JP4297966B2 - 標識ヌクレオチドを利用することによる核酸の新規測定方法 - Google Patents
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Description
(1)FRET(fluorescence resonance energy transfer)現象を利用したプローブを用いる方法(例えば、非特許文献1及び2参照)。
(2)蛍光色素が特定の核酸塩基と相互作用して蛍光発光量を減少させる特性を利用したプローブを用いる方法(例えば、非特許文献3参照)等で代表される方法等、数多くの例を挙げることができる。これらの方法は、均一系で、蛍光色素等で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせることで及び/又は標的核酸を増幅させることで、核酸プローブに標識された蛍光色素等の光学的キャラクター(蛍光強度)の変化若しくは変化量を測定するものである。以下、本件明細書全体において当該核酸プローブを「均一溶液系核酸プローブ」と呼ぶ。又は単に「核酸プローブ」という場合がある。
(i)鋳型としての核酸;(ii)核酸合成酵素;(iii)アクセプター蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマー;及び(iv)2本鎖核酸特異的ドナー蛍光色素、を含有する核酸重合反応系で核酸重合反応を行い、該反応系の光学的キャラクターの変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型として合成された核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法を提供する。
前記核酸重合反応系が、(v)核酸プライマーをさらに含むことが好ましい。
(i)鋳型としての核酸;(ii)核酸合成酵素;(iii)アクセプター蛍光色素で標識されたジデオキシヌクレオチドモノマー;(iv)2本鎖核酸特異的ドナー蛍光色素;及び(v)核酸プライマー、を含有する核酸重合反応系で1塩基伸長反応を行う工程、並びに該反応系の光学的キャラクターを測定する工程を有することを特徴とする上記(i)鋳型としての核酸のSNPを検出する方法を提供する。
非標識ヌクレオチドとは、前記ような標識物質で標識されないヌクレオチドモノマーのことをいう。
核酸プライマーとは、鋳型核酸に特異的に結合する1種のプライマーのことをいう。又、核酸プライマーが、蛍光色素、及びクエンチャー物質で標識されたものを、順に、蛍光標識核酸プライマー及びクエンチャー標識核酸プライマーという。又、2者を総称して、標識核酸プライマーという。アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミンを順にA若しくはa、G若しくはg、U若しくはu、C若しくはc、T若しくはtとした。核酸に結合することで、蛍光を発する蛍光色素を核酸特異的蛍光色素と定義した。
(1)鋳型核酸がDNAで、核酸合成酵素がDNAポリメラーゼ若しくは改変RNAポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がDNAである反応。
(2)鋳型核酸がDNAで、核酸合成酵素がRNAポリメラーゼ若しくは改変DNAポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがリボヌクレオチド体で、核酸重合体がRNAである反応。
(4)鋳型核酸がRNAで、核酸合成酵素が逆転写酵素及びRNAポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがリボヌクレオチド体及びデオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がRNAである反応、即ち、DNA合成反応を介する反応。
(6)上記の反応系に各種のキナーゼ類及び/又はヌクレオチド3リン体生成系を併用する反応系。
上記において、好ましいものは(1)〜(4)で、より好ましいものは(1)〜(3)で、特に好ましいものが、(1)及び(2)である。
1)下記{(1)〜(8)}、好ましくは{(6)、(7)及び(8)}、より好ましくは{(6)及び(7)}の何れか1つの核酸重合系で核酸重合反応(単独)、又は核酸重合反応及び核酸増幅反応(双方の反応)を開始する。
(1)鋳型核酸、少なくとも1種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
(2)前記(1)において、非標識ヌクレオチドを含む核酸重合系。
(3)鋳型核酸、少なくとも1種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
(4)上記(3)において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも1種を含む核酸重合系。
(6)上記(1)〜(5)において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む核酸重合系。
(7)鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
(8)上記(1)〜(7)の何れか1項において核酸特異的蛍光色素を含む核酸重合系。
3)必要に応じて、前記反応物を電気泳動、HPLCで分析する。
尚、上記の核酸重合系において、特に、核酸プライマーを含有する(6)のものは、当該核酸重合系の出力である核酸重合体としてDNAの場合が好適である。又、(1)及び(2)のものは、当該核酸重合系の出力である核酸重合体としてRNAの場合が好適である。又、標識又は非標識ジデオキシヌクレオチドを含む系は、後記する多型(SNPを含む。)又は変異の測定、分析若しくは解析に用いるのが好適である。
又、RNA系の核酸重合反応は前記の核酸プライマーが存在させなくとも進む場合がある。
(1)核酸特異的蛍光色素と蛍光色素間の相互作用(FRET(fluorescence resonance energy transfer)現象)。
(2)蛍光色素間の相互作用(FRET現象)。
(3)クエンチャー物質と蛍光色素間の相互作用(蛍光消光現象)(前記(2)と同じ)。
(4)グアニン塩基と蛍光色素間の相互作用(蛍光消光現象)。
尚、本発明でいう相互作用とは、一方の励起エネルギーが他方へ移動する反応である。又、”蛍光消光現象”を単に”蛍光消光”と略称する場合がある。
(1)核酸重合反応の前後の核酸重合系の測定。
(2)核酸合成を行なわせない系(例えば、鋳型核酸又は核酸合成酵素を添加しない系)を対照としての核酸重合系の測定。
(3)核酸合成が平衡に達した系の核酸重合系の蛍光強度を先ず測定し、次いで、核酸重合系の核酸変性処理(例えば、90〜98℃での処理)後、測定する。
1)本発明方法A(図1参照)
(1)少なくとも1種の蛍光標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませ、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチド間の標識された蛍光色素(A)と標識された蛍光色素(B)間の相互作用に由来する核酸重合系の蛍光キャラクターの変化を測定するか、又はその変化を時間の関数としてモニタリングする(以下、単にモニタリングするという。)ことから、鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系(1)及び(2)の1例で、特許請求の範囲の請求項1〜3の発明に相当する。
本発明の核酸重合系が、核酸特異的蛍光色素を含有する例である。そして、核酸重合系が前記核酸重合系(8)の1例である。核酸特異的蛍光色素(C)は、核酸重合体、核酸重合体・鋳型核酸複合体、核酸プライマー・鋳型核酸複合体に結合する。そして核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素(D)と核酸特異的蛍光色素(C)間の相互作用が発生する。この相互作用に由来する蛍光強度の変化を測定するか、又はモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することが可能となる。この方法は、特許請求の範囲の請求項15の発明に相当し、核酸特異的蛍光色素(C)の蛍光強度の減少、又、標識ヌクレオチドの蛍光色素(D)の蛍光強度の増加を測定することになる。即ち、核酸重合系の特定波長の蛍光強度の増加若しくは減少を測定する。
非標識核酸プライマーが存在するか、存在せずして、蛍光標識ヌクレオチド、非標識ヌクレオチド、鋳型核酸、核酸合成酵素を含有してなる核酸重合系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の減少若しくは減少量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。そして非標識ヌクレオチドの少なくとも一種がグアニン(g)を含むか及び/又は鋳型核酸が少なくとも1つグアニン(g)を含む場合が好適である。即ち、核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの塩基に対応する鋳型核酸の塩基がgc(GC)対を形成するか、又は、上記蛍光標識ヌクレオチドの塩基から1乃至3塩基離れて(当該対応塩基を1と数える。)、鋳型核酸中にGが存在するか若しくは核酸重合体中に塩基がGである非標識ヌクレオチドが存在し、蛍光強度の変化が蛍光色素(E)とGとの相互作用によるものである核酸の測定方法。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系(2)の1例で、特許請求の範囲の請求項7及び8に相当する発明である。
(1)蛍光標識ヌクレオチドの塩基がシトシン(c)又はグアニン(g)である。
(2)少なくとも一種の非標識ヌクレオチドの塩基がグアニン(g)である。
(3)鋳型核酸が少なくとも1つグアニン(g)を含む。
本発明方法Aの(1)又は(2)において、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとを使用する例である。即ち、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとを核酸重合体に取り込ませると、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素(A)とクエンチャー標識ヌクレオチドのクエンチャー物質(Q)が接近し、相互作用する(図4参照)ことにより核酸重合系の蛍光強度が減少する。この蛍光強度の減少を測定するか、又はその減少をモニタリングすることで鋳型核酸又はそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系(1)及び/又は(2)の1例で、特許請求の範囲の請求項3及び/又は4の発明に相当する。そして、核酸重合系の蛍光強度の減少を測定することになる。
本発明方法Aの(2)において、核酸プライマーとして標識核酸プライマーを用いる例である。鋳型核酸の重合を行う過程で、標識ヌクレオチドが核酸重合体に取り込まれる。標識核酸プライマーの蛍光色素(A)或はクエンチャー物質(Q)と標識ヌクレオチドの蛍光色素(A)或はクエンチャー物質(Q)間の相互作用により蛍光強度が変化する。この変化を測定するか、又はモニタリングすることから鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定する方法である。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系(6)の1例で、特許請求の範囲の請求項6の発明に相当する。そして、核酸重合系の蛍光強度の増加若しくは減少を測定することになる。この場合、蛍光強度の増加、又は減少は、標識ヌクレオチドの蛍光色素(A)若しくはクエンチャー物質(Q)と標識核酸プライマーの標識物質の蛍光色素(A)若しくはクエンチャー物質(Q)の組合せに依存する。ドナー色素とアクセプター色素の関係の場合は、本発明方法Aと同様である。クエンチャー物質と蛍光色素の関係の場合は、本発明方法Dと同様である。
本発明方法Aの(2)において、核酸プライマーとして標識核酸プライマーを用い、標識ヌクレオチドの代わりに非標識ヌクレオチドを用いた(即ち、標識ヌクレオチドを用いない)例である。標識核酸プライマーに標識した蛍光色素(A)と、取り込まれたG塩基を有する非標識ヌクレオチドのG間の相互作用により核酸重合系の蛍光強度が減少する。この蛍光強度の減少を測定するか、又はその減少をモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系(7)の1例で、特許請求の範囲の請求項9及び10に相当する発明である。
本発明方法A〜Fにおいて、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドを用いる代わりに、免疫関連物質、即ち、抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれた少なくとも1種で標識されたヌクレオチドモノマー(免疫関連標識ヌクレオチド)を用いた例である。例示して説明すると、前記のヌクレオチドモノマーに標識された抗体には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている、前記の抗原、抗抗体に対応する抗原又は抗抗体が結合する。その結果、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドと同様な作用をする。又、抗原には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている抗体が結合するようになっている。抗抗体には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている抗体が結合するようになっている。その結果、前記免疫関連標識ヌクレオチドは、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドと同様な作用をする。
尚、免疫関連物質、即ち、抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれた少なくとも1種でヌクレオチドを標識するには、前記の従来公知の方法により達成出来る。又、前記と同様に委託合成((株)日本遺伝子研究所(http://www.ngrl.co.jp)を行って入手した方が好適である。
本方法は、2つの発明を含む。
i)核酸重合系が前記核酸重合系(3)の1例で、特許請求の範囲の請求項12〜15に相当する発明である。鋳型核酸、少なくとも1種の蛍光色素及び/又は少なくとも1種のクエンチャー物質で標識された、少なくとも1種のジデオキシヌクレオチドモノマー(前者を「蛍光標識ジデオキシヌクレオチド」、後者を「クエンチャー標識ジデオキシヌクレオチド」という。両者を総称して「標識ジデオキシヌクレオチド」という。)、及び核酸合成酵素を含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。そして、核酸重合系が、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも1種を含む系である。又、核酸重合系が、非標識核酸プライマーを含む系である。
各種核酸合成酵素を用いて、固体表面上に固定化された1種以上の核酸プライマーから鋳型核酸の重合を行うことを特徴とする前述の本発明方法A〜Gの何れかに記載の方法である。
(2)Mergneyらのプローブ(Mergney et al.,Nucleic acid Res.,22:920-928,1994)で代表されるプローブ。
(3)分子ビーコン(molecular beacon)方法(Tyagi et al.,Nature Biotech.,14:303-308,1996;Schofield et al.,Applied and Environ. Microbiol.,63:1143-1147,1997)で代表されるプローブ。
(4)Livakらのプローブ(US patent No.5,538,848)で代表されるプローブ。
(7)HORNらのプローブ(US Patent Application Publication No.US2001/0009760A1,Pub.Date:Jul.26,2001)で代表されるプローブ。
以下の核酸重合系で核酸重合反応若しくは核酸増幅反応を行う。尚、詳しくは実施例7及び8に示した。
1)前記した核酸重合若しくは核酸増幅方法の核酸重合系{(1)〜(8)}、好ましくは{(6)、(7)及び(8)}、より好ましくは{(6)及び(7)}の何れか1つのものである。この場合、好適には、標識又は非標識核酸プライマーとしてA型プライマーを少なくとも1種を含有する。
2)前記1)の核酸重合系が、前記同様にB型プライマーを少なくとも1種を含有する。
3)前記1)の核酸重合系が、前記同様にA型プライマーを少なくとも1種、及びB型プライマーを少なくとも1種を含有する(但し、同種の蛍光色素で標識されたA型プライマー及びB型プライマーを除く。)。
尚、上記のA型若しくはB型プライマーの替わりに、鋳型核酸中の目的の多型(SNPを含む。)及び/又は変異の塩基に相補する(水素結合出来る。)か又は相補しない塩基を有する非標識若しくは標識ジデオキシヌクレオチドの少なくとも一種を用いることでも、多型(SNPを含む。)及び/又は変異の測定、解析、又は分析することが達成出来ることは、前記した通りである。
本発明は、特許請求の範囲の請求項1〜18の発明を開示するが、その他に以下に記載する幾つかの好ましい実施形態を開示する。
(1)鋳型核酸、少なくとも1種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
(2)前記(1)において、非標識ヌクレオチドを含む。
(3)鋳型核酸、少なくとも1種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
(4)上記(3)において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも1種を含む。
(6)上記(1)〜(5)において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む。
(7)鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む。
(8)上記(1)〜(7)の何れか1つにおいて核酸特異的蛍光色素を含む。
(1)鋳型核酸、少なくとも1種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
(2)前記(1)において、非標識ヌクレオチドを含む。
(3)鋳型核酸、少なくとも1種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
(4)上記(3)において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも1種を含む。
(6)上記(1)〜(5)において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む。
(7)鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む。
(8)上記(1)〜(7)の何れか1つにおいて核酸特異的蛍光色素を含む。
[4]前記[2]に記載の核酸重合系で、核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定して、その測定値から、多型(SNPを含む。)及び/又は変異の測定、解析、又は分析する前記[2]に記載の核酸の測定方法。
[5]非標識若しくは標識核酸プライマーの3’末端塩基若しくは3’末端から2番目の塩基(3’末端塩基を1と数える。)が鋳型核酸の検出目的の多型(SNPを含む。)及び/又は変異の塩基に対応する非標識若しくは標識核酸プライマーを含有する核酸重合系で核酸重合若しくは核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を測定し、多型(SNPを含む。)及び/又は変異の測定、解析、又は分析する前記[1]又は[4]に記載の核酸の測定方法。
1)前記した核酸重合系{(1)〜(8)}の何れか1つのものが、非標識若しくは標識核酸プライマーの、3’末端塩基若しくは3’末端から2番目の塩基(3’末端塩基を1と数える。)が、対応する鋳型核酸の塩基とは相補しない塩基を有するもの(A型プライマーと称する。)の少なくとも1種を含有する。
2)前記1)の核酸重合系が、非標識若しくは標識核酸プライマーの、3’末端塩基若しくは3’末端から2番目の塩基(3’末端塩基を1と数える。)が、対応する鋳型核酸の塩基とは相補する塩基を有するもの(B型プライマーと称する。)の少なくとも1種を含有する。
3)前記1)の核酸重合系が、A型プライマーの少なくとも1種、B型プライマーの少なくとも1種を含有する(但し、同種の蛍光色素で標識されたA型プライマー及びB型プライマーを除く。)。
[8]前記請求項1、7、9、12、16、前記[1]、[3]の何れか1項に記載の方法で得られたデータを解析する方法において、鋳型核酸若しくは核酸合成酵素を含有している核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値を、鋳型核酸若しくは核酸合成酵素が含有していない核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値により補正することを特徴とするデータ処理若しくは解析方法。
[10]核酸合成酵素が、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたVent(exo-)DNA Polymerase(サーモコッカス・リトラリス由来)、Tgo(exo-)DNA Polymerase、ThermoSequenase DNA Polymerase(Armersham社製)、AmpliTagGold、T7 Sequenase DNA Polymeraseである前記請求項1、7、9、12、16、前記[1]、[4]のいずれか1項に記載の核酸の測定方法。
[12]PCR方法がリアルタイム定量的PCR法である前記[11]の核酸の測定方法。
[13]前記請求項5に記載の標識核酸プライマーの少なくとも1種で標識された核酸プライマーを固体表面上に固定化させて、前記請求項1、7、9、12、16、前記[1]、[2]の何れか1項に記載の方法を実施できるようにしたことを特徴するデバイス(DNAチップ)類。
[14]前記のデバイス(DNAチップ)類を用いて鋳型核酸の核酸重合反応を行う前記請求項1、7、9、12、16、前記[1]、[2]のいずれか1項に記載の核酸の測定方法。
[16]前記請求項1、7、9、12、前記[2]の何れか1項に記載の方法を用いて、均一溶液系核酸プローブの任意の位置の塩基を蛍光色素で標識する方法。
1)「鋳型核酸」を「鋳型」という場合がある。
2)「核酸プライマー」を「プライマー」とした。
3)dNTSs、dATP、dGTP、dTTP、dUTPは現在分子で生物学等で用いられている意味と同じである。
本実施例で用いた、鋳型、標識又は非標識ヌクレオチド及び標識又は非標識プライマーは特別の記載がない限り、委託合成((株)日本遺伝子研究所(http://www.ngrl.co.jp)を行って入手した。
(合成1本鎖DNAの塩基配列)
プライマー1:CAGACTCGACAGTGTAGACCCG
プライマー2:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
プライマー3:TTGCATGTGTTAGGCCTG
鋳型1:
ACACACACACACACTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型2:
TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型3:
TTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型4:
TTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型5:
TTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
TTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型7:
TTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型8:
TTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型9:
TTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型10:
GCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型11:
GCTCCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
2本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間のFRET現象を利用して鋳型核酸を測定する。
1)鋳型DNAとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用した1本鎖DNA(鋳型1〜9)及び22塩基のプライマー(プライマー1)はDNA合成機ABI394(Perkin Elmer社製、米国)で調製した。鋳型1から9はプライマー1と相補的な共通の配列を3´側に有する。又、これらの鋳型は伸長反応の過程で標識されたdUTPが7つ取り込まれるように設計してある。以下に鋳型1本鎖DNAとプライマー1との組み合わせの特徴を示す:
・鋳型1とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチドが1個取り込まれるごとに1つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型2とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチドが3個取り込まれるごとに1つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型3とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチドが5個取り込まれるごとに1つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型5とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチドが8個取り込まれるごとに1つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型6とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチドが10個取り込まれるごとに1つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型7とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチドが11個取り込まれるごとに1つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型8とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチドが13個取り込まれるごとに1つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
DNAポリメラーゼは3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたサーモコッカス・リトラリス由来のVent(exo-)DNA Polymerase(NEW ENGLAND BioLabs,Beverly,MA)を用いた。蛍光標識ヌクレオチドにCyanine 5-dUTP(650nm/668nm)、LissamineTM-5-dUTP(570nm/588nm)、Texas Red(r)-5-dUTP(593nm/612nm)(カッコ内は最大吸収波長/最大蛍光波長、PerkinElmer米国)を用いた。DNAポリメラーゼにより取り込まれた標識ヌクレオチドへFRET現象を起こさせるためのドナー色素に、2本鎖核酸に特異的に結合し497nmに最大励起波長を持ち、520nm付近で最大の蛍光を発するSYBR(r)Green I Nucleic Acid Gel Stain(Molecular probes、米国)を用いた。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1%Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM dATP ・200nM dGTP
・200nM dCTP ・200nM Cyanine5-dUTP若しくはLissamineTM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTP ・1×SYBR(r)Green I ・2nM プライマー
・20nM 合成1本鎖鋳型DNA ・0.1 U(単位) Vent(exo-)DNA Polymerase
・モデル1〜9:プライマー1と鋳型1〜9の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはCyanine 5-dUTPを使用した。
・モデル10:プライマー1と鋳型9の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはCyanine 5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル11〜19:プライマー1と鋳型1〜9の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはLissamineTM-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。・モデル20:プライマー1と鋳型9の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはLissamineTM-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル21〜29:プライマー1と鋳型1〜9の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-dUTPを使用した。
・モデル30:プライマー1と鋳型9の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル31〜39:プライマー1と鋳型1〜9の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドは使用しないかわりにdTTPを用いる。
・モデル40:プライマー1と鋳型9の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドは使用しないかわりにdTTPを用いる。Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
蛍光標識ヌクレオチド同士のエネルギー移動現象を利用して鋳型核酸を測定する。
1)鋳型DNAとプライマーの合成
実施例1で使用したプライマーならびに鋳型1本鎖DNAを用いた。以下に鋳型1本鎖DNAとプライマー1との組み合わせの特徴を示す。
・鋳型1とプライマー1との組み合わせ:蛍光標識ヌクレオチドとFITC標識ヌクレオチドが交互に1つずつ取り込まれる。
・鋳型2とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチド1個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとFITC標識ヌクレオチドが交互に1つずつ取り込まれる。
・鋳型3とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチド2個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとFITC標識ヌクレオチドが交互に1つずつ取り込まれる。
・鋳型5とプライマー1との組み合わせ:FITC標識ヌクレオチドが取り込まれた後、非標識ヌクレオチド3個が取り込まれる。次に、蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。非標識ヌクレオチド4個が取り込まれる。この繰り返しである。非標識ヌクレオチド4個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとFITC標識ヌクレオチドが交互に1つずつ取り込まれる。
・鋳型6とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチド4個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとFITC標識ヌクレオチドが交互に1つずつ取り込まれる。
・鋳型8とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチド5個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとFITC標識ヌクレオチドが交互に1つずつ取り込まれる。
・鋳型9とプライマー1との組み合わせ:非標識ヌクレオチド6個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとFITC標識ヌクレオチドが交互に1つずつ取り込まれる。
蛍光標識ヌクレオチドには、実施例1と同様の蛍光標識ヌクレオチドとしてCyanine 5-dUTP、LissamineTM-5-dUTP、Texas Red(r)-5-dUTPを用いた。FITC標識ヌクレオチドはFITC-dGTP(PerkinElmer、米国)を用いた。
・20mM TrisHCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM FITC-dGTP(ドナー色素)
・200nM dCTP ・200nM dATP ・200nM Cyanine 5-dUTP若しくはLissamineTM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTP (アクセプター色素) ・2nM プライマー
・20nM 合成1本鎖鋳型DNA ・0.1 U Vent(exo-)DNA Polymerase
・モデル1〜7:プライマー1と鋳型1、プライマー1と鋳型2、プライマー1と鋳型3、プライマー1と鋳型4、プライマー1と鋳型6、プライマー1と鋳型8、プライマー1と鋳型9の組み合わせで、Cyanine 5-dUTPを用いる。
・モデル8:プライマー1と鋳型6を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにCyanine 5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル9〜15:プライマー1と鋳型1、プライマー1と鋳型2、プライマー1と鋳型3、プライマー1と鋳型4、プライマー1と鋳型6、プライマー1と鋳型8、プライマー1と鋳型9の組み合わせで、LissamineTM-5-dUTPを用いる。
・モデル17〜23:プライマー1と鋳型1、プライマー1と鋳型2、プライマー1と鋳型3、プライマー1と鋳型4、プライマー1と鋳型6。プライマー1と鋳型8、プライマー1と鋳型9の組み合わせで、Texas Red(r)-5-dUTPを用いる。
・モデル24:プライマー1と鋳型6を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにRed(r)-5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
FITC標識ヌクレオチドとCy5標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的PCR
1)鋳型の合成
鋳型はPseudomonas fluorescens DSM 50108(PF)16SリボゾーマルDNAの1400bpのDNA断片を使用した。該鋳型は以下のようにして調製した。プライマー2、3を使用し、PFゲノムを鋳型としてPCR反応を行った。該増幅断片はマイクロコンPCR(r)(ミリポア社、米国)で精製後、濃度を測定しコピー数に換算した。
反応液は以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5 mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・20μM プライマー対
・最終濃度1×109〜1×105コピーの鋳型DNA
・0.2 U Vent(exo-)DNA Polymerase ・6μM dATP、dCTP、dGTP混合物
・2.5μM dTTP ・0.25μM Cy5 5-dUTP ・0.25μM FITC-5-dUTP
Fn=fn(56℃)/f’n(56℃)
但し、Fn=各サイクルにおける蛍光強度値の補正値、fn(56℃)=各サイクルにおけるサンプルの56℃の蛍光強度値、f’n(56℃)=各サイクルにおけるブランクの56℃における蛍光強度値
Cn=Fn(56℃)/F5(56℃)
但し、Cn=各サイクルにおける蛍光強度値の換算値、Fn(56℃)=各サイクルの56℃の蛍光強度値、F5(56℃)=5サイクル目の56℃における蛍光強度値。
以上2点の補正方法は、アニーリング反応後(ここでは56℃)、若しくは伸長反応後(72℃)のどちらの蛍光強度値を用いても構わない。
2本鎖核酸特異的蛍光色素とCy5標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的PCR
鋳型とプライマーは実施例5と同様のものを使用した。以下に反応液組成を示す。
・20mM Tris-HCl(pH 8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・20μM プライマー対
・最終濃度1×109〜1×105コピーの鋳型DNA
・0.2 U Vent(exo-)DNA Polymerase ・4μM dATP、dCTP、dGTP混合物
・1μM dTTP ・1μM Cy5-5-dUTP ・1×SYBR(r)Green I
標識ヌクレオチドを用いた1塩基伸長反応によるSNPの測定
1)鋳型DNAとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用した26塩基の1本鎖DNA(鋳型10、11)DNA合成機ABI394で調製した。鋳型10と11は5’末端から数えて4塩基目がそれぞれT、Cであり、その他の配列は同じである。このように、鋳型10と11は特定の部位がT若しくはCであるSNP(single nucleotide polymorphism;1塩基多型、以下SNPと略す)を含んだDNA断片と考えることができる。これらの鋳型は3’側にプライマー1と相補的な配列を持ち、該プライマーとハイブリダイズした際、プライマーの3’末端塩基が鋳型のSNP部位の塩基に隣接するように設計してある。尚、蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-ddATP(PerkinElmer 米国)、Cy5TM-5-ddGTP(Amersham Biosciences)を用いた。又、核酸重合系にSYBR(r)Green 1を添加した。
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH 8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM Texas Red(r)-5-ddATP
・200nM Cyanine5TM-5-ddGTP ・1×SYBR(r)Green I ・20nM プライマー
・200nM 合成1本鎖鋳型DNA ・0.1 U Vent(exo-)DNA Polymerase
・モデル1:プライマー1と鋳型10の組み合わせでVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない(ブランクコントロール)
・モデル2:プライマー1と鋳型10の組み合わせ(鋳型10のホモ)でVent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
・モデル3:プライマー1と鋳型11の組み合わせ(鋳型11のホモ)でVent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
・モデル4:プライマー1、鋳型10、11を100nMずつ等量加えた組み合わせ(鋳型10と11のヘテロ)Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
一塩基伸長反応によるp53遺伝子コドン282の一塩基多型検出
(1)鋳型DNAとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用したDNAは、PCR反応にてプライマー14、15を用いて調製した。
反応液は以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.0) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgCl2
・0.1% Triton X100 ・200nM プライマー対 ・50ng ヒトゲノムDNA
・1U AmpliTaqGold(Applied Biosystems) ・200μM dNTPs
調製したPCR産物には大過剰のPCRプライマーとdNTPが含まれるため、キアゲンPCR産物精製キット(Qiagen)による精製、若しくは、シュリンプ由来アルカリフォスファターゼ(usb)とエキソヌクレアーゼI(usb)をそれぞれ4U、20Uずつ添加し、37℃、90分温置後、85℃15分間加熱して酵素を不活性化した溶液を鋳型とした。
ジェノタイピングプライマーとして、プライマー16に示したオリゴヌクレオチドを使用した。PCR反応で調製した鋳型とハイブリダイズした際、その3’末端塩基がSNP部位に隣接するように設計してある。
反応液は以下のように調製した。
・1U Thermo Sequenase I DNA Polymerase(Amersham-Pharmacia Biotech)
・10×Thermo Sequenase I DNA Polymeraseバッファー
・200nM Texas Red-5-ddATP ・200nM Cy5-5-ddGTP
・1×SYBR Green I ・200nM プライマー
・鋳型DNA
アレル特異的プライマーを用いた配列特異的伸長法によるアルデヒドデヒドロゲナーゼ2(ALDH2)遺伝子の一塩基多型検出
ALDH2は、12番染色体長腕に存在するアルコール代謝関連遺伝子の1つである。日本人に頻繁にみられる変異型アレル(ALDH2*2)は、ALDH2 exon 12中487番目のアミノ酸Glu(グルタミン酸)をコードするGAAが、Lys(リジン)をコードするAAAに変異した点突然変異である。
本実施例に使用する鋳型DNAは、PCR反応にてヒトゲノムDNAよりプライマー4、5を用いて調製した。反応溶液の組成は以下のとおりである。
・20mM Tris-HCl(pH8.0) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgCl2
・0.1% Triton X100 ・200nM プライマー対 ・50ng ヒトゲノムDNA
・1U AmpliTaqGold ・200μM dNTPs 混合物
(2)PCR産物の精製
調製したPCR産物を、PCR精製キット(Qiagen)、若しくは酵素処理(シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼIをそれぞれ4U、20Uずつ添加し、37℃、90分温置後、85℃、15分間加熱して酵素を不活性化)した溶液を鋳型として一塩基多型解析に用いた。
3’末端がそれぞれのSNPに相補的なアレル特異的プライマーを合成した。プライマー6は3’末端がC、プライマー7はTであり、その他は鋳型と相補的な同じ配列を有している。配列特異的伸長反応による一塩基多型解析は、プライマーの3’末端にミスマッチが存在すると、DNAポリメラーゼによる伸長反応が阻害されるという原理に基づいている。従って3’末端が相補的な場合、伸長反応により取り込まれた2種類の蛍光色素標識ヌクレオチドによりFRETが起き、蛍光強度が変化する。相補的でない場合、蛍光標識ヌクレオチドは取り込まれないため蛍光強度は変化しない。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・2μM dATP ・2μM dGTP ・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・400nM Cy5-5-dCTP
・400nM FITC-5-dCTP ・200nM プライマー ・精製PCR産物
・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
ICAN法(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)で調製した鋳型を用いた配列特異的伸長法によるALDH2遺伝子の一塩基多型の検出
本実施例に使用する鋳型DNAは、RNA−DNAキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法で調製した。その際使用したプライマーは、プライマー4及び5と同じ塩基配列を有し、その3’末端3塩基がリボヌクレオチドに置き換わっている。
(ICAN反応条件)
・35mM Tris-HCl(pH7.8) ・10mM MgSO4 ・5% DMSO ・1μM プライマー対
・200ng ヒトゲノムDNA ・2.2U BcaBEST DNA polymerase(宝酒造)
・15U RNase H(宝酒造) ・1mM dNTPs
(2)ICAN増幅産物の酵素処理
シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼIをそれぞれ4U、20Uずつ添加し、37℃、90分温置、続いて85℃、15分間加熱して酵素を不活性化した。
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4 ・2μM dATP
・2μM dGTP ・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・400nM Cy5-5-dCTP ・400nM FITC-5-dCTP
・100nM プライマー6、7 ・ICAN増幅産物 ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)法で調製した鋳型を用いた、配列特異的伸長法によるProstate-specific antigenの一塩基多型検出
本実施例で使用する鋳型DNAは、4つのプライマーを使用し、さらに酵素として鎖置換型DNAポリメラーゼを使用する等温遺伝子増幅法で調製した。
LAMP反応条件
・10×Thermopol Buffer(NEB) ・2mM MgSO4 ・200ng ヒトゲノムDNA
・8U Bst DNA polymerase(NEB) ・4M Betaine(Sigma) ・10mM dNTPs
・40pmol プライマー8 ・40pmol プライマー9 ・5pmol プライマー10
・5pmol プライマー11
(2)LAMP増幅産物の酵素処理
シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼIをそれぞれ4U、20Uずつ添加し、37℃、90分温置、続いて85℃、15分間加熱して酵素を不活性化した。
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・400nM CY5-5-dCTP ・400nM FITC-5-dCTP ・2μM dATP ・2μM dGTP
・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・100nM プライマー12及びプライマー13
・LAMP増幅産物 ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
逆転写酵素を用いたアレル特異的伸長反応による1塩基多型解析
LCHAD(長鎖3−ヒドロキシアシル コエンザイムA デヒドロゲナーゼ)、OAT(有機アニオントランスポーター)の一塩基多型を、逆転写酵素を用いた配列特異的伸長法により解析した。
(1)鋳型RNAの合成
本実施例に鋳型として使用するRNAは以下のように調製した。
後記の配列番号17、18、21、22のプライマーを用いて2−プレックスPCRを行った。1組のプライマーの一方には5’RNAポリメラーゼプロモーター配列を付けた。マルチプレックスPCR反応条件は、Ampli Taq Gold 1U 200nM、プライマー対50ng、ヒトゲノムDNA、Ampli Taq Gold buffer 200μM、dNTPsを均一に混合し、最終容量25μlとした。95℃、10分間熱変性させた後、変性反応95℃、30秒、アニーリング反応65℃、30秒、伸長反応72℃、30秒を1サイクルとして40サイクル行った。続いて、T7 Ampliscribe Kit(Epicentre Technologies)を用いて転写反応を行った。
マイクロアレイは、標準的なマイクロスコープガラススライドを用いた。イソチオシアネートで表面を活性化させた後、NH2−修飾オリゴヌクレオチド(配列番号19、20、23、24)を固定化した。オリゴヌクレオチドは20μMになるよう400mMの炭酸ナトリウムバッファー(pH9.0)で溶解した。直径2mmにスポットした後、気化したアンモニアにさらし蒸留水で三回洗浄した。
調製した鋳型RNAを、10mM Tris-HCl、(pH7.4)、1mM EDTA、0.2M NaCl、0.1% Triton X-100に溶解後、10μlをアレイに添加し37℃、20分間温置してアニーリングさせた。0.1M NaClで洗浄後、逆転写酵素MMLV(Epicentre Technologies)6U、dNTPs(dATP、dGTP、FITC-dUTP、CY5-dCTP)6μM、酵素付属バッファーを添加し、52℃で1時間反応させた。
マイクロスコープ ガラス スライドは、コンフォーカル スキャン アレイ4000(GSI Lumonics)を用いて励起波長480nm、蛍光波長650nmでスキャンした。バックグランドの蛍光強度値を引いた値をジェノタイプの判定に用いた。
フルオレセインクロロトリアジニル−4−dC(デオキシシチジン)ヌクレオチドモノマーを利用して、グアニンによる消光現象により核酸を検出する。
1)鋳型DNAとプライマー
プライマー1と、鋳型12を用いた。
・モデル1:プライマー1と鋳型12の組み合わせ
・モデル2:プライマー1と鋳型12の組み合わせでVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH4)2SO4 ・2.5mM MgSO4
・0.5% Triton X100 ・5% DMSO ・0.25mg/ml BSA
・200nM フルオレセインクロロトリアジニル-4-dC
・200nM dGTP ・200nM dATP ・200nM dUTP ・2nM プライマー
・50nM 合成一本鎖鋳型DNA ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
プライマー4:GTGTAACCCATAACCCCCAAGA
プライマー5:CACCAGCAGACCCTCAAGC
プライマー6:CCCACACTCACAGTTTTCACTTC
プライマー7:CCCACACTCACAGTTTTCACTTT
プライマー8:TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG
プライマー9:TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG
プライマー10:TGCTTGTGGCCTCTCGTG
プライマー11:GGGTGTGGGAAGCTGTG
プライマー13:TGATCTTGCTGGGTCGGCACAGT
プライマー14:ACCTGATTTCCTTACTGCCTCTTGC
プライマー15:GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGT
プライマー16:TGTGCCTGTCCTGGGAGAGAC
プライマー17:TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCTTGCCAGGTGATTGGC
プライマー18:GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGTTTCTGTGGTCACGAAGTC
プライマー20:CTCTAATAGTGCTGGCTG
プライマー21:
TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCTTTGTAGCTGGGA ACTTC
プライマー22:
GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTACCAAAACCTGGTAAATACGG
プライマー23:GAGATAGCAGACAACGTCC
プライマー24:GAGATAGCAGACAACGTCG
鋳型12:
TTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
[図11]2本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル1〜10のF3蛍光強度変化。
[図12]2本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル11〜20のF1蛍光強度変化。
[図13]2本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル11〜20のF2蛍光強度変化。
[図14]2本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル21〜30のF1蛍光強度変化。
[図15]2本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル21〜30のF2蛍光強度変化。
[図16]2本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル31〜40のF1蛍光強度変化。
[図17]2種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル1〜8のF1蛍光変化。
[図18]2種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル1〜8のF3蛍光変化。
[図19]2種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル9〜16のF1蛍光変化。
[図20]2種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル9〜16のF2蛍光変化。
[図21]2種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル17〜24のF1蛍光変化。
[図22]2種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用(FRET現象)を利用した核酸測定:モデル17〜24のF2蛍光変化。
[図23]2種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたPCR増幅産物のリアルタイムモニタリング(F1蛍光変化)。
[図24]2種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたPCR増幅産物のリアルタイムモニタリング(F3蛍光変化)。
[図25]2種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたPCR増幅産物のリアルタイムモニタリング(データ処理後のF1蛍光変化)。
[図26]2種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたPCR増幅産物のリアルタイムモニタリング(データ処理後のF3蛍光変化)。
[図29]2本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドを用いたPCR増幅産物のリアルタイムモニタリング(データ処理後のF3蛍光変化)。
Claims (9)
- 以下の(i)〜(iv)
(i)鋳型としての核酸;
(ii)核酸合成酵素;
(iii)アクセプター蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマー;及び
(iv)2本鎖核酸特異的ドナー蛍光色素、
を含有する核酸重合反応系で核酸重合反応を行い、該反応系の光学的キャラクターの変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型として合成された核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法。 - 前記核酸重合反応系が、(v)核酸プライマーをさらに含む請求項1に記載の核酸の測定方法。
- 以下の(i)〜(v)
(i)鋳型としての核酸;
(ii)核酸合成酵素;
(iii)アクセプター蛍光色素で標識されたジデオキシヌクレオチドモノマー;
(iv)2本鎖核酸特異的ドナー蛍光色素;及び
(v)核酸プライマー、
を含有する核酸重合反応系で1塩基伸長反応を行う工程、並びに該反応系の光学的キャラクターを測定する工程を有することを特徴とする上記(i)鋳型としての核酸のSNPを検出する方法。 - 前記(v)核酸プライマーの3’末端が、(i)鋳型としての核酸のSNP部位に隣接するように設計されている請求項3に記載のSNPの検出方法。
- 前記(iv)2本鎖核酸特異的ドナー蛍光色素が、SYBR(R) GREEN Iであり、前記(iii)のヌクレオチドモノマーを標識する蛍光色素が、SYBR(R) GREEN Iに対するアクセプター蛍光色素である請求項1又は3に記載の方法。
- 前記(iii)のヌクレオチドモノマーを標識するアクセプター蛍光色素が、Cy5、Lissamine(TM)及びTexas Red(R)からなる群より選択されるいずれかである請求項1又は3に記載の方法。
- 前記光学的キャラクターが蛍光強度である請求項1又は3に記載の方法。
- 前記核酸重合反応系の光学的キャラクターが、前記(iii)のヌクレオチドモノマーを標識するアクセプター蛍光色素の光学的キャラクターと、前記(iv)2本鎖核酸特異的ドナー蛍光色素の光学的キャラクターである請求項1又は3に記載の方法。
- 前記(iii)のヌクレオチドモノマーが、塩基の種類が異なる少なくとも2種のヌクレオチドモノマーについて、それぞれ異なるアクセプター蛍光色素で標識されている少なくとも2種のヌクレオチドモノマーであり、前記核酸重合反応系の光学的キャラクターが、上記少なくとも2種の異なるアクセプター蛍光色素の光学的キャラクターである請求項1又は3に記載の方法。
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