JP6389473B2 - 高解像能融解の較正の改善 - Google Patents
高解像能融解の較正の改善 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6389473B2 JP6389473B2 JP2015552042A JP2015552042A JP6389473B2 JP 6389473 B2 JP6389473 B2 JP 6389473B2 JP 2015552042 A JP2015552042 A JP 2015552042A JP 2015552042 A JP2015552042 A JP 2015552042A JP 6389473 B2 JP6389473 B2 JP 6389473B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- double
- stranded oligonucleotide
- strand
- nucleic acid
- chromophore
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000002844 melting Methods 0.000 title claims description 106
- 230000008018 melting Effects 0.000 title claims description 106
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 149
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 99
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 88
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 88
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 60
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 59
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 59
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 55
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 54
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 34
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 21
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 14
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 39
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 38
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 4
- -1 phosphate triester Chemical class 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150005267 Add1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 244000132059 Carica parviflora Species 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000001327 Förster resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6846—Common amplification features
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
HRM実験を特定の機器で実行する前に別個の温度較正を特別な較正板によって実行する。全ての位置でのブロックに特有の温度データを機器のソフトウェアに保存し、その後、全ての位置の温度差を補正するためにHRM実験に使用する。この方法は、例えば、Applied Biosystems 7500及び7900HTリアルタイムPCRシステム(例えば、MeltDoctor(登録商標)HRM較正板、カタログ番号PN4425618)、及びBiorad CFXリアルタイムPCRシステム(例えば、融解較正キット、カタログ番号184-5020)に対して確立されている。
本明細書の第5の側面は、上述したようにPCR実験における温度較正を行うための方法を実行するためのコンピュータプログラムに関する。
用語「a」、「an」、及び「the」は、一般に、文脈上明確に指示する場合を除き、複数形を含む。
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用でき、リボース核酸(ribose nucleic acid:RNA)又はデオキシリボース核酸(deoxyribose nucleic acid:DNA)重合体、又はそれらの類似体に相当する重合体を指す。これは、RNA及びDNA等のヌクレオチド、合成形態、及びそれらの修飾(例えば、化学的又は生化学的修飾)形態の重合体、並びに混合重合体(例えば、RNA及びDNAサブユニットを含む)を含む。修飾の例としては、メチル化、類似体による天然に存在する1個以上のヌクレオチドの置換、非荷電結合(メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、アミドリン酸エステル、カルバミン酸エステル等)等のヌクレオチド間修飾、懸垂部分(ポリペプチド等)、挿入剤(例えば、アクリジン、ソラレン等)、キレート剤、アルキル化剤、並びに修飾結合(例えば、α―アノマー核酸等)を含む。また、水素結合及び他の化学的相互作用によって指定された配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣した合成分子も含まれる。典型的には、ヌクレオチド単量体はリン酸ジエステル結合を介して連結できるが、核酸の合成形態は他の結合を含むこともできる(例えば、ニールセン等、Science 254:1497-1500, 1991に記載のペプチド核酸)。核酸は、例えば、染色体若しくは染色体部分、ベクター(例えば、発現ベクター)、発現カセット、裸のDNA又はRNA重合体、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーであるか、これらを含んでもよい。核酸は、例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であってよく、特定の長さには限定されない。特に断らない限り、特定の核酸配列は明示された全ての配列に加えて相補配列を含む、又はそれらをコードする。
特定の態様では、蛍光性非共有結合二本鎖DNA結合色素の光の波長及びドナー発色団又はアクセプター発色団の光の波長は互いに分離され、それらの融解温度とは無関係に両方の融解事象の検出が可能となる。このことによる利点は、蛍光性非共有結合二本鎖DNA結合色素の発光波長及びドナー発色団又はアクセプター発色団の発光波長を、標的核酸及び二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度が同一又は少なくとも非常に近い場合でも識別できるということである。
配列番号01 5’-Cy5-TGG GGG TGG GGG TGG GGG TGG GGG T-P-3’
配列番号02 5’-ACC ACC CCC CCC ACC ACC CCC CCC A-BHQ-3-3’
既に述べたように、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度の値の少なくとも一部が、増幅された特定の標的核酸の融解温度値の少なくとも一部と同じになるように、二本鎖オリゴヌクレオチド(較正物質)を設計するのが有利である。従って、較正物質は、増幅されて分析される標的核酸に依存する任意の配列を含むことができる。配列番号01及び配列番号02は、本実施例1〜3の較正物質として適しているとわかっている1つの可能性と考えなければならない。
特定の態様では、蛍光性非共有結合二本鎖DNA結合色素は、LightCycler(登録商標)480 Resolight Dyeである。一態様では、ドナー発色団はCy5である。一態様では、アクセプター色素は消光剤分子である。特定の態様では、消光剤分子は、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、及びBHQ-4からなる群から選択される暗消光剤である。より特定の態様では、消光剤分子はBHQ-3である。
一態様で、ドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第1鎖内の位置で共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第2鎖内の位置で共有結合して、第1鎖内の位置と第2鎖内の位置が互いに近接している。特定の態様では、第1鎖内の位置と第2鎖内の位置は、二本鎖オリゴヌクレオチドの互いに反対の位置にある。
特定の態様では、蛍光性非共有結合二本鎖DNA結合色素は、LightCycler(登録商標)480 Resolight Dyeである。一態様では、ドナー発色団はCy5である。一態様では、アクセプター色素は消光剤分子である。特定の態様では、消光剤分子は、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、及びBHQ-4からなる群から選択される暗消光剤である。より特定の態様では、消光剤分子はBHQ-3である。
特定の態様では、蛍光性非共有結合二本鎖DNA結合色素は、LightCycler(登録商標)480 Resolight Dyeである。一態様では、ドナー発色団はCy5である。一態様では、アクセプター色素は消光剤分子である。特定の態様では、消光剤分子は、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、及びBHQ-4からなる群から選択される暗消光剤である。より特定の態様では、消光剤分子はBHQ-3である。
a)位置間の温度差は分析する標的の温度に依存するので、較正物質のTmは典型的な標的核酸のTmと同程度である必要がある。
b)標的の増幅効率を阻害しない。これは較正物質の存在によって全く影響を受けないPCR解析から客観的な結果を得るために重要である。
c)標的核酸及び較正物質の融解曲線形状の干渉を低減させるために蛍光性非共有結合DNA結合色素と較正物質との発光波長の重なりを最小にする。
d)較正物質のTmの信頼できる読み出し値を得るのに十分な融解信号強度を発生する。
較正物質の設計
較正物質は、2つの25量体の相補鎖で構成されている。一方の鎖の5’末端は蛍光色素Cy5で標識され、3’末端はリン酸化されている。他方の鎖の3’末端は暗消光剤BHQ-3(Biosearch Technologies社)で標識されている。
配列番号01 5’-Cy5-TGG GGG TGG GGG TGG GGG TGG GGG T-P-3’
配列番号02 5’-ACC ACC CCC CCC ACC ACC CCC CCC A-BHQ-3-3’
以下に示す実験は、各々、本明細書の較正物質を使用する場合と使用しない場合の両方で行われる。
実施例2
熱較正されていないPCRブロックでの較正物質使用による温度分解能の改善
2つの一塩基多型(SNP)領域を2ngヒトのゲノムDNA(異なるヒト血液試料から精製)から増幅した。
ADD1遺伝子領域を、以下のプライマー配列を用いて増幅した。
配列番号03 5’-GAT GGC TGA ACT CTG GC-3’
配列番号04 5’-CGA CTT GGG ACT GCT TC-3’
Cyp2C9遺伝子領域を、以下のプライマー配列を用いて増幅した。
配列番号05 5’-CGT TTC TCC CTC ATG ACG-3’
配列番号06 5’-TCA GTG ATA TGG AGT AGG GTC-3’
以下のPCR及び融解の手順をLightCycler(登録商標)96リアルタイムPCR機器(Roche Applied Science社の試作装置)を用いて実施した。
実施例3
事前に熱較正したPCRブロックで較正物質の使用により改良された温度分解能
1つの一塩基多型(SNP)領域を88の異なるヒトのゲノムDNA(異なるヒト血液試料から精製)から増幅した。
TNFα遺伝子領域を、以下のプライマー配列を用いて増幅した。
配列番号07 5’-GGG CTA TGG AAG TCG AGT A-3’
配列番号08 5’-CGT CCC CTG TAT CCA TAC C-3’
以下のPCR及び融解の手順をLightCycler(登録商標)96リアルタイムPCR機器(Roche Applied Science社の試作装置)を用いて実施した。
Claims (13)
- PCR実験における温度較正方法であって、下記工程を含む前記方法:
a)マルチウェルプレートの各ウェルに、非共有結合で二本鎖DNAに結合する蛍光性結合色素を含む試料中の特定の標的核酸を増幅するための反応混合物を供給する工程、
b)ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第1鎖に共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第2鎖に共有結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを各ウェルに供給する工程、
c)特定の標的核酸を各ウェルで増幅させる工程、
d)増幅された特定の標的核酸を各ウェルで融解し、非共有結合で二本鎖DNAに結合する蛍光性結合色素からの光の放出を減少させ、二本鎖オリゴヌクレオチドを各ウェルで融解し、ドナー発色団とアクセプター発色団とを空間的に分離することによって、ドナー発色団からの光の放出を増加させ、又はアクセプター発色団からの光の放出を減少させる工程、
e)非共有結合で二本鎖DNAに結合する蛍光性結合色素からの光の放出の減少を検出することによって増幅された特定の標的核酸の融解温度値を各ウェルで監視し、ドナー発色団からの光の放出の増加又はアクセプター発色団からの光の放出の減少を検出することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値を各ウェルで別々に監視する工程、及び、
f)二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度値のウェル間差に基づいて、増幅された特定の標的核酸に対する融解温度値を各ウェルで補正する工程。 - 特定の標的核酸が一塩基多型を含む、請求項1の方法。
- ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第1鎖内のヌクレオチドに共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第2鎖内のヌクレオチドに共有結合し、第1鎖内のヌクレオチド及び第2鎖内のヌクレオチドが相補的な塩基対を形成する、請求項1又は2の方法。
- ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第1鎖の5’末端に共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第2鎖の3’末端に共有結合しているか、又はドナー発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第1鎖の3’末端に共有結合し、アクセプター発色団は二本鎖オリゴヌクレオチドの第2鎖の5’末端に共有結合している、請求項3の方法。
- 非共有結合で二本鎖DNAに結合する蛍光性結合色素の光の波長及びドナー発色団の光の波長が互いに分離されている、請求項1〜4の方法。
- 非共有結合で二本鎖DNAに結合する蛍光性結合色素が、LightCycler(登録商標)480 Resolight Dyeである、請求項1〜5の方法。
- ドナー発色団がCy5である、請求項1〜6の方法。
- アクセプター発色団が消光剤分子である、請求項1〜7の方法。
- 消光剤分子は、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、及びBHQ-4からなる群から選択される暗消光剤である、請求項8の方法。
- 二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度と増幅された特定の標的核酸の融解温度との差が5℃以下であるように設計される、請求項1〜9の方法。
- 二本鎖オリゴヌクレオチドが、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度と増幅された特定の標的核酸の融解温度が同一であるように設計される、請求項1〜9の方法。
- 請求項1〜11のPCR実験における温度較正を行うためのキットであって、下記を含む前記キット:
a)試料中の特定の標的核酸を増幅するために必要な全ての試薬、
b)非共有結合で二本鎖DNAに結合する蛍光性結合色素、及び、
c)ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第1鎖に共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第2鎖に共有結合する二本鎖オリゴヌクレオチド。 - 請求項1〜11のPCR実験における温度較正を行うための反応混合物であって、下記を含む前記反応混合物:
a)標的核酸、
b)特定の標的核酸を増幅するために必要な全ての試薬、
c)非共有結合で二本鎖DNAに結合する蛍光性結合色素、及び、
d)ドナー発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第1鎖に共有結合し、アクセプター発色団が二本鎖オリゴヌクレオチドの第2鎖に共有結合する二本鎖オリゴヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13150790.7 | 2013-01-10 | ||
EP13150790 | 2013-01-10 | ||
PCT/EP2014/050243 WO2014108446A1 (en) | 2013-01-10 | 2014-01-08 | Improved calibration of high resolution melting |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016504041A JP2016504041A (ja) | 2016-02-12 |
JP2016504041A5 JP2016504041A5 (ja) | 2016-09-23 |
JP6389473B2 true JP6389473B2 (ja) | 2018-09-12 |
Family
ID=47561350
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015552042A Expired - Fee Related JP6389473B2 (ja) | 2013-01-10 | 2014-01-08 | 高解像能融解の較正の改善 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20150315634A1 (ja) |
EP (1) | EP2943587A1 (ja) |
JP (1) | JP6389473B2 (ja) |
CN (1) | CN104838017B (ja) |
CA (1) | CA2896616C (ja) |
WO (1) | WO2014108446A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2654571C2 (ru) * | 2016-02-25 | 2018-05-21 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" (ООО "НПФ ДНК-Технология") | Способ оптической и температурной валидации приборов для ПЦР-исследований в режиме реального времени |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
EP0232967B1 (en) * | 1986-01-10 | 1993-04-28 | Amoco Corporation | Competitive homogeneous assay |
US5935791A (en) * | 1997-09-23 | 1999-08-10 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acids by fluorescence quenching |
US20040022764A1 (en) * | 2002-07-31 | 2004-02-05 | Hanan Polansky | Inhibition of microcompetition with a foreign polynucleotide as treatment of chronic disease |
ES2438967T3 (es) | 2002-10-23 | 2014-01-21 | University Of Utah Research Foundation | Análisis de fusión de amplicones con colorantes de saturación |
US7785786B2 (en) * | 2006-01-23 | 2010-08-31 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods for detecting nucleic acids using multiple signals |
FR2906532B1 (fr) * | 2006-09-28 | 2008-12-12 | Biomerieux Sa | Nouvel oligonucleotide marque |
EP2336358A1 (en) * | 2008-05-06 | 2011-06-22 | QIAGEN GmbH | Simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction |
US9542526B2 (en) * | 2009-03-10 | 2017-01-10 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method and system for temperature correction in thermal melt analysis |
CA2836907C (en) * | 2011-06-06 | 2020-07-21 | Waters Technologies Corporation | Compositions, methods, and kits for quantifying target analytes in a sample |
US20130157376A1 (en) * | 2011-12-20 | 2013-06-20 | Idaho Technology, Inc. | Thermal Cycler Calibration Device and Related Methods |
EP2722399A1 (en) * | 2012-10-18 | 2014-04-23 | Roche Diagniostics GmbH | Method for preventing high molecular weight products during amplification |
-
2014
- 2014-01-08 JP JP2015552042A patent/JP6389473B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-01-08 CA CA2896616A patent/CA2896616C/en not_active Expired - Fee Related
- 2014-01-08 EP EP14700170.5A patent/EP2943587A1/en not_active Withdrawn
- 2014-01-08 WO PCT/EP2014/050243 patent/WO2014108446A1/en active Application Filing
- 2014-01-08 CN CN201480003348.4A patent/CN104838017B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-07-06 US US14/792,224 patent/US20150315634A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20150315634A1 (en) | 2015-11-05 |
CA2896616C (en) | 2018-03-13 |
CN104838017B (zh) | 2017-07-21 |
CN104838017A (zh) | 2015-08-12 |
WO2014108446A1 (en) | 2014-07-17 |
JP2016504041A (ja) | 2016-02-12 |
EP2943587A1 (en) | 2015-11-18 |
CA2896616A1 (en) | 2014-07-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9909179B2 (en) | Single-cell nucleic acid analysis | |
US9938570B2 (en) | Methods and compositions for universal detection of nucleic acids | |
KR102246600B1 (ko) | 핵산 검정에서 개선된 용융 판별 및 멀티플렉싱을 위한 프로브 | |
US6506568B2 (en) | Method of analyzing single nucleotide polymorphisms using melting curve and restriction endonuclease digestion | |
AU2012374566B2 (en) | Polymerase chain reaction detection system using oligonucleotides comprising a phosphorothioate group | |
KR102295290B1 (ko) | Dna 증폭 기술 | |
JP4190562B2 (ja) | 遺伝子配列検査法 | |
EP3055430B1 (en) | Method for the detection of target nucleic acid sequences | |
WO2002040126A2 (en) | Methods for identifying nucleotides at defined positions in target nucleic acids using fluorescence polarization | |
JP4297966B2 (ja) | 標識ヌクレオチドを利用することによる核酸の新規測定方法 | |
WO2013093432A1 (en) | Method for enriching and detection of variant target nucleic acids | |
US8758997B2 (en) | Method for detecting polymorphism at nucleotide position-1639 of VKORC1 gene, and nucleic acid probe and kit therefor | |
CN105705657B (zh) | 基于利用杂交-捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸分析的在固相中的靶核酸序列检测 | |
JP6389473B2 (ja) | 高解像能融解の較正の改善 | |
CN114958986A (zh) | 一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用 | |
JP2005328758A (ja) | 核酸増幅方法及びこれを利用した一塩基多型の解析 | |
US20040038256A1 (en) | Methods for identifying nucleotides at defined positions in target nucleic acids using fluorescence polarization | |
US20210180115A1 (en) | Multiple analysis method for amplicon by using fluorescence-based multiple melting analysis | |
TW201723189A (zh) | 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法 | |
JP2004049231A (ja) | 標識ヌクレオチドを利用することによる核酸の新規測定方法 | |
JP2017163889A (ja) | K−ras遺伝子増幅用フォワードプライマーセット、K−ras遺伝子増幅用キット、K−ras遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法 | |
JP2009159854A (ja) | ハプロタイプの検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160804 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160804 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20170614 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170712 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170905 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180207 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180306 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180720 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180817 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6389473 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |