JP4481656B2 - 3’→5’エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含むfet標識オリゴヌクレオチドを使用する方法およびそれを実施するための組成物 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明の技術分野は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、および、特に高忠実度(high fidelity)リアルタイムPCRである。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、標的核酸配列を迅速かつ指数関数的に増幅する強力な方法である。PCRによって、PCR増幅DNAの直接的な配列決定、対立遺伝子の変化の決定、ならびに感染症および遺伝病疾患の検出を含む、遺伝子の特徴付けおよび分子クローニング技術の開発が容易になった。PCRは、標的配列を含むDNA鋳型の熱変性、対応するプライマーと相補DNA鎖のアニーリング、およびDNAポリメラーゼによるアニールしたプライマーの伸長からなるサイクルを繰り返すことによって行われる。PCRサイクルを繰り返すことによって、隣接する増幅プライマーによって区切られたヌクレオチド配列が指数関数的に増幅される。
関心対象の米国特許として米国特許第5,538,848号および同第6,248,526号が挙げられる。国際公開公報第01/86001号および同第01/42505号もまた関心対象である。
反応混合物におけるプライマー伸長産物を検出するための方法および組成物が提供される。本方法のある特定の態様では、プライマー伸長反応は、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、および3'→5'エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含む少なくとも1つのFET標識オリゴヌクレオチドプローブの存在下で行われる。ある特定の態様では、核酸インターカレーター(nucleic acid intercalator)がFET標識オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合している。ある特定の態様では、副溝結合剤が反応に用いられる。これらの最後の2つの態様では、ポリメラーゼは3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を含んでもよいし、含まなくてもよい。本方法を実施するためのシステムおよびキットも提供される。本発明は多種多様な用途に用いられ、SNP検出用途、対立遺伝子変化の検出用途などを含む、高忠実度PCRに基づいた反応における使用に特に適している。
本明細書で使用する「核酸」は、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNA、およびそれらの任意の化学修飾を意味する。修飾として、さらなる電荷、分極率、水素結合、静電的相互作用、および官能性を核酸に組み込む他の化学基をもたらす修飾が挙げられるが、これに限定されない。このような修飾として、2'位糖修飾、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、環外アミンでの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモまたは5-ヨード-ウラシルの置換、バックボーン修飾、メチル化、稀な塩基対の組み合わせ(例えば、イソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジン)などが挙げられるが、これに限定されない。修飾として、キャッピングなどの3'および5'での修飾も挙げることができる。
反応混合物におけるプライマー伸長産物を検出するための方法および組成物が提供される。本方法のある特定の態様では、プライマー伸長反応は、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、および3'→5'エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含む少なくとも1つのFET標識オリゴヌクレオチドプローブの存在下で行われる。ある特定の態様では、核酸インターカレーターがFET標識オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合している。ある特定の態様では、副溝結合剤が反応に用いられる。これらの最後の2つの態様では、使用されるポリメラーゼは3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有してもよいし、有さなくてもよい。本方法を実施するためのシステムおよびキットも提供される。本発明は多種多様な用途に用いられ、SNP検出用途、対立遺伝子の変化検出用途などを含む、高忠実度PCRに基づいた反応における使用に特に適している。
上記をまとめると、本発明は、プライマー伸長反応混合物におけるプライマー伸長産物の生成を検出する方法を提供する。言い換えると、本発明は、プライマー伸長反応においてプライマー伸長産物が生成されたかどうかを判定する方法を提供する。プライマー伸長産物は、鋳型依存性プライマー伸長反応によって生じた核酸分子を意味する。鋳型依存性プライマー伸長反応は、鋳型核酸分子にハイブリダイズした核酸プライマー分子をポリメラーゼが伸長する反応を意味する。この場合、プライマー核酸分子の末端に付加される塩基配列は鋳型鎖の塩基配列によって決まる。鋳型依存性プライマー伸長反応は、増幅プライマー伸長反応および非増幅プライマー伸長反応の両方を含む。本発明の多くの態様では、プライマー伸長産物の生成が検出される鋳型依存性プライマー伸長反応は増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR))である。
これらの態様の本方法の実施において、第1の段階は、「高忠実度」プライマー伸長混合物(例えば、高忠実度プライマー伸長反応が生じるのに必要な全ての要素を含む組成物)を生成することである。ここで、プライマー伸長混合物は、3'→5'エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含む少なくとも1つのFET標識オリゴヌクレオチドをさらに含む。
(式中、
R0、R1、R2、R3、R4、R5は独立して、-H、ハロゲン、-O(CH2)nCH3、-(CH2)nCH3、- NO2、SO3、-N[(CH2)nCH3]2 (n=0〜5)、または-CNであり;
R6は、-Hまたは-(CH2)nCH3 (n=0〜5)であり;かつ
vは、0〜10の数字である)
前記のように、例えば、DNAインターカレーターおよび/または副溝結合剤が存在するようなある特定の態様では、反応混合物は高忠実度反応混合物である必要はない。これらの態様では、反応混合物は前記のように調製されるが、反応混合物には3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ(例えば、前記で概説されたファミリーBポリメラーゼ)は含まれない。
反応混合物の調製後、反応混合物をプライマー伸長反応条件(すなわち、鋳型として鋳型鎖を用いた、プライマー分子末端へのヌクレオチドの付加によるポリメラーゼを介したプライマー伸長が可能な条件)に供した。多くの態様において、プライマー伸長反応条件は増幅条件である。この条件は複数の反応サイクルを含み、それぞれの反応サイクルは、(1)変性段階、(2)アニーリング段階、および(3)重合段階を含む。反応サイクルの回数は、実施される用途に応じて異なるが、通常は少なくとも15回、およびより通常は少なくとも20回であり、60回またはそれ以上の回数でもよい。ここで、異なるサイクルの回数は一般的に約20〜40の範囲である。約25回を超えるサイクル、通常は約30回を超えるサイクルが行われる方法の場合、酵素的プライマー伸長に適した条件が維持されるように、反応混合物に追加のポリメラーゼを投入する方が都合がよいまたは望ましい場合がある。
本方法の次の段階は、アッセイ結果を得るためのシグナル検出、すなわち、反応混合物に存在するFET標識オリゴヌクレオチドプローブからの蛍光シグナルの変化の検出である。言い換えると、本方法の次の段階は、反応混合物に存在するFET標識オリゴヌクレオチドによって生じる蛍光シグナルの任意の変化を検出することである。変化は、使用される標識の性質に応じて蛍光の増加または減少でもよいが、多くの態様において蛍光の増加である。試料は、任意の便利な手段、例えば、耐熱性キュベットまたはプレートリーダーフルオリメーターなどの適切なフルオリメーターを用い蛍光の増加についてスクリーニングすることができる。蛍光は公知のフルオリメーターを用いて適切にモニタリングされる。これらの装置からのシグナル、例えば光電子増倍管電圧の形のシグナルはデータ処理基板に送られ、それぞれの試料チューブに関連したスペクトルに変換される。複数のチューブ(例えば、96個のチューブ)を同時に評価することができる。データは、反応全体を通してこのように頻繁に(例えば、10ミリ秒毎に1回)集めることができる。それぞれのサイクルの間に試料からの反応性分子の蛍光をモニタリングすることによって、様々な方法で増幅反応の進行をモニタリングすることができる。例えば融解ピークによって得られるデータは、例えば融解ピーク下の面積を計算し、このデータをサイクルの回数に対してプロットすることで分析が可能である。
前記のように得られたデータは様々な方法で解釈することができる。その最も簡単な形において、増幅反応中のまたは増幅反応の終わりでの試料からの蛍光の増加または減少は存在する標的配列量の増加(すなわち、存在するプライマー伸長産物の増加)を表し、これは、増幅反応が進行し、従って、標的配列が試料中に実際に存在したことを示唆している。増幅プロセスを通じて増幅反応をモニタリングすることにより、定量も可能である。
前記の本方法は多種多様な用途に用いられる。一般的に、本発明のオリゴヌクレオチドプローブおよびそれを使用する方法は、FETプローブおよび校正ポリメラーゼが用いられる任意の高忠実度プライマー伸長反応に用いられる。
本方法を実施するためのキットも提供される。本発明によるキットは、少なくとも、(a)FET標識オリゴヌクレオチド(ここで、キットは、例えば、異なる標的核酸(例えば、2つ以上の異なるSNP)にハイブリダイズする2つ以上の識別可能なFET標識オリゴヌクレオチドを含んでもよい)、および(b)高忠実度増幅(例えば、PCR反応)において提供されるFET標識オリゴヌクレオチドを使用するための説明書を含む。
本方法の実施において使用するためのシステムも提供される。本システムは、1つまたは複数のFET標識オリゴヌクレオチドおよび校正活性、ならびに上記のようなプライマー伸長反応混合物を調製するために必要な他の任意の成分を少なくとも含む。さらに、本システムは、本方法を実施するために必要とされる任意の装置(例えば、サーマルサイクラー、フルオリメーターなど)を含んでもよい。
A.概要
以下の実施例のために、表1に示すオリゴヌクレオチドを使用した。6-カルボキシ-フルオレセイン(6-FAM)ホスホラミダイト、5'-テトラクロロ-フルオレセイン(TET)ホスホラミダイト、および6-カルボキシテトラメチル-ローダミン(TAMRA)CPG、3'-Dabcyl CPGを含む標準的なDNAホスホラミダイトを、Glen Researchから入手した。Black Hole Quencher(BHQ1、BHQ2、BHQ3)CPGをBiosearch Technologyから入手した。Eclipseダーククエンチャー(eDQ)CPGをEpoch Bioscienceから入手した。全てのプライマーを、オリゴ(Oligo)精製カートリッジ(Biosearch Technology)を用いて精製した。二重標識FETプローブを、表1に示した様々なクエンチャーを有するCPG、および5'末端に6'FAM標識またはTET標識ホスホラミダイトを有するCPGを用いて合成した。二重標識FETプローブを、標準的なプロトコールを用いて調製用HPLCおよびPAGEによって精製した。ホスホロチオエート修飾を標準的な手順によって調製した。
リアルタイム増幅および検出を、20mMのTris-HCl(pH8.3)、60mMのKCl、5.3mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのdCTP、0.5μMの各プライマー、0.2μMのFETプローブ、ジャーカットcDNAの4倍連続希釈液、0.6単位のTaqポリメラーゼ(フィッシャー(Fisher))または5:1の単位比のTaqおよびPwo DNAポリメラーゼ混合物(ロシュモレキュラーバイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals))を含む30μlの反応物を用いて、ABI PRISM 7700(Applied Biosystems)において行った。
リアルタイム増幅および検出を、20mMのTris-HCl(pH8.3)、60mMのKCl、5.3mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのdCTP、0.5uMの各プライマー、0.2μMのFETプローブ、ヒトbcl-2遺伝子またはジャーカットcDNAのcDNAクローンの様々なコピー、0.6単位のTaq DNAポリメラーゼ(Fisher Scientific)、または10:1の単位比のTaqおよびPwo DNAポリメラーゼ混合物(Roche Molecular Biochemicals)を含む30μlの反応物を用いて、ABI PRISM 7700において行った。
PCR増幅を、10mMのTris-HCl(pH8.85)、25mMのKCl、5mMの(NH4)2SO4、5mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのdCTP、0.5μMの各プライマー、0.2μMの各プライマー(ABCG-R1およびABCG-P1またはABCG-P2)、100万コピーの鋳型(ABCG-T1)(または非鋳型対照(NTC)ではTE緩衝液のみ)、0.6単位のPwo DNAポリメラーゼ(Roche Molecular Biochemicals)を含む30μlの反応物を用いて、ABI PRISM 7700において行った。熱プロフィールは、95℃10秒;95℃15秒、60℃60秒を40サイクルであった。
表1に示したプライマーMTHFR-F1およびMTHFR-R1を用いて、ヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MTHFR)遺伝子の89塩基対セグメントを増幅した。リアルタイム増幅および検出を、20mMのTris-HCl(pH8.3)、60mMのKCl、5.3mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのdCTP、0.1uMのプライマーMTHFR-F1および1μMのプライマーMTHFR-R1、0.2μMの各FETプローブMTHFR-P1およびMTHFR-P2、表4に示した様々な数のMTHFR野生型または変異体またはその両方を含む鋳型、5:1の単位比のTaqおよびPwo DNAポリメラーゼ混合物(Roche Molecular Biochemicals)を含む30μlの反応物を用いて、ABI PRISM 7700において行った。熱プロフィールは、95℃15秒; 95℃15秒、55℃40秒、70℃40秒を50サイクルであった。増幅後、各ウェルの蛍光強度をPCR後測定によって測定し、ABI PRISM 7700の対立遺伝子識別ソフトウェアによって分析した。結果を表4にまとめた。
以下の実施例では、表5に示すオリゴヌクレオチドを使用した。標準的なDNAホスホラミダイト(6-カルボキシ-フルオレセイン(6-FAM)ホスホラミダイト、5'-テトラクロロ-フルオレセイン(TET)ホスホラミダイト、アクリジン(ACR)ホスホラミダイト、および6-カルボキシテトラメチル-ローダミン(TAMRA)CPG、3'-Dabcyl CPGを含む)をGlen Researchから入手した。Black Hole Quencher(BHQ1)CPGをBiosearch Technologyから入手した。Eclipseダーククエンチャー(eDQ)CPGをEpoch Bioscienceから入手した。全てのプライマーを、オリゴ精製カートリッジ(Biosearch Technology)を用いて精製した。二重標識FETプローブを、表5に示した様々なクエンチャーを有するCPG、および5'末端に6'FAM標識またはTET標識したホスホラミダイトを有するCPGを用いて合成した。二重標識FETプローブを、標準的なプロトコールを用いて調製用HPLCおよびPAGEによって精製した。ホスホロチオエート修飾を標準的な手順によって調製した。副溝結合剤ネトロプシンおよびジスタマイシンAをSigmaから購入した。
表1に示したプライマーMTHFR-F1およびMTHFR-R1を用いて、ヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MTHFR)遺伝子の89塩基対セグメントを増幅した。リアルタイム増幅および検出を、20mMのTris-HCl(pH8.3)、60mMのKCl、5.3mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのdCTP、0.15uMの参照色素ROX、それぞれ0.5uMのプライマーMTHFR-F1およびMTHFR-R1、0.2μMの各FETプローブ、表6に示した様々な数のMTHFR野生型または変異型またはその両方を含む鋳型、5:1の単位比のTaqおよびPwo DNAポリメラーゼ混合物(Roche Molecular Biochemicals)を含む30μlの反応物を用いて、ABI PRISM 7700において行った。5種類のFETプローブ(表5に示したMTHFR-P1、MTHFR-P2、MTHFR-P3、MTHFR-P13、およびMTHFR-P14)をリアルタイム増幅において試験した。熱プロフィールは、95℃15秒;95℃15秒、57℃40秒、70℃40秒を50サイクルであった。
表1に示したプライマーMTHFR-F1およびMTHFR-R1を用いて、ヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MTHFR)遺伝子の89塩基対セグメントを増幅した。リアルタイム増幅および検出を、20mMのTris-HCl(pH8.3)、60mMのKCl、5.3mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのdCTP、0.15uMの参照色素ROX、それぞれ0.5uMのプライマーMTHFR-F1およびMTHFR-R1、FETプローブ、表7に示した様々な数のMTHFR野生型または変異型またはその両方を含むプラスまたはマイナス鋳型、5:1の単位比のTaqおよびPwo DNAポリメラーゼ混合物(Roche Molecular Biochemicals)を含む30μlの反応物を用いて、ABI PRISM 7700において行った。この試験では、表7に示したそれぞれ0.2μMの通常のFETプローブまたは3'ACR標識FETプローブを、0.4μMの遊離ネトロプシンまたはジスタマイシンAを加えてまたは差し引いて、対立遺伝子識別のために使用した。熱プロフィールは、95℃15秒;95℃15秒、63℃40秒、70℃40秒を50サイクル、または95℃15秒;95℃15秒、57℃40秒、70℃40秒を50サイクルであった。
Claims (43)
- 以下の段階を含む、プライマー伸長反応混合物におけるプライマー伸長産物の生成を検出する方法:
(a)3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、副溝結合剤、並びにFET標識オリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長混合物を生成する段階であって、該FET標識オリゴヌクレオチドは(i)ドナードメイン、(ii)アクセプタードメイン、および(iii)標的結合配列を含み、該アクセプタードメインはダーククエンチャーを含む3'→5'エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含み、該ドナードメインはフルオロフォアを含むフルオロフォアドメインを含み、さらに該FET標識オリゴヌクレオチドがフルオロフォアおよびダーククエンチャーに連結した一本鎖結合配列を含む核酸検出体分子であり、該ダーククエンチャーは該FET標識オリゴヌクレオチドの3’末端に位置する、段階;
(b)該プライマー伸長混合物をプライマー伸長反応条件に供する段階;
(c)該FET標識オリゴヌクレオチドプローブからの蛍光シグナルの変化を検出して、アッセイ結果を得る段階;ならびに
(d)アッセイ結果を使用して、該混合物にプライマー伸長産物が存在するかどうかを判定する段階。 - プライマー伸長反応がPCR増幅反応である、請求項1記載の方法。
- リアルタイムでPCR増幅反応をモニタリングする方法である、請求項2記載の方法。
- FET標識オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズしていない場合、フルオロフォアの励起時にFET標識オリゴヌクレオチドプローブのフルオロフォアとダーククエンチャーとの間でエネルギー転移が起こる、請求項1記載の方法。
- FET標識オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸にハイブリダイズしている場合、フルオロフォアの励起時にFET標識オリゴヌクレオチドプローブのフルオロフォアとダーククエンチャーとの間でエネルギー転移が起こらない、請求項1記載の方法。
- PCR増幅反応をモニタリングする5'ヌクレアーゼ法である、請求項3記載の方法。
- FET標識オリゴヌクレオチドプローブが5'ヌクレアーゼによって切断された場合、フルオロフォアの励起時にFET標識オリゴヌクレオチドプローブのフルオロフォアとダーククエンチャーとの間でエネルギー転移が起こらない、請求項6記載の方法。
- プライマー伸長混合物がさらに核酸インターカレーターを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の段階を含む、PCR増幅反応をモニタリングする方法:
(a)(i)鋳型核酸;
(ii)フォワード核酸プライマーおよびリバース核酸プライマー;
(iii)デオキシリボヌクレオチド;
(iv)3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ;
(v)(1)アクセプタードメイン、(2)ドナードメイン、および(3)標的核酸結合ドメインを含む、FET標識オリゴヌクレオチドであって、該アクセプタードメインはダーククエンチャーを含む3'→5'エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含み、該ドナードメインはフルオロフォアを含むフルオロフォアドメインを含み、さらに該FET標識オリゴヌクレオチドがフルオロフォアおよびダーククエンチャーに連結した一本鎖結合配列を含む核酸検出体分子であり、該ダーククエンチャーは該FET標識オリゴヌクレオチドの3’末端に位置するFET標識オリゴヌクレオチド、ならびに
(iv)副溝結合剤
を組み合わせることによって、PCR増幅反応混合物を調製する段階であり、
ここで、FET標識オリゴヌクレオチドがPCR反応の核酸産物にハイブリダイズしている場合、フルオロフォアの励起時に該フルオロフォアと該クエンチャーとの間で蛍光エネルギー転移が起こらない段階;
(b)PCR増幅反応混合物をPCR増幅条件に供する段階;
(c)FET標識オリゴヌクレオチドプローブからの蛍光シグナルについて該反応混合物をモニタリングして、アッセイ結果を得る段階;ならびに
(d)アッセイ結果を使用して、該PCR増幅反応をモニタリングする段階。 - リアルタイムでPCR増幅反応をモニタリングする方法である、請求項9記載の方法。
- FET標識オリゴヌクレオチドが、スコーピオンプローブ、サンライズプローブ、分子ビーコン、および構造的補助プローブからなる群より選択されるプローブである、請求項9記載の方法。
- FET標識オリゴヌクレオチドが核酸産物にハイブリダイズしていない場合、フルオロフォアの励起時にFET標識オリゴヌクレオチドのフルオロフォアとクエンチャーとの間で蛍光エネルギー転移が起こる、請求項9記載の方法。
- ダーククエンチャーの最大吸光度が約400〜約700nmである、請求項9記載の方法。
- ダーククエンチャーの最大吸光度が約500〜約600nmである、請求項13記載の方法。
- ダーククエンチャーが置換4-(フェニルジアゼニル)フェニルアミン構造を含む、請求項14記載の方法。
- ダーククエンチャーが、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、およびその組み合わせより選択される少なくとも2つの残基を含む構造を有し、該残基の少なくとも2つが環外ジアゾ結合を介して共有結合的に結合している、請求項15記載の方法。
- 反応混合物がさらに核酸インターカレーターを含む、請求項9〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の段階を含む、PCR増幅反応をモニタリングする方法:
(a)(i)鋳型核酸;
(ii)フォワード核酸プライマーおよびリバース核酸プライマー;
(iii)デオキシリボヌクレオチド;
(iv)3'→5'エキソヌクレアーゼ活性および5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ;
(v)(1)アクセプタードメイン、(2)ドナードメイン、および(3)標的核酸結合ドメインを含む、FET標識オリゴヌクレオチドであって、該アクセプタードメインはダーククエンチャーを含む3'→5'エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含み、該ドナードメインはフルオロフォアを含むフルオロフォアドメインを含み、さらに該FET標識オリゴヌクレオチドがフルオロフォアおよびダーククエンチャーに連結した一本鎖結合配列を含む核酸検出体分子であり、該ダーククエンチャーは該FET標識オリゴヌクレオチドの3’末端に位置するFET標識オリゴヌクレオチド、ならびに
(iv)副溝結合剤
を組み合わせることによってPCR増幅反応混合物を調製する段階であり、
ここで、FET標識オリゴヌクレオチドが鋳型核酸にハイブリダイズしていない場合、フルオロフォアの励起時に該フルオロフォアと該クエンチャーとの間で蛍光エネルギー転移が起こる段階;
(b)PCR増幅反応混合物をPCR増幅条件に供する段階;
(c)FET標識オリゴヌクレオチドプローブからの蛍光シグナルについて該反応混合物をモニタリングして、アッセイ結果を得る段階;ならびに
(d)アッセイ結果を使用して、該PCR増幅反応をモニタリングする段階。 - リアルタイムでPCR増幅反応をモニタリングする方法である、請求項19記載の方法。
- FET標識オリゴヌクレオチドが核酸産物にハイブリダイズしている場合、フルオロフォアの励起時にFET標識オリゴヌクレオチドのフルオロフォアとクエンチャーとの間で蛍光エネルギー転移が起こらない、請求項19記載の方法。
- FET標識オリゴヌクレオチドが5'ヌクレアーゼによって切断された場合、フルオロフォアの励起時にFET標識オリゴヌクレオチドのフルオロフォアとクエンチャーとの間で蛍光エネルギー転移が起こらない、請求項19記載の方法。
- ダーククエンチャーが置換4-(フェニルジアゼニル)フェニルアミン構造を含む、請求項19記載の方法。
- ダーククエンチャーが、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、およびその組み合わせより選択される少なくとも2つの残基を含む構造を有し、該残基の少なくとも2つが環外ジアゾ結合を介して共有結合的に結合している、請求項23記載の方法。
- 反応混合物がさらに核酸インターカレーターを含む、請求項19〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の段階を含む、互いにヌクレオチドが1つ異なる第1の核酸および第2の核酸の存在について核酸試料をスクリーニングする方法:
(a)(i)核酸試料;
(ii)3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ;
(iii)第1および第2の核酸にそれぞれ相補的な第1および第2のFET標識オリゴヌクレオチドプローブ;ならびに
(iv)副溝結合剤
を含むプライマー伸長混合物を生成する段階であり、ここで、第1のおよび第2のFET標識オリゴヌクレオチドがそれぞれ(1)ドナードメイン、(2)アクセプタードメイン、および(3)標的核酸結合ドメインを含むFET標識オリゴヌクレオチドであって、該アクセプタードメインはダーククエンチャーを含む3'→5'エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含み、該ドナードメインはフルオロフォアを含むフルオロフォアドメインを含み、さらに該FET標識オリゴヌクレオチドがフルオロフォアおよびダーククエンチャーに連結した一本鎖結合配列を含む核酸検出体分子であり、該ダーククエンチャーは該FET標識オリゴヌクレオチドの3’末端に位置するFET標識オリゴヌクレオチドである段階;
(b)該プライマー伸長混合物をプライマー伸長反応条件に供する段階;
(c)第1および第2のFET標識オリゴヌクレオチドプローブからの蛍光シグナルに変化があれば、その変化を検出してアッセイ結果を得る段階;ならびに
(d)アッセイ結果を使用して、該試料中に該第1の核酸および該第2の核酸が存在するか、存在しないかを判定する段階。 - FET標識オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズしていない場合、フルオロフォアの励起時にFET標識オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれのフルオロフォアとダーククエンチャーとの間でエネルギー転移が起こる、請求項27記載の方法。
- FET標識オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸にハイブリダイズしている場合、フルオロフォアの励起時にFET標識オリゴヌクレオチドプローブのフルオロフォアとダーククエンチャーとの間でエネルギー転移が起こらない、請求項27記載の方法。
- FET標識オリゴヌクレオチドプローブが5'ヌクレアーゼによって切断された場合、フルオロフォアの励起時にFET標識オリゴヌクレオチドプローブのフルオロフォアとダーククエンチャーとの間でエネルギー転移が起こらない、請求項27記載の方法。
- プライマー伸長混合物がさらに核酸インターカレーターを含む、請求項27〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 以下を含む、プライマー伸長反応混合物におけるプライマー伸長産物の生成の検出に使用するためのシステム:
(a) (i)ドナードメイン、(ii)アクセプタードメイン、および(iii)標的結合配列を含むFET標識オリゴヌクレオチドであって、アクセプタードメインはダーククエンチャーを含む3'→5'エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含み、該ドナードメインはフルオロフォアを含むフルオロフォアドメインを含み、さらに該FET標識オリゴヌクレオチドがフルオロフォアおよびダーククエンチャーに連結した一本鎖結合配列を含む核酸検出体分子であり、該ダーククエンチャーは該FET標識オリゴヌクレオチドの3’末端に位置するFET標識オリゴヌクレオチド;
(b)3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ;および
(c) 副溝結合剤。 - ダーククエンチャーの最大吸光度が約400〜約700nmである、請求項32記載のシステム。
- ダーククエンチャーが置換4-(フェニルジアゼニル)フェニルアミン構造を含む、請求項32記載のシステム。
- ダーククエンチャーが、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、およびその組み合わせより選択される少なくとも2つの残基を含む構造を有し、該残基の少なくとも2つが環外ジアゾ結合を介して共有結合的に結合している、請求項34記載のシステム。
- さらに核酸インターカレーターを含む、請求項32〜36のいずれか一項に記載のシステム。
- 以下を含む、プライマー伸長反応混合物におけるプライマー伸長産物の生成の検出に使用するためのキット:
(a) (i)ドナードメイン、(ii)アクセプタードメイン、および(iii)標的結合配列を含むFET標識オリゴヌクレオチドであって、アクセプタードメインはダーククエンチャーを含む3'→5'エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含み、該ドナードメインはフルオロフォアを含むフルオロフォアドメインを含み、さらに該FET標識オリゴヌクレオチドがフルオロフォアおよびダーククエンチャーに連結した一本鎖結合配列を含む核酸検出体分子であり、該ダーククエンチャーは該FET標識オリゴヌクレオチドの3’末端に位置するFET標識オリゴヌクレオチド;
(b)3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ;
(c)請求項1記載の方法を実施するための説明書;ならびに
(d)副溝結合剤。 - ダーククエンチャーの最大吸光度が約400〜約700nmである、請求項38記載のキット。
- ダーククエンチャーが置換4-(フェニルジアゼニル)フェニルアミン構造を含む、請求項38記載のキット。
- ダーククエンチャーが、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、およびその組み合わせより選択される少なくとも2つの残基を含む構造を有し、該残基の少なくとも2つが環外ジアゾ結合を介して共有結合的に結合している、請求項40記載のキット。
- プライマー伸長混合物がさらに核酸インターカレーターを含む、請求項38〜42のいずれか一項に記載のキット。
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