CN111549121B

CN111549121B - 恒温无核酸扩增的mthfr基因c677t位点分型法及所用反应探针和检测体系

Info

Publication number: CN111549121B
Application number: CN202010490363.3A
Authority: CN
Inventors: 陈志君; 金芬芬
Original assignee: Hangzhou Dunen Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Hangzhou Dunen Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2020-06-02
Filing date: 2020-06-02
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2040-06-02
Also published as: CN111549121A

Abstract

本发明公开了一种恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T位点分型方法所用的反应探针，由野生型探针和突变型探针组成；野生型探针为WT1、uni，突变型探针为MT1、uni。本发明还同时公开了包含上述反应探针的检测体系，以及利用该检测体系进行的恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T位点分型方法。本发明可以在恒温、无扩增的条件下对MTHFR基因C677T位点进行分型。

Description

恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T位点分型法及所用反应探针和检测体系

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于恒温、且无核酸扩增的基因点突变检测方法。

背景技术

同一种药物或者营养物质对一部分人非常有效或者吸收效果好，对另一部分人效果却不明显，是因为他们基因组中存在的差异。这种差异很多表现为人类基因组上单个碱基上的变异，也就是单核苷酸的多态性(SNP)。单核苷酸的多态性，全称Single NucleotidePolymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。因此，SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。

叶酸是一种水溶性B族维生素，因最初从菠菜叶中提取得到，故称为叶酸。叶酸是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。近年来大量研究已经证实，叶酸缺乏是导致出生缺陷的主要原因。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。叶酸摄入不足或者由于基因导致叶酸代谢能力差，都可能导致高同型半胱氨酸血症，引发新生儿出生缺陷等不良后果，叶酸过量摄入也可能导致胎儿生长缓慢、孕妇恶性贫血，增加结肠腺瘤和乳腺癌风险等副作用。因此，在进行叶酸补充前，提前进行基因检测，评估个体的叶酸代谢利用能力，个性化指导叶酸摄入量非常必要。参与叶酸代谢最重要的基因是亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)。研究发现，MTHFR的活性与C677T基因位点最为有关。当基因位点发生突变时就会导致MTHFR活性下降，进而引起叶酸利用能力不足，宝宝出生缺陷风险增加。C677T，就是一个典型的SNP位点。

目前检测SNP的方法有很多，sanger测序法、焦磷酸测序、taqman探针、armsPCR、HRM高分辨融解曲线等等，但几乎所有方法都需要用到核酸扩增技术，且大部分需要有一个变温的过程，包括DNA双链的变性、退火、延伸，这样就导致需要一个能变温的仪器模块，比如PCR仪，价格较贵，使得该技术推广受限。同时PCR扩增还带来一个问题，PCR产物会形成气融胶，弥散在空气中，这些产物可以做为第二次PCR的模板进行扩增，极易引起污染，对检测结果造成假阳性。因此在国内，PCR技术主要应用于临床，规定必须建设专门的核酸扩增室，至少包括试剂准备间，扩增间，检测间，并对每个房间设置气压差以避免交叉污染。这对于项目的开展是一笔巨大的投入，极大限制了分子生物学在临床上的应用。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种利用恒温且无核酸扩增的技术来检测SNP位点，对其进行分型。

本发明的方法克服了现有技术的限制，以叶酸代谢MTHFR的C677T位点为例，利用本发明的基因检测技术，将该位点区分为纯合野生CC型、杂合CT型、纯合TT突变型，从而指导孕妇对叶酸的摄入量。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

对MTHFR基因的C677T位点，在dbSNP数据库记录号为rs1801133，通过NCBI数据库获得该位点两侧的序列(作为参考序列)，括号内带下划线的部分为野生型与突变型的不同碱基，如下：

tttgaggctgacctgaagcacttgaaggagaaggtgtctgcgggag[C/T]cgatttcatcatcacgcagcttttctttgaggctgacacattcttc

分别针对该位点的野生型或突变型，设计两对探针，使两条野生型探针的序列正好与野生型CC序列匹配；另两条突变型探针的序列与突变型TT序列匹配；两对探针的差别为上游探针3’端的一个碱基不同，两对探针的下游探针是相同的，记为uni探针。

野生型探针(WT1、uni)为：

WT1:5’aaaagctgcgtgatgatgaaatcgG3’，在探针5’端标记荧光基团(例如为FAM荧光基团)；

uni:5’ctcccgcagacaccttctccttcaa 3’，在探针5’端进行磷酸化修饰，3’端标记淬灭基团(例如为BHQ-1淬灭基团)；

与参考序列的野生型可形成如下双链结构：

3‘aacttcctcttccacagacgccctc5’3’Ggctaaagtagtagtgcgtcgaaaa 5’

5‘ttgaaggagaaggtgtctgcgggag[C]cgatttcatcatcacgcagctttt

设计突变型探针(MT1、uni)为：

MT1:5’aaaagctgcgtgatgatgaaatcgA3’，在5’端标记荧光基团(例如为FAM荧光基团)

与参考序列的突变型可形成如下双链结构：

3‘aacttcctcttccacagacgccctc5’3’Agctaaagtagtagtgcgtcgaaaa 5’

5‘ttgaaggagaaggtgtctgcgggag[T]cgatttcatcatcacgcagctttt

具体序列如表1所示：

表1、序列表

每条探针的长度在20-30bp之间。

所有序列，由中国takara公司(中国地区称为大连宝生物有限公司)负责合成，返回后稀释成10pmole/ul深度，分装后避光保存。

本发明中所述发光基团为FAM、TET、J0E、HEX、TAMRA、R0X中的任意一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ-1、BHQ-2中的任意一种。

本发明还同时提供了包含上述反应探针的检测体系：包括作为模板的待测DNA、5X反应缓冲液、WT1探针、MT1探针、Uni探针、解旋酶、单链结合蛋白SSB、T4DNA连接酶、纯水。

作为本发明的检测体系的改进：

在本发明中涉及的解旋酶制剂可以包括单种解旋酶或多种解旋酶。制剂中的解旋酶可以选自3'至5'端解旋酶类型或5'至3'端解旋酶类型。更特别的，解旋酶制剂可以包括来自超家族1-4的解旋酶或AAA+解旋酶。解旋酶可以是六聚体解旋酶(hexamerichelicase)或单体解方定酶(monomeric helicase)或二聚体解方定酶(dimeric heiicase)。更特别地，解旋酶可以是UvrD解旋酶或其同源物(homolog)，例如热稳定的解旋酶或其同源物。

即，解旋酶为以下任一：大肠杆菌UvrD解旋酶、Tte-UvrD解旋酶、T7Gp4解旋酶、RecBCD解旋酶、DnaB解旋酶、MCM解旋酶、Rep解旋酶、RecQ解旋酶、PcrA解旋酶、SV40大T抗原解旋酶(SV40large T antigen helicase)、疱疹病毒解旋酶、酵母Sgsl解旋酶、DEAH—ATP依赖性解旋酶(DEAH—ATP-dependent helicases)、乳头瘤病毒解旋酶El蛋白(Papilliomavirus hdicase El protein)及其同源物。

在本发明中使用的解旋酶为热稳定性解旋酶Tte-UvrD解旋酶，可购买自美国NEB公司。

单链结合蛋白(SSB)为以下任一：ET SSB(极高热稳定单链结合蛋白)、T4基因32SSB、大肠杆菌SSB、T7基因2.5SSB、噬菌体phi 29 SSB和它们的衍生物，以及辅助蛋白(如MutL)。本发明中使用的单链结合蛋白ET SSB超热稳定单链结合蛋白购买自美国NEB公司。

T4DNA连接酶为Hi-T4^TM耐热DNA连接酶，购买自美国NEB公司。

5X反应缓冲液为：10X T4DNA连接酶反应缓冲液500μL、1000mM(NH₄)₂SO₄ 50μL、5000mM KCl 50μL、10％(体积％)

20 50μL、pH 6.0～9.0的Tris-HCl缓冲液补足至1000μL。

上述10X T4DNA连接酶反应缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，10mM DTT，1mMATP，pH 7.5)，购买自美国NEB公司。

本发明的方法是在解旋酶制剂的作用下，将双链DNA解链，所设序列特异型探针与目的片段特异型结合，并通过DNA连接酶连接后，发生探针荧光基团淬灭，从而通过检测荧光量的变化情况，判定SNP位点的具体基因型。其中DNA连接酶，能够催化磷酸二酯键的形成，使杂交到同一靶DNA链上的两条寡核苷酸链的5’-磷酸末端和3’-羟基末端通过磷酸二酯键连接，因此这个连接反应只有当两条寡核苷酸链与靶DNA完全配对并且二者之间没有空隙的条件下才可发生，而当探针3’末端碱基与靶DNA不能完全匹配，则连接酶不能起作用，不能发生连接反应。

本发明的具体使用方法如下：

在本发明在实施方案中，提供了用于确定在解旋酶依赖下的目的基因连接反应体系中所使用反应体系和反应条件是否适于高效连接目标核酸片段的方法，包括制备包含有解旋酶、缓冲液以及可选配的单链结合蛋白和/或辅助蛋白，以及DNA连接酶的反应体系。其中反应体系为：Tris-HCl缓冲液提供大约pH 6.0-9.0的pH范围，KC1的浓度为50mM，(NH₄)₂SO₄的浓度为10mM，MgCl₂的浓度为1mM，DTT浓度为1mM，ATP为浓度0.1mM，

20的浓度为0.1％将不同浓度或拷贝数的探针序列DNA连接酶加入到解旋酶制剂中；在约45℃和65℃之间的温度温育混合物和分析检测结果，确定是否发生了选择性的线性连接。

血液DNA提取试剂盒：Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒(德国凯杰公司，货号69506)。

本发明试剂中所使用的化学试剂，如(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、10％

20等购自上海生工生物有限公司。

检测方法具体如下：

1.自身采外周血2ml，利用血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA，95℃变性4分钟后，作为模板，放冰上备用；

2.配置5 X反应缓冲液

3.在冰上制备以下反应体系：

3.1野生型反应体系

模板(50ng/μL)	10μL
		5X上述缓冲液	5μL
WT1探针(1pM)	1μL
		Uni探针(1pM)	3μL
解旋酶	1U
		单链结合蛋白SSB	1U
<![CDATA[Hi-T4<sup>TM</sup>耐热DNA连接酶]]>	1U
		总体积，用无核酶的纯水补足到	25μL

3.2突变型反应体系

模板(50ng/μL)	10μL
		5X上述缓冲液	5μL
MT1探针(1pM)	1μL
		Uni探针(1pM)	3μL
解旋酶	1U
		单链结合蛋白SSB	1U
<![CDATA[Hi-T4<sup>TM</sup>耐热DNA连接酶]]>	1U
		总体积，用无核酶的纯水补足到	25μL

说明：野生型反应体系、突变型反应体系中，除了上游探针不同外，其余完全相同。

野生型检测体系/突变型检测体系分别于定量PCR仪上，进行如下程序：

50℃恒温，起始时检测荧光，而后设置每隔1分钟，检测一次荧光，荧光通道与探针的荧光基团相匹配(例如FAM)；45分钟后停止检测；

检测方法为包含以下步骤：

步骤1、首先判定反应结果，任选以下一种方法：

方法一、

当10分钟时的荧光相对值＜95％，反应结果属于阳性；

当10分钟时的荧光相对值≥95％，不予判断，需要等到45分钟后按照方法二再进行判断；

方法二、

当45分钟时的荧光相对值＜75％，反应结果属于阳性；

当45分钟时的荧光相对值＞90％，反应结果属于阴性；

75％≤当45分钟时的荧光相对值≤90％，反应结果属于临界值；

方法一、方法二中，荧光相对值＝检测体系在该时间对应的荧光值/检测体系起始荧光值(即，时间为0时对应的荧光值)；

步骤2、最终结果判读：

当野生型检测体系的反应结果为阳性、且突变型检测体系的反应结果为阴性时，判定该该待测DNA属于纯合野生型；

当野生型检测体系的反应结果为阳性、且突变型检测体系的反应结果为阳性时，判定该该待测DNA属于杂合型；

当野生型检测体系的反应结果为阴性、且突变型检测体系的反应结果为阳性时，判定该该待测DNA属于纯合突变型；

当野生型检测体系、突变型检测体系中只要有一个的反应结果属于临界区间时，者当野生型检测体系和突变型检测体系的反应结果均为阴性时，判定需要对该待测DNA重新进行检测。

需要重新进行检测的原因例如为：模板量太少，DNA模板质量不行，或超出检测灵敏度，建议加大模板量重做。

本发明中，以事先采用具有cFDA批文的人类MTHFR(C677T)基因多态性检测试剂盒(PCR-熔解曲线法)(国械注准20183400118)，检测结果为纯合野生型的作为本实验的野生型样本质控品，检测结果为杂合型、纯合突变型作为本实验的突变型样本质控品，分别采用该发明中的野生型反应液和突变型反应液同时对上述质控品进行检测。

以各反应管中初始荧光信号值为1，进行归一化处理；然后按照表2进行判定。

在各时间点上，信号值在阴性质控与杂合阳性之间的，为判断不清楚，模板量太少，DNA模板质量不行，或超出检测灵敏度，建议加大模板量重做。

表2

野生型反应结果	突变型反应结果	最终结果判读
			阳性	阴性	纯合野生型
阳性	阳性	杂合型
			阴性	阳性	纯合突变型
临界值	无论阴性或阳性	需加大模板量重做实验
			无论阴性或阳性	临界值	需加大模板量重做实验
临界值	临界值	需加大模板量重做实验

以野生型反应体系为例，其结果如图2。

本发明的技术原理如下图1所示：

1、在解旋酶作用下双链DNA解链，在解旋酶及SSB等结合蛋白的共同作用下，双链解旋为单链；

2、在解旋完成的DNA单链中，两条探针与目的序列匹配，在DNA连接酶作用下两条探针连接成为一条，使荧光淬灭：当带有FAM荧光的探针和带有BHQ1淬灭基团的探针分开时，能够发出荧光，并通过qPCR仪检测到。而当杂交时，若带FAM荧光的探针、BHQ1淬灭基团的探针与模板能够匹配，则可以通过DNA连接酶的作用，催化3’OH和5’磷酸基团形成磷酸二酯键，从而使两条探针连接成为一条，使荧光淬灭，并与模板形成一个互补的双链。若两条探针与模板不能匹配，则两条探针就不会连接成一条探针，荧光也不会淬灭。

3、在循环过程中，为保证加入的带有荧光基团和淬灭基团的荧光探针连接效率，将带有淬灭基团探针量，设置为带有荧光基团探针3～5倍(摩尔比)，即uni探针是WT1探针的3～5倍，同时uni探针是MT1探针的3～5倍，保证此类单连接探针优选结合在模板上，发生连接反应。在反复发生的连接过程中通过qPCR仪检测不同时间的荧光信号值，经过不断的循环，在解旋酶和连接酶活性充足的情况下，荧光将不断的衰减，荧光信号呈线性下降。

本发明具有如下性能优势：

1、本发明采用了恒温的反应体系，可以最大程度降低对高精密仪器的依赖，众所周知，PCR仪由于升降温模块，精密度要求较高，不同的PCR仪容易由于升降温速率不同，导致结果不稳定，或者不同实验室结果不一致，同时qPCR成本也较高。本发明的恒温体系有助于降低分子生物学检测的门槛，将变温模块去掉，降低仪器成本。

2、本发明采用了独创的闭管检测，以及无扩增反应体系，几乎可以避免所有因核酸扩增带来的气溶胶污染。从而使实验条件的要求也大大降低，不再需要临床核酸扩增实验室，使得该检测能在普通的理化实验室完成。这大大增加了该技术的应用范围。

3、本发明的结果检测，可以采用实时荧光检测，也可以采用终点荧光检测法，这使得对检测设备的要求可以进一步降低。

综上所述，本发明可以在恒温，无扩增的条件下对MTHFR基因C677T位点进行分型。即，理论上，采用本发明的方法，保温杯+试纸条就能进行基因检测。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的原理图。

图2是阴性对照/杂合阳性对照/阳性对照样本检测荧光值随检测时间的变化曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、对10例经有CFDA批文试剂验证过的4例纯合野生型，4例杂合型，2例纯合突变型的血样，利用本发明进行基因分型。

一、实验方法与步骤

1.样本DNA提取：

上述已知分型结果的10例样本的EDTA抗凝取血由合作医院负责提供，每个样本的EDTA抗凝取血2ml。用Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒(德国凯杰公司，货号69506)进行血液中的基因组DNA提取，Nanodrop测浓度后，统一稀释为100ng/μL。

2.配置5 X反应缓冲液

3.在冰上制备以下反应体系：

2.1野生型反应体系

2.2突变型反应体系

将PCR反应管放于定量PCR仪上，50℃恒温，起始时检测荧光，而后设置每隔1分钟，检测一次荧光，荧光通道设置为FAM。45分钟后停止检测。

野生型探针(WT1、uni)为：

WT1:5’aaaagctgcgtgatgatgaaatcgG3’，在探针5’端标记FAM荧光基团；

uni:5’ctcccgcagacaccttctccttcaa 3’，在探针5’端进行磷酸化修饰，3’端标记BHQ-1淬灭基团；

突变型探针(MT1、uni)为：

MT1:5’aaaagctgcgtgatgatgaaatcgA3’，在5’端标记FAM荧光基团；

4.以45分钟时的荧光信号，比上初始第一次检测的荧光信号，做为终点检测条件：

当45分钟时的荧光相对值＜75％，反应结果属于阳性；

当45分钟时的荧光相对值＞90％，反应结果属于阴性；

最终结果判读：

当野生型检测体系、突变型检测体系中只要有一个的反应结果属于临界值时，或者当野生型检测体系和突变型检测体系的反应结果均为阴性时，判定需要对该待测DNA重新进行检测。

5.结果如表3所示。

表3、10个样本的检测结果与判读情况

结果显示，在500ng人全血DNA做为模板的前提下，用该方法检测结果，与有CFDA批文的试剂检测结果完全一致。

本发明的创新之处在于恒温、无扩增、闭管检测、可以终点检测法。降低了对仪器的需求，以及避免扩增环境，无须临床扩增实验室，也不会引起气溶胶污染。在临床基因分型检测中具有非常重要的意义，特别是对药物基因组学，微生物耐药等场景，具有重要的价值。

实施例2、为了验证本发明方法的通用性，发明人进行了如下的验证实验：

将未知样本(作为待测样本)30份，进行45分钟反应后，得到的荧光信号值与初始荧光信号值的比值进行结果判定，实验方法和判定条件均同实施例1。所得结果如下：

8例为杂合型、19例为纯合野生型、3例为纯合突变型；这30份样本按照金标准法进行检测；所得结果完全同本发明的检测结果。

对比例1、下游uni探针不做磷酸化修饰，针对上述参考序列，所得的探针序列为：

野生型探针(WT2、uni)为：

Uni1:5’ctcccgcagacaccttctccttcaa 3’，3’端标记淬灭基团(例如为BHQ-1淬灭基团)；

设计突变型探针(MT2、uni)为：

将上述探针配用同实施例1所述的荧光基团、淬灭基团，按照实施例1所述方法对10个样本进行检测，所得结果无论是阴性样本，或是阳性样本，荧光信号在45分钟后仍然保持在初始值的95％以上，均判断为阴性结果；因此，说明该对比例1所述探针不能用于恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T位点分型。

对比例2、

设定探针序列为：

野生型探针(WT1、uni)为：

WT2:5’gcgtgatgatgaaatcgG3’，在探针5’端标记荧光基团(例如为FAM荧光基团)；

Uni2:5’ctcccgcagacaccttct 3’，在探针5’端进行磷酸化修饰，3’端标记淬灭基团(例如为BHQ-1淬灭基团)；

设计突变型探针(MT1、uni)为：

MT2:5’gcgtgatgatgaaatcgA3’，在5’端标记荧光基团(例如为FAM荧光基团)

其他修饰与实施案例完全相同，只是将探针长度减少5-6bp；

上述探针也满足以下条件：两条野生型探针的序列正好与野生型CC序列匹配；另两条突变型探针的序列与突变型TT序列匹配；

将上述探针配用同实施例1所述的荧光基团、淬灭基团、PO4基团，按照实施例1所述方法对10个样本进行检测，所得结果如下表4。

表4

出现一定比例不一致的情况，因此，说明该对比例2所述探针不能用于恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T位点分型。

对比例3、

设定探针序列为：

野生型探针(WT1、uni)为：

WT3:5’caaagaaaagctgcgtgatgatgaaatcgG 3’，在探针5’端标记荧光基团(例如为FAM荧光基团)；

Uni3:5’ctcccgcagacaccttctccttcaagtgct3’，在探针5’端进行磷酸化修饰，3’端标记淬灭基团(例如为BHQ-1淬灭基团)；

设计突变型探针(MT1、uni)为：

MT3:5’caaagaaaagctgcgtgatgatgaaatcgA3’，在5’端标记荧光基团(例如为FAM荧光基团)

其他修饰与实施1完全相同，只是将探针长度增长3-5bp；

将上述探针配用同实施例1所述的荧光基团、淬灭基团、PO4基团，按照实施例1所述方法对10个样本进行检测，所得结果如下表5。

表5

出现一定比例不一致的情况，因此，说明该对比例3所述探针不能用于恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T位点分型。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，如其他基于SNP位点的检测应用，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州盾恩医学检验实验室有限公司

<120> 恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T位点分型法及所用反应探针和检测体系

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaagctgcg tgatgatgaa atcgg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcccgcaga caccttctcc ttcaa 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaagctgcg tgatgatgaa atcga 25

Claims

1.恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T位点分型方法所用的反应探针，其特征是：由野生型探针和突变型探针组成；

野生型探针为WT1、uni，突变型探针为MT1、uni；

WT1:5’aaaagctgcgtgatgatgaaatcgG3’，在探针5’端标记荧光基团；

uni:5’ctcccgcagacaccttctccttcaa 3’，在探针5’端磷酸化修饰，3’端标记淬灭基团；

MT1:5’aaaagctgcgtgatgatgaaatcgA3’，在5’端标记荧光基团。

2.根据权利要求1所述的反应探针，其特征是：

所述荧光基团为以下任一：FAM、TET、J0E、HEX、TAMRA、R0X；

所述淬灭基团为以下任一：Dabcyl、BHQ-1、BHQ-2。

3.包含如权利要求1或2所述反应探针的检测体系，其特征是：包括作为模板的待测DNA、5X反应缓冲液、WT1探针、MT1探针、Uni探针、解旋酶、单链结合蛋白SSB、T4DNA连接酶。

4.根据权利要求3所述的检测体系，其特征是：

所述解旋酶为以下任一：大肠杆菌UvrD解旋酶、Tte-UvrD解旋酶、T7Gp4解旋酶、RecBCD解旋酶、DnaB解旋酶、MCM解旋酶、Rep解旋酶、RecQ解旋酶、PcrA解旋酶、SV40大T抗原解旋酶、疱疹病毒解旋酶、酵母Sgsl解旋酶、DEAH—ATP依赖性解旋酶、乳头瘤病毒解旋酶El蛋白；

单链结合蛋白SSB为以下任一：ET SSB、T4基因32SSB、大肠杆菌SSB、T7基因2.5SSB、噬菌体phi 29SSB，以及辅助蛋白。

5.根据权利要求3或4所述的检测体系，其特征是5X反应缓冲液为：

10X T4 DNA连接酶反应缓冲液500μL、1000mM(NH₄)₂SO₄ 50μL、5000mM KCl50μL、

20 50μL、pH 6.0～9.0的Tris-HCl缓冲液补足至1000μL。

6.利用权利要求3～5任一所述的检测体系进行的恒温无核酸扩增的MTHFR基因C677T位点分型的非疾病诊断或治疗的方法，其特征是：

每个待测DNA作为模板分别设定使用野生型探针的野生型检测体系、以及使用突变型探针的突变型检测体系；

50℃恒温，起始时检测荧光，而后设置每隔1分钟，检测一次荧光，荧光通道与探针的荧光基团相匹配；45分钟后停止检测；

检测方法为包含以下步骤：

步骤1、首先判定反应结果，任选以下一种方法：

方法一、

当10分钟时的荧光相对值＜95％，反应结果属于阳性；

方法二、

当45分钟时的荧光相对值＜75％，反应结果属于阳性；

当45分钟时的荧光相对值＞90％，反应结果属于阴性；

方法一、方法二中，荧光相对值＝检测体系在该时间对应的荧光值/检测体系起始荧光值；

步骤2、最终结果判读：