CN102242211A

CN102242211A - 检测突变核酸序列的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102242211A
Application number: CN2011101907582A
Authority: CN
Inventors: 富国良
Original assignee: WUXI RUIQI GENE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: WUXI RUIQI GENE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2011-07-08
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2011-11-16

Abstract

本发明涉及核酸诊断技术领域，公开了一种检测突变核酸序列的方法及试剂盒，方法如下：提供能够扩增产物的第一引物和第二引物，扩增靶序列的诊断区域的一段核酸序列得到扩增产物，第一引物包含基于靶序列第一区域的一段序列，第一区域与靶序列的诊断区域的5’部分重叠，但与突变核苷酸不重叠，其中第一区域的3’端与突变核苷酸的5’端相邻，利用核酸聚合酶对反应混合液实施扩增反应，进行PCR反应；扩增产物进行熔解曲线分析，确定标记的寡核苷酸探针与PCR产物的杂交熔解温度，熔解曲线分析中第二个双链体的熔解温度信号的出现表明在核酸样本中靶序列的诊断区域含有突变核苷酸。本发明准确性、灵敏性高。

Description

检测突变核酸序列的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸诊断技术领域，尤其涉及了一种检测突变核酸序列的方法及试剂盒。

背景技术

单核苷酸多态性(SNPs)是人类基因组中最常见的突变类型。点突变通常也是SNPs，但是这个术语通常指那些低频率发生或者是已知功能，可导致疾病的突变类型(Gibson NJ, 2006, Clin Chim Acta. 363(1-2):32-47)。检测基因型多态性和稀有突变有很多应用，检测稀有突变对病理突变的早期筛查非常重要，更多是用于癌症的辅助诊断。例如，检测临床样本中与癌症相关的点突变可用于肿瘤早期诊断，鉴定化疗中的轻微后遗症，制订个性化治疗方案，以及检测肿瘤复发患者体内是否有肿瘤细胞。例如，Kras基因的第12和13位密码子的突变在胰腺癌中占80-90%，在结直肠癌肿占35-50%。检测突变负荷对评价环境诱变剂的暴露水平，监控内源性DNA修复和研究年老个体的体细胞突变的累集都有重要作用。而且，更灵敏的检测稀有突变的定量方法可革新产前诊断方式，它能从孕妇外周血中检测胎儿细胞的存在。

虽然有多种方法，但是还没有哪一种被广泛接受的简便方法。许多检测基因组DNA低频突变的方法是利用聚合酶链反应（PCR）来扩增突变型和野生型靶序列，PCR产物可用多种方法进行分析，包括测序，寡核苷酸连接、限制性酶切、质谱或者等位基因特异的寡核苷酸杂交等方法均可实现从大量野生型背景基因中鉴定突变型。其它的方法利用等位基因特异性PCR选择性扩增低频率突变等靶核酸序列，利用或者是不利用附加选择。例如，用限制性核酸内切酶酶切PCR产物，尤其是酶切野生型产物。因为用于PCR的等位基因特异性引物通常缺乏特异性，导致现有方法存在假阳性问题。也可以说，目前的方法都存在灵敏性和准确度不足的缺点(reviewed by Jeffreys AJ and May CA, 2003 Genome Res. 13(10):2316-24)。

这些检测稀有突变的PCR方法存在的共同问题是扩增反应时复制并不完全可靠，探针杂交时也会有错误配对情况出现。Newton (Nucleic Acids Res. 17:2503-16, 1989; U.S. Pat. No. 5,595,890)等描述的常规突变检测方法显然都存在这些缺陷。所述的扩增阻碍突变系统(ARMS)，利用等位基因特异性突变引物进行PCR反应。该法利用引物的3'端与突变子的特异序列互补，由此引物得以延伸，而野生型序列因3'端不匹配而不能被延伸。这种方法要求每种突变都有相对应的特异性引物，同时PCR反应需要非常严格的反应条件。扩增中的错配常导致复制不精确或复制错误。

最近，利用PNA（或LNA）钳技术的PCR富集和测定方法已经发展起来了(B. Taback et al., 2004; A. Senescau et al., 2005; X David Ren et al., 2009; Todd S. Laughlin et al., 2008; K. Udagawa et al., 2005; Hitoshi Miyazawa, et al., 2008)。高亲和力的核酸类似物如肽核酸（PNAs）被用于抑制核酸扩增(U.S. Pat. No. 5,891,625, and D.B. Demers et al., 1995, H. Orum et al., 1993)。PNA(LNA)-DNA双链体比DNA-DNA双链体更加稳定。因此，PNA(或 LNA)能够特异地阻止在一个完全匹配的模板上的引物退火或延伸过程。

美国专利No.7,803,543公开了一种检测核酸样本中是否存在靶序列上核苷酸变异的方法，检测步骤包括引物对的应用，PCR扩增这对引物形成的产物包含该靶序列，而肽核酸（PNA）就像一个PCR钳，起到感应探针的作用。该方法使用的第一个引物距离靶序列的5’端至少有30个或更多的核苷酸。PCR过程要求延伸反应的温度低于完全匹配的探针的熔解温度。这个方法也有很多缺点，标记的PNA 探针合成比较困难，价格比较昂贵。这个方法要求有个高T_m值的锚定探针，使得反应和设计变得复杂。如果样本只含有正常的靶核酸，PNA能够使反应停止，因此必须设立单独的质控品来测试反应体系是否有效。这种方法重复性和灵敏性低。

美国专利No. 2004/0014105A1公开了在一个样本中选择性的富集低丰度多聚核苷酸的方法。这种方法利用酶催化的不能延伸的寡聚核苷酸选择性的阻滞高丰度核酸的聚合酶活性，因此导致低丰度核酸的富集。

美国专利No. 2004/0091905A1公开了一种在突变多聚核苷酸、野生型多聚核苷酸和不相关多聚核苷酸的混合物中检测突变多聚核苷酸的方法。这种方法利用一种延伸引物，它在野生型和突变型多聚核苷酸中都能与第一靶序列互补。还利用一条探针，这条探针只能与野生型多聚核苷酸的第二靶序列互补，不能与突变型互补。引物与第一靶序列的退火延伸使突变型多聚核苷酸产生长的产物。在野生型多聚核苷酸中引物与第一靶序列退火后的延伸被探针与第二靶序列的退火所抑制，因而只产生短的延伸产物或者是没有产物。分离产物后再做PCR，PCR优先的扩增长的产物。

Lay等(Lay, M. J. & Wittwer, C T. (1997), Clin. Chem., 43:2262-2267)报道了利用荧光探针和熔解曲线进行基因分型的方法。杂交探针连同熔解曲线分析被广泛用于突变或SNPs的检测。通常需要一对寡核苷酸探针，称为锚定探针和感应探针 (P. S. Bernard et al. (1998), Am. J. Pathol., 153:1055-1061)，锚定探针和感应探针被标记以不同的荧光染料，这样当他们与互补PCR链的邻近位点发生退火时，荧光能量转移发生在这两者之间。最近的研究在PCR时用一个PNA钳和一对杂交探针，证明稀有突变的同源检测可在一个闭合管中实现(C.Y.Chen et al. 2004; J. Dabritz et al. 2005; K.A. Kreuzer et al. 2003; Y. Nagai et al. 2005)。然而，在这些研究中，PNA与锚定探针相互竞争地同靶核苷酸结合，因此通过熔解曲线方法检测是非常低效的。另外，如果在一个区域存在多个变异核苷酸需要检测，就不得不设计多个感应探针。

因此，提供一个更准确和灵敏的核酸检测方法将对科学，尤其是核酸诊断领域做出贡献。

发明内容

本发明的目的是提供一种更准确和灵敏的检测突变核酸序列的方法及试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

检测突变核酸序列的方法，方法如下：

步骤a：提供能够扩增产物的第一引物和第二引物，扩增靶序列的诊断区域的一段核酸序列得到扩增产物，其中第一引物包含基于靶序列第一区域的一段序列（第一引物序列与第一区域一致或基本一致），其中第一区域与靶序列的诊断区域的5’部分重叠，但与突变核苷酸不重叠，其中第一区域的3’端与突变核苷酸的5’端相邻，其中第二引物包含基于靶序列的诊断区域下游的第二区域的一段序列；

提供标记的可供检测的寡核苷酸探针, 此标记的寡核苷酸探针包含一个可检测的基团和拥有一段基于正常靶序列（非突变）诊断区域的序列，标记的寡核酸探针上的相应序列与靶核酸序列上的正常序列一致，使得标记的寡核苷酸探针与上述的相关靶核酸序列的诊断区域杂交形成第一个双链体，得到第一个熔解温度T_m1，标记的寡核苷酸探针与突变的靶序列诊断区域杂交形成第二个双链体，得到第二个熔解温度T_m2，其中，T_m2值低于T_m1值，T_m2值和T_m1值可通过实验或者是理论计算得知；

步骤b：利用核酸聚合酶对反应混合液实施扩增反应，此扩增反应的反应混合液包含核酸聚合酶、标记的寡核苷酸探针和一对引物，进行PCR反应；

步骤c：扩增产物进行熔解曲线分析，以确定标记的寡核苷酸探针与PCR产物的杂交熔解温度，其中熔解曲线分析中第二个双链体的熔解温度信号的出现表明在核酸样本中靶序列的诊断区域含有突变核苷酸。

作为优选，所述的PCR反应采用缓慢升/降温度或者多重退火温度，其中，采用缓慢降低或升高温度的速率低于2°C/秒，或低于1°C/秒，或低于0.5°C/秒，或低于0.2°C/秒。

作为优选，所述的标记的寡核酸探针包含修饰的核苷酸或键，修饰的核苷酸或键包含LNA、PNA、 d(2-amA)TP、5-甲基胞嘧啶、小槽沟结合剂或碱基类似物。

作为优选，所述的第一区域的3’末端与靶核酸序列诊断区域的至少一个突变核苷酸的5’相邻，其中当第一引物退火后延伸，第一个延伸的核苷酸就是突变的核苷酸。

作为优选，所述的第一区域的3’末端与突变核苷酸的5’端相隔1到9个核苷酸，其中当第一引物退火后延伸，第二个到第十个延伸的核苷酸即是突变的核苷酸。

作为优选，所述的第一引物，能够与靶序列杂交，它的熔解温度与第二个熔解温度T_m2相同或低于第二个熔解温度T_m2。

作为优选，所述的第一引物，能够与靶核酸序列杂交，它的熔解温度在第二个熔解温度T_m2加减3的范围之内(T_m2-3 to T_m2+3)。

作为优选，所述的基团是荧光基团、放射显影基团、发光基团或化学发光基团。

作为优选，所述的寡核苷酸探针包含一个报告标记和一个淬灭标记，其中淬灭标记在当上述寡核苷酸探针是单链结构且没有与上述靶核酸杂交时，能够淬灭报告标记的荧光；其中上述寡核酸探针与靶核酸杂交后形成双链结构后，报告标记的荧光不能被淬灭，此时报告标记的荧光强度比当上述寡核苷酸探针是单链时构象及没有与上述靶核酸杂交时的荧光强度更强。

作为优选，所述的寡核苷酸探针与第二引物相连，成为连接的探针-引物分子，探针连接在引物的5‘端，此连接的探针-引物分子包括5’端探针部分和3‘端引物部分，探针部分含有以上探针的全部或大部分特性，此连接的探针-引物可以作为引物在模板上起始延伸，当延伸链变成单链后，在杂交条件下，其探针部分可与自己的延伸部分杂交，形成颈-环结构。

第一引物和标记的寡核酸探针竞争性的结合到靶序列的同一个区域，当突变核苷酸存在的时候，探针会结合的不牢固，因此第一引物有更高的机会结合和延伸，导致含有突变核苷酸的靶核酸的有效扩增。

其中当突变核苷酸不存在时，第一引物仍然与含有正常核苷酸的靶核酸序列结合和延伸，产生含有正常核苷酸的靶核酸的PCR产物，可以作为PCR质控。

作为优选，所述的标记的寡核苷酸探针可以被分成两部分，第一部分包含与诊断区域的5’端序列一致的序列，第二部分包含与诊断区域的3’端序列基本一致的序列，其中标记的寡核苷酸探针的第一部分和第二部分可以连续的，诊断区域的5’端部分和3’端部分可以是不连续的。

标记的寡核苷酸探针在本发明中有双重作用。首先，标记的寡核苷酸探针作为阻滞物或者竞争者，与第一引物竞争结合相同的区域。其次，标记的寡核苷酸探针作为可检测分子，在熔解曲线分析中被测定。值得称道的是标记的寡核苷酸探针可能不含任何标记，也属本发明的范畴。未标记的探针还可充当阻滞物或竞争者的角色，与第一引物结合的位点相同。但未标记的探针有可能不能在熔解曲线分析时被测得，但是当反应混合液中存在双链结合染料如Sybr green时未标记的探针能够在熔解曲线分析时被测得。

核酸样本可以来源于任何组织，例如病毒、细菌、真菌、植物和动物（包含哺乳动物和人类）。核酸样本可以来源于一个样品的体液或活检标本，或培养的细胞。体液可以来自于全血、血清、血浆、尿液、痰液、胆汁、粪便、骨髓、淋巴、精液、乳房分泌物、唾液、眼泪、支气管洗出液、脊髓液、关节液、腹水、胸膜积液和羊水等。

靶序列可能包含突变核苷酸的核酸片段或基因，也可能包含疾病相关SNP或基因、耐药基因和毒力基因。疾病相关基因可能包括但不限于癌症相关基因及与遗传相关的基因。与癌症相关的基因包含但不局限于K-ras、 H-ras、N-ras、p53 (TP53)、 CDKN2A (p16)、PIC3K、 PTEN、RB1、表皮生长因子受体基因、BRAF、BRCA1、 BRCA2、 STK11、和VHL、Kit、 Jak2。根据本发明，遗传疾病包括但不限于由于线粒体DNA突变导致的母系遗传疾病。与遗传疾病相关联的基因包括但不限于NF1、 FBN1、MSH2、MLH1 (常染色体显性紊乱相关基因)、 CFTR、血红蛋白 beta 基因、 HEXA、 SMN1、 VAPB (常染色体隐性紊乱相关基因); PHEX (伴X染色体显性紊乱相关基因)、 factor VIII、营养障碍基因、 CNGA 3、 CNGB3、 GNAT2、雌激素受体(AR) 基因 (伴X染色体隐性紊乱相关基因)、 USP9Y (伴Y染色体紊乱相关基因)、 MT-ND1、 MT-ND4、 MT-ND4L、MT-ND6 (线粒体疾病相关基因)。

所述“耐药基因”是指编码对治疗的药物产生反应的因子的基因。耐药基因可以包括，如表皮生长因子受体(EGFR)基因，它编码的EGFR是有关肺癌的治疗药物(吉非替尼)，多重耐药基因相关蛋白(MRP)基因是有关卵巢癌的治疗药物，肺耐药蛋白(LRP)基因是有关卵巢癌的治疗药物。所述“毒力基因”是指编码任何病原微生物（如细菌、原生生物、酵母、真菌等）的毒力因子的基因。

根据本项发明，靶序列的诊断区域的变异核苷酸包含一个或多个核酸置换、缺失、插入和/或非正常的甲基化。

DNA甲基化是重要的基因组后天修饰现象。异常的DNA甲基化可能会导致肿瘤抑制基因的沉默，这在多种人类癌细胞中都存在。为了检测靶多聚核苷酸的任意异常甲基化的存在，需要对样本进行前处理。核酸样本最好先用重亚硫酸盐进行化学修饰，使胞嘧啶转化为尿嘧啶，而不是甲基化胞嘧啶（例如5-甲基胞嘧啶，不会被处理而仍然是胞嘧啶）(R. Y. H., Wang et al. (1980), Nucleic Acids Res., 8, 4777-4790)。另外，寡聚核苷酸探针应当基于重亚硫酸盐处理过的野生型DNA进行设计。经过这些修饰，本发明的这些方法能够被用来检测靶核酸中异常的甲基化。

本发明的实施优选PCR方法进行核酸扩增。PCR用以扩增靶多聚核苷酸序列是基于变性、引物退火和延伸反应的重复循环。事实上，任何包括热循环的扩增反应都是适用的。例如，被称为聚合酶链置换扩增(PCDR)的热循环扩增方法(PCT/GB07/03793)也能用于本发明。

本发明的特点是低的速率或利用多重退火温度。也可以增多扩增循环数。利用低的速率尤其是低的冷却速率达到退火温度。

在PCR中，在每个热循环中引物/探针与靶核酸序列的杂交（退火）通过从较高的温度（称之为中间温度，不是热变性温度）到最低退火温度的缓慢降低实现的。

这个特征是与其他PCR方法相区别的亮点。传统的PCR在每个热循环中一般都是从热变性温度以最大的速率降到退火温度，和/或到延伸温度。但是本发明中，从中间温度缓慢降低到退火温度或者是利用多重退火温度，可增加反应效率或改变检测低频率突变的灵敏度。没有必要直接从PCR产物的变性温度开始缓慢降低降速率。然而引物或者是探针与靶序列的杂交过程需要缓慢的进行，例如降低速率。因此从热变性温度到一个温度（称之为中间温度）可以以最大速率减低，这时引物和/或探针还没有或者将要与靶核酸序列退火。从中间温度开始缓慢降低到退火温度。中间温度可以与第一个双链体的第一个熔解温度(T_m1)一样，或者中间温度可以比T_m1高6°C、 5°C、 4°C、 3°C、 2°C或1°C。中间温度也可以比T_m1 低3°C、 2°C、或1°C。中间温度最好是在第一个熔解温度加上3°C到第一个熔解温度减去2°C (T_m1+3 到T_m1-2)的范围内。例如，如果T_m1=57°C，中间温度可以选择从60°C到55°C，最好是57°C。

根据本项发明，PCR过程包括从热变性温度以最大的速率降到中间温度，接下来从中间温度缓慢降低到最低的退火温度。或者PCR过程包括从最低的退火温度缓慢提高到延伸温度。缓慢降低（或提高）的速率最好是低于2.5°C/秒，低于2°C/秒，低于1.5°C/秒，低于 1°C/秒，或低于 0.9°C/秒，或低于 0.8°C/秒, 或低于0.7°C/秒，或低于 0.6°C/秒，低于0.5°C/秒，低于 0.4°C/秒，低于 0.3°C/秒，低于0.2°C/秒，或低于 0.1°C/秒。降低的速率最好是低于0.5°C/秒，更优选的速率是低于0.2°C/秒。

有些PCR仪可能不能调节降温速率。遇到这种情况可在每个PCR热循环中采用一系列的多重退火温度可以达到与调节降温速率相似的目的，其中多重退火温度是指在一个热循环中由一个较高的退火温度降低到一个较低的退火温度，或者从一个最低的退火温度提高到延伸温度。多重退火温度可能含有至少两个退火温度，或者含有至少三个退火温度(T1, T2, T3…)，或者更多，其中T1高于T2，T2又高于T3(T1>T2>T3)，其中，在每个热循环中，一个序列的热变性温度从热变性温度开始降低，到T1, T2, T3,再到延伸温度。第一个退火温度T1最好与中间温度相同，第二个退火温度T2，第三个退火温度T3，第四个退火温度T4等位于T1和最低退火温度之间。最低退火温度最好是在第二个熔解温度(T_m2)减4到第二个熔解温度(T_m2)加4之间的范围内(T_m2-4 to T_m2+4)。优选的最低退火温度在第二个熔解温度(T_m2)减3到第二个熔解温度(T_m2)加3之间的范围内(T_m2-3 to T_m2+3)。更优选的最低退火温度在第二个熔解温度(T_m2)减2到第二个熔解温度(T_m2)加2之间的范围内(T_m2-2 to T_m2+2)。更优选的最低退火温度在第二个熔解温度(T_m2)减1到第二个熔解温度(T_m2)加1之间的范围内(T_m2-1 to T_m2+1)。最低退火温度最好是与第二个熔解温度(T_m2)相同。

本发明的热循环参数与传统的PCR参数不同，本发明利用寡核酸探针与两种不同的靶核酸序列——正常序列和突变序列杂交的不同热稳定性。假定正常的和突变的靶核酸序列存在于同一样本中，温度从中间温度缓慢降低到最低退火温度时，探针与正常核酸的诊断序列紧密结合，特别是当降低到最低温度时结合得最紧密。该探针不结合含有突变核苷酸的诊断序列，但当温度下降至最低温度时，第一个引物会同该序列结合，第一个引物与突变核酸的结合几率高于与正常核酸结合的几率。结果导致扩增中突变核酸的富集。本发明的寡核酸探针不仅仅是作为扩增引物的竞争者（或阻滞物）来富集突变靶核酸，还作为检测目标。标记的探针能够被检测到。类似于实时定量PCR探针，本发明标记的寡核酸探针与PCR产物结合导致信号的改变，在每个扩增循环中都能被检测到。更重要的是，本发明的探针在反应的最后与PCR产物结合来做熔解曲线图，来指示靶序列中突变核苷酸的存在与否。综上所述，第一，本发明的标记寡核酸探针作为竞争者（或阻滞物），与第一引物竞争地结合到靶核酸上，导致含有突变核苷酸的靶核酸的富集。第二，本发明的标记寡核酸探针作为实时定量PCR探针，在实时定量中监测荧光信号，尽管这项特征在本发明的实施中是非必须的。第三，本发明的标记寡核酸探针在PCR扩增的最后被用来作熔解曲线分析。本发明不需要采用锚定探针。许多以前的报道是用杂交探针系统或改进的杂交探针系统，需要用到锚定探针(U.S. Pat. No. 7,803.543; Luo et.al. 2006, Nucleic Acid Res.; Dabritz et.al. 2005, Br. J. Cancer; Chen et.al. 2004, Clin. Chem)。杂交探针系统包含一对寡核苷酸——锚定探针和传感探针——分别标记不同的荧光染料，这样当它们与靶序列位点退火时，它们之间发生荧光能量转移。传感探针（设计为与突变区域相退火）的熔解曲线图，允许在一个闭合管中进行同源基因分型。

本项发明的PCR过程包含一个延伸温度比第一个双链体的第一个熔解温度高的延伸反应。没有这个延伸反应本发明也能实施，尽管不是最佳选择。众所周知，在退火阶段引物始终会有一些延伸，因为在PCR过程中使用的DNA聚合酶使引物在不同的温度都能够退火，这些温度低于最适温度。

每个步骤的持续时间，包括热变性、多重退火和延伸过程，可以通过实验确定。持续时间也会影响反应效率和灵敏度。

根据本发明，第一引物与靶序列的一个区域杂交（退火），所以PCR扩增能够进行。这个靶序列区域被称为第一区域。靶核酸通常为双链，其中，第一区域是指双链靶核酸两条链上的同一位置。第一引物与第一区域的一条链完全互补或者是基本互补，同时，第一引物与第一区域的反向链相同或者是基本相同。

标记的寡聚核苷酸探针与靶序列的诊断区域相杂交。诊断区域含有突变核苷酸。诊断区域在这里是指靶核酸双链的同一个区域，这个区域有突变碱基的存在。寡聚核苷酸探针与诊断区域的一条链互补或者基本互补，同时，寡聚核苷酸探针与诊断区域的反向链相同或者大量相同。

简单的说，以下的靶序列的第一区域和诊断区域是指第一区域和诊断区域的一条链分别有与第一引物和寡聚核酸探针相同或者是相类似的序列。第一区域与靶序列的诊断区域的5’诊断部分相重叠，但不与突变核苷酸重叠。第一区域的3’末端与突变核苷酸的5’端相邻（图1）。第一引物与第一区域和部分诊断区域退火，但是不与突变核苷酸退火。换句话说，第一引物不是突变特异的引物。

在一个实施方案中，第一区域的3’端可能与靶序列的诊断区域的至少一个突变核苷酸的5’端毗连，在那里第一引物退火后延伸，第一个扩增的核苷酸就是突变核苷酸。第一引物与3’紧邻着突变核苷酸的第一区域退火。

在另一个实施方案中，第一区域的3’端可能与突变核苷酸的5’端相隔一到九个核苷酸，在那里第一引物退火后延伸，第二个到第十个延伸的核苷酸是突变核苷酸。换句话说，第一引物与突变核苷酸相隔一到九个核苷酸距离的第一区域退火。

诊断区域可以分成两个部分：5’ 部分和 3’ 部分，或者含有一个不配对的部分。诊断区域的5’ 部分与第一区域重叠。换句话说，诊断区域的5’ 部分和第一区域有一些共同的序列。诊断区域的5’ 部分和第一区域可能含有其它非共有的序列。诊断区域的3’ 部分含有突变核苷酸。诊断区域可以含有一个突变，例如BRAF V600E，或诊断区域含有潜在的多重突变，例如Kras突变时密码子12和13上的突变。

第一区域和诊断区域的长度依赖于第一引物和寡核苷酸探针的大小。

能够与靶序列杂交的第一引物，最好它的熔解温度在第二个熔解温度(T_m2)加减5 (T_m2-5 to T_m2+5)的范围之内。更优选的能够与靶序列杂交的第一引物的熔解温度在第二个熔解温度(T_m2)加减3 (T_m2-3 to T_m2+3)的范围之内。更优选的能够与靶序列杂交的第一引物的熔解温度与第二个熔解温度(T_m2)相同或低于其 1°C 到5°C。

第一引物和第二引物最好是自然发生的核苷酸，尽管修饰的核苷酸或者键也可以包括在第一和第二引物当中。

在一个实例中，标记的寡核苷酸探针可以只包含自然产生的核苷酸。在另一些实例中，标记的寡核苷酸探针可以包含自然发生的或者是修饰的核苷酸或键。寡核苷酸探针只有PNA或LNA组成不是好的选择。修饰的核苷酸或键可以包含LNA、PNA、d(2-amA)TP、5-甲基胞嘧啶、小槽沟结合剂或碱基类似物。有时寡核苷酸探针包含一个或多个修饰的核苷酸或碱基。更为优选的是相对于突变核苷酸的核苷酸被修饰。

寡核苷酸探针可以含有核苷酸、核苷酸衍生物、核苷酸类似物和/或非核苷酸的化学部分。探针的修饰促进或加强了探针的结合，这些修饰包含但不局限于小槽沟结合剂的掺入；带正电的或中性的磷酸二酯键的掺入，这种磷酸二酯键的掺入会降低探针和靶标的多聚阴离子骨架的斥力 (见 Letsinger et al., 1988, J. Amer. Chem. Soc. 110:4470) ；烷基化或卤代碱基的掺入，例如在探针中掺入5-溴尿核苷能够增强碱基堆集，加入核糖核苷酸能够使探针-靶标双链体形成"A"结构，在探针中用2,6-二氨基嘌呤（氨基腺苷）置换部分或所有的腺嘌呤，和/或5-甲基胞嘧啶置换胞嘧啶，或应用核苷酸衍生物例如LNA（锁核酸），PNA（肽核酸）等等，这些结构都能够促进碱基堆集。

能够加强探针与靶核酸结合的修饰部分最好处于探针的3’部分，或者是在探针的3’末端。例如，小槽沟结合剂可以被连接到探针的3’端。能够加强探针和靶序列的结合的一些核苷酸类似物优选的位于突变核苷酸的相对应位置上。

一般来说，探针的3'末端会被“封闭”以阻止探针和引物结合产生延伸产物，“封闭”可以采用不配对碱基或加入化学部分例如染料、淬灭剂、生物素或磷酸基团到最后一个核苷酸的3'羟基来实现，这些掺入部分可充当检测的标记。封闭也可以通过移除3'-OH或利用缺少3'-OH的核苷酸例如双脱氧核苷酸来实现。

标记的寡核酸探针包含的检测标记部分可以是荧光基团、放射显影基团、发光基团或者是化学发光基团。

杂交后能产生信号的任何类型的探针都可以使用。探针的信号强度通过杂交可以加强也可以减弱。探针可以只有一个标记基团，优选的也可以是多重标记。

探针的标记物可以是荧光基团。该探针可以包含相互作用的标记对，例如荧光基团和/或非荧光染料。这种相互作用的标记对的一个实例就是荧光——淬灭基团对。标记可以在探针的任何位置上，只要它与其它的标记或别的实体如寡核苷酸上的G核苷酸相互作用。标记最好是连接在探针的两端，例如，荧光基团连接在探针的5’末端而淬灭基团连接到探针的3’末端。

标记的寡核苷酸探针可以包含一个报告基团和一个淬灭基团，当上述的寡聚核苷酸探针为单链构象时，也就是说还未跟上述的靶核酸杂交时，其中的淬灭基团可以淬灭上述的报告基团的荧光，

所述的寡核苷酸探针在与靶核酸杂交时能够形成双链结构，这时报告基团的荧光不能被淬灭，使得报告基团的荧光强度较单链探针时大大增强。

淬灭标记最好是非荧光染料标记，它连接在寡聚核苷酸探针的3’末端或5’末端，或者是连接在寡聚核酸探针的内部残基。报告基团可以是荧光染料标记，连接到寡聚核苷酸探针的内部残基，或者是链接到寡聚核苷酸探针的5’末端或者是3’末端。优选是探针的5’末端标记荧光基团3’末端标记淬灭基团。也可以是探针的中间核苷酸标记荧光基团而3’末端标记淬灭基团。报告标记优选是荧光基团，包括荧光素、荧光素衍生物、花青染料、荧光素—花青结合物及类似的物质。

所述“荧光基团”是指在特定的激发波长下吸收光能后能发出不同的特定波长的光的化学基团。荧光基团标记包括但不局限于：Alexa Fluor染料（包含Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、 Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、 Alexa Fluor 633、 Alexa Fluor 660 和 Alexa Fluor 680), AMCA, AMCA-S, BODIPY 染料 (BODIPY FL、 BODIPY R6G、BODIPY TMR、 BODIPY TR、 BODIPY 530/550、 BODIPY 558/568、 BODIPY 564/570、 BODIPY 576/589、 BODIPY 581/591、 BODIPY 630/650、 BODIPY 650/665), 羧基罗丹明 6G, 羧基-X-罗丹明 (ROX), Cascade Blue, Cascade Yellow, 花青染料 (Cy3、 Cy5、 Cy3.5、 Cy5.5), Dansyl, Dapoxyl, Dialkylaminocoumarin, 4 ', 5'-Dichloro-2 ',7'-dimethoxy-fluorescein, DM-NERF, Eosin, 藻红, 荧光素, FAM, 羟基香豆素, IRDyes (IRD40、 IRD 700、 IRD 800), JOE, 丽丝胺若丹明B, Marina Blue, Methoxycoumarin, Naphthofluorescein, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, PyMPO, Pyrene, 罗丹明 6G, 罗丹明绿, 罗丹明红, Rhodol Green, 2 ', 4 ', 5 ', 7'-Tetra-bromosulfone-fluorescein, 四甲基罗丹明 (TMR), Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), Texas Red 和 Texas Red-X。

所述“淬灭基团”是指当它与荧光基团空间位置靠近的时候能够吸收激发荧光标记的能量以至消散能量的任何基团。淬灭基团可以是荧光素淬灭基团或者非荧光素淬灭基团，也称为黑暗淬灭物。荧光基团接近另一荧光基团时，它也能够充当淬灭者，不管是消耗淬灭还是接触淬灭都可能发生。黑暗淬灭物最好是用不能淬灭任何可见光的淬灭物。淬灭物包含但不局限于DABCYL ( 4-(4'-dimethylaminophenylazo) 苯甲酸) succinimidyl（琥珀酸）酯, diarylrhodamine carboxylic acid, succinimidyl ester (QSY-7), 和 4 ',5'-dinitrofluorescein carboxylic acid, succinirnidyl ester (QSY-33), quencherl, 或 "Black hole quenchers" (BHQ-1, BHQ-2 和d BHQ-3), 核苷酸类似物, 核苷酸 G 残基, nanoparticles, 和金颗粒。

既然诊断区域被分成两部分：5’ 部分和 3’部分，标记的寡核酸探针也可以被分成两部分，第一部分包含与诊断区域的5’端序列基本一致的序列，第二部分包含与诊断区域3’端基本一致的序列，其中，寡核苷酸探针的第一部分和第二部分是连续的，而诊断区域的5’ 部分和 3’部分可以是连续的也可以是不连续的。在一个实例中，寡核苷酸探针的一个序列与靶序列的诊断区域一致。在一个优化的实例中，寡核苷酸探针包含一个与靶序列的诊断区域不一致的序列。在寡核苷酸探针和靶核酸的诊断区域形成的双链体上，靶核苷酸序列的一条链上可以存在1—6个核苷酸的膨出。寡核苷酸探针和靶核酸的诊断区域的双链体上存在的一个膨出或错配有利于降低探针的T_m值。

因为寡核苷酸探针、第一引物和扩增的PCR产物不能形成能被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶识别的结构，所以本发明的寡核苷酸探针是不能被降解的，即使反应混合液中包含有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。

既然第一引物和标记的寡核酸探针含有共同的序列，他们与靶序列的同一区域竞争性的结合。当突变核苷酸存在的时候，探针会结合的不牢固，因此第一引物有更高的机会结合和延伸，导致含有突变核苷酸的靶核酸的有效扩增。熔解曲线分析显示熔解曲线峰值上有一个与第二个熔解温度一样或相似的温度出现。

在以上方法中，探针和引物是不同的分子。此发明的另外一种情况是，探针可以与第二引物相连，成为连接的探针-引物分子。探针可连接在引物的5‘端。此连接的探针-引物分子包括5’端探针部分和3‘端引物部分。探针部分可含有以上探针的全部或大部分特性。连接的探针-引物也含有其他特性。此连接的探针-引物可以作为引物在模板上起始延伸，当延伸链变成单链后，在杂交条件下，其探针部分可与自己的延伸部分杂交，形成颈-环结构（图2）。这里的探针部分与以上单独的探针作用相同。

在此颈-环结构中，5‘探针部分与突变的靶序列不完全匹配，使得颈-环结构不稳定，允许第一引物与颈部分杂交，完成PCR反应。相反，5‘探针部分与野生型的靶序列完全匹配，使得颈-环结构很稳定，阻止第一引物与颈部分杂交，从而不能完成PCR反应（图2）。5‘探针部分与引物的连接部分可以是正常的核苷酸，也可以是其他化学基团。此化学基团可以是不能被核酸酶识别，使得探针部分不能被复制。

当不存在突变核苷酸时，第一引物也与包含正常核苷酸的靶核苷酸结合和延伸，产生正常靶核酸序列的PCR产物，可作为PCR质控。美国专利No. 7,803,543 利用PNA作为钳子或者是传感器，PNA探针可以使只含有正常核苷酸的样本完全不扩增。没有办法知道不扩增是因为PCR失败或是由于突变靶核酸的不存在而失败。在本发明中，如果突变靶核酸不存在，反应将扩增正常的靶核酸，尽管反应是以低的效率进行。这种正常靶序列的低效率扩增仍可作为PCR反应的质控。

在本发明中，如果靶序列中正常和突变的核苷酸都存在，取决于突变和正常靶核酸的比率，PCR结束后熔解峰T_m1和 T_m2都会出现在熔解曲线图中。当突变核苷酸的比例很大时，熔解曲线中只会出现T_m2的熔解峰。当突变核苷酸以一定比例出现时，熔解曲线中会出现T_m1和 T_m2的熔解峰。两个峰的相对高度能够表示出每个靶核酸相对于已知浓度的标准质控的量的多少。当样本中只含有正常核酸，熔解曲线只显示T_m1的熔解峰，指示PCR正常工作和样本中不含有突变核苷酸。尽管目前的方法大部分是检测存在或不存在，但也能够提供一些定量信息。如上所述，T_m1和 T_m2的相对熔解峰高度能够表示每一种靶序列的量。当与已知浓度的标准质控相比较后能够得出较准确的定量数据。

突变核苷酸可以包含一个或多个核苷酸置换、缺失、插入或非正常的甲基化。

本发明的扩增反应优选是PCR，尽管也可以使用其它的扩增方法。影响检测低频率存在于样本中的突变的灵敏性的一个重要因素是第一个引物和寡核苷酸探针的浓度比。一般而言，第一个引物和寡核苷酸探针的浓度比要小于1。尽管如此，不能精确的确定哪一个比率是最好的，除非用试验的方法测试各种突变比率。事实上，来自制造商的寡核苷酸的标识浓度不一定是准确的。任何细小的不准确性都能影响两种寡核苷酸的比率，所以要做实验去核实应用的引物和探针的准确的量。趋势是比率越低，灵敏度越高。尽管如此，如果比率太低了，意味着仅有很少的引物，这样PCR可能无法有效的进行。

本发明也提供了一种在一个简单的反应器中分析生物样本中不同的靶序列的突变的存在和/或突变的数量及多对基因座的多态性。例如， Kras密码子12-13和BRAF V600E能够用一个简单的反应来测定。Kras 和BRAF的引物和探针在这个简单的PCR反应中混在一起。Kras 和BRAF的探针可以标记不同的染料，所以它们可以在不同的检测通道中被检测。

扩增反应混合液包含标准扩增试剂。一个样本可能含有靶序列核酸或感兴趣的突变核苷酸。样本中的靶核酸可以是双链基因组DNA 或 cDNA，然后用适宜的变性方法进行变性。变性的核酸链然后与寡核苷酸引物和探针在杂交条件下进行孵育，换言之，就是引物和/或探针与单核酸链混在一起的条件下进行。

本发明更进一步提供了反应混合液，包含：第一引物和第二引物，通过PCR能够扩增包含靶序列诊断区域的核酸，其中第一引物含有一段基于靶序列第一区域的序列（即第一引物序列与第一区域一致或基本一致），其中第一区域与靶序列诊断区域的5’部分有重叠，但与突变核苷酸没有重叠，其中第一区域的3’末端与突变核苷酸的5’端相邻，其中第二引物包含一段基于位于靶序列诊断区域下游第二区域上的序列，

标记的寡核苷酸探针包含一个可检测的部分和一段基于野生型核苷酸（也称为正常核酸）诊断区域的序列，其中，标记的寡核苷酸上的相应核苷酸与靶序列上的正常核苷酸一致，这样标记的寡核酸探针与靶序列诊断区域杂交导致第一个双链体形成，产生第一个熔解温度(T_m1)，标记的寡核酸探针与包含突变核苷酸的靶序列诊断区域杂交形成第二个双链体，产生第二个熔解温度(T_m2)，其中T_m2低于T_m1，T_m1 和 T_m2的值可通过实验或理论计算得到。

本发明更进一步的提供了一个组合物，包含：第一引物和第二引物，通过PCR扩增包含靶序列诊断区域的核酸，其中第一引物含有一段基于靶序列第一区域的序列（即第一引物序列与第一区域一致或基本一致），其中第一区域与靶序列诊断区域的5’部分有重叠，但与突变核苷酸没有重叠，其中第一区域的3’末端与突变核苷酸的5’端相邻，其中第二引物包含一段基于位于靶序列诊断区域下游第二区域上的序列，

一种用于检测突变核酸序列的方法的试剂盒，包括：

第一引物和第二引物，通过PCR过程能够产生包含靶序列诊断区域的一个序列的PCR产物，其中第一引物包含一段基于第一区域的序列，第一引物序列与第一区域一致或基本一致，这个区域与靶序列的诊断区域的5’部分有重叠，但是与突变核苷酸没有重叠，其中第一区域的3’末端与突变核苷酸的5’端相邻，其中第二引物包含一段基于靶序列诊断区域下游第二区域的序列；

标记的寡核苷酸探针包含一个可检测部分和一段基于靶核酸诊断区域的序列，这段序列没有突变核苷酸，即为正常的核苷酸，其中标记的寡核苷酸的相应核苷酸与靶序列上的正常的核苷酸一致，这样标记的寡核苷酸探针与上述靶序列诊断区域杂交形成第一个双链体，产生第一个熔解温度，标记的寡核苷酸探针与含有突变核苷酸的靶序列诊断区域杂交形成第二个双链体，产生第二个熔解温度，其中，第二个熔解温度低于第一个熔解温度；

上述标记的寡核苷酸探针包含一个报告标记和一个淬灭标记，当上述寡核苷酸探针是单链的构象及没有与上述靶核酸杂交时，淬灭标记可以淬灭上述报告标记的荧光；

其中，上述寡核苷酸探针与上述靶核酸杂交时形成双链构象，上述报告标记的荧光是不能被淬灭的，这样上述报告标记的荧光强度比当上述寡核苷酸探针是单链的构象及没有与上述靶核酸杂交时的荧光强度强。

上述提及的任何一种反应混合液、混合物或者是试剂盒，第一区域的3’末端与第一引物基本互补（一致），可以与靶序列诊断区域的至少一个突变核苷酸的5’端相邻。其中，第一引物退火后延伸，第一个延伸的核苷酸就是突变的核苷酸。

在另外的实例中，第一区域的3’末端可以与突变核苷酸的5’端远隔一到九个核苷酸，其中当第一引物退火后延伸，第二个到第十个延伸的核苷酸是突变的核苷酸。

能够与靶序列杂交的第一引物，它的熔解温度可以与第二个熔解温度一致或者是低于第二个熔解温度。第一引物的熔解温度可以在第二个熔解温度加减3的范围之内(T_m2-3 to T_m2+3)。

标记的寡核酸探针可以包含自然发生的核苷酸，或者是修饰的核苷酸或键。修饰的核苷酸或键可以是LNA、 PNA、 d(2-amA)TP、5-甲基胞嘧啶、小槽沟结合剂或碱基类似物。

标记的寡核苷酸探针可以包含一个报告标记和一个淬灭标记，其中，当上述寡核苷酸探针为单链构象，没有与上述靶核酸杂交时，淬灭标记可以淬灭上述报告标记的荧光；

其中，上述寡核苷酸探针当与上述靶核酸杂交时能够形成双链构象，此时上述报告标记的荧光是不能被淬灭的，荧光强度比单链探针即没有与上述靶核酸杂交时的荧光强度更强。

标记的寡核苷酸探针可以被分成两部分。第一部分包含与诊断区域的5’端序列一致的序列，第二部分包含于诊断区域的3’端序列一致的序列，其中标记的寡核苷酸探针的第一部分和第二部分可以连续的，诊断区域的5’端部分和3’短部分可以是不连续的。

为了更好的理解本发明，对一些术语定义如下：

所述“样本”是包含或者假定包含核酸的任何物质，也包含从一个或者多个个体中分离得到的组织或体液样本。这个核酸样本可能来自于病毒、细菌、真菌、植物和动物。最好该核酸样品取自哺乳动物，优选是人类样本。核酸样本可以来自于检测对象的体液或活检标本，或培养细胞。体液可能来自于全血、血清、血浆、尿液、痰液、胆汁、粪便、骨髓、淋巴、精液、乳房分泌物、唾液、眼泪、支气管洗出液、胃洗出液、脊髓液、关节液、腹水、胸膜积液和羊水等。

所述“核酸序列”是指脱氧核糖核酸、核糖核酸或其它核酸的同聚物或杂聚物。所述“核苷酸”一般是指组成核酸序列的单体，该单体可以是核苷酸和/或核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸，例如氨基修饰的核苷酸。另外，“核苷酸”包括非自然发生的类似结构。

所述“核酸”是指至少两个以共价键相连的核苷酸。本发明所述核酸通常包含磷酸二酯键，尽管在一些情况下也包含核酸类似物，它含有可替代的骨架，包括，例如磷酰胺、磷硫酰、二硫代磷酸酯、氧-甲基磷酸酯以及肽核酸骨架和连接键。还有的核酸类似物包含带正电的骨架、非离子型骨架、非核糖型骨架。核酸可以是单链或者是双链，特定的，或包含单链和双链的部分。核酸可能是DNA，基因组DNA和cDNA, RNA 或DNA-RNA杂合体，核酸包含脱氧核糖核酸和核糖核酸的任意组合，和任意碱基的组合，碱基包含尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌酐、黄嘌呤、次黄嘌呤等等。“DNA序列”包含单链和双链DNA。一个特异的序列，除了上下文中另有说明者外，指的是这个序列的单链DNA，这个序列和它的互补链（双链DNA）的双链体和/或这个序列的互补链。

所述“多聚核苷酸”和“寡聚核苷酸”是核酸的类型，一般是指引物、探针、被检的寡聚物片段、寡聚物质控和未标记的阻滞物和多聚脱氧核糖核苷酸 (包含2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(包含 D-核糖)和其他任何类型的多聚核苷酸，它的N-糖苷为嘌呤或嘧啶碱基，或者是修饰过的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”、“多聚核苷酸”和“寡聚核苷酸”在长度上不加区分，而且这些词可以互换使用。“核酸”、“DNA”及其它的类似术语也包括核酸类似物。寡聚核苷酸并不一定是天然序列或其衍生物,而可能以各种方式产生，包含化学合成、DNA复制、反转录或者是各种组合的方式。

当两个没有重叠序列或者是部分重叠的寡聚核苷酸序列与同一线性互补的核酸序列的不同区域退火时，寡聚核苷酸的3'端指向另一寡聚核苷酸的5'端方向，前者可被称为“上游”寡聚核苷酸而后者称为“下游”寡聚核苷酸。

术语“靶序列”、“靶核酸”、“靶核酸序列”及“感兴趣的核酸”可以互换使用，都是指需要被扩增和/或检测的片段，或者是与一个互补的寡聚核苷酸或多聚核苷酸杂交的核酸，例如，一个阻滞的寡聚物或引物延伸的目标片断。靶序列可以是单链或双链的DNA 、RNA、结构类似物或杂合体。靶序列可以是单链也可为双链。在引物延伸阶段，靶序列与引物杂交形成双链体，这时的靶序列也称为“模板”。模板在合成互补多聚核苷酸时起样板作用。本发明中涉及的靶序列可以来源于活体或者是死的组织，包含但不限于原核生物、真核生物、植物、动物和病毒，以及合成和/或重组的靶序列。

所述“引物”是一个以上引物，是一段自然产生的或是人工合成的寡聚核苷酸。在合成引物扩增序列中扮演了起始点的角色，互补链被诱导产生，例如在核苷酸和有聚合作用的媒介如DNA聚合酶的存在下，在合适的温度和适当的缓冲液条件下。这些条件包括：四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和诱导聚合作用的媒介如DNA聚合酶或逆转录酶，在合适的缓冲液中（“缓冲液”包含辅因子或有效的pH、离子强度等组成），和在适宜的温度下。引物最好是单链以便在扩增反应中有最高的效率。所述引物要与每一被扩增特异序列的一条链互补配对，这意味着引物必须同对应的扩增链充分地互补杂交。一段没有互补的核酸片段可以连接在引物的5’端，引物余下的序列与靶序列互补配对。通常引物是互补的，除了在引物末端预设非互补核苷酸的情况。换句话说，选用的引物要与每一个被扩增的特异序列相一致，这表明引物必须与一条链充分配对，这样它们才可以同对应链杂交。

所述“核酸序列的互补序列”是指一段寡聚核苷酸，当与核酸序列比对时，一条序列的5'端与另一条序列的3'端配对，即“反向平行联合”。互补配对不需要完美配对，稳定的双链体也可以包含错配或者是不配对的碱基。

所述“T_m”是指“熔解温度”。熔解温度是指双链多聚寡核苷酸分子或者是核酸寡聚物，同源双链体或者是异源双链体，有半数解链成单链时的温度。计算T_m值的方法要考虑到碱基序列以及其他多种因素，包括分子结构、序列特点及低聚物连接键属性。可以通过多种方式计算T_m值。例如，熔解温度可以从双链体的碱基长度进行理论推算而得到，双链体的一个错配会导致T_m值的降低。然而，一个双链体的T_m值通常通过实验测得，方法是把双链体缓慢升温，不间断的测量双链解链成单链的过程。本发明中检测T_m值的方法是众所周知的，例如，可以通过测定紫外吸收、表面离子共振 (SPR)、或者是通过检测荧光来测得T_m值。

所述“熔解曲线分析”是指分析探针与PCR扩增产物杂交双链的熔解温度差异的方法。

所述“互补”是指两条核酸序列通过氢键发生序列特异性的结合，它们的嘌呤和/或嘧啶碱基依据沃森-克里克法则形成双链核酸复合体。也可以解释为核酸序列及修饰的核酸序列或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的类似物与另一段序列依据沃森-克里克法则形成核酸双链体的能力。

所述“一致”是指两条核酸序列拥有相同的序列或者是互补的序列。“一致”和“互补”，有时候意思是相同的。例如，在靶序列的一个诊断区域包含变异的核苷酸。这个诊断区域是一个双链DNA片段。一个探针与这个诊断区域的一条链互补，即与这个诊断区域的另一条链一致。

所述“基本互补”或“基本一致”指引物或探针必须与模板链大量的互补或者是一致。像这样，引物序列或探针序列不需要完全与模板序列一致。因此，引物或探针上的碱基与靶序列有均等的或者是多于70%、更好的多于80%、或更好的多于90%或最好的多于95%或99%的一致性，或者在探针（或感兴趣的核酸）对应的链上能够找到它的沃森-克里克结合对象，这样两条核酸链才能杂交。

所述“诊断区域”、“选定区域”可以互换使用，都是指靶序列的一个特异区域，在这个区域可能有碱基突变。

所述“杂交”和“退火”也可以互换使用，是指两个核酸互补配对结合到一起形成双链体的过程。

所述“双链体”和“双链”可以互换使用，是指两个有互补序列的核酸杂交形成的结构。双链体可以由两个互补DNA序列、两个RNA序列或者是DNA序列和RNA序列之间形成，后者形成的是杂合双链体。双链体的一条链或者是两条链都可以含有修饰过的核苷酸和/或核酸类似物。所述双链体也可以是样本序列同一个或多个探针杂交而形成。

所述“野生型序列”、“野生型核酸”、“正常核酸”、“野生型DNA”和“野生型模板”可以互换使用，都是指含有正常的，未发生改变的核苷酸序列。

所述“突变多聚核苷酸”、“突变核酸”、“变异核酸”和“含有变异核苷酸的核酸”是指同野生型核酸相比有核苷酸差异的核酸序列。突变序列与野生型序列之间的差异核苷酸称为核苷酸“突变”、“变异核苷酸”或“变异”。所述“变异核苷酸”是指一个或多个碱基置换、缺失、插入、甲基化和/或修饰变化。

所述“扩增”是指在一个混合的核酸样本中使特异核酸序列的浓度显著提高的过程。

所述“标记”是指对用来提供检测（可定量的）信号的与核酸或蛋白相连的任何原子或分子。标记可以为荧光、放射性、比色、重量分析法、磁性、酶活性等方法提供可检测的信号。

所述“相邻的”或“基本相邻”是指靶序列的两个区域或在模板链的互补链上的两个寡聚核苷酸的位置。这两个区域或两个寡聚核苷酸可能相邻0-大约40个核苷酸，更加准确的为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。相隔0个核苷酸代表这两个区域或这两个寡聚核苷酸紧挨着。换句话说，通过寡聚核苷酸杂交的这两个区域或两个模板区域是连续的，例如，两个模板区域之间没有缺口。同样的，通过寡聚核苷酸杂交的两个区域可能相隔1到40个核苷酸。

所述“重叠”是指在模板核酸的互补链上的两个靶区域或者是两个寡聚核苷酸的位置。这两个区域或者是两个寡聚核苷酸可能会重叠1到40个核苷酸。换句话说，这两个区域拥有一个共同的区域，这个共同的区域与两个不同的寡聚核苷酸都互补。

所述“探针”是指一个能与靶序列互补配对形成双链体的寡聚核苷酸，但是无法像引物一样延伸形成产物。

所述“热循环”是指温度的重复循环变化，温度的变化从总的热变性温度，到退火（或杂交）温度，到延伸温度和回到热变性温度称为一个循环。这个术语也指当退火和延伸为同一温度时的热变性温度和延伸温度之间的重复循环。总的热变性温度使所有的双链片段全部解链成单链。退火温度使一个引物杂交或退火到核酸模板裂解开的一条链的互补序列。延伸温度使新生的DNA扩增子合成。术语“单轮热循环”是指包含热变性温度、退火温度和延伸温度的单轮循环。在单轮热循环中可能会有退火温度和延伸温度的内部循环。例如，一个单轮热循环可能会包一个含热变性温度，一个退火温度，一个延伸温度，另一个退火温度和另一个延伸温度。总而言之，在一个单轮热循环中可能会有多重退火温度。

所述“反应混合液”、“扩增混合液”或“PCR混合液”是指至少能够扩增核酸模板的一个扩增子的必须组分的混合液。混合液包含核苷酸(dNTPs)、热稳定聚合酶、引物及核酸模板。还可能还有Tris缓冲液、单价盐和Mg²⁺离子。本发明中每一组分的浓度都是众所周知的，并可以被常规技术人员进一步优化。

所述“扩增产物”或“扩增子”是指用一对引物利用聚合酶的方法如PCR法进行扩增而得到的DNA片段。

所述“熔解曲线图”是指对寡聚或（多聚）核苷酸和它的互补物测量结果的收集，以证实寡聚（多聚）核苷酸分子从双链到单链核酸的转变（反之亦然）。一个核酸从双链到单链的转变经常被描述为核酸分子 “变性”或“解链”。相应的，本发明的熔解曲线也可以称为“解链曲线图”、“变性曲线图”、“熔解曲线”、“解链曲线”“杂交/解链曲线图”等。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

本发明方法在检测一个或多个突变核酸序列的过程中具有更高的检测准确性、灵敏性以及可重复性。

附图说明

图1是本发明具体应用的原理示意图。反应主要包括：第一条引物、第二条引物和标记的寡核苷酸探针。在退火时，标记的寡核苷酸探针和第一条引物竞争模板上的相同结合位点，实现对突变序列的富集扩增。熔解曲线分析中，高Tm值的峰表示野生型，低Tm值的峰表示突变型。

图2是连接的探针-引物分子为扩增引物的工作原理示意图。该探针-引物分子是在引物的5’端连接一条标记的并与该引物扩增产物互补的寡核苷酸探针。在退火时，产物分子内部形成茎环结构。5’端标记探针部分与野生型序列完全互补，可形成稳定的茎环结构；与突变型有一个或更多碱基错配，使茎环结构不稳定。PCR扩增时，第一条引物可以与含有突变模板退火，而野生型模板因稳定的分子内茎环结构所阻滞而不能退火，从而实现对突变型模板的富集扩增。

图3是EGFR基因外显子21上L858R点突变模拟模板熔解曲线分析图。

具体实施方式

下面结合附图1至图3与具体实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

引物和探针的设计与合成

近年来，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因作为恶性肿瘤的分子靶向治疗的靶标受到国内外肿瘤界的普遍关注，易瑞沙、特罗凯等靶向药物已被批准在临床上应用。大量研究表明EGFR基因突变状态与这些药物的临床疗效有关，这些突变主要发生在外显子18-21上。

本例中以EGFR外显子21上的L858R点突变为例，根据其基因序列设计引物和探针，并确保产生的靶序列扩增产物中含有待检测的突变位点。正向引物的3’端与突变点相邻但不包含突变点，其序列可以是序列表中的SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.2；反向引物序列可以是序列表中的SEQ ID NO.3- SEQ ID NO.4；探针5’端与正向引物的一部分序列重叠，3’端包含突变点，其序列为序列表中的SEQ ID NO.5。

引物和探针均委托专业公司进行合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。探针在5’末端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1淬灭基团。

表1 EGFR基因外显子21 L858R突变检测引物和探针寡核苷酸序列表

序列编号	序列名称	寡核苷酸序列（5’-3’）	碱基长度（bp）
				SEQ ID NO.1	EGFR21正向引物1	GATCACAGATTTTGGGC	17
SEQ ID NO.2	EGFR21正向引物2	AGATCACAGATTTTGGGC	18
				SEQ ID NO.3	EGFR21反向引物1	CTTTGCCTCCTTCTGCATGGTA	22
SEQ ID NO.4	EGFR21反向引物2	CTCCTTACTTTGCCTCCTTCTGCA	24
				SEQ ID NO.5	EGFR21探针	GATCACAGgTTTTGCTGGCAAACTGC	26

实施例2：

DNA模板准备

首先通过分子克隆的方法制备包含EGFR基因外显子21 序列的质粒，命名为突变质粒。将突变质粒DNA和野生型基因组DNA浓度调整为3000 copies/μl，按下述方法配制模拟DNA模板。

10% 取10μl 3000copies/μl的突变质粒混入90μl同浓度的野生型基因组DNA，振荡混匀；

1% 取10μl 10%液混入90μl 3000copies/μl的野生型基因组DNA，振荡混匀；

0.5% 取40μl 1%液混入40μl 3000copies/μl的野生型基因组DNA，振荡混匀；

野生型对照即为3000 copies/μl的野生型基因组DNA。

实施例3：

PCR反应组成

按下表（表2）配制PCR反应液并加入模拟DNA模板（每次实验必须包括野生型对照和空白对照）。配制完成后旋涡振荡混匀，离心后上机。

表2 PCR体系各成分组成

组分名称	终浓度
		PCR Buffer	1×
dNTPs	0.1 mM
		EGFR21正向引物	0.05 μM
EGFR21反向引物	0.2 μM
		EGFR21探针	0.25 μM
HS-Taq	0.4 U
		无菌超纯水	适量
DNA模板	1 μl
		总体积	20 μl

实施例4：

反应程序设定

设置收集FAM荧光信号的检测通道，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪开始扩增，反应程序如下：

表3 PCR程序设定

实施例5：

结果判定

当荧光定量PCR仪运行结束后，用其配套软件对本次试验的结果进行熔解曲线分析。野生型对照模板只出现一个Tm值较高的单峰（野生峰）；10%的模拟模板只出现一个Tm较低的单峰（突变峰）；0.5%、1%模拟模板同时出现两个峰，一个野生峰，一个为突变峰。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims

1.一种检测突变核酸序列的方法，其特征在于，方法如下：

步骤a：提供能够扩增产物的第一引物和第二引物，扩增靶序列的诊断区域的一段核酸序列得到扩增产物，其中第一引物包含基于靶序列第一区域的一段序列，第一引物序列与第一区域一致，其中第一区域与靶序列的诊断区域的5’部分重叠，但与突变核苷酸不重叠，其中第一区域的3’端与突变核苷酸的5’端相邻，其中第二引物包含基于靶序列的诊断区域下游的第二区域的一段序列；

提供标记的可供检测的寡核苷酸探针, 此标记的寡核苷酸探针包含一个可检测的基团和拥有一段基于正常靶序列诊断区域的序列，标记的寡核酸探针上的相应序列与靶核酸序列上的正常序列一致，使得标记的寡核苷酸探针与上述的相关靶核酸序列的诊断区域杂交形成第一个双链体，得到第一个熔解温度T_m1，标记的寡核苷酸探针与突变的靶序列诊断区域杂交形成第二个双链体，得到第二个熔解温度T_m2，其中，T_m2值低于T_m1值，T_m2值和T_m1值可通过实验或者是理论计算得知；

2.根据权利要求1所述的检测突变核酸序列的方法，其特征在于：所述的PCR反应采用缓慢升/降温度或者多重退火温度，其中，采用缓慢升/降温度的速率低于2°C/秒，或低于1°C/秒，或低于0.5°C/秒，或低于0.2°C/秒。

3.根据权利要求2所述的检测突变核酸序列的方法，其特征在于：所述的标记的寡核酸探针包含自然发生的核苷酸，或是修饰的核苷酸或键，修饰的核苷酸或键包含LNA、PNA、 d(2-amA)TP、5-甲基胞嘧啶、小槽沟结合剂或碱基类似物。

4.根据权利要求1所述的检测突变核酸序列的方法，其特征在于：所述的第一区域的3’末端与靶核酸序列诊断区域的至少一个突变核苷酸的5’相邻，其中当第一引物退火后延伸，第一个延伸的核苷酸就是突变的核苷酸。

5.根据权利要求1所述的检测突变核酸序列的方法，其特征在于：所述的第一区域的3’末端与突变核苷酸的5’端相隔1到9个核苷酸，其中当第一引物退火后延伸，第二个到第十个延伸的核苷酸即是突变的核苷酸。

6.根据权利要求1所述的检测突变核酸序列的方法，其特征在于：所述的第一引物，能够与靶序列杂交，它的熔解温度与第二个熔解温度T_m2相同或低于第二个熔解温度T_m2。

7.根据权利要求1所述的检测突变核酸序列的方法，其特征在于：所述的第一引物，能够与靶核酸序列杂交，它的熔解温度在第二个熔解温度T_m2加减3的范围之内(T_m2-3 to T_m2+3)。

8.根据权利要求1所述的检测样本中靶序列诊断区域是否存在突变核苷酸的方法，其特征在于：所述的基团是荧光基团、放射显影基团、发光基团或化学发光基团。

9.根据权利要求1所述的检测突变核酸序列的方法，其特征在于：所述的寡核苷酸探针包含一个报告标记和一个淬灭标记，其中淬灭标记在当上述寡核苷酸探针是单链结构且没有与上述靶核酸杂交时，能够淬灭报告标记的荧光；其中上述寡核酸探针与靶核酸杂交后形成双链结构后，报告标记的荧光不能被淬灭，此时报告标记的荧光强度比当上述寡核苷酸探针是单链时构象及没有与上述靶核酸杂交时的荧光强度更强。

10.根据权利要求1或9所述的检测突变核酸序列的方法，其特征在于：所述的寡核苷酸探针与第二引物相连，成为连接的探针-引物分子，探针连接在引物的5‘端，此连接的探针-引物分子包括5’端探针部分和3‘端引物部分，探针部分含有以上探针的全部或大部分特性，此连接的探针-引物可以作为引物在模板上起始延伸，当延伸链变成单链后，在杂交条件下，其探针部分可与自己的延伸部分杂交，形成颈-环结构。

11.根据权利要求1所述的检测突变核酸序列的方法，其特征在于：所述的标记的寡核苷酸探针可以被分成两部分，第一部分包含与诊断区域的5’端序列一致的序列，第二部分包含与诊断区域的3’端序列一致的序列，其中标记的寡核苷酸探针的第一部分和第二部分可以连续的，诊断区域的5’端部分和3’端部分可以是不连续的。

12.一种用于检测突变核酸序列的方法的试剂盒，其特征在于，包括：

第一引物和第二引物，通过PCR过程能够产生包含靶序列诊断区域的一个序列的PCR产物，其中第一引物包含一段基于第一区域的序列，第一引物序列与第一区域一致，这个区域与靶序列的诊断区域的5’部分有重叠，但是与突变核苷酸没有重叠，其中第一区域的3’末端与突变核苷酸的5’端相邻，其中第二引物包含一段基于靶序列诊断区域下游第二区域的序列；

其中，上述寡核苷酸探针与上述靶核酸杂交时形成双链构象，上述报告标记的荧光是不能被淬灭的，此时上述报告标记的荧光强度比当上述寡核苷酸探针是单链的构象及没有与上述靶核酸杂交时的荧光强度强。