JP5357893B2 - 迅速超長鎖ｐｃｒのための単一酵素系 - Google Patents

Description

関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２００７年１２月２７日出願の米国仮特許出願第６１／０１６，８５０号、および２００８年１月３１日出願の第６１／０２５，０４７号に優先権を請求し；該出願の全開示は、その全体が本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は長鎖核酸断片の合成法に関する。特に、本発明は、単一ＤＮＡポリメラーゼを含有する配合物を用いて、長鎖および超長鎖核酸断片を増幅するためのＰＣＲ法に関する。

ゲノミクスの分野が発展してくるにつれて、ますます長い連続したストレッチの核酸を単離しそして分析する必要性が増加してきている。疾患遺伝子発見および分析のための方法は、これらの配列を容易にそして迅速に得る能力によって促進されるであろう。例えば、遺伝的ハプロタイプの分析は、長い連続したＤＮＡに渡って、マーカーアレルを決定する必要があるが、この分析は、現在、非常に困難であり、そしてしばしば統計的方法によって行われる。単純にそして迅速に、長い連続したストレッチのＤＮＡを単離可能な方法があれば、この分析が非常に単純化され、そしてこの分野における新規研究が可能になるであろう。

非常に長いＤＮＡを増幅するための現在の方法は、いくつかの欠点に苦しむ。Ｃｈｅｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９１（１２）：５６９５−５６９９（１９９４）。反応は遅く、伸長時間は、伸長アンプリコン１ｋｂあたり、１．０分の桁である。したがって、２０ｋｂアンプリコンは、周期あたり２０分より長い伸長時間または６時間を超えるＰＣＲ反応時間を要する。より大きいＤＮＡの増幅は極めて遅い。ＰＣＲの、上昇した温度でのこうした長時間のインキュベーションは、反応中のヌクレオチド、ＤＮＡおよびポリメラーゼの物理的および化学的安定性に負担をかけ、そしてしたがって改善が困難になっている。また、この長さのＤＮＡを増幅するための現在の商業的キット配合物は、３’−５’校正活性を持つポリメラーゼおよび非校正ＤＮＡポリメラーゼの２つの別個のＤＮＡポリメラーゼの混合物を必要とする。この配合物は２つのポリメラーゼを必要とするため、最適化し、トラブル解決し、または制御するのが困難である。したがって、単純な単一酵素配合物を用いた、長鎖核酸断片の迅速な増幅法があることが望ましい。

米国ワシントン州沖の深海孔フランジ（ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ ｆｌａｎｇｅ）、ファンデフーカ海嶺のエンデバー・セグメントから得られた好熱性生物、テルモコッカス・バロッシー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉｉ）から、Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が単離され、そしてクローニングされた（Ｄｕｆｆａｕｄ ＧＤ， Ｓｙｓｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２１（１）：４０−４９（１９９８））。精製されたＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼの性質決定によって、該酵素がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性に加えて、活性校正機能を所持することが示された。他のＤＮＡポリメラーゼに比較すると、Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼのメンバーであり、そしてＰｆｕおよびＴ．リトラリス（Ｔ． ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼと比較して、およそ８０％保存されることが明らかになった（ＵＳ ５，６０２，０１１）。

いくつかのポリメラーゼにおいて、ＦＤＩＥＴ配列をＦＡＩＡＴに改変すると、ヌクレアーゼ活性が減少することが示されてきている（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ， Ｖ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１９９−２０１， １９８８； Ｂｅｒｎａｄ， Ａ．ら， Ｃｅｌｌ ５９：２１９−２２８， １９８９； Ｆｒｅｙ， Ｍ．Ｗ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２５７９−２５８３， １９９３； ＵＳ ５，４８９，５２３）。ＵＳ ５，８８２，９０４は、Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼを操作して、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させうることを開示する。具体的には、ＦＤＩＥＴアミノ酸配列（天然Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼの残基１４０〜１４４）をＦＡＩＡＴに改変して、エキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを生成した。

ＵＳ ５，６０２，０１１ ＵＳ ５，４８９，５２３ ＵＳ ５，８８２，９０４

Ｃｈｅｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９１（１２）：５６９５−５６９９（１９９４） Ｄｕｆｆａｕｄ ＧＤ， Ｓｙｓｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２１（１）：４０−４９（１９９８） Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ， Ｖ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１９９−２０１， １９８８ Ｂｅｒｎａｄ， Ａ．ら， Ｃｅｌｌ ５９：２１９−２２８， １９８９ Ｆｒｅｙ， Ｍ．Ｗ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２５７９−２５８３， １９９３

長鎖ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するための新規方法を開示する。これは、単一ＤＮＡポリメラーゼ系を用いて達成され、この系はまた、特に、約５ｋｂより長い長鎖配列の増幅に関して、先に知られる方法よりも実質的により迅速である。生じた増幅産物を、ハイブリダイゼーション・プローブとして、配列決定テンプレートとして用いてもよく、そしてフィンガープリンティングのために、または他の下流分析目的のために、制限エンドヌクレアーゼで消化してもよい。

本発明の１つの側面において、長鎖核酸配列をＰＣＲ増幅するための方法を提供する。該方法はまず、核酸ターゲットを提供し；次いで、オリゴヌクレオチド・プライマー、単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸を添加して、反応混合物を形成し；そして次いで、熱周期条件下で反応混合物をインキュベーションして、増幅されたＰＣＲ産物を形成する、多数周期のプライマーの伸長によって、ターゲットの増幅を促進する工程を含む。

本発明は、他の酵素またはタンパク質またはペプチド補因子のいずれも存在しない中、長鎖ＰＣＲ断片を増幅するために単一のＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いる点で、先のＰＣＲ法を改善する。単一酵素系は、長さ少なくとも１０ｋｂ、例えば長さ少なくとも２０ｋｂ、または長さ４０ｋｂを超える、またはさらに長さ１００ｋｂを超えるＰＣＲ産物を増幅可能である。

本発明はさらに、重合速度およびしたがって増幅速度が非常に増加している点で、先のＰＣＲ法を改善する。したがって、１ｋｂあたり約１分よりはるかに少ない、またはさらに２ｋｂあたり約１分より少ない、またはさらに５ｋｂあたり約１分より少ない伸長時間しか必要とされない。特定の態様において、伸長時間は、１０ｋｂあたり約１分未満であり、またはさらに２０ｋｂあたり約１分未満である。

本発明の特定の態様において、単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕエキソ⁻ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼおよびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔエキソ⁻ＤＮＡポリメラーゼの１つである。好ましい態様において、単一のＤＮＡポリメラーゼはＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼである。最も好ましい態様において、単一のＤＮＡポリメラーゼはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼである。

いくつかの態様において、増幅される核酸ターゲットは、低複雑性核酸試料、例えばバクテリオファージまたはウイルス由来の精製ＤＮＡである。他の態様において、増幅される核酸ターゲットは、高複雑性ゲノムＤＮＡ、例えば植物または動物由来のゲノムＤＮＡである。好ましい態様において、核酸ターゲットはヒト・ゲノムＤＮＡである。

特定の態様において、増幅プライマーは、エキソヌクレアーゼ耐性プライマーである。１つの好ましい態様において、プライマーはＬＮＡヌクレオチドを有するか、あるいはプライマーの３’末端またはその近傍に、通常のホスホジエステルの代わりに、１以上のホスホロチオエート連結を有する。

第二の側面において、長鎖核酸断片をＰＣＲ増幅するための配合物を提供する。配合物は、単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチド・プライマー、ｄＮＴＰ、核酸テンプレートおよび増幅反応を実行するのに適した反応緩衝剤で構成される。この配合物を用いて増幅されるＰＣＲ断片は、長さ少なくとも１０ｋｂであるが、配合物には第二の酵素またはポリメラーゼまたはタンパク質またはペプチド補因子組成物は含まれない。好ましくは、新規配合物は、長さ少なくとも２０ｋｂ、または長さ４０ｋｂを超える、またはさらに長さ１００ｋｂを超える、ＰＣＲ産物を増幅する。

本発明の配合物に付加される利点は、重合または増幅の速度が非常に増加することである。したがって、２ｋｂに関して約１分未満、またはさらに５ｋｂに関して約１分未満の伸長時間しか必要でない。好ましい態様において、伸長時間は、１０ｋｂに関して約１分未満、またはさらに２０ｋｂに関して約１分未満である。

配合物中の単一のＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼである。最も好ましい態様において、ポリメラーゼはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼである。核酸テンプレートは、低複雑性核酸試料、例えばバクテリオファージまたはウイルス由来の精製ＤＮＡ、またはあるいは高複雑性、ゲノムＤＮＡ、例えば植物または動物由来のゲノムＤＮＡのいずれでもよい。好ましい態様において、核酸ターゲットは精製ヒト・ゲノムＤＮＡである。増幅プライマーには、エキソヌクレアーゼ耐性プライマー、例えばＬＮＡヌクレオチドを有するもの、あるいはプライマーの３’末端またはその近傍に、通常のホスホジエステルの代わりに、１以上のホスホロチオエート連結を有するものが含まれてもよい。

別の側面において、本発明は、少なくとも１０ｋｂの長鎖核酸産物をＰＣＲ増幅するためのキットを提供する。該キットは、単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、増幅反応を実行するのに適した反応緩衝剤、およびユーザーマニュアルを含む。場合によって、キットにはまた、ＬＮＡヌクレオチドを含有するか、あるいは３’末端またはその近傍に、通常のホスホジエステルの代わりに１以上のホスホロチオエート連結を含んで、エキソヌクレアーゼ耐性でありうる、オリゴヌクレオチド・プライマーも含まれる。キットの反応構成要素は、１以上のバイアル中で提供される。長鎖ＰＣＲキットには、第二の酵素、ポリメラーゼ、タンパク質またはペプチド補因子組成物は含まれないが、長さ少なくとも２０ｋｂ、または長さ４０ｋｂを超える、またはさらに長さ１００ｋｂを超える、ＰＣＲ産物を増幅する。

新規キットに付加される利点は、伸長速度が非常に増加することである。したがって、２ｋｂあたり約１分よりはるかに少ない、またはさらに５ｋｂあたり約１分より少ない伸長時間しか必要とされない。好ましい態様において、伸長時間は、１０ｋｂあたり約１分未満であり、またはさらに２０ｋｂあたり約１分未満である。

キット中の単一ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼである。最も好ましい態様において、ポリメラーゼはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼである。キットは、低複雑性、またはあるいは高複雑性、例えば植物または動物から単離されたゲノムＤＮＡのいずれの核酸テンプレートを増幅するのにも適している。

本発明のさらに別の側面において、長鎖ターゲット核酸分子の相補鎖を合成するための方法を提供する。該方法はまず、ターゲット核酸分子を相補的プライマー分子に曝露して、ターゲットへのプライマーのハイブリダイゼーションを達成し；そして単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下、重合条件下で、プライマーを高温で伸長して、長さ１０ｋｂを超える核酸鎖を伸長する工程を含む。

本発明は、他のＤＮＡポリメラーゼ酵素のいずれも存在しない中、長鎖相補的核酸鎖を伸長するための単一のＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いる。単一酵素系は、長さ少なくとも１０ｋｂの核酸鎖を伸長する。好ましくは、新規方法は、長さ少なくとも２０ｋｂ、または長さ４０ｋｂを超える、またはさらに長さ１００ｋｂを超える核酸鎖を伸長する。本発明に付加された利点は、重合速度の増加にある。必要な重合時間または伸長時間は、２ｋｂに関して約１分未満、またはさらに５ｋｂに関して約１分未満である。好ましい態様において、伸長時間は１０ｋｂに関して約１分未満、またはさらに２０ｋｂに関して約１分未満である。

相補鎖伸長反応に有用な単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼである。より好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、核酸ターゲットは低複雑性核酸試料である。他の態様において、ターゲットはゲノムＤＮＡ、例えば植物または動物由来のゲノムＤＮＡである。

図１は、アガロース電気泳動ゲル上、Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼを用いて２０ｋｂラムダＤＮＡアンプリコンを増幅した増幅産物を示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー（ＨｉｎｄＩＩＩで切断したラムダＤＮＡ）。緩衝剤条件の変動を示す。 図２は、アガロース電気泳動ゲル上、変動する量のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓの熱安定性一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＥＴ ＳＳＢ）とともに、ＴｂａまたはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いて４７ｋｂラムダＤＮＡアンプリコンを増幅した増幅産物を示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。 図３は、アガロース電気泳動ゲル上、Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼを用いて２２ｋｂラムダＤＮＡアンプリコンを増幅した増幅産物を示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。緩衝剤条件の変動を示す：Ｓ−標準緩衝剤、ＡＢＩ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＸＬ ＰＣＲ緩衝剤。伸長時間を示す。 図４は、アガロース電気泳動ゲル上、ＴｂａまたはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いて２２ｋｂラムダＤＮＡアンプリコンを増幅した増幅産物を示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。伸長温度およびヌクレオチド濃度およびテンプレートＤＮＡ量の変動を示す。レーンの最後のセットはＰＣＲサイクリングを伴わず、出発反応と同等の体積を含有する。 図５は、アガロース電気泳動ゲル上、変動する濃度の酢酸マグネシウムとともに、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いて２２ｋｂラムダＤＮＡアンプリコンを増幅した増幅産物を示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。バンド強度の定量的グラフもまた示す。 図６は、変動する濃度の投入テンプレートＤＮＡとともに、ＴｂａまたはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いて２２ｋｂラムダＤＮＡアンプリコンを増幅した増幅産物を示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。レーンの最後のセットはＰＣＲサイクリングを伴わず、出発反応と同等の体積を含有する。 図７は、アガロース電気泳動ゲル上、増加する量のヒト・ゲノムＤＮＡの存在下、通常のまたはホスホロチオエート・プライマーのいずれかとともに、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いて２２ｋｂラムダＤＮＡアンプリコンを増幅した増幅産物を示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。 図８は、アガロース電気泳動ゲル上、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いて１０．９ｋｂ大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡアンプリコンを増幅した増幅産物を示す。大腸菌ゲノムＤＮＡの量を示し、ＰＣＲ伸長時間の変動も示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。 図９は、アガロース電気泳動ゲル上、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いて、大腸菌ゲノムＤＮＡ中の２２ｋｂラムダ溶原菌アンプリコンを増幅した増幅産物を示す。大腸菌ゲノムＤＮＡの量を示し、ＰＣＲ伸長時間の変動も示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。 図１０は、アガロース電気泳動ゲル上、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いて、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｕｒｅｕｓ）の３つの株から単離されたゲノムＤＮＡから１０．９ｋｂアンプリコンを増幅した増幅産物を示す。黄色ブドウ球菌ゲノムＤＮＡの量を示し、ＰＣＲ伸長時間の変動も示す。予期される産物サイズを示す。 図１１は、アガロース電気泳動ゲル上、多様な濃度のテトラメチレンスルホキシド（ＴＭＳＯ）の存在下、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）から単離された非常にＧＣリッチであるゲノムＤＮＡ １０ｎｇ由来のいくつかのアンプリコンの増幅産物を示す。予期される産物サイズを示す。 図１２は、アガロース電気泳動ゲル上、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ヒト・ゲノムＤＮＡに存在するミトコンドリアＤＮＡの１２．４ｋｂアンプリコンを増幅した増幅産物を示す。ヒト・ゲノムＤＮＡの量を示し、ＰＣＲ伸長時間および周期数の変動も示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。 図１３は、アガロース電気泳動ゲル上、個々の増幅として、そして多重増幅においての両方で、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ヒト・ゲノムＤＮＡにおけるいくつかのアンプリコンの増幅産物を示す。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。 図１４Ａおよび１４Ｂは、アガロース電気泳動ゲル上、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ヒト・ゲノムＤＮＡからのＣＦＴＲ遺伝子全域の一連のタイル状のアンプリコンの増幅産物を示す。図１４Ａ。１９〜２０ｋｂアンプリコン。予期される産物サイズを示す。Ｍ−ＤＮＡマーカー。図１４Ｂ。タイル状のおよそ４０ｋｂのアンプリコン。数字はアンプリコン・マップを指す。図１４Ｃ。ＣＦＴＲ遺伝子のアンプリコン・マップ。

開示する方法は、ＤＮＡの分析に、そして特に、しばしば遺伝子型ならびに元来の配列情報を決定するために用いられる、ＤＮＡの配列に応じた分析に関する。本発明はまた、ＤＮＡ配列の増幅にも関する。増幅は、元来のものに相補的な配列を有し、元来の配列情報を保持する、ＤＮＡの新規鎖の合成を意味する。より具体的には、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための改善法に関する。本出願者らは、改善法を用いると、１０ｋｂより長い長鎖ＰＣＲ断片をルーチンに得ることも可能であり、そして先の方法に比較して、何分の１かの時間で可能であることを見出した。本方法を実行するための配合物およびキットがやはり提供される。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸または核酸混合物中に含有される少なくとも１つの特定の核酸配列を増幅するためのプロセスと定義され、ここで各核酸は、２つの別個の相補鎖からなる。第一に、鎖を変性させ、そして特定の配列を増幅するための２つのオリゴヌクレオチド・プライマーと合わせる。一方のプライマーから合成される伸長産物が、相補体から分離された際に、他方のプライマーによって開始される合成のテンプレートとして働きうるようにプライマー配列が選択された。ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーを伸長し、次いで、加熱または他の手段によって伸長産物を変性させて、一本鎖分子を産生する。アニーリング温度まで冷却すると、生成された一本鎖分子はプライマーとアニーリングし、そしてアニーリング温度または伸長温度で、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される準備が再び整う。このプロセスを１回以上反復して、プライマー部位「間」の配列（すなわちアンプリコン）の指数関数的増幅を生じる。例えばＵＳ ４，６８３，２０２を参照されたい。

したがって、１つの側面において、本発明は、長鎖核酸配列をＰＣＲ増幅するための方法を提供する。該方法は、核酸ターゲットを提供し；オリゴヌクレオチド・プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を添加して、反応混合物を形成し、そして熱周期条件下で反応混合物をインキュベーションして、多数の増幅されたＰＣＲ産物を形成するプライマーの伸長によって、ターゲットの増幅を促進する工程を含む。本出願者らは、予期せぬことに、特定のＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝剤組成を用いると、長鎖ＰＣＲ断片がルーチンに増幅されることを発見した。該方法は長鎖断片を増幅するだけでなく、必要な伸長時間もまた実質的に減少させる。さらに、増幅は、他の酵素、タンパク質またはペプチド補因子を伴わずに、単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて達成され、これは、２つの酵素の混合物を必要とする先行技術の長範囲ＰＣＲ増幅法に付加される利点である。

熱安定性によって、不可逆的に不活性化されるかまたは変性することなく、何分間も９５℃までの温度に耐える能力、および高温（６０℃〜７５℃）でＤＮＡを重合させる能力を有することを意味する。特に、本発明者らは、ファミリーＢ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの特定のメンバーが、特定の条件下で、増加した速度で、さらなるＤＮＡポリメラーゼ酵素のいずれも存在しない中、長鎖核酸断片を増幅させることが可能であることを見出した。好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｂａ、ピロコッカス・フリオシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ）（Ｐｆｕ）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）およびピロコッカス属種ＧＢ−Ｄ（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される。やはり好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、減少した３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼである。最も好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼである。

「Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼ」は、テルモコッカス・バロッシーから天然に単離されたものに対応するＤＮＡポリメラーゼを意味する。配列番号１は、本明細書にその開示の全体が援用されるＵＳ ５，８８２，９０４に開示される、Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼの１つの好ましい型のアミノ酸配列である。

Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼ

「Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼ」は、本明細書にその開示の全体が援用されるＵＳ ５，８８２，９０４に開示される、天然単離Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼよりも減少した３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するように操作されたＤＮＡポリメラーゼを意味する。配列番号２は、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。

Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼ

ＰＣＲのための反応条件は、分子生物学の分野において周知である。Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼに関して最適反応条件が決定されてきている（ＵＳ ５，６０２，０１１）。長鎖ＰＣＲに関しては、反応条件はさらに最適化される。一般的に、Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、ｐＨ８．７を含有する緩衝液において、カリウム塩およびマグネシウム塩の存在下で、反応は適度によく働く。特に、ｄＮＴＰ濃度の増加は、よりよい増幅結果を生じることが見出されている。また、４０〜８０ｍＭの間の塩化カリウムまたは酢酸カリウムが望ましいことも見出されている。さらに、反応系の最適な実行には、狭い範囲のマグネシウム塩濃度が必要であるが、実際に使える濃度は各反応で用いるヌクレオチドの濃度に応じる。他のＰＣＲ法と同様に、酵素による最適重合のための反応系には、適切な界面活性剤もまた含まれる。

本方法に有用なオリゴヌクレオチド・プライマーを、核酸の特定の部分に相補的であるように設計し、これらの間で二重鎖が形成されるのを可能にしてもよい。これらの二重鎖の安定性は、ＬｅｓｎｉｃｋおよびＦｒｅｉｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１０８０７−１０８１５（１９９５）に記載されるものなどの既知の方法を用いて計算可能である。増幅のプロセスにおいて有用なオリゴヌクレオチド・プライマーは、どのように設計された長さであってもよい。例えば、こうしたプライマーは、長さ少なくとも１０から約３０〜５０ヌクレオチド、好ましくは長さ約１０〜３５ヌクレオチド、最も好ましくは長さ約１５〜約３０ヌクレオチドであってもよい。

オリゴヌクレオチド・プライマーを単一対で用いて、これらの間にある単一の領域を増幅してもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドの多数の単一対であって、各対が単一の特定の領域を増幅する前記対を単一反応において組み合わせて、多数の特定の産物が同じ反応中で生成される、多重反応を生成してもよい。これは、必要な反応数を減少させる効果があり、そして同じ反応由来の産物の直接比較を可能にする。以下の実施例に示すように、この系で生成される長鎖ＰＣＲ反応は、多重化に受け入れられる。

エキソヌクレアーゼ耐性プライマーは、増幅反応の収量を増加させるのに有用である。本明細書で開示する方法で有用なエキソヌクレアーゼ耐性プライマーには、エキソヌクレアーゼ消化に耐性にする修飾ヌクレオチドが含まれてもよい。例えば、プライマーは、プライマーの３’端のヌクレオチド間に、１つ、２つ、３つまたは４つのホスホロチオエート連結を所持してもよい。同様に、ロック核酸ヌクレオチド（２’−４’メチレン架橋リボースを有する、ＬＮＡ）を含有するプライマーは、エキソヌクレアーゼ消化に耐性でありうる。

増幅工程には、一般的に酵素による、特にエキソヌクレアーゼによる、そして最も特に３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性による消化に対してプライマーを耐性にする少なくとも１つのヌクレオチドを、プライマーが含有するプロセスが含まれてもよい。こうした態様において、少なくとも１つのヌクレオチドは、ホスホロチオエート・ヌクレオチドまたは何らかの修飾ヌクレオチドであってもよい。こうしたヌクレオチドは、一般的に３’末端ヌクレオチドであるが、本明細書に記載するプロセスはまた、こうしたヌクレオチドが３’末端位以外の場所に位置し、そして前記プライマーの３’末端ヌクレオチドが３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性によって除去されてもよい方法にも関する。

開示するプロセスで有用な増幅ターゲットＤＮＡは、一本鎖または二本鎖いずれかのＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子を含み、一般的に１０，０００〜５００，０００ヌクレオチドを含有する。ＤＮＡが１０，０００〜２００，０００ヌクレオチドの範囲内であることが好ましい可能性もある。しかし、ターゲットのサイズには上限はないと予期される。ターゲットが二重鎖である場合、こうした数は、個々のヌクレオチド残基ではなく塩基対を指すよう意図される。本明細書に開示するプロセスで有用なターゲット・テンプレートは、異なる目的に特に有用なものにする、機能的に異なる部分またはセグメントを有してもよい。少なくとも２つのこうした部分は１以上のオリゴヌクレオチド・プライマーに相補的であり、そして存在する場合、プライマー相補部分または部位と称される。開示する方法で有用な増幅ターゲットには、例えば、細菌コロニー、バクテリオファージ、ウイルスプラーク、酵母コロニー、バキュロウイルスプラーク、ならびに天然または一過性トランスフェクション真核細胞および組織試料などの供給源から直接由来するものが含まれる。ターゲットを得る前に、こうした供給源を溶解してもまたはしなくてもよい。こうした供給源が溶解されている場合、こうした溶解は、一般的に、溶解剤が、熱、酵素である場合を含む、いくつかの手段によって達成され、酵素には、限定されるわけではないが、リゾチーム、ヘリカーゼ、グルシラーゼ（ｇｌｕｃｙｌａｓｅ）、およびザイモリアーゼが含まれ、あるいはこうした溶解剤は有機溶媒または高ｐＨ溶液であってもよく、そして界面活性剤を含んでもよい。

ターゲット核酸は、例えば、一本鎖または二本鎖バクテリオファージまたはウイルスＤＮＡ、プラスミド、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣあるいは他の構築物またはベクターであってもよい。あるいは、ターゲット核酸は、例えば細菌、植物または動物細胞または組織試料由来のゲノムＤＮＡであってもよい。増幅前に、ターゲット核酸を場合によって精製するかまたは濃縮する。

本発明の特定の態様に関して、ターゲット核酸は、低複雑性のものである。これらは、小さいゲノム、すなわちウイルスおよびバクテリオファージから、実質的に濃縮された構築物、ベクターまたは核酸である。ターゲットＤＮＡはまた、複雑な混合物、例えば未精製細胞溶解物、または精製ゲノムＤＮＡの一部であってもよい。以下の実施例は、長鎖ＰＣＲ断片が低複雑性試料（例えば精製バクテリオファージ・ラムダＤＮＡ）およびより複雑なゲノムＤＮＡ試料の両方を用いて成功裡に増幅されることを示す。さらに、ターゲットＤＮＡは、増幅効率に影響を及ぼすことが知られるパラメーターであるＧＣ含量が多様であってもよい。以下の例は、３５％ＧＣ（黄色ブドウ球菌）から６８％ＧＣ（ロドバクター・スフェロイデス）のＧＣ含量の極値からの増幅を示す。

以下の実施例に示すように、２０〜４７ｋｂの断片が、精製ラムダＤＮＡから増幅される。同様に、１０〜２２ｋｂの大きい断片が、細菌ゲノムＤＮＡからルーチンに増幅される。本発明者らの結果はまた、より複雑なゲノムＤＮＡ試料から、ターゲットＤＮＡが増幅可能であることも示唆する。ヒト・ミトコンドリア・アンプリコンならびにヒト・ゲノム断片もまた、ヒト・ゲノムＤＮＡから成功裡に増幅された。したがって、本発明者らの方法によって、複雑な出発物質から、長さ１００ｋｂまでのターゲットＤＮＡをルーチンに増幅可能である。

予期せぬことに、本方法において、ＰＣＲ周期の伸長期中のＤＮＡ合成速度もまた、２つの酵素の組み合わせを必要とする先の長範囲ＰＣＲ法を含めた先のＰＣＲ法（１分あたり〜１ｋｂ）に比較した際、非常に増加する。単一酵素を用いた、本方法のもとでの増幅は、１分あたり少なくとも２ｋｂ、そして典型的には１分あたり少なくとも５ｋｂの速度で達成される。２２ｋｂもの長さのターゲットＤＮＡ断片が、本方法のもとで、１分以内に合成されてきている。

いくつかの状況において、起こる増幅の度合いまたはＤＮＡ収量を定量的に決定することが望ましい可能性もある。こうした場合、本方法の増幅工程は、定量的測定の実行をより容易にする、特別なデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を利用する場合などの、任意のいくつかの標準的検出スキームを用いて、よく働く。最も一般的な例は、こうしたヌクレオチド基質が放射標識されているか、または該基質に何らかの他のタイプの標識、例えば蛍光標識等が付着している場合である。これらは、産物ＤＮＡの組成を最小限にしか乱さないように、典型的には微量で用いられる。ここでも、こうした状況で使用可能な方法は数多く、そして関与する技術は標準的であり、そして当業者に周知である。したがって、こうした検出標識には、増幅された核酸と直接または間接的に会合可能であり、そして直接または間接的にのいずれかで測定可能な検出可能シグナルを生じる任意の分子が含まれる。核酸内に取り込まれるかまたは核酸プローブにカップリングするこうした標識の多くが当業者に知られる。一般的な例には、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、プローブ、染色剤、およびリガンドが含まれる。

適切な蛍光標識の例には、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより入手可能なＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５などのシアニン色素が含まれる（ＵＳ ５，２６８，４８６）。適切な蛍光標識のさらなる例には、フルオレセイン、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、およびローダミンが含まれる。好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。多様な商業的供給源からこれらを得てもよい。

標識ヌクレオチドは、合成中の増幅産物内に直接取り込まれうるため、検出標識の好ましい形である。増幅ＤＮＡ内に取り込まれうる検出標識の例には、ヌクレオチド類似体、およびビオチンまたは適切なハプテン、例えばジゴキシゲニンで修飾されたヌクレオチドが含まれる。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（Ｙｕら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２：３２２６−３２３２（１９９４））。ＤＮＡのための好ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、Ｓｉｇｍａ）であり、そして好ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ビオチン−１６−ウリジン−５’−三リン酸（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）である。放射標識は本明細書に開示する増幅法に特に有用である。

固体支持体にターゲット・テンプレートまたはオリゴヌクレオチド・プライマーを付着させると好適である可能性もあり、そしてこれは、前記プライマーまたはターゲット・テンプレートを固体支持体に付着させるように働く、何らかのタイプの生物学的または他のポリマーなどの何らかの分子種の手段を通じて達成可能である。本明細書に記載する方法で有用なこうした固体状態支持体には、オリゴヌクレオチドがカップリング可能な任意の固体物質が含まれてもよい。これには、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、酸化ポリエチレン、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、ＴＥＦＬＯＮ^ＴＭ、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸などの物質が含まれる。固体状態支持体は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ビン、プレート、繊維、織り繊維、成形ポリマー、粒子および微粒子を含む、任意の有用な型を有してもよい。固体状態支持体の好ましい型はガラススライドまたはマイクロタイタープレート（例えば標準的な９６ウェルプレート）である。好ましい態様は、支持体としてガラスまたはプラスチックを利用する。さらなる配置に関しては、ＵＳ ５，８５４，０３３に記載されるものを参照されたい。

オリゴヌクレオチドの固体状態支持体への固定法はよく確立されている。確立されたカップリング法を用いて、アドレス・プローブおよび検出プローブを含むオリゴヌクレオチドを支持体にカップリングしてもよい。例えば、適切な付着法が、Ｐｅａｓｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）に記載される。固体状態支持体にオリゴヌクレオチドを付着させる好ましい方法が、Ｇｕｏら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：５４５６−５４６５（１９９４）に記載される。

本方法によって増幅された長鎖産物は、ハプロタイプ分析および特定の染色体遺伝子座の配列決定などの特定の適用に有用である。
長鎖核酸断片の迅速なＰＣＲ増幅のためのいくつかの方法において、単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４つのヌクレオシド三リン酸、適切な緩衝剤、および他の潜在的に望ましい構成要素であって、別個のバイアル中にあるか、あるいは全部で１つ、２つ、３つ、またはそれより多い別個のバイアルを形成するように異なる組み合わせで一緒に混合されているかいずれかのこうした前記構成要素、および例えば増幅プロセスで使用するために意図されるターゲット核酸を懸濁するためのブランクまたは緩衝液バイアル、ならびにユーザーマニュアルを含む、キットの形などのプレミックスを用いてもよい。場合によって、キットにはまた、オリゴヌクレオチド・プライマーおよび陽性対照のための対照テンプレートも含まれる。

ＤＮＡ配列を増幅するための１つのこうしたキットは、緩衝剤、単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含む。ＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有してもよい。ＤＮＡポリメラーゼはＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。いくつかの方法において、通常のｄＮＴＰの少なくとも１つが、全体でまたは部分的に、産物ＤＮＡに存在した場合に、産物ＤＮＡにまたは配列依存性分析などの続くプロセスに、何らかの好適な特性を与える類似体で置き換えられる。

やはり提供されるのは、１０ｋｂを超える長鎖核酸断片のＰＣＲ増幅のための新規配合物である。配合物には、オリゴヌクレオチド・プライマー、ｄＮＴＰ、核酸テンプレート、単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび増幅反応に適した反応緩衝剤が含まれる。好ましくは、単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼである。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼである。場合によって、オリゴヌクレオチド・プライマーのいくつかは、ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチド・プライマーなどのエキソヌクレアーゼ耐性プライマーである。

方法、キット、配合物および組成物は、長鎖核酸断片のＰＣＲによる増幅に適しているが、長範囲に渡る（すなわち長さ１０ｋｂを超える）ターゲット核酸分子の相補鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成にも有用である。

したがって、長鎖ターゲット核酸分子の相補鎖を合成する方法であって、ターゲット核酸分子を相補的プライマー分子に曝露して、ターゲットへのプライマーのハイブリダイゼーションを達成し、その後、単一のＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下、重合条件下で、プライマーを伸長する工程を含む、前記方法をさらに提供する。本発明の特定の態様において、合成される鎖の長さは、長さ少なくとも２０ｋｂ、好ましくは長さ少なくとも４０ｋｂ、より好ましくは長さ少なくとも５０ｋｂ、そして最も好ましくは長さ最大１００ｋｂであってもよい。これらの核酸分子合成法において、上述のＰＣＲ法におけるように、ターゲットの指数関数的増幅はないが、にもかかわらず、プライマーは大規模に伸長される。核酸伸長（延長）反応に関しては、緩衝剤および他の条件は、上述の長鎖ＰＣＲのものと実質的に類似であることが注目される。この方法は、高ＧＣ含量のテンプレートの伸長に特に適している。

本核酸合成法のさらなる利点は、反応速度にある。本明細書において、最適条件下では、重合反応は、１分あたり少なくとも２ｋｂ、例えば１分あたり少なくとも５ｋｂ、そして好ましくは１分あたり少なくとも１０ｋｂ、またはさらに１分あたり少なくとも２０ｋｂの速度で進行することが示されている。

適切には、長鎖ターゲット核酸分子の相補鎖を合成する方法は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、高温で行われる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼである。やはり好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼである。

記載する方法を実行する際、特定の緩衝剤、媒体、試薬、細胞、培養条件、ｐＨ等に対する言及は、限定を意図されるのではなく、考察を提示する特定の背景において、関心対象であるかまたは価値があると当業者が認識するすべての関連物質を含むように読み取られるものとする。例えば、しばしば、１つの緩衝系または培地を別のものに関して置換して、そしてなお同一でないとしても類似の結果を達成することが可能である。当業者は、過度の実験を伴わずに、本明細書に開示する方法および手順で用いた際に、こうした置換がその目的を最適に果たすようにしうるために、こうした系および方法論の十分な知識を有するであろう。

本実施例は、例示目的のみのために提供され、そして付随する請求項によって定義されるような本発明の範囲を限定すると見なされてはならない。以下にそして本明細書の別の箇所に提供するすべての参考文献は、本明細書に援用される。

以下の特定の実施例には、以下のプライマーを用いる：
ラムダＤＮＡの増幅のために用いたプライマーは、それぞれ：順方向プライマー５０６： ５’−ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＡＡ ＡＣＣ ＧＣ−３’（配列番号３）；逆方向プライマー２３１４１： ５’−ＡＣＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＣＧ Ａ−３’（配列番号４）、４３７６８： ５’−ＡＡＣ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＣＧ ＣＣＴ ＴＴＧ ＡＴＴ Ｔ−３’（配列番号５）、４７５１３： ５’−ＴＴＴ ＣＣＴ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＧＴ−３’（配列番号６）、および２１５３９： ５’−ＧＣＣ ＴＣＧ ＣＡＴ ＡＴＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＡＣ−３’（配列番号７）である。

大腸菌ＤＮＡの増幅のために用いたプライマーは：順方向プライマーｆｌａ−ＦＰ１： ５’−ＣＧＣ ＧＣＧ ＧＴＡ ＴＴＧ ＣＴＡ ＡＣＡ ＣＧ−３’（配列番号８）および逆方向プライマーｒｐｏＳ−ＲＰ１： ５’−ＧＡＴ ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＡＣ ＧＡＴ ＴＧＡ ＡＣ−３’（配列番号９）である。

黄色ブドウ球菌ＤＮＡ増幅のために用いたプライマーは：順方向プライマーＡ１０−Ｆ： ５’−ＴＧＣ ＣＡＣ ＴＡＣ ＣＡＡ ＣＧＡ ＴＡＴ ＧＡＴ ＣＧＧ Ｔ−３’（配列番号１０）および逆方向プライマーＡ１０−Ｒ： ５’−ＣＣＧ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＴＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＴＴ ＣＴＡ Ｃ−３’（配列番号１１）である。Ｚａｋｏｕｒ Ｎ．Ｂ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３２， ｐｐ １７−２４， ２００４。

ヒト・ミトコンドリアＤＮＡ増幅のために用いたプライマーは：順方向プライマーＭＫ−７Ｆ−１１６７３： ５’−ＣＣＣ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＣＧ Ｇ−３’（配列番号１２）および逆方向プライマーＭＴ−３Ｒ−７６０８： ５’−ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＧＣ ＧＣＴ ＧＣＡ ＴＧＴ ＧＣＣ−３’（配列番号１３）である。

特定の反応に関しては、ホスホロチオエート・プライマーを用いる。これらのプライマーは、個々のプライマー名の後に「−Ｓ」とマークされる（すなわち５０６−Ｓ）。これらのプライマーにおいて、最後のおよび最後から二番目の３’ホスホジエステル結合はホスホロチオエートである。

実施例１：Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼを用いた２０〜４８ｋｂアンプリコンの増幅
ａ）ラムダＤＮＡからの２０ｋｂアンプリコンの増幅
５０ｎｇのバクテリオファージラムダＤＮＡ（ｃＩ８５７ｉｎｄ １ Ｓａｍ ７）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、１．４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％Ｒｈｏｄａｆａｃ ＲＥ−９６０（ノニルフェノールポリオキシエチレンエーテル、リン酸エステル）、またはＧｅｎｅＡｍｐ ＸＬ ＰＣＲキット緩衝剤（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のいずれか、および０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４μＭの順方向プライマー５０６、０．４μＭの逆方向プライマー２１５３９を含有する最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。ＫＣｌまたは酢酸カリウムの量を図１に示すように変動させた。氷上で反応を組み立て、その後、１５ｎｇのＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
７２℃−２．５分間
第３段階−７２℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして０．５μｌの反応を５μｌの１ｘＴＡＥ緩衝液（１ｘ＝４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸ｐＨ７．９、５ｍＭ酢酸ナトリウム、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ）＋０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳと混合し、そして６５℃に２分間加熱した。１ｘＴＡＥ中、０．３％ＳＥＡＫＥＭ ＧＯＬＤ^ＴＭアガロースゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ）上のゲル電気泳動によって、産物をＤＮＡサイズマーカーとともに分離した。次いで、製造者の指示にしたがって、アガロースゲルをＧＥＬＳＴＡＲ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）によって染色し、そして分析のため、ＴＹＰＨＯＯＮ^ＴＭ８６００スキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で産物を視覚化した。

本発明者らは、Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼが、いくつかの条件および塩のタイプのもとで、２０ｋｂのアンプリコンを合成する能力を調べた。これらの反応において、４０〜８０ｍＭの塩（ＫＣｌまたは酢酸カリウム）では２０ｋｂアンプリコンの収量が優れており、より高濃度の塩では収量が減少した。この単純化された緩衝系からの収量は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．から得られる緩衝系の使用と同等である（図１）。

ｂ）ラムダＤＮＡからの４７ｋｂアンプリコンの増幅
５０ｎｇのバクテリオファージラムダＤＮＡ（ｃＩ８５７ｉｎｄ １ Ｓａｍ ７）を用い、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、２．６ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ＲＥ−９６０、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４μＭの順方向プライマー５０６−Ｓ、０．４μＭの逆方向プライマー４７５１３−Ｓおよび示す量のＥＴ−ＳＳＢを含有する最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。氷上で反応を組み立て、その後、１５ｎｇのＴｂａまたは２０ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
６９℃−１０分間
第３段階−７２℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして実施例１ａにおけるように分析した。
アンプリコンの長さを伸長するため、ＴｂａおよびＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼの両方がラムダＤＮＡテンプレートの９８％を含む４７ｋｂアンプリコンを増幅するのを可能にした。どちらの酵素も予期される産物の頑強な増幅を提供し、エキソ^＊酵素がよりよい収量を有した。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）が、ＰＣＲ反応の収量および特異性を改善しうるという文献報告がある。商業的に入手可能な熱安定性ＳＳＢ（ＥＴ−ＳＳＢ）を添加しても、これらのＰＣＲ反応は増進されず、非常に多量のＥＴ−ＳＳＢを添加すると、阻害が見られた（図２）。本発明者らは、本発明者らの単一酵素系が、試験したうちで最長の直鎖ＤＮＡ、４７ｋｂを増幅可能であると結論づけた。さらなる実験によって、反応収量を改善するため、反応パラメーターを変化させた相対的効果を調べた。

ｃ）増幅に対する伸長時間の影響
５０ｎｇのバクテリオファージラムダＤＮＡ（ｃＩ８５７ｉｎｄ １ Ｓａｍ ７）を用い、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、１．４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ＲＥ−９６０、またはＧｅｎｅＡｍｐ ＸＬ ＰＣＲキット緩衝剤（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のいずれか、および０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４μＭの順方向プライマー５０６−Ｓ、０．４μＭの逆方向プライマー２１５３９−Ｓを含有する最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。氷上で反応を組み立て、その後、２０ｎｇのＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
７２℃−示す伸長時間（図３を参照されたい）
第３段階−７２℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして実施例１ａにおけるように分析した。
長鎖ＰＣＲに対する伸長時間の影響を、いくつかの緩衝系において、ラムダＤＮＡ由来の２０ｋｂアンプリコンに対して調べた。わずか１分間の伸長時間で優れた収量の産物が得られ、試験した緩衝剤間で収量のわずかな変動を伴いつつ、３００ヌクレオチド／秒を超える伸長速度が示された。伸長時間を増加させた結果、産物量が増加したが、時間がより長い（１０〜２０分間）と、ゲルのウェル中に巨大分子量の非特異的物質の集積が見られた（図３）。増幅の最適条件は、２０ｋｂアンプリコンに関して、およそ２．５〜５分間、または０．１〜０．２分／ｋｂであり、先に示される方法よりはるかに短い時間である。

ｄ）ｄＮＴＰ濃度および伸長温度の変動は、ＰＣＲ産物の収量を増加させる
５または５０ｎｇいずれかのバクテリオファージラムダＤＮＡ（ｃＩ８５７ｉｎｄ １ Ｓａｍ ７）を用い、２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、１．４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ＲＥ−９６０、および０．４μＭの順方向プライマー５０６−Ｓ、０．４μＭの逆方向プライマー２３１４１−Ｓを含有する最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。所定の量で、ｄＮＴＰを変動させ、各反応において、４つのヌクレオチドはすべて、同じ所定の濃度を有した。ｄＮＴＰ濃度全体の総量よりも０．６ｍＭ多いように、マグネシウム濃度を調節した。氷上で反応を組み立て、その後、１５ｎｇのＴｂａまたは２０ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
６９℃または７２℃−４分間
第３段階−７２℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして実施例１ａにおけるように分析した。
この実施例において、本発明者らは、４つのｄＮＴＰすべての濃度を増加させる一方、マグネシウムを一定に過剰に維持して、重合反応の駆動を補助した。ｄＮＴＰ濃度を増加させると、すべての場合で、２２ｋｂ産物ＤＮＡがよりよい収量で生じた（３つの各セットにおいて、第一および第三のレーンを比較されたい）。さらに、本発明者らは、この反応に関して、伸長温度の影響、ならびにＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼの２つの変異体の相対的感度も調べた。７２℃から６９℃への伸長反応温度のわずかな減少は、最低限からわずかに陽性の影響を有した。より興味深いことに、Ｔｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼは、より低い濃度のテンプレートで、はるかにより高い活性を示した（図４）。

ｅ）マグネシウムの滴定
５０ｐｇのバクテリオファージラムダＤＮＡ（ｃＩ８５７ｉｎｄ １ Ｓａｍ ７）を用いて、２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、０．０２％ＲＥ−９６０、および０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４μＭの順方向プライマー５０６−Ｓ、０．４μＭの逆方向プライマー２３１４１−Ｓを含有する最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。総マグネシウム濃度を示す。氷上で反応を組み立て、その後、２０ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
６９℃−４分間
第３段階−７２℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして実施例１ａにおけるように分析した。
長鎖ＰＣＲ反応は、マグネシウム塩濃度に対して非常に感受性であることが知られる。本発明者らが選択した条件が最適であるかどうかを評価するため、本発明者らは、高い感度を持つ反応（５０ｐｇ投入ＤＮＡ）を実行し、そしてマグネシウム濃度を変動させた。すべての場合で正しい産物サイズが作製されたが、添加する酢酸マグネシウム２．４ｍＭ〜２．６ｍＭで、マグネシウム濃度の鋭い最適値がある（図５）。これは、本発明者らの実験の範囲内であり、そしてこの系においては、マグネシウム二価陽イオン濃度に対する厳しい制御が必要であることが示される。

実施例２：Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅の高感度
示す量のバクテリオファージラムダＤＮＡ（ｃＩ８５７ｉｎｄ １ Ｓａｍ ７）を用い、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、２．６ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ＲＥ−９６０、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４μＭの順方向プライマー５０６−Ｓ、０．４μＭの逆方向プライマー２３１４１−Ｓを含有する最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。氷上で反応を組み立て、その後、１５ｎｇのＴｂａまたは２０ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
６９℃−４分間
第３段階−７２℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして実施例１におけるように分析した。
Ｔｂａエキソ^＊ポリメラーゼが、より少量の投入テンプレートを使用可能であった、上記観察を考慮して、２つの型のＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼの相対的感度を評価した。減少する量のテンプレートを増幅反応に添加した。野生型Ｔｂａ ＤＮＡポリメラーゼは、これらの条件下では、比較的高濃度（＞５ｎｇ）のテンプレートでのみ、２２ｋｂアンプリコンを合成可能であった。しかし、エキソ^＊型での増幅は、少なくとも１０００倍高い感度を有した。わずか５０ｐｇの出発ラムダＤＮＡから高収量の２２ｋｂ産物が合成され、５ｐｇ投入ＤＮＡで、測定可能な産物が得られた（図６）。これは、投入出発ＤＮＡに対して高い度合いの増幅が行われたことを示す。これは、これらの非常に長い産物ＤＮＡの合成に関して、先に報告されるよりも、はるかに高いレベルの感度に相当し、そしてゲノムＤＮＡにおいて長いアンプリコンを分析するのに非常に有用である。

実施例３：高濃度のヒトＤＮＡの存在下での増幅
５ｐｇのバクテリオファージラムダＤＮＡ（ｃＩ８５７ｉｎｄ １ Ｓａｍ ７）を用い、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、２．４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ＲＥ−９６０、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４μＭの順方向プライマー５０６、０．４μＭの逆方向プライマー２３１４１（図７に示すように、通常またはホスホロチオエート含有のいずれか）を含有する最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。ヒトＪｕｒｋａｔ（Ｔ細胞白血病）ゲノムＤＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の量を、示すように変動させた。氷上で反応を組み立て、その後、４０ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
６９℃−２．５分間
第３段階−６９℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして実施例１ａにおけるように分析した。
これらの酵素がゲノムＤＮＡの増幅に有用であるためには、特異的ゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行う際に存在するであろう非常に過剰な非特異的配列の存在によって、多大には影響を受けてはならない。非常に低濃度のターゲットを用いて、混入ゲノムＤＮＡに対する感度に関して、Ｔｂａエキソ^＊の活性を試験した。５ｐｇのラムダテンプレートの２２ｋｂアンプリコンへの増幅は、最大１０^４過剰（質量による）ゲノムＤＮＡによって影響を受けなかった（図７）。非特異的ゲノムＤＮＡに対する、この相対的非感受性によって、ゲノムＤＮＡ自体に包埋された配列からの長鎖ＰＣＲの試験が可能になった。

実施例４：細菌ゲノムＤＮＡの増幅
ａ）大腸菌ゲノムＤＮＡからの１０．９ｋｂアンプリコンの増幅
製造者の指示にしたがって、ＩＬＬＵＳＴＲＡ^ＴＭ細菌ゲノムＤＮＡミニスピンキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、大腸菌ゲノムＤＮＡを単離した。２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、２．４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテルリン酸メチルエステル（Ｒｈｏｄａｆａｃ ＲＥ−９６０ Ｒｈｏｎｅ Ｐｏｕｌｅｎｃ）、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４μＭの順方向プライマーｆｈｌＡ−ＦＰ１−Ｓ、０．４μＭの逆方向プライマーｒｐｏＳ−ＲＰ１−Ｓ（Ｊ． Ｂａｃｔ．（２０００）１８２ ｐｐ５３８１−５３９０）中の示す量のＤＮＡを用いて、最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。氷上で反応を組み立て、その後、４０ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
６９℃−１または２．５分間のいずれか
第３段階−６９℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして実施例１ａにおけるように分析した。
試験したすべての条件下で、精製大腸菌ＤＮＡから特異的１０．９ｋｂアンプリコンが容易にそしてきれいに増幅され、予期されるサイズの産物を生じた。本発明者らは、わずか１分の伸長時間で産物を見出しうるが、伸長時間を増加させると、収量は改善される。出発物質量を増加させると収量が改善される（２．５ｎｇを１０ｎｇ投入ＤＮＡに比較されたい）が、投入テンプレートをさらに増加させてもまったく効果はなく、この時点で、テンプレートに関しては系が飽和していることが示唆される（図８）。比較のため、これらのプライマーセットの元来の増幅（Ｊ． Ｂａｃｔ．（２０００）１８２ ｐｐ５３８１−５３９０）は１２時間より長い時間を要し、一方、記載する増幅は１．５時間未満で実行され、この酵素系の有用性がさらに立証される。

ｂ）大腸菌ゲノムＤＮＡからの２２ｋｂラムダ溶原菌アンプリコンの増幅
製造者の指示にしたがって、ＩＬＬＵＳＴＲＡ^ＴＭ細菌ゲノムＤＮＡミニスピンキットを用いて、ラムダ溶原菌を含有する株（ＪＳ４５８８ラムダ＋）から大腸菌ゲノムＤＮＡを単離した。２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、２．４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ＲＥ−９６０、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４μＭの順方向プライマー５０６、０．４μＭの逆方向プライマー２３１４１中の示す量のＤＮＡを用いて、最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。氷上で反応を組み立て、その後、４０ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
６９℃−２．５または５分間のいずれか
第３段階−６９℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして実施例１ａにおけるように分析した。
増幅したゲノムＤＮＡの長さをさらに伸長するため、ラムダ溶原菌由来のＤＮＡを調製した。大腸菌ゲノムＤＮＡの背景に包埋されたこのラムダＤＮＡの増幅を調べると、精製ラムダＤＮＡを含む上記実施例に直接比較することが可能であった。２２ｋｂラムダＤＮＡアンプリコンの増幅は、優れた収量の正しいサイズの産物を生じた（図９）。この背景における増幅時間は、精製ＤＮＡに関するものより幾分長いが、先の方法に比較するとなお迅速であり、そしてゲノムＤＮＡの長いストレッチを増幅するためのこの方法の有用性が立証される。

ｃ）黄色ブドウ球菌からの１０．９ｋｂゲノムＤＮＡアンプリコンの増幅
黄色ブドウ球菌亜種アウレウスの３つの株由来のゲノムＤＮＡをＡＴＣＣから得た（黄色ブドウ球菌亜種アウレウスＡＴＴＣ（登録商標）１０８３２Ｄ−５^ＴＭ、黄色ブドウ球菌亜種アウレウスＡＴＴＣ（登録商標）３５５５６^ＴＭ＝ＳＡ１１３、および黄色ブドウ球菌亜種アウレウスＡＴＴＣ（登録商標）７００６９９^ＴＭ）。Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、２．４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテルリン酸メチルエステル（Ｒｈｏｄａｆａｃ ＲＥ−９６０ Ｒｈｏｎｅ Ｐｏｕｌｅｎｃ）、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４μＭの順方向プライマーＡ１０−Ｆ、０．４μＭの逆方向プライマーＡ１０−Ｒ（Ｚａｋｏｕｒ， Ｂ．Ｎ．ら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７−２４（２００４））中の示す量のＤＮＡを用いて、最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。氷上で反応を組み立て、その後、４０ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
６９℃−示すように、１または２．５分間のいずれか
第３段階−６９℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして実施例１ａにおけるように分析した。
試験したすべての条件下で、精製黄色ブドウ球菌亜種アウレウスＤＮＡから特異的１０．９ｋｂアンプリコンが容易にそしてきれいに増幅され、予期されるサイズの産物を生じた。産物は、わずか１分の伸長時間で増幅されるが、伸長時間を増加させると、収量は改善される。出発物質量を増加させると収量が改善される（２．５ｎｇを１０ｎｇ投入ＤＮＡに比較されたい）が、投入テンプレートをさらに増加させてもまったく効果はなく、この時点で、テンプレートに関しては系が飽和していることが示唆される（図１０）。比較のため、これらのプライマーセットの元来の増幅（Ｚａｋｏｕｒ， Ｂ．Ｎ．ら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７−２４（２００４））は８時間より長い時間を要し、一方、本明細書に記載する増幅は１．５時間未満で実行され、この単一酵素系の有用性がさらに立証される。

ｄ）ロドバクター・スフェロイデスからのアンプリコンの増幅
ロドバクター・スフェロイデス由来のゲノムＤＮＡをＡＴＣＣから得た（ロドバクター・スフェロイデス（ｖａｎ Ｎｉｅｌ）Ｉｍｈｏｆｆら ＡＴＴＣ（登録商標）ＢＡＡ−８０８^ＴＭ）。Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテルリン酸メチルエステル（Ｒｈｏｄａｆａｃ ＲＥ−９６０ Ｒｈｏｎｅ Ｐｏｕｌｅｎｃ）、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．１μＭの順方向プライマー、０．１μＭの逆方向プライマー、および示す量のテトラメチレンスルホキシド（ＴＭＳＯ）中の１０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。氷上で反応を組み立て、その後、１００ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９８℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

用いたプライマーは、図１１に示す、予期される増幅産物サイズにちなんだ。プライマーは：Ｒｓ １０．４順方向： ５’−ＣＣＡ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＣＧ ＴＴＡ Ｃ−３’（配列番号１４）およびＲｓ １０．４逆方向： ５’−ＧＡＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＧＴ ＴＴＧ−３’（配列番号１５）； Ｒｓ １０．７順方向： ５’−ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＧＡ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＡ−３’（配列番号１６）およびＲｓ １０．７逆方向： ５’−ＣＧＣ ＣＧＣ ＡＧＡ ＣＧＣ ＡＣＣ ＣＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＣ−３’（配列番号１７）；ならびにＲｓ １４順方向： ５’−ＣＣＡ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＧＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＣＧ ＴＴＡ Ｃ−３’（配列番号１８）およびＲｓ １４逆方向： ５’− ＣＣＡ ＧＡＧ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＧＴ ＧＴＧ ＡＴＡ ＣＴＴ−３’（配列番号１９）である。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９８℃−１分間
第２段階−１５反復
９８℃−１５秒間
７２℃−１０分間
第３段階−７２℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして実施例１ａにおけるように分析した。
ロドバクター・スフェロイデスのゲノムは、平均６８％ＧＣ含量であることから、ＰＣＲによる増幅が特に困難である。この難題にもかかわらず、試験したすべての条件下で、精製ロドバクター・スフェロイデスＤＮＡから１０．４、１０．７および１４ｋｂの特異的アンプリコンが容易にそしてきれいに増幅され、予期されるサイズの産物を生じた。ＴＭＳＯを添加すると、ＧＣリッチテンプレートの増幅が増進されると考えられる（Ｃｈａｋｒａｂａｔｉ Ｒ．およびＳｃｈｕｔｔ Ｃ．Ｅ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２， ｐｐ ８６６−８７２， ２００２）が、このＴＭＳＯ添加は、本発明者らの系において、ほとんどまたはまったく影響がなかったことから、より長い増幅時間を必要とするものの、これらの困難なテンプレートの増幅にはこの条件が十分であることが示唆される。

実施例５：単離ヒトＤＮＡに存在するミトコンドリアＤＮＡの増幅
ヒト・ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ヒト・ミトコンドリアＤＮＡの１２．４ｋｂアンプリコンの増幅を評価することによって、ヒト・ゲノムＤＮＡに存在する非常に低濃度のターゲットの増幅に関するＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼの能力を試験した。ヒト・ゲノムＤＮＡは、約０．１％のミトコンドリアＤＮＡを含有する（すなわち１５ｎｇゲノムＤＮＡはほぼ１５ｐｇのミトコンドリアＤＮＡを有すると予期される）。

１５〜４０ｎｇのヒト・ゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用い、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、２．４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ＲＥ−９６０、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４μＭの順方向プライマーＭＫ−７Ｆ−１１６７３、０．４μＭの逆方向プライマーＭＫ−７Ｆ−１１６７３を含有する最終体積２５μｌ中で、増幅を行った。ヒト・ゲノムＤＮＡの量を、示すように変動させた。氷上で反応を組み立て、その後、４０ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−１５または２０反復
９４℃−１５秒間
６８℃−３０秒間
６９℃−示すように、２．５分間または５分間のいずれか
第３段階−７２℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして反応産物５μｌを用いて、実施例１ａにおけるように分析した（図１２）。わずか１５ｎｇのヒト・ゲノムＤＮＡを用いて、１２．４ｋｂミトコンドリア・アンプリコンの増幅成功が達成された（図１２）。

実施例６：ヒト・ゲノムＤＮＡからの、単一および多重増幅での長鎖アンプリコンの増幅
ＩＬＬＵＳＴＲＡ^ＴＭゲノムＰｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｆｌｏｗキットを用いて、ヒト全血から調製したヒト・ゲノムＤＮＡ ５０ｎｇを用いて、最終体積２５μｌ中で増幅を行った。増幅反応はまた、２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテルリン酸メチルエステル（Ｒｈｏｄａｆａｃ ＲＥ−９６０ Ｒｈｏｎｅ Ｐｏｕｌｅｎｃ）、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰも含有した。同じ個々のプライマー濃度の単一または多重化のいずれかで、順方向および逆方向プライマー各０．１μＭのプライマーを用いた。氷上で反応を組み立て、その後、１００ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９４℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

Ｐｅｒｌｅｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．のウェブサイトからプライマーをランダムに選択し、そしてプライマーはゲノムの異なる領域をカバーする。Ｐｅｒｌｅｇｅｎ番号の後の、ｋｂで表した予期される産物サイズ、および方向を用いて、これらに名前を付けた。例えば「９４０７３−１１順方向」は、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ番号９４０７３であり、１１ｋｂの産物を生じ、そしてこれは順方向プライマーである。これらのプライマーには：（１）染色体１３上： ９４０７３−１１順方向： ５’−ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＴＴ ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＧＧ ＣＡＡ ＧＣＡ ＴＡＧ−３’（配列番号２０）および９４０７３−１１逆方向： ５’−ＡＣＣ ＡＣＴ ＣＴＡ ＣＴＴ ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＡＴ ＡＴＡ ＡＴＡ ＣＴＧ ＧＣ−３’（配列番号２１）； （２）染色体２１上： ２１５２−１５順方向： ５’−ＧＣＴ ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＴＣＡ ＣＧＧ ＧＡＧ ＡＣＣ ＴＡＧ ＡＴ−３’（配列番号２２）および２１５２−１５逆方向： ５’−ＴＴＣ ＴＴＡ ＴＡＡ ＴＧＴ ＧＴＴ ＴＧＣ ＡＴＡ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＣＧ ＴＡ−３’（配列番号２３）； （３）染色体１８上： ２５３０１３−１６順方向： ５’− ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＡＣＡ−３’（配列番号２４）および２５３０１３−１６逆方向： ５’−ＧＣＴ ＧＣＴ ＡＧＴ ＡＣＡ ＧＧＣ ＴＣＴ ＣＧＣ ＡＡＴ ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＣ−３’（配列番号２５）；ならびに（４）染色体１８上： ２４７８８１−１９順方向： ５’−ＧＧＡ ＴＣＴ ＴＴＡ ＧＧＡ ＡＣＧ ＣＴＡ ＴＡＡ ＣＧＣ ＣＡＴ ＴＡＧ ＧＡ−３’（配列番号２６）および２４７８８１−１９逆方向： ５’−ＣＡＣ ＴＧＴ ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＴＡ ＧＡＴ ＡＧＡ ＡＣＧ ＣＡＴ ＴＴ−３’（配列番号２７）が含まれる。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９４℃−１分間
第２段階−２０反復
９４℃−１５秒間
６８℃−１０分間
第３段階−６８℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして１μｌの反応産物を用いて、実施例１ａにおけるように分析した（図１３）。
１１ｋｂ〜１９ｋｂの範囲のヒトＤＮＡのいくつかのアンプリコンを評価することによって、ヒト・ゲノムＤＮＡにおける単一コピー・ターゲットの増幅に関して、Ｔｂａエキソ^＊の活性を試験した。第ＩＩ期ＨａｐＭａｐプロジェクトにおける遺伝子型決定のため、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって設計されたプライマーセットから、ランダムにアンプリコンを採用した。試験したプライマーは、予期されるサイズの産物のきれいな増幅を生じた。さらに、単に、ＰＣＲ反応にすべてのプライマーを含めることによって、多重化形式で、４つのアンプリコンすべてが増幅可能であった。これは、Ｔｂａエキソ^＊が、分析のために、異なる染色体由来の単一コピー・ヒトＤＮＡの長いストレッチを増幅する能力だけでなく、多重化においてこれらの増幅を行うための特異性も有することを立証する。

実施例７：ヒトＣＦＴＲ遺伝子に関するタイル状４０ｋｂアンプリコンの増幅
ＩＬＬＵＳＴＲＡ^ＴＭゲノムＰｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｆｌｏｗキットを用いて、ヒト全血から調製したヒト・ゲノムＤＮＡ １００ｎｇを用いて、最終体積２５μｌ中で増幅を行った。増幅反応はまた、２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ ＫＯＨ ｐＨ８．７、４０ｍＭ酢酸カリウム、２．４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテルリン酸メチルエステル（Ｒｈｏｄａｆａｃ ＲＥ−９６０ Ｒｈｏｎｅ Ｐｏｕｌｅｎｃ）、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．１μＭの順方向プライマー、および０．１μＭの逆方向プライマーも含有した。氷上で反応を組み立て、その後、１００ｎｇのＴｂａエキソ^＊ＤＮＡポリメラーゼを添加して、そしてあらかじめ９６℃に加熱したＰＣＲ熱サイクラーに入れることによって、反応を開始した。

ウェブに基づくアプリケーション、ＧｅｎｏＦｒａｇ（Ｚａｋｏｕｒ Ｎ．Ｂ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３２， ｐｐ １７−２４， ２００４）を用いてプライマーを設計し、そして増幅産物の予期されるサイズにしたがって名付けた。これらのプライマー対は： １９０３３順方向： ５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＡＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＧＡ Ｇ−３’（配列番号２８）および１９０３３逆方向： ５’−ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＡＡ ＧＣＣ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＴＡ ＡＡＴ Ａ−３’（配列番号２９）； １９２４７順方向： ５’−ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＡＧ ＴＡＧ Ｔ−３’（配列番号３０）および１９２４７逆方向： ５’−ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＡＡ ＣＴＡ Ａ−３’（配列番号３１）； １９６６５順方向： ５’−ビオチン−ＧＧＧ ＴＣＣ ＴＡＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＡＡＣ Ａ−３’（配列番号３２）および１９６６５逆方向： ５’−ＧＡＧ ＧＧＡ ＡＣＴ ＴＡＧ ＡＧＧ ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＡＡ Ｔ−３’（配列番号３３）； ２０４４１順方向： ５’−ＴＴＧ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＡＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ Ｔ−３’（配列番号３４）および２０４４１逆方向： ５’−ＴＡＧ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＧＧＡ ＣＡＡ Ｔ−３’（配列番号３５）； ２０４４６順方向： ５’−ＣＴＣ ＣＡＴ ＡＴＣ ＣＣＡ ＣＣＣ ＴＡＡ ＧＡＡ ＣＡＡ Ｃ−３’（配列番号３６）および２０４４６逆方向： ５’−ＣＧＣ ＴＣＡ ＡＣＴ ＴＣＣ ＣＡＴ ＴＡＣ ＡＴＣ ＣＴＡ Ｃ−３’（配列番号３７）；ならびに２０５１４順方向： ５’−ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＧＴ ＧＴＡ ＧＴＴ Ｇ−３’（配列番号３８）および２０５１４逆方向： ５’−ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＡＡ ＣＴＣ ＴＧＣ ＣＴＴ ＣＡＴ Ａ−３’（配列番号３９）である。

サイクリングは以下の通りであった：
第１段階−９６℃−１．５分間
第２段階−２５反復
９６℃−１５秒間
７０℃−１０分間（〜２０ｋｂアンプリコンに関して）または２０分間（〜４０ｋｂアンプリコンに関して）
第３段階−７２℃１０分間
４℃にして貯蔵。

試料を回収し、そして５μｌの反応産物を用いて、実施例１ａにおけるように分析し、そして０．６％アガロースゲル上で泳動して産物を分離した（図１４）。
遺伝子の大きいセグメントの構造を分析するため、ヒトＣＦＴＲ遺伝子全域で、タイル状２０ｋｂアンプリコンを設計した（図１４Ｃ）。これらのプライマー対のセットをまず増幅して、およそ２０ｋｂの産物を得た。続いて、別のプライマー対を用いて、４０ｋｂアンプリコンを生成し（例えば２０５１４順方向と２０４４６逆方向では、４０ｋｂ＃１が生じた）、それによって、全部で６０ｋｂの連続ＤＮＡに関して、２反応において、８０ｋｂを超えるＤＮＡを増幅した。さらに、産物を捕捉するため、プライマーの１つをビオチン化した（１９６６５順方向）。これらの非常に長いストレッチのＤＮＡを反復して増幅する能力と、ビオチンなどの捕捉標識でのアンプリコンのタグ化、ならびに先のセクションに示すような多重化能を組み合わせると、Ｔｂａエキソ^＊に基づく増幅反応系は、ゲノム分析の強力なツールとなる。

本発明は、特定の態様に関して上述されてきているが、当業者に明らかであるように、以下の請求項に示すような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの修飾および変動を作成してもよい。

Claims (19)

1. 長鎖核酸ターゲット領域配列をＰＣＲ増幅するための方法であって：
   （ａ）増幅ターゲットを含む核酸試料を提供し；
   （ｂ）オリゴヌクレオチド・プライマー、配列番号２のＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼである単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸を添加して、反応混合物を形成し；そして
   （ｃ）熱周期条件下で前記反応混合物をインキュベーションして、多数の増幅されたＰＣＲ産物を形成するプライマーの伸長によって、前記ターゲットの増幅を促進する
   工程を含み、
   前記増幅が、他の酵素またはタンパク質またはペプチドの非存在下で行われ、そしてさらに前記の増幅されたＰＣＲ産物が長さ少なくとも１０ｋｂである
   前記方法。
2. さらに、１分あたりに、前記増幅ターゲットの少なくとも２ｋｂが伸長される、請求項１の方法。
3. さらに、１分あたりに、前記増幅ターゲットの少なくとも５ｋｂが伸長される、請求項１の方法。
4. さらに、１分あたりに、前記増幅ターゲットの少なくとも１０ｋｂが伸長される、請求項１の方法。
5. さらに、１分あたりに、前記増幅ターゲットの少なくとも２０ｋｂが伸長される、請求項１の方法。
6. 前記の増幅されたＰＣＲ産物が長さ少なくとも２０ｋｂである、請求項１の方法。
7. 前記の増幅されたＰＣＲ産物が長さ少なくとも４０ｋｂである、請求項１の方法。
8. 前記の増幅されたＰＣＲ産物が長さ少なくとも５０ｋｂである、請求項１の方法。
9. 前記の増幅されたＰＣＲ産物が長さ少なくとも１００ｋｂである、請求項１の方法。
10. 前記プライマーがエキソヌクレアーゼ耐性プライマーである、請求項１の方法。
11. 前記核酸試料が低複雑性核酸試料である、請求項１の方法。
12. 前記核酸試料がゲノムＤＮＡである、請求項１の方法。
13. 前記核酸試料が細菌または哺乳動物ゲノムＤＮＡである、請求項１の方法。
14. 前記核酸試料がヒト・ゲノムＤＮＡである、請求項１の方法。
15. 前記増幅ターゲットが６０％以上のＧＣ含量を有する、請求項１の方法。
16. 前記プライマーに、異なる増幅ターゲット用の多数のプライマー対が含まれ、そして前記反応が多数の増幅産物を産生する、請求項１の方法。
17. 長鎖核酸断片のＰＣＲ増幅用の配合物であって、配列番号２のＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼである単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチド・プライマー、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、核酸テンプレートおよび前記増幅反応に適した反応緩衝剤を含み、増幅されるＰＣＲ断片が長さ少なくとも１０ｋｂであり、さらに前記配合物にいかなるさらなる酵素またはタンパク質またはペプチド組成物も含まれない、前記配合物。
18. 少なくとも１０ｋｂの長鎖核酸断片をＰＣＲ増幅するためのキットであって、配列番号２のＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼである単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、前記増幅反応に適した反応緩衝剤、ユーザーマニュアルおよびオリゴヌクレオチド・プライマーを含む、前記キット。
19. 長鎖ターゲット核酸分子の相補鎖を合成するための方法であって：
    （ａ）ターゲット核酸分子を相補的プライマー分子に曝露して、ターゲットへのプライマーのハイブリダイゼーションを達成し；そして
    （ｂ）配列番号２のＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼである単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下、重合条件下で、プライマーを高温で伸長する
    工程を含み；
    前記伸長ターゲットが６０％以上のＧＣ含量を有し、前記伸長が他の酵素またはタンパク質またはペプチドの非存在下で実行され、そして伸長される核酸鎖が長さ少なくとも１０ｋｂである、前記方法。