換え発現に使用され得る適当な宿主細胞は、特に限定されず、本技術分野において周知である。それらは、例えば適当な細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む。

さらなる態様において、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼと共に適当な鋳型分子をインキュベートするステップを含むＤＮＡ分子の生成のための方法に関する。

それぞれの方法は、特に限定されず、本発明のＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ分子の生成に用いられる全ての方法を含む。適当な鋳型分子は、特に限定されず、天然又は合成ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む。本技術分野において周知であるように、ＤＮＡポリメラーゼは、新規のＤＮＡ分子の合成のために単量体ヌクレオチドを必要とする。これらは、天然ヌクレオチド、合成ヌクレオチド、及び２’−デオキシヌクレオチド等の修飾型ヌクレオチドを含む。例えばインキュベーション時間及びインキュベーション温度といった本発明のＤＮＡポリメラーゼの助けによりＤＮＡ分子を生成するのに適当な条件は、本技術分野において周知である。

特定の実施形態において、本発明の方法は、１つのステップ（すなわちワンステップ法）での、ＲＮＡ分子からｃＤＮＡへの逆転写、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による該ｃＤＮＡの増幅のための方法であり、該ステップは、該ＲＮＡ分子を本発明のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることを含み、該逆転写及び増幅の両方は、該ＤＮＡポリメラーゼにより進められる。

本発明のこの方法において、ＲＮＡ分子からｃＤＮＡへの逆転写、及び該ｃＤＮＡの増幅の両方は、本発明のＤＮＡポリメラーゼにより媒介される。有利には、一方では、更なる酵素が必要でなく、好ましくは反応混合液にそのような酵素は存在せず、他方では、本発明の方法は逆転写後で且つｃＤＮＡ増幅前に該反応混合液のいずれの操作も必要としない。従って、逆転写及び増幅は、１つのステップで行われる（すなわちワンステップ法）。有利には、逆転写ステップは、７０℃を超える高温で行われ得る。本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応に用いるのに適当なバッファーは、特に限定されず、本技術分野において周知である。さらに、適当なＲＴ−ＰＣＲプログラム、すなわちＲＴ−ＰＣＲ反応のそれぞれのステップの時間及び温度を規定するレジームは、特に限定されず、本技術分野において周知である。

本発明の方法の特定の例において、前記ワンステップ法は、ｄＮＴＰｓ、適当なプライマー及び本発明のＤＮＡポリメラーゼを含む適当なバッファーと、ＲＮＡ分子を含むサンプルとを混合することと、ＰＣＲ装置に反応混合液を置くことと、特定のＲＴ−ＰＣＲプログラムを実行することとから単純に構成され、さらなるサンプル操作のステップは必要としない。

他の特定の実施形態において、本発明の方法は、修飾型ヌクレオチドを含むＤＮＡ分子の生成のための方法であり、該修飾型ヌクレオチドの存在下で本発明のＤＮＡポリメラーゼと共に適当な鋳型分子をインキュベートするステップを含む。

本発明のこの方法において、「修飾型ヌクレオチド」の用語は、特に限定されず、天然型ヌクレオチドが修飾されてなるいずれかのヌクレオチドを含む。それらは、例えば２’‐デオキシヌクレオチドを含む。

しかしながら、７０℃を超える温度での増大された熱安定性及び活性により、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、２ステップ法、逆転写のみの方法、又は更なる酵素と組み合わせて行う方法を含むさらなる方法においても有利に用いられ得る。

さらなる態様において、本発明は、本発明に係るＤＮＡポリメラーゼを含むキットに関する。好ましい実施形態において、本発明のキットは、適当なバッファー及び／又は適当な使い捨て品及び／又は適当な酵素をさらに含む。

最後の態様において、本発明は、ＤＮＡ分子の生成のための本発明のＤＮＡポリメラーゼの使用に関する。好ましい実施形態において、本発明は、ＲＮＡ分子からｃＤＮＡへの逆転写、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による該ｃＤＮＡの増幅のための本発明のＤＮＡポリメラーゼの使用に関する。他の好ましい実施形態において、本発明は、修飾型ヌクレオチドを含むＤＮＡ分子の生成のための本発明のＤＮＡポリメラーゼの使用に関する。

本発明のＤＮＡポリメラーゼは、Ｍ７４７ＫＤＮＡポリメラーゼで知られる変異、すなわちＭ７４７Ｋの変異と、Ｍ１ＤＮＡポリメラーゼで知られる変異、すなわちＳ５１５Ｒ及びＩ６３８Ｆの変異と、任意にＬ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ及びＥ７７３Ｇの変異の１つ又はそれ以上とを含むことが好ましい。しかしながら、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、上記のＤＮＡポリメラーゼの変異の組み合わせから合理的に期待され得る特性を顕著に超える逆転写活性及び熱安定性に関する特性を示す（実施例１及び２を参照）。従って、上記変異の組み合わせは、極めて有利な特性を有するＤＮＡポリメラーゼを生じる驚くべき且つ予測しない相乗効果を提供する。

KlenTaqＤ９ＤＮＡポリメラーゼの変異領域を示すKlenTaqＤＮＡポリメラーゼの三次元の三次構造を示し、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ及びＭ７４７Ｋの変異の位置を示す図である。ＲＮＡ鋳型を用いて経時的なｄＮＴＰｓの変換により測定された本発明のKlenTaqＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を示す図である。本発明のKlenTaqＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を示す図であり、ここでは相関的な酵素活性を、図に示す時間で９５℃の温度で酵素をインキュベートした後に測定し、９５℃でインキュベートしない酵素活性を１００％と設定した。野生型KlenTaq（レーン１）、KlenTaqＭ１（レーン２）、KlenTaqＭ７４７Ｋ（レーン３）、KlenTaqＭ１／Ｍ７４７Ｋ（レーン４）及び異なるKlenTaq変異体（レーン５：Ｃ１２、レーン６：Ｄ９、レーン７：Ｅ９、レーン８：Ｆ４）を用いた逆転写プライマー伸長反応を示す図であり、ここで、反応混合液（２０μｌ）は、50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%Tween 20, 2.5 mM MgCl₂, 200 μMの各dNTP,150 nM F20 プライマー, 225 nM F30 RNA 及び25nM の各KlenTaqDNA ポリメラーゼを含み、反応混合液を７２℃でインキュベートし、Ｐはプライマーを表す。野生型KlenTaq、KlenTaqＭ１、KlenTaqＭ７４７Ｋ、KlenTaqＭ１／Ｍ７４７Ｋ及びKlenTaqＤ９を用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図であり、（Ａ）では鋳型として50pg/μl MS2 RNA (Roche)を用い、（Ｂ）では鋳型として40pg/μl 16S rRNA 及び23S rRNA(Roche)を用い、反応混合液（２０μｌ）は、50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%Tween 20, 2.5 mM MgCl₂, 200 μMの各dNTP,100 nMの各プライマー,0.6x SYBRgreen I、5 nMの各KlenTaqDNAポリメラーゼ、及びそれぞれのＲＮＡ鋳型を含む。野生型Taq(レーン１),Taq M1 (レーン２),Taq M747K(レーン３), Taq M1/M747K (レーン４)及びTaqD9 (レーン５)を用いて逆転写プライマー伸長反応を行った結果を示し、ここで、反応混合液（２０μｌ）は、50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%Tween 20, 2.5 mM MgCl₂, 200 μMの各dNTP,150 nM F20プライマー, 225 nM F30 RNA 及び25nMの各TaqDNAポリメラーゼを含み、反応混合液を７２℃でインキュベートし、Ｐはプライマーを表す。野生型Taq, TaqM1, Taq M747K, Taq M1/M747K及びTaq D9を用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、ここでは、50pg/μl MS2 RNA (Roche)を鋳型として用い、反応混合液（２０μｌ）は、50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%Tween 20, 2.5 mM MgCl₂, 200 μMの各dNTP,100 nMの各プライマー,0.6x SYBRgreen I, 5 nMのそれぞれのTaq DNAポリメラーゼ、及びそれぞれのＲＮＡ鋳型を含む。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ由来のＤＮＡポリメラーゼを用いたヌクレアーゼ反応の結果を示し、（Ａ）は鋳型のヘアピン構造及び２２‐ｎｔ基質（太字）を示し、矢印は予測される切断部位を示す。（Ｂ）は変性ＰＡＧＥにより分離された反応生成物を示し、Ｓは２２‐ｎｔ基質を示し、ここで、反応混合液（６０μｌ）は、50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%Tween 20, 2.5 mM MgCl₂, 50 nMの各dNTP, 150nM 22-nt基質,225 nM鋳型、及び150nMの各TaqDNAポリメラーゼを含み、反応混合液は３０℃でインキュベートした。フルオレセイン‐１２‐ｄＵＴＰ、５‐（２‐（４‐エチニルフェニル）エチニル）‐ｄＵＴＰ又はビオチン１１‐ｄＵＴＰの存在下でのプライマー伸長実験の結果を示し、（Ａ）はフルオレセイン‐１２‐ｄＵＴＰ、５‐（２‐（４‐エチニルフェニル）エチニル）‐ｄＵＴＰ又はビオチン１１‐ｄＵＴＰの構造を示し、（Ｂ）は野生型KlenTaq(レーン1),KlenTaq M1 (レーン2), KlenTaq M747K (レーン3),KlenTaq M1/M747K (レーン4), 及びKlenTaqD9 (レーン5)を用いたプライマー伸長反応の結果を示す。ここで、反応混合液（２０μｌ）は、50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%Tween 20, 2.5 mM MgCl₂, 100 μMの各dNTP, 150nM BRAF23Cプライマー, 200 nM 鋳型及び30nMのそれぞれのKlenTaqDNAポリメラーゼを含み、反応混合液は、７２℃で１時間インキュベートした（天然ＴＴＰを含むものは５分間インキュベートした）。Ｐはプライマーを示す。

本発明は、本発明を限定するものではない以下の実施例においてさらに詳細に説明される。

実施例１：本発明のＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性
本発明のＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を、ＲＮＡ鋳型を用いて経時的なｄＮＴＰｓの変換を測定することにより測定した。

特に、野生型KlenTaq,KlenTaq M1, KlenTaq M747K及び本発明のKlenTaq DNAポリメラーゼを用いた逆転写プライマー伸長反応を、50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%Tween 20及び2.5mM MgCl₂を含む溶液中に１５０ｎＭの放射性ラベルプライマーＦ２０(5’-d(CGTTGG TCC TGA AGG AGG AT)-3’)、２２５ｎＭのＲＮＡ鋳型Ｆ３０(5’-AAAUCA ACC UAU CCU CCU UCA GGA CCA ACG-3’)、２００μＭの各ｄＮＴＰ、及び２５ｎＭのKlenTaqDNAポリメラーゼを含む溶液を用いて７２℃で行った。反応混合液の反応を、１０秒、３０秒及び６０秒で停止し、９５℃で５分間変性し、１２％変性ＰＡＧＥゲルを用いて分離した。放射線イメージングにより可視化した。得られたバンドを分析し、それらの強度をｄＮＴＰの変換に換算する。

図２から得られ得るように、Ｍ７４７ＫＤＮＡポリメラーゼの変異及びＭ１ＤＮＡポリメラーゼの変異を含む本発明のKlenTaq DNAポリメラーゼは、顕著に改善された逆転写酵素活性を有する。特に、KlenTaqM1 DNAポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型において６０秒で約２ｐｍｏｌのｄＮＴＰｓを重合し、一方、M747KDNAポリメラーゼは、上記同一の時間で約１ｐｍｏｌのｄＮＴＰｓを重合する。しかしながら、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、上記同一の時間で２０ｐｍｏｌに至るｄＮＴＰｓを重合する。この増大は、Ｍ１及びＭ７４７ＫＤＮＡポリメラーゼにおけるデータから合理的に予測されるものを顕著に超えるものであり、それぞれの変異の驚くべき且つ予測されない相乗効果を証明する。

実施例２：本発明のＤＮＡポリメラーゼの熱安定性
本発明のKlenTaqDNAポリメラーゼの熱安定性は、特定の時間で９５℃で該KlenTaqDNAポリメラーゼをインキュベートし、該インキュベーションの後にそれらの活性を測定することにより測定された。

詳細には、KlenTaqDNAポリメラーゼ（２０ｎＭ）を50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%Tween 20及び2.5mM MgCl₂中において、９５℃でインキュベートした。異なる時点で、１５μｌのサンプルを取り、氷上に保存した。その後、プライマー伸長反応を総容量１５μｌ、５分間、７２℃で行った。特に、プライマー、鋳型及びｄＮＴＰｓを含む反応混合液を、３．７５μｌのポリメラーゼサンプルと混合し、50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%Tween 20 and 2.5 mM MgCl₂中に、最終濃度が150 nMの放射性ラベルプライマーF23 (5’-d(CGT TGG TCC TGA AGG AGG ATA GG)-3’), 225 nMのDNA鋳型F33A (5’-d(AAA TCA ACC TAT CCT CCT TCA GGA CCA ACG TAC)-3’), 200 μMの各dNTP及び5nMのそれぞれのポリメラーゼを含む溶液を得た。反応混合液を１２％変性ＰＡＧＥゲルを用いて分離し、放射線イメージングにより可視化した。得られたバンドを分析し、それらの強度をｄＮＴＰの変換に換算した。ＤＮＡポリメラーゼサンプルを加熱しなかった反応の変換を１００％の活性と設定した。

図３から得られ得るように、KlenTaqC12, KlenTaq D9, KlenTaq E9及びKlenTaq F4 DNAポリメラーゼは、Ｍ１ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大された熱安定性を示す。

実施例３：プライマー伸長実験における本発明のKlenTaqDNAポリメラーゼの逆転写酵素活性
野生型KlenTaq,KlenTaq M1, KlenTaq M747K及び本発明のKlenTaq DNAポリメラーゼの逆転写酵素活性を、鋳型としてＲＮＡを用い、プライマーとしてＤＮＡを用いてプライマー伸長実験で比較した。

反応を、50 mMTris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1% Tween20及び2.5mM MgCl₂中に、150 nM放射性ラベルプライマーF20(5’-d(CGT TGG TCC TGA AGG AGG AT)-3’), 225 nM RNA鋳型 F30 RNA(5’-AAA UCA ACC UAU CCU CCU UCA GGA CCA ACG-3’), 200 μMの各dNTP及び25nMのそれぞれのKlenTaqDNAポリメラーゼを含む溶液を用いて７２℃で行った。反応混合液の反応を、３０秒、１分及び５分後に停止した。９５℃で５分の変性後、反応混合液を、１２％変性ＰＡＧＥゲルを用いて分離した。放射線イメージングにより可視化した。コントロール試験を、鋳型としてDNA(5’-d(AAA TCA ACC TAT CCT CCT TCA GGA CCA ACG TAC)-3’)を用い、１分間のインキュベートを行い、他は上記と同様に行った。

図４から得られ得るように、本発明のKlenTaqDNAポリメラーゼは、KlenTaqM1及びKlenTaqM747Kと比較して増大された逆転写酵素活性を示す。

本発明のKlenTaqDNAポリメラーゼは、各時点においてより効率的にプライマーを伸長し、３０秒後であっても全長の生成物を生成できた。従って、この試験は、１つの酵素におけるＭ７４７Ｋ変異とＭ１変異との組み合わせで得られる本発明のＤＮＡポリメラーゼの増大された逆転写酵素活性を確証する。

実施例４：本発明のKlenTaqDNAポリメラーゼを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試験を、野生型KlenTaq,KlenTaq M1, KlenTaq M747K, KlenTaq M1/M747K及びKlenTaqD9を用いて行った。

反応混合液（２０μｌ）には、50 mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM(NH₄)₂SO₄, 0.1% Tween 20, 2.5 mM MgCl₂,200 μMの各dNTP, 100nMの各プライマー(5’-d(ATC GCT CGA GAA CGC AAG TT)-3’; 5’-d(CG GAC TTC ATG CTG TCG GTG)-3’),0.6x SYBRgreen I, 5 nMのそれぞれのDNAポリメラーゼ、及び50pg/μlMS2 RNA (Roche)を含有させた。

まず、９５℃で３０秒の最初の変性ステップ、５５℃で３５秒のアニーリングステップ、及び７２℃で７．５分の伸長ステップを用いて逆転写を行った。９５℃で１分の変性の後、９５℃で３０秒、５５℃で３５秒、及び７２℃で４０秒のＰＣＲサイクルを５０回行った。

E. coliからの 40 pg/μl16S-rRNA 及び23S-rRNA (Roche)を含む反応を、６６℃のアニーリング温度、４０回のＰＣＲサイクル、及びそれぞれのプライマー(5’-d(CTGGCG GCA GGC CTA ACA CA)-3’; 5’-d(GCA GTT TCC CAG ACA TTA CT)-3’)以外は上述と同様にして行った。二本鎖ＤＮＡの形成をSYBRgreenIの結合、従って蛍光の増大により検出した。正しい生成物の形成をアガロースゲル分析により確認した。

鋳型としてＲＮＡを用いることにより、本発明のKlenTaqDNAポリメラーゼは、（図５に示すように）KlenTaqM1及びKlenTaqM747Kと比較して少ないサイクル後に蛍光の増大を示し、Ｍ１では極めて乏しい性能を示す条件において増大されたＲＴ−ＰＣＲ活性を示す。これは、この酵素のより広い適用範囲を可能にさせる。

実施例５：プライマー伸長試験における本発明のＴａｑＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性
野生型Taq, Taq M1, Taq M747K, Taq M1/M747K及びTaqD9の逆転写酵素活性を、鋳型としてＲＮＡを用い、プライマーとしてＤＮＡを用いてプライマー伸長試験で比較した。

反応を、50 mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM(NH₄)₂SO₄, 0.1% Tween 20及び2.5mM MgCl₂を含む溶液中に、150 nM放射性ラベルプライマーF20(5’-d(CGT TGG TCC TGA AGG AGG AT)-3’), 225 nM RNA鋳型 F30(5’-AAA UCA ACC UAU CCU CCU UCA GGA CCA ACG-3’), 200 μMの各dNTP及び25nMのそれぞれのDNAポリメラーゼを含む溶液を用いて７２℃で行った。反応混合液の反応を３０秒、１分、５分及び１０分後に停止した。９５℃で５分の変性後、反応混合液を、１２％変性ＰＡＧＥゲルを用いて分離した。放射線イメージングにより可視化した。

図６から得られ得るように、本発明のＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、Taq M1及びTaqM747Kと比較して増大された逆転写酵素活性を示す。

本発明のＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、各時点でより効率的にプライマーを伸長する。従って、この試験は、１つの酵素におけるＭ７４７Ｋ変異とＭ１変異との組み合わせで得られる本発明のＤＮＡポリメラーゼの増大された逆転写酵素活性を確証する。

実施例６：本発明のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試験を、野生型Taq, Taq M1, Taq M747K,Taq M1/M747K及びTaq D9を用いて行った。

反応混合液（２０μｌ）には、50 mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM(NH₄)₂SO₄, 0.1% Tween 20, 2.5 mM MgCl₂,200 μMの各dNTP,100 nMの各プライマー(5’-d(ATCGCT CGA GAA CGC AAG TT)-3’; 5’-d(CG GAC TTC ATG CTG TCG GTG)-3’), 0.6xSYBRgreen I, 5 nM のそれぞれのDNAポリメラーゼ及び50pg/μlMS2 RNA (Roche)を含有させた。

二本鎖ＤＮＡの形成をSYBRgreenIの結合、従って蛍光の増大により検出した。

鋳型としてＲＮＡを用いることにより、本発明のTaq DNAポリメラーゼは、（図７に示すように）KlenTaqM1及びKlenTaqM747Kと比較して少ないサイクル後に蛍光の増大を示し、Ｍ１及びＭ７４７Ｋでは極めて乏しい性能を示す条件においてより高い逆転写酵素ＰＣＲ活性を示す。これは、この酵素のより広い適用範囲を可能にさせる。

実施例７：本発明のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ由来のＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性
Taq M1/M747K及びTaq D9のヌクレアーゼ活性を、野生型Taq,Taq M1及びTaqM747Kのヌクレアーゼ活性と比較した。安定ＤＮＡヘアピン構造及び相補的放射性ラベル基質を用いた。これらの２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、基質オリゴヌクレオチドの切断が生じるずれた５’末端及び解かれた３’プライマー末端を残す。この基質の切断を、異なる時点（０、５、１５、３０、６０分）で測定した。反応混合液には、50mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%Tween 20, 2.5 mM MgCl₂, 50 nMの各dNTP, 150nM 22-nt基質(5’-d(CCCCCC CCC CTC ATA CGT ACA C)-3’), 225 nM鋳型(5’-d(GTGTAC GTA TGA TCA TGC AGG TAG CCG ATG AAC TGG TCG AAA GAC CAG TTC ATC GGC TAC CTGCAT GAT)-3’)及び150 nMのそれぞれのTaq DNAポリメラーゼを含有させた。反応混合液を３０℃でインキュベートした。

Taq M1, Taq M747K及びTaqD9のヌクレアーゼ活性は、図８に見られるように類似する。TaqM1/M747Kのみが、わずかに低減されたヌクレアーゼ活性を示したが、そうであっても、活性ヌクレアーゼドメインを表し、基質を切断する。

実施例８：プライマー伸長試験における本発明のKlenTaqDNAポリメラーゼによる修飾型２’‐デオキシヌクレオシド三リン酸の変換
核酸塩基での修飾をもつ２’‐デオキシヌクレオシドの許容性を野生型KlenTaq,KlenTaq M1, KlenTaq M747K, KlenTaq M1/M747K及びKlenTaqD9を用いたプライマー伸長試験で試験した。

反応を、50 mM Tris-HCl (pH 9.2), 16 mM(NH₄)₂SO₄, 0.1% Tween 20及び2.5mM MgCl₂の中に、150 nM放射性ラベルプライマーBRAF23C(5’-d(GAC CCA CTC CAT CGA GAT TTC TC)-3’), 200 nM鋳型(5’-d(A₄₆GA GAA ATC TCG ATG GAG TGG GTC)-3’), 100 μMのそれぞれのdNTP及び30nM のKlenTaqDNAポリメラーゼを含む溶液を用いて７２℃で行った。反応混合液の反応を、ＴＴＰの場合では５分後に、他の全ての場合では１時間後に停止し、９５℃で５分間変性し、１２％変性ＰＡＧＥゲルを用いて分離した。放射線イメージングにより可視化を行った。コントロール試験を、ｄＮＴＰ非存在下で、又は修飾型ｄＮＴＰｓの代わりに天然型ＴＴＰを用いて上述のように行った。

図９から得られ得るように、本発明のKlenTaq DNAポリメラーゼは、KlenTaqM1及びKlenTaqM747Kと比較して、顕著に増大された修飾型ｄＮＴＰｓの許容性を示す。特に、プライマー結合領域の後に２’‐デオキシアデノシン残基のみを有するＤＮＡ鋳型を、フルオレセイン‐１２‐ｄＵＭＰ(ThermoScientific)、５‐（２‐（４‐エチニルフェニル）エチニル）‐ｄＵＭＰ(Obeid S.et al., Chem. Commun., 2012, Interactions of non-polar and “Click-able”nucleotides in the confines of a DNA polymerase active site; DOI:10.1039/C2CC34181F)又はビオチン‐１１‐ｄＵＭＰ(JenaBioscience)の複数組み込みに用いた。

陽性コントロールでは、全ての試験されたＤＮＡポリメラーゼで５分後に全長の生成物の形成を示す。修飾型基質とのインキュベーションでは、全長の生成物は得られないが、全てのＤＮＡポリメラーゼはいくつかの修飾型ヌクレオチドを組み込むことができる。しかしながら、KlenTaqM1/M747K及びKlenTaqD9は、親酵素のKlenTaqM1及びKlenTaqM747Kと比較して、フルオレセイン‐１２‐ｄＵＴＰ及び５‐（２‐（４‐エチニルフェニル）エチニル）‐ｄＵＴＰの増大された許容性を示す。ビオチン‐１１‐ｄＵＴＰの存在下で、KlenTaqM1及びKlenTaqM747Kは、連続する約１０の修飾型ヌクレオチドを組み込むことができる。しかしながら、本発明のKlenTaqM1/M747K及びKlenTaqD9のＤＮＡポリメラーゼでは、１８に至る組み込まれた修飾型ヌクレオチドを示す生成物を生じ、２５に至る組み込まれたヌクレオチドのより長い生成物でさえも合成できる。

３つ全ての試験は、KlenTaq D9及びKlenTaqM1/M747KがKlenTaqM1及びKlenTaqM747Kと比較して修飾型基質の増大された組み込み及び伸長の効率を有することを示す。

Claims

野生型Thermus aquaticus（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列においてＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ及びＭ７４７Ｋの変異の全てを含む、野生型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ由来のＤＮＡポリメラーゼ。
前記SEQ ID NO: 1のアミノ酸の位置２９３〜８３２の配列に対応するアミノ酸配列において前記変異の全てを有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
SEQIDNO: 2に示すアミノ酸配列において前記変異の全てを有するアミノ酸配列を含む
請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
前記SEQ ID NO: 1においてＬ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ、Ｅ７７３Ｇ及びＬ７８９Ｆからなる群から選択される１つ又はそれ以上の変異をさらに含むアミノ酸配列を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
前記SEQ ID NO: 1においてＬ４５９Ｍの変異を含むアミノ酸配列を含む請求項４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
前記SEQ ID NO: 1においてＬ３２２Ｍ及びＬ４５９Ｍの変異を含むアミノ酸配列を含む請求項４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
前記SEQ ID NO: 1においてＬ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ及びＥ７７３Ｇの変異を含むアミノ酸配列を含む請求項４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
前記SEQ ID NO: 1においてＬ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ及びＥ７７３Ｇの変異を含むアミノ酸配列を含む請求項４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
SEQ ID NOs: 3〜12のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
請求項１１に記載のベクター、又は請求項１０に記載の核酸を含む宿主細胞。
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼと適切な鋳型とを共にインキュベートするステップを含むＤＮＡ分子の製造方法。
前記方法は、ＲＮＡ分子からｃＤＮＡへの逆転写と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による前記ｃＤＮＡの増幅とを１つのステップで行うための方法であり、
前記ステップは、前記ＲＮＡ分子を請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることを含み、
前記逆転写及び増幅の両方は、前記ＤＮＡポリメラーゼにより進められる請求項１３に記載の方法。
前記方法は、修飾型ヌクレオチドを含むＤＮＡ分子の生成のための方法であり、
前記修飾型ヌクレオチドの存在下で請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼと適切な鋳型分子とを共にインキュベートするステップを含む請求項１３に記載の方法。
ＤＮＡ分子の生成のための請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼの使用。
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼを含むキット。