CN100588953C - 生物芯片检测单核苷酸多态性的方法 - Google Patents

Abstract

一种生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其首先对核酸样本进行扩增，得到扩增产物；再进行液相杂交和连接酶反应，使液相杂交中的完全匹配探针和通用探针连接，以检测单核苷酸的多态性；然后进行固相杂交，将5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针与生物芯片进行杂交，温度25℃-75℃，时间0.5h-36h，检测基团被分配到生物芯片的不同位置；进行单核苷酸多态性检测，得检测结果。本发明解决了背景技术中难以实现高通量检测、检测成本高的技术问题。本发明具有简便、快速、灵敏、特异性高等特点，应用范围广泛，可检测多种单核苷酸多态性位点。

Description

生物芯片检测单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于一种与基因检测相关的领域，适用于核酸分子上特定位点的核苷酸鉴别，具体涉及一种生物芯片检测单核苷酸多态性的方法。

背景技术

2001年单核苷酸多态性协作组(The SNP Consortium)构建了含1.42×10⁶个SNP、密度达每1.9kb片段内含有一个单核苷酸多态性位点的人类遗传图谱，这对开展致病基因和人类起源与进化的研究非常重要。据估计，大约有10万个SNP分子标记将被用于基因功能及与疾病相关的研究。如此庞大的分析需求，对检测技术提出了极高的要求。

目前，对于等位基因的单核苷酸多态性的常见检测方法主要有以下几种：

等位基因特异扩增法，是在聚合酶链式反应体系中使所设计的引物1的3′端与一条待测等位P基因的序列互补，而与另一条等位基因(Q基因)的序列不互补；在聚合酶链式反应扩增时，扩增出P基因。依此，设计引物2与Q基因的序列互补，再分别将扩增产物进行电泳。该方法虽然可检测出单核苷酸多态性，但操作步骤繁琐，对引物设计要求较高，因此，操作难度和工作量较大。

双向特定等位基因PCR扩增法，与等位基因特异扩增法原理相同，不同之处在于所设计的引物为4条，即：引物F1与待测等位X基因的5′端序列互补；引物R2与待测等位Y基因的3′端序列互补；引物R1位于X基因序列的中下游，其3′末端为X；引物F2位于5′基因序列的中上游，其3′末端为Y。X、Y分别代表多态位点。在聚合酶链式反应扩增时，可同时扩增出两条包含有单核苷酸多态性位点的寡核苷酸序列。经过一次聚合酶链式反应即可鉴定目标基因。该方法操作虽简单、经济，但由于是在液相中进行，多重平行反应数量有限，故难以实现单核苷酸多态性的高通量检测。

引物延伸法(primer extension)，是依赖DNA聚合酶来分辨碱基多态性位点的一类方法，其特异性比建立在等位特异性杂交的方法要高。这类方法有多种名称，如：微测序(Minisequencing)、单核苷酸引物延伸(single nucleotide primer extension，缩写为SnuPE)、引物指导的核苷酸合成(primer-guided nucleotide incorpration)、基于模板指导末端荧光掺入技术(template directed dye terminator incorpration，缩写为TDI)等。其中，微测序(Minisequencing)最为常用。微测序反应首先扩增出含有单核苷酸多态性位点的一段DNA，然后进行微测序反应，加入一检测引物，其3′末端碱基紧挨于多态性碱基，在DNA聚合酶及标记的ddNTP的存在下进行一个碱基的延伸反应，延伸的这个碱基就是多态性碱基。因为聚合酶链式反应引物会和延伸引物竞争，产生多个扩增片段，而多余的dNTP会使延伸反应延伸多个碱基。所以，微测序反应前必须对聚合酶链式反应产物进行纯化，以去除其中含有的聚合酶链式反应引物及dNTP。引物延伸产物的检测有放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法及质谱分析法、变性高压液相色谱法等多种方法。但这些方法均不同程度的存在成本高、操作繁琐的缺陷或不足。如：放射性同位素标记法，发光检测法的自动化程度较高，且较方便，但所需设备的成本较高；凝胶为基础的荧光检测法制作过程繁琐费力。

基于等位基因特异核苷酸片段(Allele specific oligonucleotide，缩写为ASO)杂交基础上对单核苷酸多态性进行分析的方法，是最简单的基于杂交原理的检测方法。其根据短的核苷酸探针和互补的目的片段进行杂交时，在完全匹配和有错配两种情况下杂交复合体稳定性的不同，将单核苷酸多态性位点检测出来。这种方法首先要设计一段短的核苷酸探针，一般为15-20bp，其中包括了单核苷酸多态性位点；当其与样品DNA杂交时，由于在20bp中一个碱基的差异会导致Tm值下降5-7.5度，所以，通过严格控制杂交条件，就可以鉴定出样品DNA中是否存在单核苷酸多态性。缺点是杂交的严格性不易控制，不能更准确地区分出单核苷酸多态性位点。

为了提高杂交的严格性，以更好的区分出单核苷酸多态性位点，则需采用修饰过的核苷酸探针和样品DNA杂交，例如：利用肽核酸(Peptide nucleic acids，缩写为PNA)探针。但由于肽核酸作探针可溶性差，所以反应不易进行。而且，探针的长度至少应是7个碱基，才能确保在室温下较好的杂交。对富含鸟嘌呤罗丹明标记的探针，还存在本底荧光(FP)信号高的问题等。有报道在探针内人为地插入错配碱基(3′-nitropyrrole)，用这种含有错配碱基的探针杂交时，探针和目的片段之间一个碱基的差异导致Tm值的下降是传统杂交的2倍，可以提高杂交的特异性。但该方法需要严格控制杂交条件，而且检测的精确性不高。

TagMan技术，是基于杂交原理、按常规聚合酶链式反应方式进行体外基因扩增的方法。该方法是在聚合酶链式反应体系中加入针对单核苷酸多态性位点及侧翼序列设计的探针，探针只有一个碱基的差异，分别对应于不同的等位基因，并用荧光标记探针，探针末端被磷酸化，以防止探针在扩增过程中被延伸该探针能与目标序列进行特异性结合。探针完整时，由于淬灭基团的存在，通过荧光共振能量转移(FRET)技术作用，可使荧光标记不发荧光；当进行聚合酶链式反应扩增时，利用TagMan DNA聚合酶5′-3′端的外切酶活性，将探针5′端荧光标记从探针上切下来，释放出荧光信号。由于是在聚合酶链式反应过程中进行的，无需分离或洗脱过程，减少了聚合酶链式反应污染的可能性，且扩增产物分析简便、快捷、准确，无需电泳，实验速度高。但，由于所设计的探针仅有一个碱基的差异。检测结果存在假阳性，所以，操作方法复杂，检测成本高，不适于推广应用。

现有技术还存在如下缺点：

1.检测的工作量大和时间长。采用普通聚合酶链式反应、荧光定量聚合酶链式反应等单核苷酸多态性检测方法，一次只能针对一种或几种单核苷酸多态性位点进行检测，很难进行大量、多种单核苷酸多态性位点的同时检测。

2.传统生物芯片上固定的探针都是物种特异的探针，因此芯片所能检测的物种是固定的，若想更改或添加检测对象只能重新制作芯片。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其解决了背景技术中难以实现高通量检测、检测成本高的技术问题。

本发明的技术解决方案是：

一种生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：该方法的实现步骤如下

1)对核酸样本进行扩增

取核酸样本，进行扩增反应，将少数含多态性位点的核酸片断扩增成大量含有同样多态性位点的核酸片断，得到扩增产物；

2)进行液相杂交和连接酶反应

(1)进行液相杂交：加入区别探针和通用探针，与扩增产物进行液相杂交，得经液相杂交的扩增产物；

(2)进行连接酶反应：进行连接酶反应，使液相杂交中的完全匹配探针和通用探针连接，以检测单核苷酸的多态性；

3)进行固相杂交：将5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针与生物芯片进行杂交，温度25℃-75℃，时间0.5h-36h，检测基团被分配到生物芯片的不同位置；

4)进行单核苷酸多态性检测：检测生物芯片不同位置上检测基团的荧光种类、亮度及分布，得检测结果。

上述连接酶反应可采用高温连接酶反应，实现步骤如下：

1)对经液相杂交的扩增产物进行纯化，除去扩增产物中多余的酶与引物；

2)进行连接酶反应：采用耐高温连接酶，在PCR仪中进行变性、连接循环过程，完全匹配探针与通用探针进行连接，成为一条5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针。采用耐高温连接酶，反应速度快，连接效率高。

上述纯化采用PCR产物纯化试剂盒、酚氯仿抽提法、磁球分离法或碱性磷酸酶和外切酶I处理法等对扩增产物进行纯化均可，以采用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增产物的方法操作简单，且纯化效率高。

上述连接酶反应可采用普通连接酶反应，实现步骤如下：

采用普通连接酶，0℃-25℃温度下，完全匹配探针与通用探针进行连接，成为一条5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针。采用普通连接酶，扩增产物不需要纯化，可直接连接。

上述区别探针是具备下列条件：

1)根据每一个多态性位点的碱基变化，采用与之相应的二至四条区别探针；

2)每条区别探针的5′端均是带有不同碱基序列的标签探针，可与固定在生物芯片上对应的标签互补探针发生特异性杂交；

3)其中一条区别探针是完全匹配探针，其3′末端的碱基可与扩增产物中多态性位点杂交；

4)其余区别探针是不完全匹配探针，其3′末端的碱基不与扩增产物中多态性位点杂交；

5)每条区别探针的中间部分与扩增产物的序列碱基部分互补。

上述通用探针是具备下列条件：

1)每个多态性位点采用一条与之对应的通用探针；

2)通用探针5′端带有磷酸基团；5′端的第一个碱基与多态性位点后的第一个碱基互补；

3)通用探针3′端带有可被检测系统识别的检测基团。

4)通用探针中间部分与扩增产物的序列碱基部分互补。

上述检测基团可以是荧光素、若丹明、绿色荧光蛋白、量子点、胶体金、磁球或生物素。检测基团优选Cy3，其操作方便，可直接检测，且灵敏度高。

上述对核酸样本进行扩增采用聚合酶链式反应或恒温扩增等均可。恒温扩增无需温度变化的循环过程，所需仪器简化，反应时间短。

上述生物芯片可采用原位合成法、针点法或喷墨法等方式制成，所述生物芯片的固相载体可以是微球、尼龙膜、醋酸纤维膜或玻璃片等。能确保标签互补探针高效固定与其上的固相载体均可。采用针点法制成的生物芯片，生物芯片制作过程操作较简单。玻璃片作为固相载体，操作简单，标签互补探针固定效率高，成本低。

上述进行单核苷酸多态性检测采用直接检测或间接检测均可。

上述固相杂交以温度60℃、时间1h为佳。该温度下不仅固相杂交的时间短，且效率高。

发明具有以下优点：

1.杂交效率高，非特异性结合率低。

本发明将核酸扩增、连接酶反应(LDR)和生物芯片有机结合，特异性强，杂交效率高，交叉杂交，非特异性结合率低。

2.准确率高，假阳性率低。

采用生物芯片检测，准确率高，假阳性率低。

3.低成本，操作简便。

本发明通过聚合酶链式反应对原始核酸样本进行扩增，通过连接酶反应检测扩增后DNA核酸样本中单个核苷酸的差别，通过与生物芯片杂交来检测杂交信号，得到检测结果，在降低成本的同时，简化了操作步骤。

4.可检测多种单核苷酸多态性位点。

本发明在生物芯片表面固定大量的标签互补探针(antitag)，不同的标签互补探针对应不同的单核苷酸多态性位点，因此，可以同时检测上千种不同的单核苷酸多态性位点。

5.在检测多种单核苷酸多态性位点时兼具高通量的特点。

高通量可大大减少单核苷酸多态性位点检测的工作量和时间，在对多种单核苷酸多态性位点进行检测的时候，优势显著。例如，检测20种不同的病原微生物的单核苷酸多态性位点，大约只需16小时，其中8小时的杂交时间无需工作人员操作，不仅节约了一半时间，也大大减少了工作量。若要检测上千种单核苷酸多态性位点，优势更为显著。

6.检测准确性高。

本发明采用连接酶反应技术检测核酸样本并进行标记，能充分保证最终结果的准确性。连接酶反应技术采用两类探针来检测一个位点，其中一类探针连接检测基团，另一类连接标签探针(tag)。在两条探针和核酸样本的扩增产物杂交时，当且仅当两条探针和核酸样本的扩增产物完全匹配时，在连接酶的作用下，两条探针之间的5′磷酸基团和3′羟基基团发生连接，最终使检测产物带上检测基团。由于连接酶反应技术使用了两条探针，好比“双保险锁”，在连接酶反应中是两条探针必须都和核酸样本的扩增产物完全匹配，接下来的连接反应才能正常进行。即，由两条探针确定一个核酸序列，检测一种多态性位点，因此，精确性大大提高，避免了假阳性结果。

生物芯片上发生的杂交反应是在标签探针和标签互补探针之间进行的。交叉杂交(cross hybrization)是生物芯片杂交过程中的瓶颈问题。由于生物本身基因组的限制，无法设计出特异性高且杂交效率相同的探针，但本发明的生物芯片却能解决这一问题。因为最终杂交的标签互补探针是一种随机序列，是通过软件筛选出来的，只和与它碱基互补的标签探针发生杂交，而和任何的其他探针都不杂交。由于这些标签互补探针的序列都是高通量筛选出来的，在设计过程中可保证其具有非常接近的熔点(Tm)，即可以采用同样的杂交温度，因此保证了探针在统一的温度下，都具有一样的杂交效率。为提高特异性，探针在设计时通常都具有较高的退火温度，可达65℃，以保证在较高的温度进行杂交，可大大降低非特异性杂交的可能，进一步提高检测的准确性。

7.检测灵敏度高。

本发明采用液相杂交和固相杂交结合的杂交方法，可充分保障杂交的准确性。在杂交反应的第一步是带有标签探针的区别探针和通用探针与核酸样本的扩增产物杂交，反应在液相里进行。液相杂交的优点是探针可以和核酸样本的扩增产物最大空间地接触，空间位阻减小，探针捕获核酸样本的扩增产物的能力大大提高，因此杂交效率提高。也就是说相同数量的探针可以捕捉到更多的核酸样本的扩增产物，灵敏度得以提高。

液相杂交反应液和生物芯片进行杂交，实质是生物芯片上固定的标签互补探针与液相杂交反应液的标签探针进行杂交，这两段探针可以避免和其他探针错配，杂交的灵敏度较传统的生物芯片探针高很多，加上其退火温度较高，杂交的效率大大提高，因此，本发明的检测灵敏度也得到进一步提高。

8.检测速度快。

由于本发明生物芯片上固定的标签互补探针的熔点值较高，并且标签互补探针和标签探针之间的杂交特异性非常高，所以固相杂交的时间只需1小时，大大缩减了检测时间。

9.具有系统的开放性。

本发明中固定在生物芯片上的探针是和检测对象无关的标签互补探针，改变检测对象只需更换液相杂交体系中的探针即可，而固定在生物芯片上的探针则无需更换，所以制成的生物芯片可用于不同的单核苷酸多态性的检测。

10.成本低。

生物芯片最大的成本来自探针，而本发明中的生物芯片由于其本身的特性，避免了重复点制芯片，可节约探针的成本。

一般，杂交时探针越长，杂交的准确度、可信度越高。本发明在确保标签探针和标签互补探针特异性杂交的效率很高的情况下，芯片上固定的探针长度大约是20个碱基，节省了探针合成的成本。

另外，由于生物芯片本身的高通量性，可同时用于上千种不同单核苷酸多态性位点的检测，大大降低了检测成本。

11.本发明具有简便、快速、灵敏、特异性高等特点，应用范围广泛。本发明可对微量核酸样本进行检测，可以在成千上万个高度平行方式的多态性型中获取基因型，还可应用于病原微生物的诊断、疾病诊断、寻找致病基因座、数量性状位点分析、诊断癌症基因杂合性的丢失以及相关研究等等。

附图说明

图1为本发明的检测机理示意图；

图2为本发明实验结果的生物芯片杂交图谱。

具体实施方式

核酸扩增技术是一种快速的经济的合成大量DNA片段拷贝的技术。常用于遗传病的产前诊断，癌基因的检测和诊断，致病病原体的检测，DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证，动、植物检疫，快速诊断检测，基因拼接、测序等分子生物学领域。

连接酶反应是将两条核酸片断连接起来的技术，常用于分子克隆等分子生物学领域。

生物芯片具有高度的敏感性和特异性，它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况，所以在基因表达分析方面如：分析基因表达时空特征、基因差异表达检测、发现新基因、大规模DNA测序等方面都有很多的应用。而正因为生物芯片的高通量性和灵敏性，可以分析出多个相似基因之间的微弱差别，也广泛应用于基因型、基因突变和大规模多态性分析。另外生物芯片也是疾病诊断和治疗的强有力的工具如：遗传病相关基因的定位、感染性疾病的诊断、耐药菌株和药敏检测。

本发明将核酸扩增技术、连接酶反应(ligase detection reaction，缩写为LDR)和生物芯片有机地结合起来，主要用于检测核酸序列中的多态性位点。可同时检测不同样本中单个基因的多态性位点或一种样本中多个基因的多态性位点。

参见图1，本发明检测步骤如下：

1.对核酸样本进行扩增。

为得到大量含有单核苷酸多态性位点的核酸片断，需要对核酸样本进行扩增。采用能将少数含多态性位点的核酸片断扩增成大量含有同样多态性位点的核酸片断的方法均可。例如，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、恒温扩增等。聚合酶链式反应是将核酸样本进行聚合酶链式反应，得到扩增产物。恒温扩增最主要的特点是反应均在同一温度下进行。如：核酸序列的扩增(Nucleic acidsequence-based amplification，NASBA)，可通过逆转录酶、RNA酶H、RNA聚合酶三种酶协同作用，同时合成单链DNA，双链DNA和单链RNA。

取核酸样本，进行扩增反应，将少数含多态性位点的核酸片断扩增成大量含有多态性位点的核酸片断，得到扩增产物。对核酸样本进行扩增可采用聚合酶链式反应或恒温扩增等。恒温扩增无需温度变化的循环过程，所需仪器简化，反应时间短。

2.液相杂交和连接酶反应。

为引入可识别单核苷酸多态性位点的检测基团，便于检测系统检测。具体实施方案如下：

1)液相杂交：加入区别探针(discriminating oligo)、通用探针(common probe)与扩增产物进行液相杂交，使扩增产物变性，得经液相杂交的扩增产物。

液相杂交中加入的区别探针须满足下列条件：

(1)根据每一个多态性位点的碱基变化，采用与之相应的二至四条区别探针。

(2)每条区别探针的5′端均是带有不同碱基序列的标签探针，可与固定在生物芯片上对应的标签互补探针发生特异性杂交。

(3)其中一条区别探针是完全匹配探针(perfect match probe)，其3′末端的碱基可与扩增产物中多态性位点杂交；

(4)其余区别探针是不完全匹配探针(mismatch probe)，其3′末端的碱基不与扩增产物中多态性位点杂交；

(5)每条区别探针的中间部分与扩增产物的序列碱基部分互补。

液相杂交中加入的通用探针须具备下列条件：

(1)每个多态性位点采用一条与之对应的通用探针

(2)通用探针5′端带有磷酸基团；5′端的第一个碱基与多态性位点后的第一个碱基互补。

(3)通用探针3′端带有可被检测系统识别的检测基团。检测基团可以是荧光素，若丹明，绿色荧光蛋白、磁球、生物素以及用试验室检测系统可以识别的任何物质。本发明中检测基团选择Cy3，因为操作方便，可直接检测，并且灵敏度高。

(4)通用探针中间部分与扩增产物的序列碱基部分互补。

2)连接酶反应：在连接酶的作用下，使液相杂交中的完全匹配探针和通用探针连接，以检测单核苷酸的多态性。在连接酶反应中，因连接酶性质的不同，可分为高温连接酶反应和普通连接酶反应。对经液相杂交的扩增产物进行纯化，可除去扩增产物中多余的酶与引物。

采用耐高温连接酶，如：耐高温的DNA连接酶(Taq DNA ligase)，在PCR仪中进行变性、连接循环过程，完全匹配探针与通用探针进行连接，成为一条5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针。采用耐高温连接酶，反应速度快，连接效率高，但扩增产物须先经过纯化。

纯化方法：用PCR产物纯化试剂盒、酚氯仿抽提法、磁球分离法或碱性磷酸酶和外切酶I处理法等对扩增产物进行纯化。以采用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增产物的方法操作简单，且纯化效率高。

采用普通连接酶，如T4连接酶，0℃-25℃温度下，完全匹配探针与通用探针进行连接，成为一条5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针。采用普通连接酶，扩增产物不需要纯化，可直接连接，但反应速度慢，连接效率低。

3.固相杂交。

两种不同的核酸分子通过碱基互补结合，碱基通过氢键结合。杂交实际发生在5′末端的标签探针和固定在生物芯片上的标签互补探针之间。将5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针与生物芯片杂交，杂交温度为25℃-75℃，杂交时间为0.5h-36h，检测基团被分配到生物芯片的不同位置。检测基团可被检测系统识别。杂交温度为60℃时，杂交时间短，仅为1h；且杂交效率高。

在固相杂交中使用的生物芯片根据制作方式和固相载体的不同分为：原位合成法、针点法、喷墨法等方式制成的、能确保标签互补探针高效固定与其上的生物芯片。采用针点法制成的生物芯片，生物芯片制作过程比较简单。微球、尼龙膜、醋酸纤维膜、玻璃片等能稳定固定标签互补探针的固相载体。玻璃片作为固相载体，操作简单，标签互补探针固定效率高，成本低。

4.检测单核苷酸多态性。

对杂交结果进行检测分析，根据生物芯片不同位置上检测基团的荧光种类、亮度及分布，可得到检测结果。检测方法采用直接检测或间接检测均可。

直接检测：检测基团直接被检测设备识别，如：检测基团是Cy3、Cy5、以及各种荧光基团、量子点等。采用直接检测的方法，操作简单，灵敏度高。

间接检测：检测基团须与其他物质进一步发生反应后才可被检测设备识别的方法。如：检测基团是生物素，磁球等。

实验：同时鉴定金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌0157:H7、肠炎沙门氏菌、小肠结肠耶尔森氏菌、单核增生李氏菌、福氏志贺菌、蜡样芽孢杆菌、A型产气荚膜菌等八种食源性致病菌。

操作步骤：

1.取金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌0157:H7、肠炎沙门氏菌、小肠结肠耶尔森氏菌、单核增生李氏菌、福氏志贺菌、蜡样芽孢杆菌、A型产气荚膜菌八种菌的核酸样本，即基因组DNA。

2.用聚合酶链式反应对核酸样本进行扩增。

3.进行液相杂交和连接酶反应。

4.进行固相杂交

5.用Axon公司生产的Axon Genepix 4000B型芯片扫描仪对固相杂交后的产物进行检测，在532nm通道的激光“PMT voltage”设为600，“Power”均设为100％对生物芯片进行扫描，得到生物芯片杂交图谱，参见图2。

6.对杂交图谱进行分析证明：本实验最低可检测到20ng的扩增产物，最低可检测到的菌落总数为110cfu/mL。

本发明的核酸样本，其核酸或核酸分子指的是单链或双链形式存在的脱氧核(糖核)苷酸或核(糖核)苷酸多聚体，如没有其他限制，还包括与天然核酸有着类似性质的物质。

1)可用于本试验的核酸包括研究者感兴趣的多态性位点及从根据多态性位点来的核酸。这里根据多态性位点来的核酸指的是最终用于模版的基因组DNA，其中包含有多态性位点。

(1)从基因组扩增而来的DNA，从扩增DNA而来的RNA，从基因组DNA转录而来的mRNA，或从mRNA反转录而来的cDNA等，都是根据多态性位点而来。

(2)在没有特别说明时，能应用于本试验的核酸样本应该包括从基因组扩增而来的DNA，从扩增DNA而来的RNA，从基因组DNA转录而来的RNA，从mRNA反转录而来的cDNA，从cDNA而来的cDNA，从基因中扩增出的DNA，从扩增DNA中转录的RNA及类似的样本。

(3)如果样本不是DNA样本，在扩增前首先需要将其转化为双链DNA，可以用反转录酶和(或)DNA聚合酶。

2)核酸样本可以从单一的有机体而来，如：人，动物，植物或微生物，也可以从多种微生物而来，这时检测结果可以揭示核酸样本等位基因出现的频率。

3)核酸样本应该是细胞、组织或其他生物性样本的均匀混合物。

(1)生物样本适合以总DNA为模版，有时也可以是总RNA，总RNA包括带有Poly-A的已经成熟的mRNA和正在合成中的mRNA。

(2)生物性样本指的是从任何有机体而来的生物组织、体液或细胞。

通常这些样本都是临床样本，临床样本可以提供各种等位基因与其相关疾病的丰富信息。

此发明具体可以检测基因突变及鉴别突变表型。所以此发明在临床诊断和临床研究上有着广泛的应用价值。

临床样本包括体液、血浆、血细胞(如白细胞)、组织、骨髓等等。

生物样本还包括另一些组织，如冻存或以福尔马林液浸泡的样本。

此外，细胞培养物也是一类典型的生物样本，它可以是临床样本，最初的细胞培养物，次培养物，任何一种有机物细胞系，都可以作为DNA和RNA样本的来源。本发明主要试剂的说明：

Taq DNA聚合酶：可采用宝生物工程(大连)有限公司的产品。

Taq DNA连接酶：可采用美国NEB公司生产的产品。

Tris-HCl缓冲液：可实验室配制。

脱氧核酸三磷酸混合物dNTPs：可采用美国Invitrogen公司生产的产品。

特异性PCR引物：可采用北京三博远志生物技术有限责任公司合成的产品。

区别探针：可采用北京三博远志生物技术有限责任公司合成的产品。

通用探针：可采用北京三博远志生物技术有限责任公司合成的产品。

tag探针：可采用北京三博远志生物技术有限责任公司合成的产品。

antitag探针：可采用北京三博远志生物技术有限责任公司合成的产品。

PCR产物纯化试剂盒：可采用美国QIAGEN公司生产的产品。

Claims (10)

1.一种生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤

1)对核酸样本进行扩增

取核酸样本，进行扩增反应，将少数含多态性位点的核酸片断扩增成大量含有同样多态性位点的核酸片断，得到扩增产物；

2)进行液相杂交和连接酶反应

(1)进行液相杂交：加入区别探针和通用探针，与扩增产物进行液相杂交，得经液相杂交的扩增产物，所述区别探针包括完全匹配探针和不完全匹配探针；

(2)进行连接酶反应：进行连接酶反应，使液相杂交中的完全匹配探针和通用探针连接，成为一条5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针；

3)进行固相杂交：将5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针与生物芯片进行杂交，温度25℃-75℃，时间0.5h-36h，检测基团被分配到生物芯片的不同位置；

4)进行单核苷酸多态性检测：检测生物芯片不同位置上检测基团的荧光种类、亮度及分布，得检测结果。

2.根据权利要求1所述的生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的连接酶反应为高温连接酶反应，实现步骤如下：

1)对经液相杂交的扩增产物进行纯化；

2)进行连接酶反应：采用耐高温连接酶，在PCR仪中进行变性、连接循环过程，完全匹配探针与通用探针进行连接，成为一条5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针。

3.根据权利要求2所述的生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述纯化是用PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化；或用酚氯仿抽提法对扩增产物进行纯化；或用磁球分离法对扩增产物进行纯化；或用碱性磷酸酶和外切酶I处理法对扩增产物进行纯化。

4.根据权利要求1所述的生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的连接酶反应为普通连接酶反应，实现步骤如下：

采用普通连接酶，0℃-25℃温度下，成为一条5′端带有标签探针、3′端带有检测基团的探针。

5.根据权利要求1或2或4所述的生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的区别探针具备下列条件：

1)根据每一个多态性位点的碱基变化，采用与之相应的二至四条区别探针；

2)每条区别探针的5′端均是带有不同碱基序列的标签探针，可与固定在生物芯片上对应的标签互补探针发生特异性杂交；

3)其中一条区别探针是完全匹配探针，其3′末端的碱基可与扩增产物中多态性位点杂交；

4)其余区别探针是不完全匹配探针，其3′末端的碱基不与扩增产物中多态性位点杂交；

5)每条区别探针的中间部分与扩增产物的序列碱基部分互补；

所述的通用探针具备下列条件：

1)每个多态性位点采用一条与之对应的通用探针；

2)通用探针5′端带有磷酸基团，5′端的第一个碱基与多态性位点后的第一个碱基互补；

3)通用探针3′端带有可被检测系统识别的检测基团；

4)通用探针中间部分与扩增产物的序列碱基部分互补。

6.根据权利要求5所述的生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的检测基团是荧光素、若丹明、绿色荧光蛋白、量子点、胶体金、磁球或生物素。

7.根据权利要求5所述的生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的对核酸样本进行扩增是采用聚合酶链式反应或恒温扩增。

8.根据权利要求7所述的生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的生物芯片是采用原位合成法、针点法或喷墨法方式制成的，所述生物芯片的固相载体为微球、尼龙膜、醋酸纤维膜或玻璃片。

9.根据权利要求8所述的生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的进行单核苷酸多态性检测是采用直接检测或间接检测。

10.根据权利要求9所述的生物芯片检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的固相杂交温度为60℃，固相杂交时间为1h。

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