JP3752466B2 - 遺伝子検査方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明はDNA検出、遺伝子診断、一塩基変異検出などDNAの検出、遺伝子のタイピングなどの方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ヒトゲノム配列解析の完了にともない、遺伝子情報を診断など医療分野に活用しようとする動きが活発化している。DNAの代表的な分析技術はゲル電気泳動であり、特にキャピラリーアレーゲル電気泳動装置は高速高スループットDNA分析システムとして広く用いられ、ゲノム解析にも用いられている。ゲノム配列解析に続いて注目されているのは遺伝子発現プロフィール分析や遺伝子中の1塩基置換(SNPs:single nucleotide polymorphisms)の分析である。種々条件下で発現している遺伝子を調べたり、種々固体の遺伝子変異を調べたりすることで遺伝子の機能や遺伝子と病気あるいは医薬品感受性との関連が調べられている。また、これらの蓄積された遺伝子に関する知識を用いて病気の診断などが行われつつある。
【0003】
病気の診断では未知の遺伝子の解析と異なり、既に知られた遺伝子やその変異の有無が検査対象である。これには安いコストで検査できることが望ましく、種々の方法が発達してきている。医療診断では単一の遺伝子による病気の診断から種々遺伝子と環境が影響して起こる病気や医薬品に対する感受性に関連した複数の遺伝子の検査が重要になりつつある。此処では何種類もの遺伝子を同時に検査することが重要である。従って一つの遺伝子や変異を検査するのでなく複数の遺伝子を検査する必要があるが、遺伝子の検査部位の増幅プロセスを含めて安価にSNPsなどを測定するシステムが求められている。このため、ゲノム解析に用いられたキャピラリーゲル電気泳動とは異なった簡便な方法が望まれている。SNPs分析や遺伝子のプローブ検査に使用できるシステムとしては、Invader assay,Taqman assay,DNA chip,pyrosequencing(Science 281, 363(1998))などが報告されている。前3者は蛍光標識を用いた検出方法であり、励起レーザー光源と光検出システムを持つ。Pyrosequencingは段階的相補鎖合成と化学発光を用いたシステムで、微量の核酸基質を順次注入するシステムと光検出システムを持つ。また、我々は最近、プライマーの3’末端近傍をターゲットのSNPs部位にハイブリダイズさせ相補鎖合成を進行させて得られるピロリン酸をATPに変えて化学発光させてSNPsを検出する方法を報告している。此処では3’末端のプライマーがターゲットにしっかりとハイブリダイズしたときにだけ相補鎖合成が起きる特性を利用して野生種のターゲットと変異種のターゲットを見分けている(生物物理化学 2001, 45: 219−225)。一方、ゲル電気泳動を用いたSNPs分析方法も普及してきている。もっとも簡便なのが4種類の蛍光標識ターミネーターを用いて1塩基相補鎖伸長を行いゲル電気泳動により、蛍光標識ターミネーターと蛍光標識DNAを分離して計測する(Bio Wave 17, 2−5(2001))。この方法は本発明に一番近いので詳しく説明する。PCRなどでコピー数を増幅したターゲットとなるDNAを用意する。解析に用いるのは2本鎖DNAでも1本鎖DNAでも良いが此処では話しを簡単にするために1本鎖DNAをターゲットとする。ターゲットの変位を観測しようとする部位の手前に3’末端が来るように設計されたプライマーをハイブリダイズして1塩基相補鎖合成する。この時相補鎖合成基質として4種の蛍光標識ターミネーターを加えておく。どの核酸基質(此処ではターミネーター)が取り込まれてもこれ以上相補鎖伸長はしない。相補鎖伸長したプライマーにはどれか一つだけ蛍光標識ターミネーターが取り込まれる。複数の蛍光体がプライマーに結合し合成相補鎖をつくることはない。生成した相補鎖伸長鎖はターゲットDNAに変位した塩基が合っても無くても同じ長さであり、変位の有無により標識蛍光体の種類が異なる。反応液中には未反応のたくさんの蛍光標識ddNTPがあるのでこのままでは蛍光検出できず、ゲル電気泳動により蛍光標識ddNTPと伸長した蛍光標識DNA鎖を分離し、色分解蛍光計測により変位(SNPs)の種類を決定する。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
医療診断のためのDNA検査方法としては(1)装置および試薬などのコストが安いこと、(2)高速高スループットの検出ができること、(3)同時に複数のDNA部位の診断をおこなえること、(4)1塩基の変異を識別検出できること、などが重要である。種々の方法の中で1塩基相補鎖伸長による方法は産物を質量分析したりキャピラリーゲル電気泳動により分析したりするもので広く普及している。しかし、質量分析装置は高価であり、また、計測自体は短時間で終わるものの測定にかけるための試料の準備に手間がかかるなどの難点があった。一方、キャピラリーゲル電気泳動を用いた方法ではDNAシーケンシングに用いている装置を使用しているため、泳動路長が長く検出に30−60分を必要とする。さらに、4種のターミネーター(ddNTP)をそれぞれ異なる蛍光体で標識したものを相補鎖合成基質として用いており、色分離機能を持った高価な計測装置が必要であった。これらは短時間で簡便にSNPs計測をしたり、高スループット分析をするには適しているとはいえず、新しいSNPs分析手法が求められている。
【0005】
【課題を解決するための手段】
これらの課題を解決するために、用いる蛍光体を一種類とし、検査用のプライマーをターゲットにハイブリダイズさせ相補鎖合成して得られるDNA鎖の長さがターゲットDNAに変位が有るが否かで変化する様にした。さらに、高速泳動を実現する為にゲル電気泳動路長の短いキャピラリーゲル電気泳動あるいはチップ上に設けたゲル電気泳動路を活用して1―2分以内に計測結果が得られる方法を提示する。
【0006】
まず発明の基本となっている方法について説明する。ここで用いる検出用のプローブ(プライマー)は変異種のターゲットと相補的な変異種用のプライマーと野生種のターゲットに相補的な野生種用のプライマーを混合したものである。野生種用のプライマーには10マーからなるポリT配列(他の配列でも良い)がついており、変異種用のプライマーよりも時間がかかって泳動する。すなわち電気泳動でこれらは分離検出できる。ターゲットとなるDNAにプローブ(プライマー)をハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼと反応基質dNTP(デオキシヌクレオチド3リン酸)および蛍光標識ターミネーター(ddNTP−f)を加えてDNA相補鎖合成をおこなう(dNTPは必ずしも必要でない)。プライマーの末端部分の変異部位に相補的な部分がマッチすれば蛍光標識ddNTP−fが取り込まれてプライマーは蛍光標識される。しかし、ターゲットの変異部位に相補的なプライマーの部分がマッチしていないと相補鎖合成は起こらず蛍光標識は取り込まれない。末端の変異部位に隣接するか、2塩基離れた部位の塩基をターゲットと相補的でない様にしておくと変異部のマッチミスマッチによる相補鎖合成のスイッチングをより確実に行うことができる。プライマーのターゲットにハイブリダイズする長さは20マー前後を用いた。野生型と変異型が含まれるヘテロタイプのターゲットでは2本の強度の等しいピークが現れる。一方、野生型だけあるいは変異型だけのホモタイプのターゲットでは1本のピークしか現れないのでどちらのピークか判定するために内部標準となる蛍光標識DNA鎖を少量加えておく必要がある。相補鎖合成しただけの反応産物をそのまま電気泳動すると蛍光標識核酸基質(dNTP−f)によるピークがスペクトル中に現れるのでこれを内部標準にしても良い。以下発明の詳細を開示する。
【0007】
【発明の実施の形態】
<実施例1>
第一の実施例は検査用プライマーの3’末端をターゲットの変異部位に一致させ、相補鎖合成により蛍光標識ターミネーター(dNTP−f)をプライマーに取り込み、流動性ポリマーを分離媒体として用いるチップ電気泳動あるいはキャピラリー電気泳動によるSNPsタイピングの例である。短時間でSNPsタイピングをするには泳動路長の短いゲル電気泳動を用いることが必要である。20マー程度の蛍光標識DNAを2−3分以内に分析するには泳動路長は3−10cm程度が良い。ガラスやプラスティックの表面に作製した溝を電気泳動路として用いるチップ電気泳動は安価な装置と短時間で泳動結果が得られる手段として使われており、日立電子エンジニアリングあるいはアジレントテクノロジーから装置が市販されている。現在はほとんどPCR産物の長さチェックなどの目的に使われる。DNAを蛍光標識したり、2本差DNAの間に入るインターカレーター色素を用いてDNAを染色したりしてレーザー誘起蛍光法で測定する。レーザーとして安価な赤色レーザーが便利であり、このレーザーで励起できるCy−5などの色素でDNAを標識して計測が行われる。簡便な装置では計測できる蛍光の種類は一つである。チップ電気泳動では泳動路長が短いこともあり、1塩基の鎖長差のDNAを識別することは難しい。そこでターゲットが野生型かあるいは変異型化によって、できるだけ鎖長に変化がでるように試料調製し計測すると短い泳動路のゲル電気泳動でSNPsのタイピングができる。本発明はこれを可能にする方法を提供するものである。
【0008】
10cm以下の短い電気泳動路でも分離できるように野生型にマッチするプライマーと変異型にマッチするプライマーとでは長さが変化するようにした。すなわち野生型のプライマーにはポリTからなるオリゴヌクレオチドを5’末端に付加し、電気泳動速度が変異型のプライマーより遅くなるようにした。両者の違いはこのポリT配列と変位部分の核酸の種類が野生型に相補的(野生型プライマー)か、あるいは変異型に相補的(変異型プライマー)かだけである。図1は本発明の原理説明図である。野生型プライマーと変異型プライマーを等しい濃度で含む検査用プライマーを用意する。野生型プライマーは5’末端に10マーから成るポリT配列を持つ。配列番号1〜8に例として用いたプライマーの配列と、配列番号9〜12にターゲットDNAの配列を示した。ターゲットDNAの注目する変異部の隣の塩基種に相補的なターミネーター(dNTP−f)、この例ではdTTP−f、とDNAポリメラーゼを加えて相補鎖合成を行う。プライマーの3’末端がターゲットと相補的である場合にはプライマーを起点として相補鎖が伸びる。相補的でない場合には相補鎖伸長は起こらないので蛍光標識は取り込まれない。この場合には1塩基伸長であるがdNTP(ターミネーターの塩基種を除く)と蛍光標識ターミネーターを加えて数塩基伸長して蛍光標識ターミネーターを取り込むようにしても良い。いずれの場合にも伸長する塩基長は野生型及び変異型で同じであるがターゲットがどちらであるかによって相補鎖伸長従って蛍光標識が取り込まれるか否かが決定される。DNAポリメラーゼとしてはThermo Seqenase DNA Polymerase(AmershamBiosciences)やSeqenase Ver.2 T7 DNA Polymerase(Amersham Biosciences)、Ambion製のExo−Klenowが使用できる。これらの酵素はいずれも遺伝子工学的に5’→3’エキソヌクレアーゼ活性と3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を無くしたものである。特に本発明に使用できる酵素の条件としては、プライマーの3’末端を削るエクソヌクレアーゼ活性(3’→5’エキソヌクレアーゼ活性)の無いことが重要である。これは、プライマーの3’末端とターゲットDNAがミスマッチの状態においてエクソヌクレアーゼによりプライマーの3’末端が削られると、野生型のプライマーと変異型のプライマーとで3’末端の構造に関係なく相補鎖伸長が可能となるためである。本発明の実施例では、プライマーの高次構造の影響で相補鎖伸長反応が起きづらくなる影響を除去する目的、2本鎖DNAでも野生型及び変異型の測定を可能とするために、耐熱性酵素であるThermo Seqenase DNA Polymeraseを用いる。蛍光標識はCy−5を用い、ddNTP−Cy5はアマシャムバイオサイエンスのThermo Sequenase Cy5 Dye Terminator Kit(各々、ddATP−Cy5:8.8μM、ddCTP−Cy5:7.0μM、ddGTP−Cy5:17.6μM、ddTTP−Cy5:14.3μMのストック)を用いた。
【0009】
ターゲットDNAは通常の方法に従って血液からDNAを抽出して、注目する部位をPCR増幅して用いた。すなわち、全血2mlに50mMのNaCl溶液18mlを添加して赤血球を溶血させる。4℃の条件で3500rpmで15分間遠心して沈殿を得る。得られた沈殿を50mMのNaCl溶液で洗浄し、白血球分画を得る。DNAzol(GBCO BRL)1ml添加し、細胞壁を溶解する。18Gの注射針付きのシリンジで溶液を出し入れしてゲノムDNAを短く切断する。遠心して不要物を除く。エタノール0.5mlと添加し攪拌後、遠心してゲノムDNAを回収する。70%エタノールでリンス後、400μlの水を添加し65℃で溶解する。10mg/mlのRnase Aを8μl添加し37℃2時間インキュベートしてRNAを分解する。フェノール・クロロホルム・アミルアルコール混合液を400μl添加し、酵素を失活させる。プロパノ−ル沈殿操作によりゲノムDNAを回収する。0.5×TE(pH8.0)200μlに溶解する。この操作でほぼ100μg/mlのゲノムDNA溶液を得る。一本鎖DNAを得るために、PCRプライマーの片方にビオチンをつけておき、アビジンを表面に固定した磁気ビーズでPCR産物を釣りだし、熱変性などで一本鎖にしてターゲットDNAとして用いた。すなわち、上記で調製したゲノムDNA試料1μlにキアゲン社のHotStarTaq添付の10×PCR緩衝液5μl、5mMのdNTPを2μl、PCR用の2種のプライマー(1pmol/μl)5μl、水37μl、HotStarTaq 0.25μlを添加し、95℃10分間加熱後、94℃で30秒間、57℃で30秒間、72℃で60秒間のステップを30回繰り返し、特定DNA領域を増幅する。PCR産物にはフリーのプライマーが混在し、後の時期ビーズを用いた1本鎖DNA調製の収率を低下させるため、QIAquick PCR purification kit (QIAGEN)を用いて取り除く。
【0010】
PCR産物(200〜500fmol)に磁気ビーズであるDynabeades (M280) Streptavidin (Dynal, 6.7×108 beads/ml)1μlと2M NaCl、1mM EDTA、0.02%NP−40、10 mM Tris・HCl (pH 7.5)の溶液25μlを添加し、25℃で30分間攪拌する。マグネットでPCR産物の結合した磁気ビーズを回収し、0.1 M NaOH 100μlに懸濁して5分間放置後、水洗し、ビーズに固定した1本鎖DNAあるいはNaOH溶液中に遊離した1本鎖DNAを得る。ビーズに固定した1本鎖DNA は10μlの水に懸濁して試料として用いる。NaOH溶液中に遊離した1本鎖DNAの場合は、直ちに3M酢酸で中和し、エタノール沈殿して10μlの水に溶解して試料として用いる。、各々にプライマー(10pmol)を添加し、Thermo Sequenaseの系で伸長反応を行わせ、Cy5ddNTPを取りこませ、電気泳動計測する。具体的には、10μl反応体積で、上記1本鎖DNA(0.4〜1pmolがベスト)に野生型と変異型用のプライマーを各々10pmolとターゲットDNAに対応する20〜40pmolのddNTP−Cy5 酵素に添付されている10×緩衝液1μlとThermo Sequenase 2ユニットを氷上で添加し、直ちに94℃30秒間、54℃30秒間、72℃30秒間のサイクルを30回行った後に、さらに72℃で2分間伸長反応を行う。伸長反応終了液5μlに1mMEDTA(pH8)を含むホルムアミド5μlを加え、80℃で3分間熱変成した後、氷冷する。全量を以下の電気泳動装置で電気泳動分離分析する。
【0011】
電気泳動分離は日立電子エンジニアリング製の電気泳動装置「コスモアイ」を用い、電気泳動部は日立化成製の「I−チップ」を用いた。これは流動性ポリマーを分離媒体に用いた電気泳動チップである。電気泳動路の長さは約4cmであり、数塩基の鎖長の差を分析するのは難しいが、10塩基鎖長の差があると分離分析可能である。図2は配列番号1のポリT部分の長さを変え、蛍光標識ターミネーターを3’末端に相補鎖合成で導入したDNA鎖の電気泳動スペクトルである。21は配列番号2に示した変異型プライマーで21マー、22は配列番号1記載の野生型プライマーのポリTの長さが2のもの、23は配列番号1記載の野生型プライマーのポリTの長さが5のもの、24は配列番号1記載の野生型プライマーのポリTの長さが9のものである。ポリTの長さが5塩基以上では変異型プライマーと野生型プライマーとを良く識別できる事が分かる。ゲル電気泳動に要する時間は1−2分である。ポリTの長さを20マー以上に長くすると電気泳動時間は長くなり、ddNTP−fの信号と重なる事が在り望ましくない。蛍光標識されたプライマーの現れる位置は背景蛍光も無く精度の高い測定が行える。
【0012】
上記の他種々のSNPsについてタイピングを行った。この結果、十分な精度で1−2分以内にタイピングできる事が確認された。電気泳動の場合、電気泳動時間は条件により変化する事があり、単独のピークが観測された場合にこれが変異型なのか野生型なのか判断しにくい難点がある。しかし、この場合には残存する蛍光標識ddNTP−fが現れるのでこれを基準にして判別できる利点がある。また、ddNTP−fはプライマーによる信号より後にでるので相補鎖合成サンプルを精製処理すること無しに計測試料とすることができる便利さがある。
【0013】
このようにして調製したゲノムDNAから本発明のSNP検出ができることを確認しているが、以下の実施例では本発明に直結する部分を説明するために、テンプレートとしては配列番号9−12に示した配列のDNAを化学合成したものをモデルとして用いた。
サンプル1:5’−CCGAG GCATAGTAGA C/T GACTGGATAT AGGGACCTAC−3’(配列番号9)
サンプル2:5’−AAAAT ATAAAATAAA G/C ATGGTACTAT ATTGGTAAGA−3’(配列番号10)
サンプル3:5’−GGAGG CTGAGGTGGG T/C GGATCACGAG GTTAGGAGTT−3’(配列番号11)
サンプル4:5’−TTGGT CCCTGTCCTA G/T TGGTCGAGGA ATTCTAATGC−3’(配列番号12)
【0014】
サンプル1ではプライマーとして野生型 3’−GcAgacctatatccctggatgtttttttttt−5’(配列番号1)を用いる。一方、変異型プライマーには3’−AcAgacctatatccctggatg−5(配列番号2)を用いる。これらを1:1の割合で混合したものが検査用のプライマーである。これはターゲットサンプルの変異位置より3’末端側にハイブリダイズする。プライマーの3’末端は変異部位に来るように設計されている。プライマーの3’末端から3塩基目にはターゲットとミスマッチするように塩基種を選んでいる。これは、変異部位の塩基種のミスマッチによりプライマーの3’末端が非常にはがれ安くなり、相補鎖合成が完全にブロックされる様にするためである。このような人工的なミスマッチ塩基種をプライマーに入れないときには3’末端だけのミスマッチでは相補鎖合成が部分的に進行して精度の高いタイピングができない事が在るためである。加える蛍光標識ターミネーターはddTTP−fである。
【0015】
サンプル2,3,4に対応した野生型及び変異型プライマーと蛍光標識ターミネーターは以下の通りである。
サンプル2:
野生型プライマー 3’−CtTccatgatataaccattcttttttttttt−5’(配列番号3)、
変異型プライマー 3’−GtTccatgatataaccattct−5’(配列番号4)、
ターミネーター ddTTP−f
サンプル3:
野生型プライマー 3’−AcGtagtgctccaatcctcaatttttttttt−5’(配列番号5)、
変異型プライマー 3’−GcGtagtgctccaatcctcaa−5’(配列番号6)、
ターミネーター ddCTP−f
サンプル4:
野生型プライマー 3’−CaGcagctccttaagattacgtttttttttt−5’(配列番号7)、
変異型プライマー 3’−AaGcagctccttaagattacg−5’(配列番号8)
ターミネーター ddTTP−f
である。
【0016】
ここでは一種類のターミネーターだけを用いたが、ターミネーターに加えて残り3種の核酸基質dNTPを加えた試薬キットを用意しておけば全てのSNPsに対応できる。この場合、相補鎖合成の長さはターゲットにより変化し、数塩基伸びてからターミネーターが取り込まれて相補鎖合成が停止する場合もあるがこの場合でも変異種と野生型の鎖長の差は10塩基である。
【0017】
<実施例2>
第2の実施例はプライマーとして変異部分の数塩基先に3’末端が来るものを用いた例である。サンプル1を例にプライマー末端の構造を説明する。プライマーの末端から3塩基目がターゲットの変異部位に一致する様にプライマーを作る。サンプル1の場合には
野生型プライマー 3’−ctGGtgacctatatccctggtttttttttt−5’(配列番号13)
変異型プライマー 3’−ctAGtgacctatatccctgg−5’(配列番号14)
である。3’末端から3塩基目はターゲットを認識して相補鎖合成を行うか否か判別する塩基である。此処では4塩基目にミスマッチ塩基種G(本来C)を入れて、3塩決めがミスマッチの時には3’末端がはがれて相補鎖合成が起こらない様にした。この人工的なミスマッチは2塩基目に入れても良い。注目する変異部位がプライマーの塩基とターゲットの塩基種とで相補的か否かで末端のハイブリダイゼーションの安定度が変化して相補鎖合成能力がコントロールできれば良いので、いろいろな変形が採用できる。相補鎖合成基質としてddTTP−fを入れておけば1塩基伸長して反応は停止するので生成物は野生型の場合3’−T(−f)ctGGtgacctatatccctggtttttttttt−5’であり、変異型の場合 3’−T(−f)ctAGtgacctatatccctgg−5’である。此処で(−f)は核酸塩基Tに蛍光体が付いていることを示す。相補鎖合成基質としてdNTPとddNTPの混合物たとえばddCTP−f, dTTPを用いることもできる。この場合、dTTPおよびddCTP−fが一つずつ取り込まれて2塩基伸長し、生成する蛍光標識断片は野生型の場合3’−C(−f)tctGGtgacctatatccctggtttttttttt−5’、変異型の場合 3’−C(−f)tctAGtgacctatatccctgg−5’である。これらはいずれもddCTP−fよりも早く電気泳動し、2分以内に結果を知ることができる。蛍光体がCy5やCy5.5やTexasRedでは、ddNTP−fが蛍光標識断片より遅く泳動される条件を作ることができる。これは、蛍光体のチャージに強く依存しており、フルオレッセインのようなマイナスチャージを持つ蛍光体ではddNTP−fが早く泳動するのでこれは成立しない。
【0018】
<実施例3>
第3の実施例はSNPsの頻度解析の例である。個人のSNPs解析の場合には現れるスペクトルパターンは野生型ホモ、変異型ホモおよびヘテロの3種である。此処では変異種が何%入っているかなどの詳しい定量分析は不要である。測定対象がこれら3つのいずれに属するか決めることをSNPタイピングと言っている。SNPsと医薬品感受性あるいは病気に関する感受性との関連を調べるには数万人にもなる非常に多くの患者のSNPsを調べてこれら感受性との相関関係を調べる必要がある。SNPsのかずは数百万と言われているのでひとつ筒これを調べると大変な労力が必要である。そこで、患者サンプルを症状毎にあるいは医薬品応答のタイプ毎に混合してSNPsを測定して病気や医薬品に対する応答とSNPsの関連を調べることが良いスクリーニング方法として考えられている。これには変異ターゲットと野生型ターゲットを鋳型として同時に同じ条件で相補鎖合成して得られる産物を分離して精度良く検出する必要がある。相補鎖合成とゲル電気泳動を用いるSNPsタイピング方法として使われている4種の蛍光標識ddNTPを用いて相補鎖合成して1塩基伸長する方法では野生型から得られる相補鎖も変異型から得られる相補鎖も同じ塩基長であり電気泳動分離したときに得られるピークが重なる。これらを色分離検出して相対的な存在比を計算するが誤差が大きい難点がある。本発明では同じ色素で同じ条件下で相補鎖合成して電気泳動分離して同じ検出器で検出するので定量的な評価にはより適した方法である。短時間で電気泳動を完了するチップ電気泳動を用いてもDNA鎖長が10塩基以上離れるとピークは完全に分離できるので定量検討に適している。図3は変異型プライマーの信号強度(Im)および野生型プライマーの信号強度(Iw)の和(Iw+Im)を母数にして変異型の信号強度(Im)割合を表した検量線31である。32のポイントが変異型1%のプロットである。この結果より1%以下の精度で分析できる事がわかる。変異株の存在量と信号強度が比例関係にあることから、本方法が変異株の存在比を調べるのに有効である事が分かる。このような分析はプールサンプル分析として特に重要視されているが良い方法がなく新たな方法が望まれていたものである。存在量の少ないSNPsの頻度解析には野生型プライマーに対して変異型プライマーを相対的に多く入れて測定することも有効である。これにより、変異型のプライマーに蛍光標識が導入された相補鎖伸長産物が多く生成して少ない頻度で現れる変異型をより簡単に計測できる。
【0019】
<実施例4>
本実施例は複数のサンプルを同時にタイピングする例である。この場合、複数の変異部位に対応した信号を分離検出してピークの同定をする必要がある。電気泳動スペクトルの横軸すなわち電気泳動時間は条件によって変化するので、その都度標準物質を同時に電気泳動するなどしてピークの同定をする必要がある。より簡単に観測された信号が変異種のターゲットによるのか、野生型のターゲットによるのか同定するのに都合の良い方法を開示する。
【0020】
通常電気泳動スペクトルに現れるパターンは1本のピークである。ピークの形状を変えて識別できるようにすれば標準物質などを用いなくても、また、野生型に起因するピークと変異型に起因するピークの間隔を短くしても識別検出できる。本実施例では、野生型のプライマーを2つの異なる長さのポリTを付加したプライマー(異なる泳動速度のプライマーであればよい)から構成し、スペクトル上でピークに特徴ある形を作るようにした。より具体的にサンプル1に対する野生型のプライマーで示すと
野生型プライマー 3’−ctGGtgacctatatccctggtttttt−5’(配列番号15)
および 3’−ctGGtgacctatatccctggttt−5’(配列番号16)
であり、比率を2:1の5 pmolと2.5 pmol(50μlスケール)とした。一方、変異型プライマーは3’−ctAGtgacctatatccctgg−5’ (5 pmol)(配列番号14)である。ここで、野生型プライマーに付けるポリTの長さは3塩基及び6塩基であり前の実施例より短くしてある。得られるスペクトルパターンは図4に示したように形から変異種と野生型を容易に識別できる。調べようとするSNPsが複数ある場合には、まず、ゲノムから前期と同様に目的とする領域を複数DNA断片同時PCRなどで増やした後、前期と同様にターゲットのDNA鎖を1本鎖として取り出す。各SNPsに対応する検査用プライマーをサンプルと混合しハイブリダイゼーションを行う。Cy−5(異なる蛍光体を用いても良い)で標識された4種のdNTP−fを加えて相補鎖合成する。もちろん、ddNTP−fとdNTPあるいはdNTP−fとddNTPの組み合わせでも良い。検査用のプライマーはSNPsの種類ごとに異なる位置に蛍光標識された相補鎖合成産物が現れるようにプライマーの長さや泳動速度を調製しておく。図5は複数(3種)のサンプルを測定した例である。51、54、57が変異型のピーク、52と53の組、55と56の組、58と59の組が51、54、57に対応する野生形のピークである。どのSNPsについても必ず野生型か変位型のピークが観測される。場合によっては両方の信号が観測される。ピーク形状の違いに注目するとヘテロタイプのサンプルでは真ん中が低く、量端が高い3本のピークで並んでいることになる。ホモの場合にはいずれかの高いピークが消失する(変異型では低いピークも消失)ので容易にSNPsのタイプを判別でき、全てのSNPsが同定できる。
【0021】
<実施例5>
ここではSNPsタイピングを中心に有効性を述べたが、一般の遺伝子タイピング(検査対象のDNA中に目的とする配列を持ったものがあるか否かを調べること)にも応用可能である。検査しようとする部位にハイブリダイズする種々長さのプローブを用意する。電気泳動パターンとして現れたときにどのピークが何に相当するかわかるように、いくつかのプローブについてはターゲットにハイブリダイズする部分の配列は同じで5’末端にTやAを1−2塩基付加したプローブ(プライマー)を一定の比率で混合しておく。スペクトルパターン中にはこの混合比を反映したピーク型が現れるので種々のピークが同時に現れても、また、電気泳動速度が変化して単純に泳動時間からピークの同定が困難な場合でも、形状からピークの同定が容易である。複数のDNAプローブが一度に電気泳動すると分離能などの点で問題となる場合もあるが、この場合、グループ分けしたサンプルを時系列的に電気泳動分離して連続して分離解析することもできる。特に電気泳動時間が短いので繰り返し測定してもあまり多くの時間を必要としない利点がある。
【0022】
【発明の効果】
以上説明したように本発明では一つのターゲットDNA配列部位に対して長さの異なる二つのプライマー(プローブ)を同時に用いてターゲットにハイブリダイズし、ハイブリダイズしたものについて相補鎖合成可能な条件のものについて同じ塩基数だけ相補鎖合成すると共に蛍光標識を取り込み、短い電気泳動、早い電気泳動で短時間に分離検出ことで、簡便、高スループット、低価格機器の使用などを実現するものである。SNPs分析の場合について言うと、2つのプライマーすなわち野生型ターゲットDNAにマッチする野生型プライマーと変異型ターゲットにマッチする変異型プライマーを混合したものを検査用のプライマーとして用いて相補鎖合成により蛍光標識核酸をプライマーの末端に導入する。この時ターゲットにマッチしたプライマーにだけ蛍光標識核酸は導入される。変異型プライマーと野生型プライマーとでは長さが異なるように作られており、短いゲル電気泳動で短時間に分離検出する事ができる。相補鎖合成はターゲットにマッチしたプライマーにだけ起こるが、この場合に伸びる塩基数は野生型と変異型で同じである。そこで長さの違いから容易にどちらのプライマーか区別することができる。此処では野生型プライマーの5’末端にポリTをつけたが、DNA以外の原子団をつけて電気泳動速度を変化させても良く、いずれの場合も短時間で電気泳動分離できるものである必要がある。この結果1―2分で変異の有無を調べる事を可能とした。泳動路を100本持った装置を使用し、測定サイクルを長めに見て3分とすると1時間で2000の変異測定が可能である。また、一日10時間稼働すると2万のSNPsタイピングを可能とする高スループットSNPsタイピングを可能とする。さらに、SNPsと医薬品感受性の関連研究で重要となる変異DNAの存在比計測にも活用できる方法であり、DNA検出分野に大きく貢献する方法である。
【0023】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> HITACHI, LTD.
<120> A method for testing a gene
<130> H200747
<160> 16
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>1
cttccatgat ataaccattc tttttttttt t 31
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>2
acagacctat atccctggat g 21
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 10 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 10
<400>3
cttccatgat ataaccattc tttttttttt t 31
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 10 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>4
gttccatgat ataaccattc t 21
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 11 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 11
<400>5
acgtagtgct ccaatcctca attttttttt t 31
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 11 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 11
<400>6
gcgtagtgct ccaatcctca a 21
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 12 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 12
<400>7
cagcagctcc ttaagattac gttttttttt t 31
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 12 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 12
<400>8
aagcagctcc ttaagattac g 21
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA template
<400>9
ccgaggcata gtagaygact ggatataggg acctac 36
<210>10
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA template
<400>10
aaaatataaa ataaasatgg tactatattg gtaaga 36
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA template
<400>11
ggaggctgag gtgggyggat cacgaggtta ggagtt 36
<210>12
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA template
<400>12
ttggtccctg tcctaktggt cgaggaattc taatgc 36
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>13
ctggtgacct atatccctgg tttttttttt 30
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>14
ctagtgacct atatccctgg 20
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>15
ctggtgacct atatccctgg tttttt 26
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>16
ctggtgacct atatccctgg ttt 23
【0024】
【配列表フリーテキスト】
配列番号1:配列番号9に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号9に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号2:配列番号9に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号9に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号3:配列番号10に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号10に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号4:配列番号10に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号10に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号5:配列番号11に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号11に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号6:配列番号11に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号11に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号7:配列番号12に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号12に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号8:配列番号12に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号12に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号9:DNA鋳型
配列番号10:DNA鋳型
配列番号11:DNA鋳型
配列番号12:DNA鋳型
配列番号13:配列番号9に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号9に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号14:配列番号9に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号9に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号15:配列番号9に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号9に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号16:配列番号9に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号9に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の原理説明図である。
【図2】種々ポリTを用いて分離能を調べた図である。
【図3】SNPsの定量分析のための検量線を示す。
【図4】スペクトルパターンでピークを識別する結果を示した図である。
【図5】混合分析の模式図である。
【符号の説明】
11;検査プライマーのターゲットと相補的な部分
12;プライマーがハイブリダイズするターゲットの配列部分
13;蛍光標識
14;ポリTの付いてない変異型ターゲットを調べるための変異型プライマーに蛍光標識核酸が付加したオリゴマーによるピーク
15;ポリTの付いている野生型ターゲットを調べるための変異型プライマーに蛍光標識核酸が付加したオリゴマーによるピーク
21;変異型プライマーから得た蛍光標識1塩基伸長産物
22;TTTを付加した野生型プライマーから得た蛍光標識1塩基伸長産物
23;TTTTTTを付加した野生型プライマーから得た蛍光標識1塩基伸長産物
24;TTTTTTTTTTを付加した野生型プライマーから得た蛍光標識1塩基伸長産物
25;T20(Tが20つながったもの)を付加した野生型プライマーから得た蛍光標識1塩基伸長産物
41;一種の変異プライマーを用いて得られるピークパターン
42;2−3マーの異なるポリTを持つ野生型プライマーを混合して得られるピークパターン
51;ヘテロタイプのSNPs検査部位1から得られるパターン
52;変異型のSNPs検査部位2から得られるパターン
53;野生型のSNPs検査部位3から得られるパターン
Claims (8)
- 変異型にマッチする第1のプライマーと野生型にマッチする第2のプライマーとの混合物を遺伝子検査プローブとして用いDNA配列の検査部位に対して相補鎖伸長反応を行い、該伸長反応に際して蛍光標識を取り込み、蛍光標識DNA鎖を得、さらに当該蛍光標識DNA鎖を電気泳動により分離する工程を含み、第1のプライマーと第2のプライマーとの間で検査部位における少なくとも1つの核酸が異なり、第1のプライマーまたは第2のプライマーは電気泳動における泳動速度を変えるために付加的な他の配列を有し、第1のプライマーおよび第2のプライマーはいずれも前記検査部位における核酸および付加的な他の配列以外は同一の塩基配列を有し、蛍光標識DNA鎖中の蛍光標識は同じ色素である遺伝子検査方法。
- 第1のプライマーと第2のプライマーとの間で検査部位における複数の塩基が異なり、第1のプライマーおよび第2のプライマーの伸長した鎖の長さが異なるものである請求項1記載の遺伝子検査方法。
- 相補鎖伸長反応の際に蛍光標識デオキシヌクレオチド3リン酸(dNTP)またはジデオキシヌクレオチド3リン酸(ddNTP)が取り込まれ、相補鎖伸長の生成物が蛍光検出により検出される請求項1記載の遺伝子検査方法。
- 電気泳動がマイクロチップ電気泳動であり、泳動路が溝を切ることによりまたはキャピラリーを設けることにより形成され、それぞれの泳動路長が10cm未満である請求項1に記載の遺伝子検査方法。
- 第1のプライマーおよび第2のプライマーの3’末端または3’末端領域はターゲットにマッチさせるに際し検査すべき変異部位とハイブリダイズするよう設計され、相補鎖伸長反応に際して蛍光標識ddNTPまたは蛍光標識dNTPが取り込まれる請求項1に記載の遺伝子検査方法。
- 相補鎖伸長反応により蛍光標識核酸基質とともに取り込まれたDNA鎖が電気泳動に際して蛍光標識核酸基質より早く泳動する請求項1に記載の遺伝子検査方法。
- ゲルあるいは流動性ポリマーを用いた電気泳動による遺伝子検査方法であり、一組のプライマーを用いて1塩基あるいは数塩基の相補鎖伸長反応を行い、さらに蛍光標識の取り込み後に電気泳動分離で見られるDNAバンドの電気泳動パターンのピーク形状を観測する工程を含み、当該プライマーは少なくとも検査部位における核酸および付加的な他の配列以外は同一の塩基配列を有し、蛍光標識DNA鎖中の蛍光標識は同じ色素であり、前記ピーク形状は各ターゲット部位の種類によって異なるものであることを特徴とする遺伝子検査方法。
- 第1のプライマーと第2のプライマーの伸長鎖の長さが異なる請求項7に記載の遺伝子検査方法。
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