JP2001245698A

JP2001245698A - 核酸検出法

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Publication number: JP2001245698A
Application number: JP2000286503A
Authority: JP
Inventors: Xiao Bing Wang; 小兵王
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-11-22
Filing date: 2000-09-21
Publication date: 2001-09-11
Also published as: EP1101824A3; US20060141503A1; TWI252254B; KR20010051353A; EP1101824A2; CA2319349A1; CN1297058A

Abstract

(57)【要約】【課題】予め定められた位置の核酸塩基について種々
の突然変異を高感度かつ高精度で検出できる方法を提供
する。【解決手段】まず、対象とする核酸とプライマーとを
アニーリングさせる。次にターミネーターヌクレオチド
と非ターミネーターヌクレオチドを含む試薬を用いてプ
ライマー伸長反応を行う。ターミネーターヌクレオチド
は目的とする野生型塩基に相補的なものである。対象と
する核酸において、プライマーと対合していない３’側
の最初の塩基が野生型であれば、それに相補的なターミ
ネーターがプライマーの３’末端に結合しプライマー伸
長反応は停止する。一方、当該最初の塩基が変異して野
生型でない場合、非ターミネータがプライマーに組込ま
れ、プライマー伸長反応が進む。プライマー伸長反応後
の生成物を分析すれば、野生型塩基の存在または変異を
知ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】本発明は、核酸配列検出の分野に関す
る。本発明は、予め定められた対象とする核酸塩基部位
における任意のタイプの突然変異を検出する方法に関す
る。本発明は、特異的ターミネーションアッセイまたは
シフトターミネーターアラインメントとしても知られる
シフトターミネーション分析と呼ばれる方法に関し、こ
れらはすべてＳＴＡと略すことができる。

【０００２】本発明による方法の実用的用途には、検出
すべき突然変異の部位が既に分かっている、遺伝病の診
断、感染症の診断、法医学の手法、実父判定、およびゲ
ノム地図作製がある。

【０００３】過去１０年間にわたって、癌になりやすい
体質に関係する遺伝子が同定され、多くの癌に関係する
突然変異の特徴が得られてきた。これらの突然変異の診
断テストによって、個人の癌の発現リスクをより正確に
推定できる。癌をはじめ、色々な疾病に関係する突然変
異の早期診断は、本発明の目標の１つである。

【０００４】遺伝子の突然変異には４つの主要なタイプ
がある。第１のタイプは、正常なＤＮＡ配列内の１個の
ヌクレオチドの置換によって生じる点変異である。多く
の場合、この突然変異によって、コード鎖のフレームシ
フトが生じ、その結果正常なたんぱく質合成ができなく
なる。家族性アデノポリポーシス（ＦＡＰ）患者に見ら
れるＡＰＣ遺伝子の点変異は典型的な例である（Kinzle
r et al., Science 253, 661-665 (1991); Joslyn et a
l., Cell 66, 601-613 (1991); Nishisho et al., Scie
nce 253, 665-669 (1991)）。第２のタイプは、正常な
ＤＮＡ配列に、単一のまたは複数のヌクレオチドが挿入
される挿入変異である。第３のタイプは、正常なＤＮＡ
配列から単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチド
が欠失する欠失変異である。挿入タイプの突然変異およ
び欠失タイプの突然変異の両方とも、フレームシフト、
たんぱく質合成の早期中止、および１つまたは複数のア
ミノ酸の付加または欠失などの重大な変化を引起し得
る。第４のタイプは、遺伝子のフラグメントが他の遺伝
子に組込まれるときに起こる遺伝子の転座である。慢性
骨髄性白血病患者に見られるフィラデルフィア染色体が
この現象の一例である（Konopka et al., Cell 37 1035
(1984)）。たんぱく質の構造に変化があると細胞内に
一連の異常が発生し、それが癌の発生につながり得る。

【０００５】数億もの正常な塩基の中から１つ突然変異
の塩基を検出することは困難である。分離されたＤＮＡ
配列を直接読む化学的または酵素的ＤＮＡ塩基配列決定
法は、遺伝子の突然変異の分析および同定における最も
徹底した方法として研究実験室で使用されてきた。しか
し、こうした塩基配列決定法を臨床で応用することは非
現実的である。というのも、そのような方法の用途は、
アッセイを行なうために必要とされる専門的技術レベ
ル、その作業集約性、配列決定反応を実行する際の装置
および試薬の調達に関連する高いコスト、ならびに測定
を完遂するために必要な長い期間により、制約されるか
らである。さらに、上記配列決定法は、大量のＤＮＡテ
ンプレートが必要であり、そのような大量のテンプレー
トは通常患者から採取される１０ｍｌの血液試料から得
るのは難しいという欠点がある。

【０００６】従来の突然変異検出法には、たとえば、制
限フラグメント長多形法（ＲＦＬＰ）（Botstein et a
l., Am. J. Hum. Genet., 32, 314-331 (1980), and Wh
ite et al., Scientific American, 258:40-48 (198
8)）、一本鎖コンフォメーションの多形法（ＳＳＣＰ）
（Howell et al., Am. J. Hum. Genet., 55, 203-206
(1994)）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブ
リダイゼーション（Studencki et al., Am. J. Hum. Ge
net., 37, 42-51 (1985), and Saiki et al., Nature,
324, 163-166）、オリゴヌクレオチド連結反応アッセイ
（Landgrun et al.,Science, 241, 1077-1080 (199
0)）、および、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）
（Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 2757-2760
(1989), and Okayama et al., J. Lab. Clin. Med. 11
4, 105-113 (1989)）がある。

【０００７】これらの手法のいくつかは、点変異の検出
にしか適さない。他のいくつかの手法は、たとえば制限
酵素開裂部位を破壊または構築できる挿入変異または欠
失変異の検出にのみ使用できるが、単一塩基の突然変異
の検出には適さない。たとえば、制限酵素開裂部位に影
響しない点変異は、ＲＦＬＰなどの手法では見逃されて
しまう。他の手法では、特定のプローブハイブリダイゼ
ーション条件を最適化する必要がある。さらに上述の手
法いずれにおいても、ゲル電気泳動装置およびハイブリ
ダイゼーション装置などの特殊な研究室用装置が必要で
あり、時間および労力がかかる。

【０００８】突然変異を検出するためのプライマー伸長
に基づくいくつかの方法も知られている（Mohan et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1143-1147 (199
1), Prezant et al., Hum. Mutation 1, 159-164 (199
2), Fahy et al., Nucleic AcidResearch, 25, 3102-31
09 (1997), and U.S. Patent Nos. 5,846,710 (1998) a
nd 5,888,819 (1998)）。そのような方法には、チオヌ
クレオチドを使用するプライマー伸長、突然変異ヌクレ
オチド塩基に相補的な標識ヌクレオチドを使用した突然
変異ヌクレオチドに隣接するオリゴヌクレオチドプライ
マーからのプライマー伸長、および、突然変異塩基に相
補的な標識ジデオキシヌクレオチドターミネーターを使
用するプライマー伸長がある。

【０００９】これらのプライマー伸長に基づく突然変異
検出法は、時間をとらず、実行が容易で、臨床に応用で
きる可能性がある。しかし、これらの方法には少なくと
も２つの弱点がある。第１に、これらの手法はすべて、
標識されたヌクレオチドを１つだけプライマー伸長鎖に
組込むことに基づいている。１タイプのみのＡ、Ｃ、
Ｇ、ＴまたはＵから選ばれた標識ヌクレオチドあるいは
標識されたジデオキシヌクレオチドを組込むことによ
り、特異的点変異のみを検出できるようになり、そのよ
うな点変異は、アッセイに使用される標識ヌクレオチド
に相補的なヌクレオチド塩基に特異的なものである。

【００１０】仮に、異なったタイプのまたは異なった性
質の突然変異が同じ位置にあるとき、たとえば、ＡがＣ
またはＧＴまたはＴＣＴに変化し、それに多数の他の変
更が伴うとき、これら既知の方法によれば、標識した
Ｇ、Ｃ、Ａを用いて少なくとも３つの別個のテストを行
なう必要がある。その代わりに、１つのテストアッセイ
を行なうことができるが、それは、Ｇ、Ｃ、Ａ突然変異
体を別個に検出するよう、示差的に標識されたヌクレオ
チドを、ゲル分析および特殊なマーカー検出システムと
組合せて使用するものである。しかし、３つの別個のテ
ストを行なうためには、通常患者から得られる血液試料
の３倍以上の試料が必要となる。このような大量の血液
試料や複雑なゲル分析手法は、テストのコストを増加さ
せるだけでなく、必要な時間および労力を増加させる。
さらに重要なのは、これらのアッセイでは、チューブを
誤って標識する機会が生じたり、アッセイを行うのに必
要な工程が多数にのぼるため、エラーの確率が高くなる
ことである。したがって、これらのプライマー伸長に基
づく方法は、多数の試料のスクリーニングあるいは診療
所での日常的なテストの実行には不都合であるかまたは
適さない。

【００１１】また、これらのプライマー伸長に基づくア
ッセイは、その感度を改良する必要がある。というの
も、これらのテストにおいて得られるプライマー伸長鎖
は、標識されたヌクレオチドまたは標識されたジデオキ
シヌクレオチドを１つしか持たないため、発生する信号
は変動し、信号の強度は、使用される化学標識の種類に
依存するからである。また一般に、その信号は弱い。

【００１２】したがって、特定の予め定められた位置の
核酸塩基において生じるどのようなタイプの突然変異で
も検出することができ、しかも強く正確な検出信号を与
えるような、迅速、低コストで、手間がかからず、しか
も臨床に適用できる方法が、突然変異検出の分野におい
て必要とされている。

【００１３】

【発明の概要】本発明は上述した要求に応えるものであ
る。

【００１４】本発明は、特定の部位における突然変異テ
ストの設計が単純であることなど、一般的なプライマー
伸長に基づく方法の有利な特徴をいくつか有する一方
で、本発明は、上述したようなプライマー伸長に基づく
方法の欠点を克服する方法を提供する。本発明は、あら
ゆるタイプの突然変異の検出および同定に対して広く適
用することができる。本発明は、従来の方法よりも、費
用対効果がよく、時間が少なくてすみ、手間がかからな
い。

【００１５】上述した方法に対しての本発明の主要な利
点のいくつかは、次のとおりである。（１）必ずしもゲ
ル電気泳動によるサイズ分離法を用いる必要なく、たっ
た１つの反応チューブにおいてすべてのタイプの突然変
異を検出することができる。（２）標識された複数のヌ
クレオチドがプライマー伸長鎖に組込まれるため、発生
する信号が強く、したがって検出感度が高い。（３）プ
ライマー伸長鎖に、２または３の異なった種類のヌクレ
オチドまたはヌクレオチド類似体マーカーを挿入するこ
とができるので、精度が高くなる。これらの有利な特徴
のため、本発明の単純な手順に基づいて、あらゆる診療
所で遺伝的突然変異の存在を日常的にテストすることが
可能になる。さらに本発明は、多数の試料をスクリーニ
ングするための自動化に容易に適合させることができ
る。

【００１６】本発明は、既知の核酸配列の予め定められ
たヌクレオチド（標的塩基）に生じる任意の突然変異を
１回の反応で検出するための方法に関する。本発明によ
る方法は、突然変異を検出するためプライマー伸長分析
を用いる。プライマ−は、対象とする核酸に相補的であ
り、予め定められたヌクレオチド塩基のすぐ隣りの位置
で、対象とする核酸と配列特異的にハイブリッド形成
し、二本鎖を形成する。対象とする核酸における標的塩
基は、プライマーの３’末端のすぐ下流で対を形成して
いない塩基となる。プライマー伸長反応試薬は、１種類
のターミネーターヌクレオチド（好ましくは標識されて
いないターミネーターヌクレオチド）（あるいは必要に
応じて、該当するヌクレオチド塩基なし）とともに、３
種類の標識された（あるいは、必要に応じて他と異なる
よう標識されているか標識されていない）ターミネータ
ーでないヌクレオチド（非ターミネーターヌクレオチ
ド）を含む。そこにおいて、ターミネーターヌクレオチ
ドは、対象とする核酸の予め定められた位置における標
的塩基に相補的なものである。非ターミネーターヌクレ
オチドは、標的塩基に相補的でない。対象とする核酸の
標的塩基に相補的なターミネーターヌクレオチドがプラ
イマーの３’末端に組込まれると、プライマー伸長反応
は停止され、非ターミネーターヌクレオチドは組込まれ
なくなる。また、プライマー伸長反応において対象とす
る核酸の標的塩基に相補的な塩基がない場合も、プライ
マー伸長は停止され、非ターミネーターヌクレオチドは
組込まれなくなる。一方、もし標的塩基が突然変異のた
め変化していれば、非ターミネーターが、その配列に応
じてプライマー中に組込まれるようになる。かくして、
プライマー中に検出される非ターミネーター由来のシグ
ナル、好ましくは非ターミネーターの標識シグナルは、
予め定められた核酸塩基部位に突然変異が生じているこ
とを知らせる。

【００１７】本発明の目的の１つは、試料において標的
核酸を検出または定量するための方法を提供することで
ある。そのような本発明による方法は、以下の工程を備
える。

【００１８】（ａ）対象とする核酸のテンプレート中の
予め定められた位置おける標的ヌクレオチド塩基の５’
側のすぐ上流にある塩基配列に相補的なプライマーを準
備する。

【００１９】（ｂ）もし対象とする核酸が二本鎖であれ
ば、当該核酸を含む試料を処理して一本鎖に変性させ
る。もし対象とする核酸が一本鎖であれば、そのまま工
程（ｃ）に移る。

【００２０】（ｃ）高ストリンジェンシーの条件下で工
程（ｂ）からの標的核酸と工程（ａ）からのプライマー
とをアニーリングさせて、プライマー−核酸の二本鎖を
得る。

【００２１】（ｄ）工程（ｃ）からのプライマー−核酸
二本鎖とプライマー伸長反応試薬とを混合する。プライ
マー伸長反応試薬は、（ｉ）対象とする核酸の予め定め
られた位置における標的ヌクレオチド塩基に相補的な１
種類のターミネーターヌクレオチド（あるいは、必要に
応じてそのようなヌクレオチドなし）と、（ｉｉ）対象
とする核酸の予め定められた位置における標的ヌクレオ
チド塩基に非相補的な３種類の非ターミネーターヌクレ
オチドとを含む。必要に応じて、３種類の非ターミネー
ターヌクレオチドのうち少なくとも１種が検出可能なマ
ーカーで標識される。

【００２２】（ｅ）酵素または化学的手段によりプライ
マー伸長反応を行う。そこにおいて、ターミネーターヌ
クレオチドまたは非ターミネーターヌクレオチドのプラ
イマーへの組込みは、プライマーの３’末端のすぐ下流
にある対象とする核酸のプライマーと塩基対を形成して
いない最初の塩基の種類に左右される。当該最初の塩基
が、標的ヌクレオチド塩基であれば、それに相補的なタ
ーミネーターヌクレオチドがプライマーの３’末端に組
込まれてプライマー伸長は停止されるか、あるいは、当
該最初の塩基に相補的な塩基がないためにプライマー伸
長は停止される。したがって、非ターミネーターヌクレ
オチドはプライマーに組込まれない。一方、標的ヌクレ
オチド塩基が別の種類のヌクレオチドに変化している
（いわゆる突然変異の）場合、非ターミネーターヌクレ
オチドが、該変化したヌクレオチド塩基配列に応じて、
相補的にプライマーに組込まれる。（ｆ）プライマーに組込まれた非ターミネーターヌクレ
オチドを検出することにより、対象とする核酸の予め定
められた位置におけるヌクレオチド塩基の存在および変
異を測定する。

【００２３】工程（ｃ）において、プライマーと結合す
る塩基配列は、予め定められた位置の同定すべきヌクレ
オチド塩基のすぐ隣りにあり、また、対象とする核酸
（テンプレート）にある同定すべきヌクレオチド塩基
は、プライマーの３’末端のすぐ下流にある予め定めら
れた位置の対を形成していない塩基である。好ましい態
様において、当該方法における工程（ｄ）では、工程
（ｃ）からの二本鎖は、少なくとも１種の標識された非
ターミネーターおよび少なくとも１種の標識されていな
いターミネーターに接触させられる。またその代わり
に、工程（ｄ）において、工程（ｃ）からの二本鎖を、
同一のまたは異なる検出可能な標識でそれぞれ標識され
た複数の非ターミネーターと接触させてもよい。

【００２４】上述の方法を実施するため、テンプレート
依存性の酵素として、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリ
メラーゼ、あるいは逆転写酵素を用いることができ、た
とえば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはその「クレ
ノウフラグメント」、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチカス（T. aquat
icus）ＤＮＡポリメラーゼ、レトロウイルス逆転写酵
素、またはそれらの組合せを用いることができる。

【００２５】本発明の核酸は、典型的に、デオキシリボ
核酸、リボ核酸、あるいはデオキシリボ核酸とリボ核酸
の共重合体である。プライマーは、オリゴデオキシリボ
ヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、あるいはデオ
キシリボ核酸とリボ核酸の共重合体とすることができ
る。好ましくは、テンプレートはデオキシリボ核酸であ
り、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチド、
オリゴリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチ
ドとリボヌクレオチドの共重合体であり、テンプレート
依存性酵素はＤＮＡポリメラーゼである。好ましくは、
テンプレートはリボ核酸であり、プライマーはオリゴデ
オキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチドまた
はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの共重
合体であり、テンプレート依存性酵素は逆転写酵素であ
る。好ましくは、テンプレートはデオキシリボ核酸であ
り、プライマーはオリゴリボヌクレオチドであり、酵素
はＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、テンプレー
トはリボ核酸であり、プライマーはオリゴリボヌクレオ
チドであり、テンプレート依存性酵素はＲＮＡレプリカ
ーゼである。

【００２６】上述した方法の工程（ｄ）において、工程
（ｃ）からのプライマー−テンプレートを、少なくとも
１つの標識された非ターミネーターおよび該非ターミネ
ーターと異なるように標識された少なくとも１つのター
ミネーターに接触させることができる。さらに、工程
（ｅ）において、組込まれた標識された非ターミネータ
ーの標識シグナルおよび該非ターミネーターとは異なる
よう標識された少なくとも１つのターミネーターの標識
シグナルを検出することができる。

【００２７】本発明による方法において、対象とする核
酸は、インビボで酵素により合成されたもの、インビト
ロで酵素により合成されたもの、あるいは非酵素的に合
成されたものとすることができる。オリゴヌクレオチド
プライマーは、インビボで酵素により合成されたもの、
インビトロで酵素により合成されたもの、あるいは非酵
素的に合成されたものとすることができる。さらに、オ
リゴヌクレオチドプライマーは、組込まれていない試薬
および／または対象とする核酸からのプライマーのアフ
ィニティ分離を可能にする１つまたは複数の特殊構造か
らなり得る。

【００２８】たとえば、オリゴヌクレオチドプライマー
はビオチンを含み、これは、固体支持体に付着されたス
トレプトアビジンへのビオチンの結合を介して、組込ま
れていない試薬および／または対象とする核酸からのプ
ライマーのアフィニティ分離を可能にする。本発明の他
の態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、固
体支持体に付着された核酸中に存在する相補的配列への
塩基対合を介して、組込まれていない試薬および／また
は対象とする核酸からのプライマーのアフィニティ分離
を可能にする塩基配列（典型的にはＤＮＡ配列またはＲ
ＮＡ配列）を含む。本発明のさらに他の態様において、
対象とする核酸は、組込まれていない試薬および／また
はプライマーからの対象とする核酸のアフィニティ分離
を可能にする１つまたは複数の特殊構造を含む。対象と
する核酸はビオチンを含むことができ、それは、固体支
持体に付着されたストレプトアビジンへのビオチンの結
合を介して、組込まれていない試薬および／またはプラ
イマーからの対象とする核酸のアフィニティ分離を可能
にする。

【００２９】本発明の方法において、対象とする核酸の
配列は、固体支持体に付着された核酸中に存在する相補
的配列への塩基対合を介して、組込まれていない試薬お
よび／またはプライマーからの対象とする核酸のアフィ
ニティ分離を可能にする塩基配列（典型的にはＤＮＡ配
列またはＲＮＡ配列）を含んでもよい。オリゴヌクレオ
チドプライマーは、検出可能なマーカーで標識され得
る。オリゴヌクレオチドプライマーは、試薬に存在する
検出可能なマーカーあるいは対象とする核酸に付着され
る検出可能なマーカーとも異なる検出可能なマーカーで
標識することができる。対象とする核酸は、検出可能な
マーカーで標識され得る。対象とする核酸は、好ましく
は、試薬に存在する検出可能なマーカーあるいはプライ
マーに付着される検出可能なマーカーとも異なる検出可
能なマーカーで標識される。

【００３０】本発明の他の態様において、対象とする核
酸は、天然にないヌクレオチド類似体を含む。天然にな
いヌクレオチド類似体は、デオキシイノシンまたは７−
デアザ−２’−デオキシグアノシンを含む。対象とする
核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成
され得る。

【００３１】本発明において、試料は、生物からのゲノ
ムＤＮＡ、そのＲＮＡ転写物、またはそのＲＮＡ転写物
から調製されるｃＤＮＡを含む。試料は、生物からのゲ
ノム外のＤＮＡ、そのＲＮＡ転写物、またはそのＲＮＡ
転写物から調製されるｃＤＮＡを含み得る。

【００３２】本発明の方法は、植物、微生物、ウィルス
あるいはトリを含む任意の生物からの核酸を使用して行
うことができる。そのような生物は、脊椎動物または無
脊椎動物であり得る。そのような生物は、好ましくは哺
乳動物である。さらに好ましくは哺乳動物はヒトであ
る。さらに、哺乳動物は、ウマ、イヌ、ウシ、ネコ、ブ
タまたはヒツジであり得る。

【００３３】本発明の種々の目的は、以下の説明、添付
の図面および前掲の特許請求の範囲からさらに理解する
ことができる。

【００３４】

【より詳細な説明】ここで使用する「核酸」または「ヌ
クレオチド」は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、あるい
はデオキシリボ核酸とリボ核酸の共重合体とすることが
できる。核酸の試料は、天然のものでも合成のものでも
よい。核酸の試料は、天然に存在する核酸でもよいし、
任意の生物から得られるものでもよい。本発明が適用さ
れる生物には、たとえば、植物、微生物、ウイルス、
鳥、脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物、ヒト、ウマ、イ
ヌ、ウシ、ネコ、ブタ、ヒツジがある。標的核酸は、天
然由来のものでもよいし、インビボで酵素により合成さ
れたもの、インビトロで酵素により合成されたもの、あ
るいは非酵素的に合成されたものでもよい。

【００３５】対象とする１つまたは複数の核酸を含有す
る試料は、生物からのゲノムＤＮＡ、そのＲＮＡ転写
物、またはそのＲＮＡ転写物から調製されるｃＤＮＡを
含み得る。対象とする１つまたは複数の核酸を含有する
試料はさらに、生物からのゲノム外のＤＮＡ、そのＲＮ
Ａ転写物、またはそのＲＮＡ転写物から調製されるｃＤ
ＮＡを含み得る。さらに、対象とする１つまたは複数の
核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成さ
れ得る。

【００３６】対象とする核酸は、デオキシイノシンまた
は７−デアザ−２−デオキシグアノシンなどの天然にな
いヌクレオチド類似体を含み得る。これらの類似体は、
ＤＮＡ二本鎖を不安定にし、鎖を完全に分離することな
く、二本鎖試料においてプライマーのアニーリングおよ
び伸長反応が起こることを可能にし得る。

【００３７】対象とする核酸は、組込まれていない試薬
および／またはプライマーからの対象とする核酸のアフ
ィニティ分離を可能にする１つまたは複数の特殊構造を
含み得る。たとえば、対象とする核酸はビオチンを含む
ことができ、それは、固体支持体へ付着されたアビジン
またはその類似体へのビオチンの結合を介して、組込ま
れていない試薬および／またはプライマーからの対象と
する核酸のアフィニティ分離を可能にする。対象とする
核酸の配列は、固体支持体に付着された核酸中に存在す
る相補的配列への塩基対合を介して、組込まれていない
試薬および／またはプライマーからの対象とする核酸の
アフィニティ分離を可能にするＤＮＡ配列を含み得る。
対象とする核酸は検出可能なマーカーで標識することが
でき、この検出可能マーカーは、試薬に存在する検出可
能なマーカーあるいはプライマーに付着された検出可能
マーカーと異なるものとすることができる。

【００３８】本発明に関し、「正常なヌクレオチド」ま
たは「正常な塩基」という用語は、野生型塩基または既
知の標準的ヌクレオチド塩基を意味し、それに対して、
塩基部位における突然変異を同定することができる。
「標準的ヌクレオチド塩基」は、任意の塩基を含み、そ
れは、野生型の塩基の他、その塩基が既知でありその変
異体を知りたい場合には、既知の突然変異塩基を含み得
る。正常な塩基は、たとえば既知の野生型塩基であり
得、それに対して該当する位置での突然変異を調べるこ
とができる。一方、既知の塩基は、既知の突然変異体で
あり得、それに対して、該当する位置での野生型塩基の
存在を調べることができる。あるいは、既知の正常な塩
基は、既知の突然変異体であり得、それに対して、他の
突然変異体塩基を調べることができる。このように本発
明の方法は、該当する部位において任意の他の塩基変異
体が存在するかどうかを決定するのに用いることができ
る任意の既知の配列に適用することができる。

【００３９】ここで使用する「プライマー」または「オ
リゴヌクレオチドプライマー」という用語は、たとえば
ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの酵素、な
らびに適当な温度およびｐＨなどのさまざまな要因の存
在下で、核酸（テンプレート）鎖に相補的なプライマー
伸長物の合成を可能にする条件下におかれたとき、合成
の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。

【００４０】一方、用語「プライマー」は、任意の材料
から得られる任意の核酸フラグメントを含む。たとえば
プライマーは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＰＣＲに
より得られたＤＮＡのようなより大きな核酸フラグメン
トを断片化することにより調製することができる。プラ
イマーの性質は、プライマーを得る方法、たとえば、そ
れが、天然由来の核酸あるいは合成された核酸を断片化
することによるものなのか、あいいはそれ自体を合成す
ることによるものなのかによって、限定されるものでは
ない。またプライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオ
チド、オリゴデオキシリボヌクレオチドの共重合体、オ
リゴリボヌクレオチド、リボヌクレオチドの共重合体、
またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの
共重合体とすることができる。プライマーは、天然のも
のでもよいし合成のものでもよい。オリゴヌクレオチド
プライマーは、インビボでの酵素による合成、インビト
ロでの酵素による合成、あるいはインビトロでの酵素に
よらない合成のいずれでも合成することができる。プラ
イマーは、検出可能なマーカーで標識することができ、
この検出可能なマーカーは、試薬に存在するかあるいは
対象とする核酸に付着されるいずれの検出可能マーカー
とも異なり得る。さらに、プライマーは、同定すべきヌ
クレオチド塩基の上流に隣接した対象とする特定の位置
にあるフランキング配列に対応する配列を有している必
要がある。

【００４１】また、プライマーは、対象とする核酸に存
在するヌクレオチドと、ハイブリッド形成またはアニー
リングできる必要がある。必要なハイブリッド形成を達
成する方策の１つは、テンプレート依存的にプライマー
を、既知の塩基配列に対し実質的に相補的または完全に
相補的にすることである。

【００４２】オリゴヌクレオチドプライマーは、組込ま
れていない試薬および／または対象とする核酸からのプ
ライマーのアフィニティ分離を可能にする１つまたは複
数の特殊構造を含み得る。そのようなアフィニティ構造
は、限定されることなく、たとえば、ジギトニン、磁気
ビーズ、リガンド類、たとえば抗体を含むタンパク質リ
ガンド類を含む。好ましくは当該構造はビオチンであ
る。ビオチンを用いる場合、ビオチンを含むプライマー
は、固体支持体に付着されたアビジンまたはその類似体
へのビオチンの結合を介して、組込まれていない試薬お
よび／または対象とする核酸からのプライマーのアフィ
ニティ分離を可能にする。オリゴヌクレオチドプライマ
ーの配列は、固体支持体に付着された核酸中に存在する
相補的配列への塩基対合を介して、組込まれていない試
薬および／または対象とする核酸からのプライマーのア
フィニティ分離を可能にするＤＮＡ配列を含み得る。

【００４３】ここで使用する「プライマー伸長反応」と
いう用語は、テンプレート依存性の核酸合成反応が行な
われる反応状態を指す。テンプレート依存性のプライマ
ー伸長反応を起こすための条件は、部分的に、適当なテ
ンプレート依存性酵素を存在させることにより作り出す
ことができる。適当なテンプレート依存性酵素にはＤＮ
Ａポリメラーゼがある。ＤＮＡポリメラーゼには、いく
つかの種類のものが有り得る。しかし、ＤＮＡポリメラ
ーゼは、プライマー依存性でありかつテンプレート依存
性でなければならない。たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩまたはその「クレノウフラグメント」、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（シークエ
ナーゼ）、サーマス・アクアチカス（T. aquaticus）
ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはレトロウィルス逆転写酵
素を使用することができる。Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼま
たはＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ
類も、いくつかのプロトコルで使用できる。ポリメラー
ゼに応じて、異なった条件を使用する必要があり、ま
た、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応のために異
なった温度範囲が必要となり得る。

【００４４】ここで使用する「プライマー伸長鎖」とい
う用語は、プライマーが添加された後、二本鎖において
テンプレートに対向して形成される鎖を含む。好ましく
は、プライマーの伸長は、ターミネーターのテンプレー
トへの結合によって停止される。

【００４５】ここで使用する「テンプレート」という用
語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ、ある
いはその任意の修飾物を含む核酸を指し、任意の長さま
たは配列であり得る。

【００４６】ここで使用する「ターミネーター」または
「チェーンターミネーター」という用語は、テンプレー
ト鎖に対向するプライマー伸長鎖に組込まれたとき、効
果的にプライマー伸長反応を終わらせる、Ａ、Ｇ、Ｃ、
ＴもしくはＵ、またはその類似体などの核酸塩基を指
す。好ましくは、ターミネーターはジデオキシヌクレオ
チドである。また好ましくは、ターミネーターは、非タ
ーミネーター上の標識と区別できるように、標識されな
いかまたは標識される。ここで、「ターミネーター」ま
たは「チェーンターミネーター」という用語が単数形で
使用されるとき、それは、ヌクレオチド一分子を使用す
ることを意味するものではない。むしろ「ターミネータ
ー」という用語の単数形は、アッセイに用いられるヌク
レオチド、核酸塩基あるいは核酸類似体の種類を表して
いる。たとえば、ターミネーターがｄｄＡであるとき、
単数形のｄｄＡは集合名詞であり、ｄｄＡのたった一分
子を指しているのではない。一方、「ターミネーター」
は、特定の種類のヌクレオチドが存在しないことでもあ
り得る。その場合、プライマー伸長は、該当する位置に
特定のヌクレオチドがないことによって停止される。た
とえば、テンプレート鎖上の「Ｃ」に対向する位置でプ
ライマー伸長反応を停止させたい場合、非終結塩基であ
るＡ、ＴおよびＣをプライマー伸長反応混合物に含有さ
せる一方、「Ｇ」（「Ｃ」の相補塩基）を含有させない
ようにすることができる。このようにすれば、相補的塩
基が存在しないことにより、プライマー伸長反応を停止
させることができ、たとえばジデオキシターミネーター
ヌクレオチドを添加する場合と同様の結果を得ることが
できる。

【００４７】ここで使用される「非ターミネーター」ま
たは「非チェーンターミネーター」という用語は、プラ
イマー伸長鎖に組込まれたときに伸長反応を終わらせな
いヌクレオチド塩基をいう。好ましくは、プライマー伸
長反応における少なくとも１つの非ターミネーターが標
識される。ここで、「非ターミネーター」または「非チ
ェーンターミネーター」という用語を単数形でいうと
き、それは、ヌクレオチド一分子を使用することを意味
するものではない。むしろ「非ターミネーター」という
用語の単数形は、アッセイに用いられるヌクレオチド、
核酸塩基あるいは核酸類似体の種類を表している。たと
えば、ターミネーターがＧであるとき、単数形のＧは集
合名詞であり、Ｇのたった一分子を指しているのではな
い。

【００４８】ここで使用する「突然変異体」または「突
然変異」という用語は、野生型の塩基または正常な塩基
と異なる、テンプレート鎖上の任意の塩基を示してい
る。本発明の方法を使用して検出され得る突然変異は、
アニーリングされたプライマーのすぐ３′側の塩基に直
接対向するテンプレート上の塩基対を形成していない塩
基が変化しているならば、単一塩基の突然変異、挿入変
異、欠失変異または遺伝子の転座を含むあらゆるタイプ
の突然変異であり得る。

【００４９】ここで使用する「標識」という用語は、検
出可能なシグナルを与えるため、ターミネーターヌクレ
オチドまたは非ターミネーターヌクレオチドに結合され
る任意の分子を指す。標識は、放射性のもの、化学蛍光
性のもの、抗体などのタンパク質リガンドとすることが
でき、もし蛍光基が使用されるのであれば、非ターミネ
ーターヌクレオチド塩基の各タイプについて異なった蛍
光基を使用してもよい。これらの蛍光性標識は、分光測
定によって識別可能な発光スペクトルを有する。

【００５０】一方、プライマー伸長物へのヌクレオチド
塩基の組込みのレベルは、米国特許明細書第５，８８
５，７７５号に例示される質量分析法によっても測定す
ることができる。同公報に記載された内容はすべて本明
細書中に引用により援用する。

【００５１】ここで使用する「高ストリンジェンシーの
ハイブリダイゼーション条件」という用語は、核酸のハ
イブリダイゼーション条件を指し、限定されるものでは
ないが、たとえば４２℃で０．１×ＳＳＣの洗浄条件な
どがある。ハイブリダイゼーション条件は一般的な分子
生物学のプロトコル書に見ることができ、たとえば、Au
subel et al. Current Protocols in Molecular Biolog
y, Greene and Wiley,Pub.（1994）に記載されている。
同書籍の内容すべてをここに引用により援用する。

【００５２】ここで使用する「薄層クロマトグラフィ
（ＴＬＣ）」は、セルロース材料をベースとする紙媒体
において行なうことができるが、それに限定されること
なく、分子を細かく分離し均一な層を形成させることの
できる任意の物質で行なうことができる。そのような材
料は、シリカゲル、酸化アルミニウム、ケイソウ土また
はケイ酸マグネシウムなどの無機物質を含むがこれらに
限定されるものではない。そのための有機物質には、セ
ルロース、ポリアミドまたはポリエチレン粉末があるが
これらに限定されるものではない。薄層クロマトグラフ
ィ法は、化学プロトコル書に一般的に記述されており、
たとえば、Freeman and Co.出版のFreifelder, Physica
l Biochemistry-Applications to Biochemistry and Mo
lecular Biology, second ed.（1982）、特にクロマト
グラフィの技法について述べる第８章、とりわけ、薄層
クロマトグラフィについて述べる第２２９頁から２３２
頁に記載されている。同書籍の内容すべてをここに引用
により援用する。

【００５３】当業者には明らかなように、ターミネータ
ーを非ターミネーターと異なる標識で標識することがで
き、それを、プライマー伸長鎖におけるターミネーター
と非ターミネーターの組込みを区別するのに用いること
ができる。ターミネーターの例には、特定の種類のヌク
レオチドが存在しないことも含まれる。そのようなター
ミネーターも一例であり、それにより特許請求の範囲が
限定されるものではない。ターミネーター上の標識が非
ターミネーター上の標識と異なる限り、示差的に標識さ
れたあるいは示差的に標識されていないターミネーター
も本発明に含まれる。

【００５４】当業者には明らかなように、テンプレート
の配列の少なくとも一部が既知であれば、テンプレート
鎖に結合するプライマーを設計することができ、そし
て、そのようなプライマーをテンプレート鎖に結合させ
ることができる。また当業者に明らかなように、本発明
の方法は、１またはそれ以上のアッセイチューブにおい
て、数種類のプライマーを用いて行うことができる。

【００５５】本発明の方法の特徴は、強いシグナルを発
生させることができる点にある。というのも、非ターミ
ネーターが均一に標識されていれば、予め定められた部
位において突然変異があった場合、プライマー伸長鎖に
いくつかの標識された非ターミネーターが組込まれ、そ
れにより加成的なシグナル効果が得られるからである。
これは、各プライマー伸長鎖ごとに１つのシグナル標識
しか組込まれない従来の突然変異検出法と比較して、有
利なシグナル強度をもたらす。種々のターミネーターま
たは非ターミネーターに特異的な種々の標識を使用して
シグナルを検出すれば、精度が向上する。

【００５６】以下の例は、本発明の例示として提供され
るものであり本発明を限定するものではない。

【００５７】例例１本発明のＳＴＡテストのため、標的配列としてヒトＡＰ
Ｃ遺伝子の配列を選んだ。野生型ＡＰＣ配列４３１７−
４３４７に相当するオリゴヌクレオチドと、その３つの
異なる種類の突然変異体に相当するオリゴヌクレオチド
を、合成し、テンプレートとして使用した。ＳＴＡテス
トにおいて用いたプライマーを表１に示す。

【００５８】

【表１】

【００５９】ＳＴＡ各ＳＴＡ反応は、テンプレートオリゴヌクレオチド５０
ｎｇ、１μＭのプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ２ユニ
ット、［α−³²Ｐ］−標識されたｄＣＴＰ（250 μCi/m
l, 3000 Ci/mmol Dupont-New England Nuclear）１μ
ｌ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、および標識されていないｄｄ
ＧＴＰ１μＭを含有する、緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ、および５ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂）２０μｌ中で行なった。混合物を３０
分間、３７℃でインキュベートし、さらに３分間１００
℃で加熱した。反応混合物１μｌを、薄層クロマトグラ
フィの小片であるＴＩストリップ（ＴＲＩＭＵＳＡ、
ＭＤ）に添加した。小片を１ＭのＨＣｌおよび１ＭのＮ
ａＣｌを含有する溶液を用いて１０分間展開した。この
方法により、ＴＩストリップ上で、組込まれていないヌ
クレオチドからプライマーを完全に分離した。標識され
たプライマーを、オートラジオグラフィによって可視化
し、シンチレーションカウンタ（Beckman LS 5000）で
放射能を計測した。図２にオートラジオグラフを示す。
また、オートラジオグラフに対応する計測結果を表２に
示す。

【００６０】

【表２】

【００６１】表２に示す数のうち、右の列は、プライマ
ー伸長鎖に組込まれた［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰの量を示
している。Ｏａｐｃ−ｗ、野生型オリゴヌクレオチドが
テンプレートとして働いた場合は次ぎのとおりである。
プライマーアニーリング後、最初の対にならないヌクレ
オチドはＣであり、これは、ターミネーターｄｄＧと相
補的に対合する。テンプレート依存性プライマー伸長反
応が開始したとき、ターミネーターｄｄＧはすぐに最初
の伸長ヌクレオチドとしてプライマーの３′末端に組込
まれた。そして結合されたｄｄＧにより、標識されたヌ
クレオチドのそれ以上の組込は遮断された。結果的に、
プライマーは、１ヌクレオチド塩基すなわちターミネー
ターヌクレオチドしか伸長されなかった。ターミネータ
ーが結合した後は、他のヌクレオチド塩基がテンプレー
トに結合することは不可能であるため、プライマー伸長
反応は停止した。Ｏａｐｃ−ｗ試料における放射能計数
は、全くテンプレートを含まない試料、すなわちバック
グラウンド対照の計数と同様であることが示された。

【００６２】これに対し、Ｏａｐｃ−ｐは点変異したオ
リゴヌクレオチドである。このテンプレートは、野生型
テンプレートの３′末端で最初に対合しなくなるヌクレ
オチドを野生型のＣから変異体Ｔへ置換することにより
調製した。この場合、プライマー伸長反応が開始したと
き、突然変異ヌクレオチドＴには、ターミネーターｄｄ
ＧではなくｄＡＴＰが相補的に対合した。テンプレート
鎖上のＣ残基に対向する位置へターミネーターｄｄＧが
組込まれると、プライマー伸長反応が停止した。

【００６３】挿入変異を含む突然変異オリゴヌクレオチ
ド、表１および表２のＯａｐｃ−ｉにおいて、最初に対
にならないヌクレオチドはＴであり、これはターミネー
ターｄｄＧと相補的でない。この場合、Ｔに対向してプ
ライマーにｄＡＴＰが結合することでプライマーが伸長
され、［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、２つの［α
−³²Ｐ］−ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰが付加されることで
プライマーはさらに伸ばされる。続いて、ヌクレオチド
ポリメラーゼが最初のＣと出会うことにより、ｄｄＧが
組込まれ、伸長プロセスが終わる。最終的に得られる結
果は、プライマー伸長鎖への３つの［α−³²Ｐ］−ｄＣ
ＴＰの組込みであった。

【００６４】挿入突然変異体と同様、オリゴヌクレオチ
ド欠失突然変異体Ｏａｐｃ−ｄ（表１および表２）を、
本発明のＳＴＡ試薬および方法を使用して検定した。プ
ライマーは、順番に、２つの［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰ、
ｄＡＴＰを組込むことで伸長され、ｄｄＧにより終端さ
れた。このように、２つの［α−³²Ｐ］−ＣＴＰがプラ
イマー伸長鎖に組込まれた。これらの結果は、本発明の
ＳＴＡ法がすべてのタイプの突然変異を検出できること
の強力な証拠である。このＳＴＡ法によれば、１回のテ
ストを行なうだけであらゆるタイプの突然変異の存在を
明らかにすることができる。

【００６５】特に、欠失突然変異体および挿入突然変異
体（Ｏａｐｃ−ｄおよびＯａｐｃ−ｉ）では、複数の標
識されたヌクレオチドがプライマー伸長鎖に組込まれ
た。この複数標識付けにより検出感度は劇的に向上し
た。さらに、同一の検出マーカーで標識された異なる複
数のヌクレオチドを使用することで、テストの感度をさ
らに上げることができる。たとえば、プライマーの伸長
において、［α−³²Ｐ］−ＣＴＰ、［α−³²Ｐ］−ＡＴ
Ｐ、［α−³²Ｐ］−ＴＴＰのように、すべての非ターミ
ネーターに標識を付けることができる。

【００６６】また複数の標識付けの場合、複数の非ター
ミネーターヌクレオチドをそれぞれ異なる検出可能なマ
ーカーで標識し、各非ターミネーターヌクレオチド塩基
を互いに区別してもよい。たとえば、複数のヌクレオチ
ドを異なる蛍光染料で標識することができ、その場合、
伸長されるプライマーは異なる複数種の蛍光標識を持つ
ように伸長される。異なる複数のシグナルを同時に検出
すれば、ＳＴＡテストの精度は高くなる。これらのさら
に進んだ複数標識付けの手法を本発明のＳＴＡ試薬およ
び方法と結びつけて行えば、従来の方法よりも高い感度
および精度で突然変異を検出することができる。

【００６７】例２ヒトＡＰＣ遺伝子のＰＣＲ産物をテスト試料として使用
した。標準ＰＣＲプロトコルを使用して、ＡＰＣ遺伝子
のフラグメントをＰＣＲ増幅した。ヒトＡＰＣのｃＤＮ
Ａをテンプレートとして使用した。ＰＣＲのために使用
したプライマーを表３に示す。

【００６８】

【表３】

【００６９】複数のプライマーを組合せることで、サイ
ズ約２００ｂｐの４種類の異なるＰＣＲ生成物を調製し
た。それらは、野性型であるＡＰＣ−ｗ、点変異を有す
るＡＰＣ−ｐ、挿入変異を有するＡＰＣ−ｉ、および欠
失変異を有するＡＰＣ−ｄである。ＰＣＲ生成物を、１
％アガロースゲルに付与し、テンプレートおよび遊離ヌ
クレオチドを除去した。次に生成物をＱｉａｘＤＮＡ
精製キット（Qiagen）により精製した。ＳＴＡプライマ
ーとして５′−ＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴ
ＡＣＴＴＣ−３′（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）を設計
し、ＳＴＡ反応を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．
０５ｐｍｏｌの二本鎖ＰＣＲ生成物、５ｐｍｏｌのプラ
イマー、２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、１μＣｉ［α
−³²Ｐ］−標識ＣＴＰ、２０μＭの標識されていないジ
デオキシＴＴＰ、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２ユ
ニットを含有する総量２０μｌの緩衝液中で行った。サ
ーモサイクラー（Perkin Elmer, GeneAmp 9600）におい
て、９４℃２０秒、５５℃１分と７２℃１分のサイクル
を２０回行なった。ＳＴＡ生成物１μｌを、トリムＵＳ
Ａ社製の薄層クロマトグラフィ小片であるTrim Stripに
塗布し、例１と同様にして放射能を計測した。結果を表
４に示す。

【００７０】

【表４】

【００７１】［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰを使用して、３つの
タイプの突然変異体の試料すべてでプライマーが伸長さ
れた。標識を組込んだプライマー伸長鎖から発生するシ
グナルの強度は、プライマー伸長鎖中に保持された標識
ヌクレオチドの数とよく相関している。

【００７２】例３本発明のＳＴＡ試薬および方法を、ヒトＡＰＣ遺伝子の
ＲＮＡフラグメントに適用した。例２のヒトＡＰＣ遺伝
子のＰＣＲ生成物を、ＴＡクローニングベクター３．１
（ＴＡクローニングキット、Invitrogen）に連結した。
４つのベクターを構築した。それらを表５に示す。

【００７３】

【表５】

【００７４】各ベクターに対応するＲＮＡ種を、インビ
トロＲＮＡ合成キット（Promega、ＷＩ）を使用して合
成した。ＲＮＡは、２μｇのベクターおよびＴ７ポリメ
ラーゼを含有する緩衝液中で１時間３７℃において合成
した。ＬｉＣｌおよび１００％エタノールを添加して反
応を止めた。１５分間−２０℃でインキュベートした
後、遠心分離器において１５分間１４０００Ｇで回転さ
せてＲＮＡを沈降させた。そして、精製したＲＮＡをＲ
Ｎアーゼを含まない水中に再懸濁した。ＲＮＡ５μｇ
を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｍ
ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＫＣｌを含有する総量１
０μｌの緩衝液中で、例２と同様にＳＴＡプライマーと
混合した。混合物を３分間６５℃で熱変性し、続いて２
分間、氷上でクエンチさせた。例１と同様にＳＴＡ反応
を行った。緩衝液は、１μｌの［α− ³²Ｐ］−標識ｄＣ
ＴＰ（250 μCi/ml, 3000 Ci/mmol Dupont-New England
Nuclear）、１０μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、および１
０μＭの標識されていないｄｄＴＴＰおよび逆転写酵素
２０ユニットを含有するものであった。１５分間４０℃
でインキュベートした後、２分間１００℃で加熱するこ
とにより反応を停止させた。反応生成物１μｌをTrim S
tripに塗布し、例１と同様に放射能を計測した。結果を
表６に示す。

【００７５】

【表６】

【００７６】上述の工程はすべて、すでに自動化されて
いるかまたは自動化できる、化学反応、操作およびプロ
トコルを含む。したがって、本発明の好ましい実施の態
様を、適当にプログラムされた自動化装置のワークステ
ーション操作に組入れることで、生物試料から得られる
核酸中の特定のヌクレオチド配列または配列の違いの検
出に応じて、実質的にあらゆる診断法について顕著にコ
ストを節約でき、生産性を高めることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａ〜Ｃは、本発明の突然変異検出法の好まし
い態様を示す模式図である。「Ｌ」は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ
またはＵを含み得る野生型のヌクレオチドを表わす。
「Ｌ^*」は、Ｌに相補的なジデオキシヌクレオチドなど
の標識されていないターミネーターを表わす。「Ｍ」
は、部位Ｌでの突然変異を表わし、突然変異ヌクレオチ
ドは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵを含み得る。「Ｗ」は、
Ｍに相補的なヌクレオチドを表わし、検出可能なマーカ
ーで標識されたＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵを含み得る。
「ｎ」は、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵを含む１または複数
のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を表わす。
「ｙ」は、検出可能なマーカーで標識されたＡ、Ｇ、
Ｃ、ＴまたはＵを含み、Ｍまたはｎに相補的である、ヌ
クレオチドまたはヌクレオチド類似体を表わす。

【図２】例１におけるオートラジオグラフの結果を示
す図である。この結果は以下の手順により得られる。１
μｌのＳＴＡ反応混合物を、薄層クロマトグラフィの小
片に塗布する。小片を１ＭのＮａＣｌおよび１ＭのＨＣ
ｌを含有する溶媒につける。その後、小片を１０分間、
室温で乾燥し、そして３０分間コダック（Ｋｏｄａｋ）
フィルムに感光させる。フィルムは、自動フィルム現像
機で現像した。各小片の下に、ＳＴＡテストで使用した
テンプレートの種類を示している。また、上の矢印は遊
離ヌクレオチドを示し、下の矢印は［α−³²Ｐ］−ｄＣ
ＴＰを組込んだプライマー伸長鎖を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＦターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 GA25 HA12 HA19 4B063 QA01 QA12 QA17 QQ02 QQ05 QQ12 QQ41 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR62 QR82 QS03 QS25 QS31 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の標的核酸の存在と変異を検出ま
たは定量する方法であって、（ａ）対象とする核酸のテンプレート中の予め定められ
た位置おける標的ヌクレオチド塩基の５’側のすぐ上流
にある塩基配列に相補的なプライマーを準備し、（ｂ）前記対象とする核酸が二本鎖であれば、当該核酸
を含む試料を処理して一本鎖に変性させる一方、もし前
記対象とする核酸が一本鎖であれば、そのまま工程
（ｃ）に移り、（ｃ）高ストリンジェンシーの条件下で工程（ｂ）から
の標的核酸と工程（ａ）からのプライマーとをアニーリ
ングさせて、プライマー−核酸の二本鎖を得、（ｄ）工程（ｃ）からの前記プライマー−核酸二本鎖と
プライマー伸長反応試薬とを混合し（そこにおいて、前
記プライマー伸長反応試薬は、（ｉ）前記対象とする核
酸の予め定められた位置における標的ヌクレオチド塩基
に相補的な１種類のターミネーターヌクレオチドを含む
かまたはそのようなヌクレオチドを含まず、かつ（ｉ
ｉ）前記対象とする核酸の予め定められた位置における
標的ヌクレオチド塩基に非相補的な３種類の非ターミネ
ーターヌクレオチドを含むものであり、さらに、必要に
応じて、前記３種類の非ターミネーターヌクレオチドの
うち少なくとも１種が検出可能なマーカーで標識されて
おり）、（ｅ）酵素または化学的手段によりプライマー伸長反応
を行い（そこにおいて、前記ターミネーターヌクレオチ
ドまたは前記非ターミネーターヌクレオチドの前記プラ
イマーへの組込みは、前記プライマーの３’末端のすぐ
下流にある前記対象とする核酸の前記プライマーと塩基
対を形成していない最初の塩基の種類に左右され、前記
最初の塩基が前記標的ヌクレオチド塩基であれば、それ
に相補的な前記ターミネーターヌクレオチドが前記プラ
イマーの３’末端に組込まれてプライマー伸長が停止さ
れるかまたは前記最初の塩基に相補的な塩基がないため
にプライマー伸長が停止され、その結果、前記非ターミ
ネーターヌクレオチドは前記プライマーに組込まれず、
一方、前記標的ヌクレオチド塩基が別の種類のヌクレオ
チドに変化している場合、前記非ターミネーターヌクレ
オチドが、該変化したヌクレオチド塩基配列に応じて、
相補的に前記プライマーに組込まれ）、かつ（ｆ）前記プライマーに組込まれた前記非ターミネータ
ーヌクレオチドを検出することにより、前記対象とする
核酸の予め定められた位置におけるヌクレオチド塩基の
存在および変異を測定することができる、方法。
【請求項２】前記プライマーは、デオキシリボ核酸ま
たはリボ核酸のフラグメント、オリゴデオキシリボヌク
レオチド、オリゴリボヌクレオチド、またはデオキシリ
ボ核酸とリボ核酸の共重合体である、請求項１に記載の
方法。
【請求項３】前記対象とする核酸は、デオキシリボ核
酸、リボ核酸、またはデオキシリボ核酸とリボ核酸の共
重合体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】前記標的ヌクレオチドは、野生型または
既知の突然変異体（塩基が知られており、かつその変異
体が知りたい場合）を含む、既知の塩基である、請求項
１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】前記ターミネーターヌクレオチドはジデ
オキシリボヌクレオチドであり、かつ前記非ターミネー
ターヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドまたはリ
ボヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか１項に
記載の方法。
【請求項６】前記ターミネーターヌクレオチドは標識
されていない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項７】前記ターミネーターヌクレオチドは、前
記非ターミネーター上のマーカーと異なる検出可能なマ
ーカーで標識されている、請求項１〜５のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項８】工程（ｄ）において、工程（ｃ）からの
二本鎖は、同じまたは異なる検出可能なマーカーでそれ
ぞれ標識された複数種の非ターミネーターヌクレオチド
と接触させられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項９】前記検出可能なマーカーは、酵素、放射
性同位体、蛍光性分子、またはタンパク質リガンドから
なる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】前記検出は質量分析法により行われ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記酵素はテンプレート依存性であ
る、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】前記テンプレート依存性の酵素はＤＮ
Ａポリメラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記ＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩもしくはそのクレノウフラグメン
ト、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラー
ゼ、またはサーマス・アクアチカス（T.aquaticus）Ｄ
ＮＡポリメラーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記酵素はＲＮＡポリメラーゼまたは
逆転写酵素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】前記プライマーは、組込まれていない
試薬および／または前記対象とする核酸からの前記プラ
イマーのアフィニティ分離を可能にする１つまたは複数
の特殊構造を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に
記載の方法。
【請求項１６】前記プライマーは、固体支持体表面へ
の前記プライマーの結合を可能にする１つまたは複数の
特殊構造を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項１７】前記特殊構造はビオチンまたはジギト
ニンからなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】前記特殊構造はビオチンまたはジギト
ニンからなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】前記特殊構造は、固体支持体の表面に
固定された相補配列と結合することによって、組込まれ
ていない試薬および／または前記対象とする核酸からの
前記プライマーのアフィニティ分離を可能にするＤＮＡ
またはＲＮＡの配列である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】前記特殊構造は、固体支持体の表面に
固定された相補配列と結合することによって、組込まれ
ていない試薬および／または前記対象とする核酸からの
前記プライマーのアフィニティ分離を可能にするＤＮＡ
またはＲＮＡの配列である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】前記特殊構造は、固体支持体の表面に
固定された相補配列と結合することによって、前記プラ
イマーを前記固体支持体に結合させるＤＮＡまたはＲＮ
Ａの配列である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】前記特殊構造は、固体支持体の表面に
固定された相補配列と結合することによって、前記プラ
イマーを前記固体支持体に結合させるＤＮＡまたはＲＮ
Ａの配列である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】前記対象とする核酸は、インビボもし
くはインビトロで酵素により合成されたものであるか、
または酵素によらずに合成されたものである、請求項１
〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】前記対象とする核酸は、ポリメラーゼ
連鎖反応により合成されたものである、請求項１〜２３
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】前記対象とする核酸は天然のものでな
いヌクレオチド類似体からなるものである、請求項１〜
２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】前記天然のものでないヌクレオチド類
似体は、デオキシイノシンまたは７−デアザ−２’−デ
オキシグアノシンからなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記試料は、生物からのゲノムＤＮ
Ａ、そのＲＮＡ転写物、またはそのＲＮＡ転写物から調
製されたｃＤＮＡを含む、請求項１〜２４のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項２８】前記試料は、生物からのゲノム外のＤ
ＮＡ、そのＲＮＡ転写物、またはそのＲＮＡ転写物から
調製されたｃＤＮＡを含む、請求項１〜２４のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項２９】前記生物は、植物、微生物、細菌また
はウイルスである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】前記生物は、植物、微生物、細菌また
はウイルスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】前記生物は、脊椎動物または無脊椎動
物である、請求項２７に記載のヌクレオチド塩基を同定
する方法。
【請求項３２】前記生物は、脊椎動物または無脊椎動
物である、請求項２８に記載のヌクレオチド塩基を同定
する方法。
【請求項３３】前記生物は哺乳動物である、請求項２
７に記載の方法。
【請求項３４】前記生物は哺乳動物である、請求項２
８に記載の方法。
【請求項３５】前記生物はヒトである、請求項２７に
記載の方法。
【請求項３６】前記生物はヒトである、請求項２８に
記載の方法。