KR20210110245A - 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일염기다형성(SNP), 점 돌연변이 또는 miRNA 이형체(isoform)와 같은 유전적 변이가 포함된 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 단일핵산을 사용하여 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 절단시약에 의해서만 절단되는 단일핵산(promer)을 이용한 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법은 종래 프로브를 이용한 유전적 변이 검출 방법에 비해 보다 정확하게 측정할 수 있는 이점이 있다. 또한, 암과 관련된 KRAS, EGFR 유전자 등에서 발생하는 다양한 점 돌연변이를 정확하게 구분할 수 있어 암을 비롯한 다양한 질병의 진단 및 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법{Single nucleic acid for real-time detection of genetic variation of a single target gene and detection method using the same}
본 발명은 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일염기다형성, 점 돌연변이 또는 miRNA 이형체(isoform)와 같은 유전적 변이가 포함된 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 단일핵산을 사용하여 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
유전자 변형에 있어 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 변형은 가장 일반적인 형태이며, 다양한 질병을 유발시키는 원인으로 작용한다(Barreiro LB, et al., Methods Mol. Biol., 578:255-276, 2009; Beaudet L. et al., Genome Res., 11(4):600-608, 2001). 이에 유전자 변형에 의한 여러 질병들을 조기에 진단하기 위해 SNP 검출을 통한 진단 방법은 매우 효율적이며 빠른 진단이 가능하다. 따라서 SNP를 정확하게 검출하기 위한 많은 방법들이 제시되어 왔으며, 현재에도 이와 관련된 많은 연구가 진행되고 있다(Ermini ML. et al., Biosen. & Bioele., 61:28-37, 2014; K. Chang et al., Biosen. & Bioele., 66:297-307, 2015).
구체적으로, 다수의 유전자 분석을 위한 가장 보편적으로 사용하는 방법으로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하는 방법, 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, Multiplex PCR) 방법이 있다.
상기 중합효소 연쇄반응은 템플레이트(template) DNA와 결합할 수 있으며, 형광물질과 소광물질이 결합된 프라이머 또는 프로브를 임의로 설계함으로써 검출하고자 하는 유전자의 원하는 부위만을 정확하게 증폭할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 한 번의 반응으로 하나의 관심 유전자만을 증폭시킬 수 있어 증폭하고자 하는 관심 유전자가 다수일 경우에는 동일한 작업을 반복해서 수행하여야 하는 번거로움이 있다.
상기 다중 중합효소 연쇄반응은 여러 개의 중합효소 연쇄반응을 한 튜브에서 수행함으로써 다수의 유전자 영역을 동시에 분석할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 여러 개의 프라이머 또는 프로브를 한 튜브에서 동시에 사용함에 따라 프라이머 또는 프라이머들 간의 교차반응이 발생하게 되기 때문에 한 번에 증폭할 수 있는 유전자 영역의 수에는 한계가 있다. 또한, 반응 조건을 찾기 위한 많은 노력과 시간을 필요로 하고 민감도 및 특이도에서 좋은 결과를 얻을 수 없다는 단점이 있다(Hardenbol P. et al., Nat. Biotechnol., 21(6):673-678, 2003).
최근에는 다중 중합효소 연쇄반응을 사용하지 않고 공통 프라이머를 사용하여 다수의 유전자 영역을 동시에 증폭하여 대량 분석을 가능하게 하는 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 대표적인 기술로는 동시에 여러 유전자 영역의 단일염기다형성(SNP)을 분석할 수 있는 SNPlex, Goldengate assay, molecular inversion probes(MIPs) 등이 있다.
상기 SNPlex는 OLA(oligonucleotide ligation assay) 이후에 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 이용한 정제 과정을 수행하고 프로브(probe)의 양쪽 끝에 있는 공통 프라이머 염기서열로 중합효소 연쇄반응 증폭을 한 다음, 마지막으로 프로브(probe)에 포함되어 있는 집코드(ZipCode) 염기서열을 이용해 DNA 칩에서 분석하는 방법이다(Tobler et al., J. Biomol. Tech., 16(4):398-406, 2005).
Goldengate assay는 고체 표면에 고정화된 게놈 DNA(genomic DNA)에 업스트림(upstream) 프로브로 대립 유전자 특이적 프라이머 연장 반응을 수행한 후에 다운스트림(downstream) 프로브와 DNA 연결 반응을 수행하고, 세척 과정을 거쳐 DNA 연결 반응이 되지 않은 프로브들을 제거한 다음, SNPlex와 같이 프로브에 포함되어 있는 공통 프라이머 염기서열로 증폭시키고, 증폭된 중합효소 연쇄반응 결과물을 일루미나 비드칩(Illumina BeadChip)에서 분석하는 방법이다(Shen R. et al., Mutat. Res., 573(1-2):70-82, 2005).
Molecular inversion probes(MIPs)는 패드록 프로브(padlock probe)를 사용하여 갭-결찰(gap-ligation)을 한 이후에 DNA 연결이 되지 않은 프로브들과 게놈 DNA를 엑소뉴클레아제(exonucelase)를 이용하여 제거하고, 우라실-N-글리코실라아제(uracil-N-glycosylase)를 이용해 패드록 프로브를 선형화시킨 이후에 프로브에 포함된 공통 프라이머 염기서열을 이용해서 중합효소 연쇄반응을 수행하고, GenFlex Tag Array(Affymetrix)에 혼성화시켜 단일염기다형성을 분석하는 방법이다(Hardenbol P. et al., Nat. Biotechnol., 21(6):673-678, 2003).
그러나, 이러한 방법들은 첫 번째 튜브에서 반응시킨 생성물의 일부를 두 번째 튜브로 옮겨 반응을 수행해야 하거나, 여러 종류의 효소를 이용하여야 하기 때문에 서로 다른 샘플들 간의 오염이 발생될 수 있으며, 실험 방법이 복잡한 문제점이 있다. 또한, 형광표지가 부착된 프로브의 개수만큼의 단일염기다형성만이 검출 가능하므로 분석하고자 하는 단일염기다형성의 개수가 증가할수록 분석 비용이 높아지는 문제가 있다.
점 돌연변이(point mutation)는 일반적으로 DNA 복제 중에 발생하는 것으로 알려져 있다. DNA 복제는 하나의 이중 가닥 DNA 분자가 두 개의 단일 가닥 DNA를 생성할 때 발생하며, 각 가닥은 상보적 가닥 생성을 위한 템플레이트로 사용된다. 단일 점 돌연변이는 전체 DNA 서열을 변화시킬수 있으며 하나의 퓨린(purine) 또는 피리미딘(pyrimidine)을 변경하면 뉴클레오티드가 코딩하는 아미노산이 변경 될 수 있다.
점 돌연변이는 DNA를 복제하는 동안 자발적 돌연변이에서 발생할 수 있으며 돌연변이율은 그러한 원인에 의해 증가될 수 있다.
1959년 에른스트 프리즈 (Ernst Freese)는 "전이 (transitions)" 또는 "전환 (transversions)" 이라는 용어를 만들어 서로 다른 유형의 점 돌연변이를 분류하였다. 전이는 퓨린 염기를 다른 퓨린으로 대체하거나 피리미딘을 다른 피리미딘으로 대체하는 것이다. 전환은 퓨린을 피리미딘으로 또는 그 반대로 대체하는 것이다. 전이 (Alpha) 및 전환 (Beta)에 대한 돌연변이율에는 차이가 있으며 통상 전이 돌연변이는 전환보다 약 10 배 더 흔한 것으로 알려져 있다.
점 돌연변이에 대한 기능적 분류는 넌센스 돌연변이와 같이 stop-gain 및 start-loss처럼 단백질의 생성이 비정상적으로 단축되거나 추가되는 경우, 미스 센스 돌연변이의 경우와 같이 다른 아미노산을 코딩하는 경우(BRAF 유전자에서 발린(valine)을 글루탐산(glutamic acid)으로 변화시키는 경우, 이것은 암 세포에서 무제한 증식 신호를 일으키는 RAF 단백질의 활성화로 이어진다.), 침묵 돌연변이와 같이 동일한 아미노산을 코딩하는 경우가 있으며 통상적인 연구자에게 공지되어 있는 사항이다.
이러한 점 돌연변이는 특정 질병의 원인으로도 알려져 있다. 다중 종양 억제 단백질에서의 점 돌연변이는 암을 유발하며, 신경섬유종(Neurofibromatosis)은 Neurofibromin 1 또는 Neurofibromin 2 유전자의 점 돌연변이에 의해 발생한다. 낫 세포 빈혈(Sickle-cell anemia)은 헤모글로빈의 β-글로빈 사슬에서 점 돌연변이에 의해 야기되어, 6번째 위치에서 친수성 아미노산 글루탐산이 소수성 아미노산 발린으로 대체된다. 이 외에도 테이-삭스 병(Tay-Sachs disease)이나 색맹에서도 발견되고 있다.
이러한 점 돌연변이의 분석은 특히 암을 진단하고 치료제의 선택에 중요한 요소로 작용하고 있다. 동반진단의 경우 암 돌연변이에 따른 최적화된 항암제의 선택 또는 특정 항암제를 배제하는데 중요한 판단 근거로 활용되고 있으며, 최근 특정 돌연변이를 타겟으로 한 항암제의 개발은 지속적으로 증가하고 있다.
이러한 돌연변이의 분석 방법은 PCR, NGS, ddPCR 등을 통해 이루어지고 있으며 액체생검에 대한 중요도와 관심은 계속 증가하고 있어 보다 정밀한 측정 방법이 요구되고 있다. 그러나 현재 알려져 있는 방법은 충분한 분석능을 보유하고 있지 않거나 분석능을 충족하는 경우에는 고가의 별도의 장비와 복잡한 분석과정을 요구하고 있어 보다 간단하게 분석이 가능한 방법의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 SNP, 점 돌연변이(point mutation), miRNA의 이형체(isoform) 등 유전자 변형을 실시간으로 검출하는데 있어서 낮은 민감도와 특이도를 증가시켜 암을 간단하고 정확하게 진단할 수 있는 방법을 오랫동안 연구하여 오던 중, 본 발명자들의 단일핵산을 활용할 경우 높은 민감도 및 높은 특이성을 나타내어 암을 비롯하여 암과 같은 유전자 변형에 의한 다양한 질환 진단에 매우 유용함을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Barreiro LB, et al., Methods Mol. Biol., 578:255-276, 2009 Beaudet L. et al., Genome Res., 11(4):600-608, 2001 Ermini ML. et al., Biosen. & Bioele., 61:28-37, 2014 K. Chang et al., Biosen. & Bioele., 66:297-307, 2015 Hardenbol P. et al., Nat. Biotechnol., 21(6):673-678, 2003 Tobler et al., J. Biomol. Tech., 16(4):398-406, 2005 Shen R. et al., Mutat. Res., 573(1-2):70-82, 2005 Kiki C. Andree et al., Mol Oncol., 10(3):395-407, 2016 Snyder MW. et al., Cell., 164(1-2):57-68, 2016 Vogelstein B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96(16):9236-9241, 1999 Li M. et al., Nat. Methods., 3(2):95-97, 2006 Kou R. et al., PLoS one., 11(1):e0146638, 2016 Bartel D.P., Cell., 116(2):281-297, 2004 Bentwich, et al., Nat. Rev. Genet., 37(7):766-770, 2005 Lee Y. et al., Nature, 425(6956):415-419, 2003 Chen X. et al., Cell Res., 18(10):997-1006, 2008
본 발명의 하나의 목적은 ⅰ) X-Y-Z의 구조를 가지며, ⅱ) 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, ⅲ) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 상기 Y는 단일 표적 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA인 것을 특징으로 하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)인 경우에 상기 단일핵산은 (a) 상기 X는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (b) 상기 Z는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 또는 점돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)인 경우 (c) 상기 X는 10 내지 30개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (d) 상기 Z는 1 내지 3개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일핵산을 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계; b) 상기 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제조하는 단계; c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 단일핵산, 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 증폭된 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산(promer)을 제공한다.
상세하게는, 상기 단일핵산은 ⅰ) X-Y-Z의 구조를 가지며, ⅱ) 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, ⅲ) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 상기 Y는 단일 표적 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA로서 단일 표적 유전자와 혼성화시 절단 시약에 의해 절단된다.
이때, 상기 단일핵산은 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)인 경우에 상기 단일핵산(promer)은 (a) 상기 X는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (b) 상기 Z는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 하거나, 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 점돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)인 경우 (c) 상기 X는 10 내지 30개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (d) 상기 Z는 1 내지 3개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단일핵산은 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)인 경우에 단일 표적 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 X 및 Z도 단일 표적 유전자로부터 분리되어 프로브로 작동하는 것을 특징으로 하거나, 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 점돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)인 경우 단일 표적 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 Z는 단일 표적 유전자로부터 분리되지만 상기 X는 분리되지 않고 프라이머와 프로브로 동시 작동하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 단일핵산을 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계; b) 기 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제조하는 단계; c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 단일핵산, 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 증폭된 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법은 종래 qPCR을 이용한 SNP 및 점 돌연변이(point mutation) 분석 방법과 비교하여 실시간 확인을 위한 별도의 위치의 프로브(probe)가 필요치 않아 SNP 및 점 돌연변이와 같은 유전적 변이를 보다 정확하게 측정할 수 있는 이점이 있다. 즉, 본 발명에 따른 단일핵산은 절단시약에 의해서만 절단되어 종래 프로브를 이용한 유전적 변이 검출 방법에 비해 보다 정확하게 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 단일핵산을 이용하여 SNP 및 점 돌연변이와 같은 유전적 변이 분석시, 용융온도(melting temperature) 분석과 같은 별도의 돌연변이 확인 과정 필요없이 바로 돌연변이의 구분이 가능하다.
따라서, 본 발명의 단일핵산(promer) 및 이를 이용한 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출 방법은 KRAS, EGFR 등에서 발생하는 다양한 점 돌연변이를 신속 정확하게 구분할 수 있어 암을 비롯한 다양한 질병의 진단, 치료제 선택 및 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산을 이용하여 ApoE 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 ApoE 단일핵산 1형(서열번호 3 내지 6)를 이용하여 ApoE 유전자 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4 구분이 가능함을 확인한 PCR 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 G13D 단일핵산 1형을 이용하여 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G13D 돌연변이 세포주인 HCT-15 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G13D 돌연변이 유전자 발현 여부를 G13D 단일핵산 1형(서열번호 7)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 KRAS 야생형 단일핵산을 이용하여 야생형 KRAS 유전자의 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 KRAS 야생형 세포주인 NCI-H1975 세포주의 gDNA를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 야생형 KRAS 유전자 발현 여부를 KRAS 야생형 단일핵산 1형(서열번호 8)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRAS 야생형 단일핵산 1형을 이용하여 야생형 KRAS 유전자의 발현 여부를 확인한 도이다. 상세하게는, HCT-15 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 야생형 KRAS 유전자 발현 여부를 KRAS 야생형 단일핵산 1형(서열번호 8)을 이용하여 확인한 PCR 결과로, HCT-15 세포주는 이형접합형(heterozygous type)의 유전자로 G13D 돌연변이와 KRAS 야생형의 유전자를 동시에 보유하고 있는 세포주임을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRAS 야생형 단일핵산 1형을 이용하여 야생형 KRAS 유전자와 혼합된 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 HCT-15 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 NCI-H1975 세포주의 게놈 DNA(gDNA) 농도 대비 10 내지 0.01%로 희석하고 이들 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 혼합한 후 G13D 단일핵산 1형(서열번호 7)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형를 이용하여 ApoE 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 ApoE 단일핵산 2형(서열번호 11 내지 14)을 이용하여 ApoE 유전자 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4 구분이 가능함을 확인한 PCR 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 KRAS 유전자의 G12V 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12V 돌연변이 세포주인 SW620 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12V 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12V 단일핵산 2형 (서열번호 15)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 KRAS 유전자의 G12C 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12C 돌연변이 세포주인 MIA-Paca2 세포주의 gDNA를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12C 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12C 단일핵산 2형(서열번호 16)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 KRAS 유전자의 G12S 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12S 돌연변이 세포주인 A549 세포주의 gDNA를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12S 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12S 단일핵산 2형(서열번호 17)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 EGFR 유전자 엑손 20의 T790M 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 T790M 돌연변이 세포주인 H1975 세포주와 야생형 세포주인 A549 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 T790M 돌연변이 유전자 발현 여부를 T790M 단일핵산 2형 (서열번호 24)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 let-7a miRNA 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 RT-PCR을 통해 let-7a miRNA로부터 합성하여 얻은 let-7a cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 let-7a miRNA 유전자 발현 여부를 let-7a 단일핵산 2형(서열번호 21)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 let-7d miRNA 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 RT-PCR을 통해 let-7d miRNA로부터 합성하여 얻은 let-7d cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 let-7d miRNA 유전자 발현 여부를 let-7d 단일핵산 2형(서열번호 24)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 let-7 miRNA 유전자 특이적 검출능을 확인한 도로, 상세하게는 let-7d cDNA(1pM 농도) 존재하에 let-7a cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 let-7a miRNA 유전자 발현 여부, 즉 let-7d cDNA 존재하에서의 let-7a miRNA 유전자에 대한 특이적 검출 여부를 let-7a 단일핵산 2형(서열번호 21)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 miRNA 34a 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 RT-PCR을 통해 miRNA 34a로부터 합성하여 얻은 miRNA 34a cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34a 유전자 발현 여부를 miRNA 34a 단일핵산 2형(서열번호 27)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 miRNA 34b 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 RT-PCR을 통해 miRNA 34b로부터 합성하여 얻은 miRNA 34b cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34b 유전자 발현 여부를 miRNA 34b 단일핵산 2형(서열번호 30)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 miRNA 34c 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 RT-PCR을 통해 miRNA 34c로부터 합성하여 얻은 miRNA 34c cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34c 유전자 발현 여부를 miRNA 34c 단일핵산 2형(서열번호 33)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 miRNA 34 유전자 특이적 검출능을 확인한 도로, 상세하게는 miRNA 34a cDNA(100pM 농도) 존재하에 miRNA 34c cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34c 유전자 발현 여부, 즉 miRNA 34a cDNA 존재하에서의 miRNA 34c 유전자에 대한 특이적 검출 여부를 miRNA 34c 단일핵산 2형(서열번호 33)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 miRNA 34 유전자 특이적 검출능을 확인한 도로, 상세하게는 miRNA 34b cDNA(100pM 농도) 존재하에 miRNA 34c cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34c 유전자 발현 여부, 즉 miRNA 34b cDNA 존재하에서의 miRNA 34c 유전자에 대한 특이적 검출 여부를 miRNA 34c 단일핵산 2형(서열번호 33)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA올리고(DNAoligo)-DNA-RNA-돌연변이-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산 2형(G12D-R1DrMR2)을 이용하여 KRAS 유전자의 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12D 단일핵산 2형(서열번호 36)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 DNA올리고-RNA-DNA-돌연변이-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산 2형(G12D-R1rDMR2)을 이용하여 KRAS 유전자의 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12D 단일핵산 2형(서열번호 37)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 DNA올리고-DNA-돌연변이-RNA-DNA-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산 2형(G12D-R1DMrDR2)을 이용하여 KRAS 유전자의 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12D 단일핵산 2형(서열번호 38)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
본 발명은 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일염기다형성(SNP), 점 돌연변이 또는 miRNA 이형체(isoform)와 같은 유전적 변이가 포함된 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 단일핵산을 사용하여 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산은 ⅰ) X-Y-Z의 구조를 가지며, ⅱ) 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, ⅲ) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.
이때 부착되는 탐지 가능한 마커의 위치는 특정 부위에 국한하지 않으며, 절단 시약에 의해 Y 부위 절단 시 탐지 가능한 마커가 분리되는 위치라면 어느 곳이든 가능하다.
또한, 상기 단일핵산은 실시간 검출을 목적으로 하는 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합하여 복합체를 형성, 증폭시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산은 유전적 변이 검출 시 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP), 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 핵산을 의미한다. 여기서, 단일염기다형성(SNP)의 존재를 탐지하는 단일핵산은 “1형 단일핵산” 또는 “단일핵산 1형”으로 표현할 수 있으며, 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 또는 점 돌연변이 또는 miRNA 이형체의 존재를 탐지하는 단일핵산은 “2형 단일핵산” 또는 “단일핵산 2형”으로 표현할 수 있다. 상기 1형 단일핵산은 2형 단일핵산과 달리 프로브(probe)로 작동 가능하며, 2형 단일핵산은 1형 단일핵산과 달리 프라이머(primer)와 프로브(probe)로 동시에 사용 가능하다.
구체적으로, 1형 단일핵산이 단일 표적 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 X 및 Z도 단일 표적 유전자로부터 분리되어 프로브로 작동 가능하며, 2형 단일핵산이 단일 표적 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 Z는 단일 표적 유전자로부터 분리되지만 상기 X는 분리되지 않고 프라이머와 프로브로 동시 작동하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 각각의 X, Y, 및 Z는 다양한 개수의 뉴클레오티드(nucleotide)를 가질 수 있다.
상기 Y는 단일 표적 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA이며, 절단 시약에 의해 절단되는 부위이다.
여기서, 절단 시약은 DNase, RNase, 헬리카제(helicase), 엑소뉴클리아제 및 엔도뉴클리아제 같은 효소효소를 매개로 한 절단이 이루어지는 것이 바람직하나, 기타 공지된 절단시약이 사용되어도 무방하다.
상기 X는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)의 존재를 탐지하는 경우 4 내지 20개, 바람직하게는 4 내지 19개, 보다 바람직하게는 4 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 5 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 17개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 16개, 가장 바람직하게는 6 내지 15개의 염기서열로 구성되는 DNA이다. 이에 따른 X는 1형 단일핵산에 속한다.
또한, 상기 X는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 또는 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 경우 10개 내지 30개, 바람직하게는 11개 내지 30개, 보다 바람직하게는 12 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 13 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 14 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 29개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 28개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 27개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 26개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 25개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 24개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 23개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 22개, 보다 더 바람직하게는 15내지 21개, 가장 바람직하게는 15 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이다. 이에 따른 X는 2형 단일핵산에 속한다.
상기 Z는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)의 존재를 탐지하는 경우 4 내지 20개, 바람직하게는 4 내지 19개, 보다 바람직하게는 4 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 5 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 17개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 16개, 가장 바람직하게는 6 내지 15개의 염기서열로 구성되는 DNA이다. 이에 따른 Z는 1형 단일핵산에 속한다.
또한, 상기 Z는 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 경우 1 내지 3개, 바람직하게는 2 내지 3개로 구성되는 DNA이다. 이에 따른 Z는 2형 단일핵산에 속한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전적 변이 검출은 단일염기다형성(SNP), 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 것으로, 상술한 단일핵산으로서 X 및 Z를 구성하는 염기 개수에 따라 이들 각각의 유전적 변이 검출을 특이적이며 민감하게 탐지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, ApoE 단일핵산(서열번호 3 내지 6)을 이용하여 ApoE 유전자 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4 구분이 명확하게 가능함을 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 1).
본 발명의 일 실시예에 있어서, KRAS 유전자 G12V 돌연변이 세포주인 SW620 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12V 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12V 단일핵산(서열번호 15)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 7).
본 발명의 일 실시예에 있어서, KRAS 유전자 G12C 돌연변이 세포주인 MIA-Paca2 세포주의 gDNA를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12C 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12C 단일핵산(서열번호 16)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 8).
본 발명의 일 실시예에 있어서, KRAS 유전자 G12S 돌연변이 세포주인 A549 세포주의 gDNA를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12S 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12S 단일핵산(서열번호 17)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 9).
본 발명의 일 실시예에 있어서, EGFR 유전자 엑손 20의 T790M 돌연변이 세포주인 H1975 세포주와 야생형 세포주인 A549 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 T790M 돌연변이 유전자 발현 여부를 T790M 단일핵산(서열번호 19)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 10).
본 발명의 일 실시예에 있어서, let-7a cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 let-7a miRNA 유전자 발현 여부를 let-7a 단일핵산(서열번호 21)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 11).
본 발명의 일 실시예에 있어서, let-7d cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 let-7d miRNA 유전자 발현 여부를 let-7d 단일핵산(서열번호 24)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 12).
본 발명의 일 실시예에 있어서, 1pM 농도의 let-7d cDNA 2㎕에 1/10씩 100fM에서 1aM 농도까지 희석한 let-7a cDNA 2㎕씩 첨가한 실험군에서 100fM에서 1fM 농도까지 let-7a cDNA를 탐지할 수 있음을 확인하였다 (도 13).
본 발명의 일 실시예에 있어서, miRNA 34a cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34a 유전자 발현 여부를 miRNA 34a 단일핵산(서열번호 27)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 14).
본 발명의 일 실시예에 있어서, miRNA 34b cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34b 유전자 발현 여부를 miRNA 34b 단일핵산(서열번호 30)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 15).
본 발명의 일 실시예에 있어서, miRNA 34c cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34c 유전자 발현 여부를 miRNA 34c 단일핵산(서열번호 33)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 16).
본 발명의 일 실시예에 있어서, miRNA 34a cDNA 또는 miRNA 34b cDNA에 miRNA 34c cDNA가 농도별로 희석한 후 miRNA 34c 단일핵산(서열번호 33)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 miRNA 34c 유전자 발현 여부를 미세농도에서도 확인할 수 있었다 (도 17 및 18).
본 발명에 있어서, 상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 탐지 가능한 마커로 형광쌍을 사용하는 경우, 형광물질과 소광물질의 위치는 X 또는 Z에 위치한 형태이거나 Y 부위에 위치할 수 있으며, 그 어느 것에 한정되는 것은 아니다. 하나의 예로서, 형광물질은 X에 위치하고 소광물질은 Y 또는 Z에 위치할 수 있다.
본 발명의 단일핵산은 단일 표적 유전자의 유전적 변이로서 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 검출하는데 있어서, ⅰ) 핵산 중 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 RT 프라이머; ⅱ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머; ⅲ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 역방향 프라이머; ⅳ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머; 또는 ⅴ) 검출하고자 하는 핵산(DNA 또는 RNA)을 실시간으로 확인하기 위한 프로브로 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 단일핵산을 RNA(miRNA 등 포함)를 cDNA로 합성 및 증폭하기 위한 RT 프라이머; 또는 정방향 프라이머와 프로브; 또는 역방향 프라이머와 프로브로 사용하는 경우에, cDNA 합성시 RT 프라이머를 루프형태로 제작하거나 폴리 A를 형성하는 과정이 필요하지 않고 검출하고자 하는 RNA와 혼성화되어 cDNA를 합성하고 탐지하고자 하는 RNA(miRNA 등 포함)를 증폭 및 실시간 검출할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일핵산을 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 단일핵산을 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 검출하기 위한 키트로 사용하는 경우, 상기 키트는 본 발명의 단일핵산 이외에 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소는 단일핵산의 Y 부위를 특이적으로 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 예를 들어 Y 부위가 DNA인 경우 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소 등을 사용하는 것이 바람직하며, Y 부위가 RNA인 경우 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2 등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 단일핵산을 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 검출하기 위한 키트로 사용하는 경우, 상기 키트는 본 발명의 단일핵산 및 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소 이외에 DNA의 증폭반응에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 증폭반응에 필요한 시약은 예를 들어, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermusaquatiucs(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcusliteralis 또는 Phyrococcusfuriosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg2+), 완충용액, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH2O)을 들 수 있다. 또한, 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등이 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계; b) 상술한 단일핵산을 제조하는 단계; c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 단일핵산, 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 증폭된 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산은 시료로부터 검출하고자 하는 RNA 또는 DNA이거나, 상기 RNA를 역전사 중합효소로 증폭하여 얻은 cDNA일 수 있다.
상기 시료는 생물학적 시료이거나, 생물학적 시료로부터 분리된 RNA, DNA 또는 이들의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 혈액, 타액, 뇨, 분변, 조직, 세포 및 생검 표본으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 또는 보관된 생물학적 시료로부터 분리된 RNA, DNA 또는 이들의 단편일 수 있다. 그러나, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.
상기 보관된 생물학적 시료는 당업계에 통상적으로 알려진 보관방법으로 1주일 이상, 1년 이상, 예를 들면 1년 내지 10년 동안 보관되거나, 냉동 보관, 또는 포르말린으로 고정된 조직을 상온에서 보관한 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 시료로부터 RNA 또는 DNA의 추출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다.
b) 상기 단일핵산을 제조하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 단일핵산은 전술한 바와 같으며, 상세하게는 ⅰ) X-Y-Z의 구조를 가지며, ⅱ) 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, ⅲ) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
c) 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체의 증폭은 상기 수득한 표적 핵산, 상기 제조한 단일핵산, 상기 수득한 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 절단시약은 효소를 매개로 한 절단이 이루어지는 것이 바람직하나, 기타 공지된 절단시약이 사용되어도 무방하다. 이때, DNase, RNase, 헬리카제(helicase), 엑소뉴클리아제 및 엔도뉴클리아제 같은 효소들에 의해 촉매되는 RNA 또는 DNA의 절단을 표시하기 위하여, "효소매개 절단(enzyme-mediated cleavage)"이라는 용어를 사용한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 혼성화된 프로브의 닉(nick) 생성 및 절단은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제인 리보뉴클리아제에 의해서 수행되는 것이 보다 바람직하다. 리보뉴클리아제는 이중 가닥 DNA-RNA 혼성화 가닥으로부터 리보 핵산(ribonucleic acid)에서 닉을 생성하고 절단시키는 이중 가닥 리보뉴클리아제인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 절단시약은 이에 제한되지는 않으나, RNaseH, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ 또는 RNase T2의 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase)일 수 있다.
d) 상기 증폭된 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 단일핵산 단편의 양 측정은 다양한 검출방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따라 분리된 단일핵산의 단편은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정되는 것이 바람직하며, 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정으로 이루어질 수 있다.
상기 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정은 당업계에 공지된 형광 표지자 검출이 가능한 모든 측정 장치를 이용할 수 있으며, 예를 들어 트라이애드 멀티모드 디텍터(TRIAD Multimode Detector), 활락/빅터 형광(Wallac/Victor fluorescence) 또는 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer), LightCycler96, Applied Biosystems 7500, 또는 Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler 등을 이용하여 이루어질 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 따라 절단된 단일핵산 단편의 양 측정과 검출방법은 단일핵산 또는 반응액 내로 유입된 표지 또는 탐지 가능한 마커의 종류에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 단일핵산은 Y 부위가 절단된 후 증폭하는 단계에 의해 Y 부위의 유전적 변이 구별을 용이하게 하므로, 이후의 핵산 증폭 반응을 통해 돌연변이 확인을 가능하게 한다. 즉, 본 발명의 단일핵산에서 Y 부위와 표적 핵산의 유전적 변이 부위에 혼성화를 형성하도록 하였을 경우, Y 부위가 유전적 변이 부위와 정확하게 상보적인 결합을 한 경우에만 절단되고 이후에 증폭 반응이 수행되기 때문에 유전적 변이 여부를 명확하게 확인할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단일핵산에서 Y 부위와 표적 핵산의 유전적 변이 부위가 혼성화를 형성하도록 하였음에도 Y 부위가 상보적인 결합을 하지 않은 경우라면 Y 부위가 절단되지 않으므로 증폭 반응이 일어나지 않으며, 이는 표적 핵산에 측정하고자 하는 유전적 변이가 없음을 의미하게 된다. 이와 반대로, 본 발명의 단일핵산에서 Y 부위를 표적 핵산의 유전적 변이가 발생하는 부위의 비 돌연변이인 경우와 혼성화를 형성하도록 하였음에도 Y 부위가 상보적인 결합을 하지 않은 경우라면 Y 부위가 절단되지 않으므로 증폭 반응이 일어나지 않으며, 이는 표적 핵산에 유전적 변이가 있음을 의미하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 유전적 변이 검출은 단일염기다형성(SNP), 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 것을 의미한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 DNA올리고(DNAoligo)-DNA-RNA-돌연변이-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산(G12D-R1DrMR2; 서열번호 36)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 19).
본 발명의 일실시예에 있어서, G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 DNA올리고-RNA-DNA-돌연변이-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산(G12D-R1rDMR2;서열번호 37)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 20).
본 발명의 일실시예에 있어서, G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 DNA올리고-DNA-돌연변이-RNA-DNA-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산(G12D-R1DMrDR2; 서열번호 38)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 21).
본 발명에 쉽게 이용할 수 있는 신장반응, 즉 핵산 증폭반응은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 즉, 상기 표적 핵산의 증폭은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA), 핵산가닥 전치 증폭(strand displacement amplification; SDA) 또는 핵산서열기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)을 포함하지만 상기 방법에 국한되지 아니한다. 상기 핵산 증폭 산물은 DNA 또는 RNA이다.
일반적으로, 표적 핵산의 증폭 및 상기에서 기술한 단일핵산의 절단에 의한 탐지를 동시에 가능하도록, 반응 혼합액에 표적 핵산, 단일핵산, 핵산 증폭 반응의 구성물 및 절단 효소가 포함된다. 각 증폭반응은 완충액 조건, 프라이머, 반응온도 및 단일핵산 절단 조건 등을 각각 개별적으로 최적화시키는 것이 필요하다. 핵산 증폭반응과 연계하여 본 발명의 검출방법을 사용하면 표적 핵산을 탐지하는 민감도와 속도가 현저하게 개선될 것이다.
한편, 본 발명의 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산이 암과 관련된 KRAS, EGFR 등의 점 돌연변이의 유전자를 신속 정확하게 검출 및 탐지할 수 있음을 확인한 바, 상기 단일핵산은 암 진단용 키트 또는 암 진단용 조성물에 적용가능하며, 실시간 암 진단을 수행하여 암 발생 여부에 대한 정보를 제공하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 1형 단일핵산을 이용한 ApoE 분석
1형 단일핵산을 아포리포단백질 E(Apolipoprotein E, ApoE) 유전자의 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4를 분석하는데 이용하였다.
인간 염색체 19번에 위치한 ApoE 유전자는 심혈관계 및 알츠하이머 질병과 관련된 유전자이다. ApoE 유전자는 코돈(codon) 112(cys/arg), 코돈 158(cys/arg)의 DNA의 단일염기다형성(SNP)[게놈 DNA 위치 586(T/C), 724(T/C)번째]에 의해 세 가지의 대립 유전자 이형체(isoform)인 ApoEε2, ApoEε3, ApoEε4를 가지게 되며, 이 대립 유전자의 조합에 의해 6종의 표현형(E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4)을 갖게 된다. 상기 ApoE 유전자의 각 6종의 표현형을 구분하기 위하여, 5'-말단을 각각의 형광 염료(dye)가 부착된 4종의 개선된 형태의 1형 단일핵산을 이용하여 4-plex로 분석이 가능하도록 하였다. 기존의 분석법에서는 통상적으로 4-plex에 의한 분석법의 민감도 및 특이도를 충족시키기 쉽지 않았으나, 본 발명에서는 이에 대하여 충족할 만한 결과를 보여주었다.
상세하게는 ApoE 유전자의 코돈 112 및 코돈 158의 대립 유전자형에 대한 SNP 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 1형 단일핵산과 프라이머(primer)를 하기 표 1과 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다. 여기서 1형 단일핵산의 경우 X-Y-Z의 구조를 가지는 프로브로서 5'-말단에는 각각 6-FAM, HEX, TexasRed, Cy5를, 그리고 각 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
ApoE 특이적 프라이머 세트 및 4종의 ApoE 단일핵산
프라이머명 또는 프로브명 서열 서열번호
ApoE_F 프라이머 5'-GAAGGCCTACAAATCGGAACT-3' 1
ApoE_R 프라이머 5'-GCCACCTGCTCCTTCAC-3' 2
ApoE 단일핵산 1 56-FAM/-GAGGACGTGrUGCGGCC-/3IABkFQ 3
ApoE 단일핵산 2 5-HEX/-GAGGACGTGrCGCGGCC-/3IABkFQ 4
ApoE 단일핵산 3 5-TexRd/-CTGCAGAAGrUGCCTGGCA-/3IABkFQ 5
ApoE 단일핵산 4 5-Cy5/-GCAGAAGrCGCCTGGCA-/3IABkFQ 6
분석을 위하여 한국세포주은행으로부터 인간 세포주 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 분양받았고, 이로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 수득하였다. 6종의 표현형에 대한 분석을 위하여, 동형 표현형은 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 사용하였고, 이형 표현형은 각 게놈 DNA의 혼합형인 PC3+A549(E2/E3), PC3+U937(E2/E4), A549+U937(E3/E4)을 고농도로 반응당 32ng (약 104 카피(copy))으로 포함되도록 하여 분석에 사용하였다.
상기 표 1의 ApoE 단일핵산 1, 2, 3, 4 각각의 0.2μM, 0.15μM, 0.15μM, 및 0.075μM과, ApoE 정방향 및 역방향 프라이머 각각의 0.35μM의 최종농도 존재하에서, 상기 정량한 게놈 DNA, 0.5U RNase-H, AptaTaq DNA Master(Roche) 4㎕, GC rich solution(Roche) 3㎕, nuclease-free water로 총 부피(total volume)가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 15초, 65℃에서 70초로 45 사이클(cycle)을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 한 개의 반응 웰(well)에서 ApoE 각 대립 유전자의 조합 6종에 대한 분석이 가능한 것을 확인하였다. 이 결과에서 선천적 돌연변이(mutation)와 같이 전체 또는 절반만 돌연변이(mutation)된 경우 개선된 프로브(probe) 형태를 사용할 경우 구분능이 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 1형 단일핵산을 이용한 KRAS 돌연변이 분석
실시예 2-1: 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 실시간 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 분석
본 발명에 따른 1형 단일핵산을 이용하여 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이(mutant) 여부를 측정하고자, IDT에 의뢰하여 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 단일핵산(1형), KRAS 야생형(wild type) 단일핵산(1형), KRAS 유전자의 G13D 돌연변이의 정방향 및 역방향 프라이머를 하기 표 2와 같이 제조하였다. 이때, 제조된 단일핵산의 경우 5'-말단에는 HEX, FAM을, 그리고 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오타이드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 및 야생형 단일핵산과 G13D 돌연변이 특이적 프라이머 세트
프라이머명 또는 프로브명 서열 서열번호
G13D 단일핵산 HEX/-AGCTGGTGrACGTAGGC-/3IABkFQ 7
야생형 단일핵산 FAM/-AGCTGGTGrGCGTAGGC-/3IABkFQ 8
G13D_F 프라이머 5'-CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACT-3' 9
G13D_R 프라이머 5'-TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAG-3' 10
측정하고자 하는 KRAS 유전자는 일정 기간 동안 배양한 HCT-15 세포주와 NCI-H1975 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA(total genomic DNA)에서 검출하였다. 총 게놈 DNA는 PureLink Genomic DNA Mini Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat No. K1820-00)를 사용하여 각 세포주의 5×106 세포에서 추출하였으며, NanoDrop One(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 정량하였다. 정량한 총 게놈 DNA는 15ng/㎕로 희석하고, 1/10씩 계단 희석(serial dilution)을 진행하여 15ng/㎕~1.5pg/㎕ 농도의 게놈 DNA 2㎕씩 사용하였다. HCT-15 세포주는 G13D 돌연변이 세포주이며, NCI-H1975는 KRAS 야생형 세포주로 알려져 있다.
이후, 상기 제조한 서열번호 7의 10uM 농도의 G13D 단일핵산 0.3㎕를 준비하고, 서열번호 9 및 10의 10uM 농도의 프라이머들은 각각 0.5㎕씩 준비하였다. 여기에 0.5U RNase-H, AptaTaq DNA Master(Roche) 4㎕, NCI-H1975 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 30ng에 HCT-15 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 30ng, 3ng, 300pg, 30pg을 각각 첨가한 후 3차 증류수로 총 부피가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reation)을 수행하여 G13D 돌연변이(mutant)를 측정하였다. 이때, 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 10초, 64℃에서 60초를 40 사이클 수행하였고, 사이클마다 실시간으로 시그널(HEX)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
실시예 2-2: 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 실시간 KRAS 유전자의 야생형 분석
상기 실시예 2-1과 같은 조건으로 서열번호 8의 KRAS 유전자 야생형 단일핵산과 서열번호 9 및 10의 프라이머를 NCI-H1975 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 30ng, 3ng, 300pg, 30pg과 HCT-15 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 30ng, 3ng, 300pg, 30pg을 각각 첨가한 후 KRAS 야생형 유전자를 측정하였다. 이때의 결과는 도 3에 나타내었다. HCT-15 세포주는 이형접합형(heterozygous type)의 유전자로 G13D 돌연변이(도 2의 결과 참조)와 KRAS 야생형의 유전자를 동시에 보유하고 있는 세포주로 야생형을 절반만 가지고 있을 경우에도 도 4와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 2-3: 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 실시간 KRAS 유전자의 야생형과 혼합된 G13D 돌연변이 분석
측정하고자 하는 KRAS 유전자는 일정 기간 동안 배양한 HCT-15 세포주와 NCI-H1975 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA(total genomic DNA)에서 검출하였다. 총 게놈 DNA는 PureLink Genomic DNA Mini Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat No. K1820-00)를 사용하여 각 세포주의 5X106 세포에서 추출하였으며, NanoDrop One(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 정량하였다. 정량한 NCI-H1975 DNA는 30ng/ul로 희석하고, HCT-15 DNA는 30ng/ul로 희석한 후, 1/10씩 계단 희석(serial dilution)을 진행하여 3ng/㎕~3pg/㎕ 농도의 NCI-H1975 게놈 DNA 및 HCT-15 게놈 DNA를 수득하였다. 그 후 각각의 게놈 DNA 2㎕씩 혼합하여 HCT-15의 농도가 NCI-H1975 농도 대비 10~0.01%로 만들어 실험에 사용하였다. HCT-15 세포주는 G13D 돌연변이 세포주이며, NCI-H1975는 KRAS 야생형 세포주로 알려져 있다.
이후, 상기 제조한 서열번호 7의 10uM 농도의 G13D 단일핵산 0.3㎕를 사용하고, 서열번호 9 및 10의 10uM 농도의 프라이머들은 각각 0.5㎕씩 준비하였다. 여기에 0.5U RNase-H, AptaTaq DNA Master(Roche) 4㎕, 10~0.01%로 희석한 DNA를 각각 첨가한 후 3차 증류수로 총 부피(total volume)가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reation)을 수행하여 G13D 돌연변이(mutant)를 측정하였다. 이때 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 10초, 64℃에서 60초를 40 사이클 수행하였고 사이클마다 실시간으로 시그널(HEX)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 2 내지 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, G13D 단일핵산(1형)을 이용하여 G13D 돌연변이 검출 반응시 NCI-H1975 야생형 게놈 DNA와의 교차반응이 일어나지 않아 특이성은 우수하나, HCT-15 게놈 DNA 600pg 이하에서는 부정확하게 검출되었는바, 야생형과 점 돌연변이(point mutation) 유전자가 포함된 분석의 경우 점 돌연변이(point mutation) 유전자가 10% 미만으로 포함된 분석은 어려움이 있음이 확인되었다.
실시예 3: 2형 단일핵산을 이용한 ApoE 분석
ApoE 유전자의 코돈(codon) 112 및 코돈 158의 대립 유전자형에 대한 SNP 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 사용하였다. 하기 표 3과 같이, IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 2형 단일핵산을 제조하였다.
여기서, 2형 단일핵산의 경우 X-Y-Z의 구조를 가지는 프라이머 및 프로브로서, 5'-말단에는 각각 FAM, HEX, TexasRed를, 그리고 각 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
4종의 ApoE 단일핵산(2형)
단일핵산명 서열 서열번호
ApoE 단일핵산 1 56-FAM/-CGGTCATGGAGGACGTGrUGC-/3IABkFQ 11
ApoE 단일핵산 2 5TexRd-XN/-GCGGATATGGAGGACGTrGCG-/3IABkFQ 12
ApoE 단일핵산 3 56-FAM/-CTGGTACACTGCCAGGCArCTT-/3IABkFQ 13
ApoE 단일핵산 4 5HEX/-CTGGTACACTGCCAGGCrGATTC-/3IABkFQ 14
분석을 위하여 한국세포주은행으로부터 인간 세포주 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 분양받았고, 이로부터 게놈 DNA를 수득하였다. 6종의 표현형에 대한 분석을 위하여, 동형 표현형은 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 사용하였고, 이형 표현형은 각 게놈 DNA의 혼합형인 PC3+A549(E2/E3), PC3+U937(E2/E4), A549+U937(E3/E4)을 고농도로 반응당 32ng(약 104 카피)으로 포함되도록 하여 분석에 사용하였다.
상기 표 3의 ApoE 단일핵산 1, 2, 3, 4 각각의 0.375μM, 0.1μM, 0.25μM, 및 0.25μM의 최종농도 존재하에서, 상기 게놈 DNA와 0.1ng의 내열성 RNase H, 그리고 AptaTaq DNA Master w/o MgCl2(Roche) 4㎕, GC rich solution(Roche) 4㎕, 2.75mM MgCl2, 62.5nM Low ROX에 nuclease-free water로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 64℃에서 55초로 40 사이클을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 ApoE 각 대립 유전자의 조합 6종에 대한 분석에서, 코돈 112의 586T 변이와 코돈 158의 724T 변이의 경우 형광 염료 차이에 의한 분석이 아닌 동일 형광 염료에 의한 종료점(end point) 형광 값의 차이로 구분이 가능한 제한점이 있었다. 이러한 제한점에 의해 각 DNA 샘플의 농도에 따라 결과 판독에 문제를 줄 여지가 있다. 이는, 선천적인 돌연변이인 ApoE의 경우, 실시예 １에서 보여준 바와 같이 2형 단일핵산을 이용하는 것보다 1형 단일핵산을 이용하는 것이 분석을 위해 더 용이함을 보여준다.
실시예 4: 2형 단일핵산을 이용한 KRAS 돌연변이 분석
실시예 4-1: 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 실시간 G12V, G12C, G12S 돌연변이 분석
2형 단일핵산을 이용하여 KRAS 유전자의 12 코돈 돌연변이 3종(G12V, G12C, G12S)의 돌연변이(mutant) 여부를 측정하였다. IDT에 의뢰하여 본 발명에 따른 단일핵산과 Uni-역방향 프라이머(Uni-reverse primer)를 하기 표 4와 같이 제조하였다. 단일핵산의 경우 5'-말단에는 HEX, FAM, Cy5를, 그리고 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오타이드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
KRAS 돌연변이 분석에 이용한 단일핵산 및 프라이머
단일핵산명 또는 프라이머명 서열 서열번호
G12V 단일핵산 HEX/-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGrUTG-/3IABkFQ 15
G12C 단일핵산 Cy5/-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTrUGT-/3IABkFQ 16
G12S 단일핵산 FAM/-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTrAGT-/3IABkFQ 17
Uni-역방향 프라이머 5'-CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG-3' 18
상기 합성한 단일핵산을 이용하여 KRAS 점 돌연변이(point mutation) 검출능을 확인하기 위해 각각 야생형 세포주 및 돌연변이 세포주를 배양하고 총 게놈 DNA는 PureLink Genomic DNA Mini Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat No. K1820-00)를 사용하여 각 세포주의 5×106 세포에서 추출하였다. 한편, NanoDrop One(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 정량한 후 템플레이트(template)로 사용하였다. 사용한 세포주는 하기 표 5와 같다.
KRAS 유전자의 12코돈 돌연변이 3종(G12V, G12C, G12S)의 돌연변이 세포주
돌연변이 세포주 세포주명 타입
G12V 돌연변이 세포주 SW620 동형접합형(homozygous)
G12C 돌연변이 세포주 MIA-Paca2 동형접합형
G12S 돌연변이 세포주 A549 동형접합형
이후, 상기 제조한 서열번호 15의 G12V 단일핵산과 서열번호 18의 프라이머는 10uM 농도 0.5㎕를 사용하고, 5× AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 3.6㎕와 내열성 RNase H 0.2㎕에 Colo201 (KRAS 야생형 세포주) 30ng과 SW620(G12V 돌연변이) 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 3ng, 300pg, 30pg, 3pg을 각각 첨가한 후 3차 증류수로 총 부피가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 G12V 돌연변이를 측정하였다. 이때, 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 15초, 66℃에서 30초를 4 사이클 수행하여 1차 PCR 반응을 수행한 후, 85℃에서 15초, 64℃에서 40초를 40 사이클 수행하여 2차 PCR 반응을 수행하였고, 각 사이클마다 실시간으로 시그널(HEX)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.
또한, 상기 제조한 서열번호 16의 G12C 단일핵산과 서열번호 18의 프라이머는 10uM 농도 0.5㎕를 사용하고, 5X AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 2.8㎕와 5X Apta Fast buffer 1.2㎕, 1U/㎕의 내열성 RNase H 0.4㎕, 25mM MgCl2 0.5㎕에 Colo201(KRAS 야생형 세포주) 70ng과 MIA-Paca2(G12C 돌연변이) 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 7ng, 700pg, 70pg, 7pg을 각각 첨가하고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응을 수행하여 G12C 돌연변이를 측정하였다. 이때 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 10초, 64℃에서 60초를 40 사이클 수행하였고, 각 사이클마다 실시간으로 시그널(Cy5)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.
또한, 상기 제조한 서열번호 17의 G12S 단일핵산과 서열번호 18의 프라이머는 10uM 농도 0.5㎕를 사용하고, 5X AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 3.6㎕와 10ng/㎕의 내열성 RNase H 0.2㎕에, Colo201(KRAS 야생형 세포주) 30ng과 A549(G12S 돌연변이) 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 3ng, 300pg, 30pg, 7pg을 각각 첨가하고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reation)을 수행하여 G12S 돌연변이를 측정하였다. 이때 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 10초, 64℃에서 60초를 40 사이클 수행하였고, 각 사이클마다 실시간으로 시그널(FAM)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
상기 도 7 내지 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 단일핵산은 돌연변이(point mutation) 유전자가 0.01% 미만으로 포함된 경우에도 우수한 특이성 및 민감도로 돌연변이 유전자를 분석할 수 있었다.
실시예 5: 2형 단일핵산을 이용한 EGFR 돌연변이 분석 방법
EGFR(Epidermal growth factor receptor)은 비소세포폐암에서 과발현되어 EGFR 타이로신 키나아제(tyrosine kinase; TKI)의 표적이 된다. 이 EGFR 유전자의 엑손(Exon) 18, 19, 20, 21에 해당하는 타이로신 키나아제 도메인(tyrosine kinase domain)에 발생되는 돌연변이를 분석함으로써 비소세포암 환자의 치료제에 대한 약제 반응성을 예측할 수 있기 때문에, 돌연변이 분석이 환자의 약제 처방과 치료에 도움이 된다. 이 중 가장 사용 빈도가 높은 T790M(C2369T) 돌연변이에 대하여 돌연변이 여부를 분석하였다.
본 발명에 따른 2형 단일핵산 및 프라이머(primer)를 하기 표 6과 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다. 여기서, T790M 단일핵산의 경우 5'-말단에는 FAM을, 그리고 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 한편, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
EGFR 돌연변이 분석에 이용한 단일핵산 및 프라이머
단일핵산 또는 프라이머명 서열 서열번호
T790M 단일핵산 56-FAM/-CCGTGCAGCTCATCArUG+C-/3IABkFQ 19
T790M 프라이머 5'-CCTTGTGTTAAAGGACATAGTCCAG-3' 20
분석을 위하여 T790M 돌연변이 세포주인 H1975와 야생형 세포주인 A549로부터 게놈 DNA를 수득하였다. H1975 및 A549 게놈 DNA는 30ng(약 1×104 카피)로 정량 후 10배씩 희석하여 사용하였다.
상기 표 6의 T790M 단일핵산 0.25μM, T790M 프라이머를 0.25μM의 최종농도 존재하에서, 상기 게놈 DNA, 0.5unit의 내열성 RNase H, 5× AptaTaq DNA Master(Roche) 3.6㎕에 nuclease-free water로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 64℃에서 60초로 45 사이클을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.
그 결과, 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 EGFR 돌연변이 분석에서, 각각의 돌연변이형을 야생형과 비교하였을 때, 0.1% 이하까지 구분이 가능함을 확인하였다. 이는 전술한 바와 같이, 암(cancer)의 점 돌연변이(point mutation)와 같은 후성적인 돌연변이의 경우에는 2형 단일핵산을 이용하여 탐지하는 것이 유리함을 확인하였다.
실시예 6: 2형 단일핵산을 이용한 let-7 miRNA 및 miRNA 34 이형체 분석
실시예 6-1: 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 실시간 let-7 miRNA 분석
let-7 miRNA는 miRNA 중에서 가장 많은 이형체(isoform)가 존재하는 것으로 알려져 있다. 이러한 let-7의 이형체를 구별하는 것은 상당히 어려운 분석으로 알려져 있으며 통상 1% 미만의 특이도의 구별은 특히 어려운 것으로 알려져 있다. 본 실험은 그 중에서도 let-7a(5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU)와 let-7d(5'-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU)의 유전자 발현 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 2형 단일핵산과 프라이머(primer), RT-프라이머를 하기 표 7과 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다. 또한, 정확한 정량을 위하여 상기 let-7의 miRNA를 IDT에 의뢰하여 제조하였다. 여기서, 단일핵산의 경우 5'-말단에는 FAM(fluorescein succinimidyl ester)을, 그리고 3'-말단에는 3IABkFG를 부착하였다. 한편, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
let-7 miRNA 이형체 구별에 이용한 단일핵산 및 프라이머
단일핵산 또는 프라이머명 서열 서열번호
let-7a 단일핵산 FAM/-GCTGCTTGAGGTAGTAGGTTGrUAT-/3IABkFQ 21
let-7a R 프라이머 5'-GCCGCTGAGGTAGTAGGT-3' 22
let-7a RT 프라이머 5'-GCTAACGTCTGTACTTCGTCA(TTT)nAACT-3' 23
let-7d 단일핵산 FAM/-GCTGCTAGAGGTAGTAGGTTGrCAT-/3IABkFQ 24
let-7d R 프라이머 5'-GCCGCTGAGGTAGTAGGT-3' 25
let-7d RT 프라이머 5'-GCTAACGTCTGTACTTCGTCA(TTT)nAACT-3' 26
합성한 각각의 20pM 농도의 miRNA 1㎕와 Ambion사의 poly-(A) tailing kit와 Roche사의 Nxtscript RT kit (총 20㎕)를 이용하여 45℃에서 상기 표 7의 각각의 RT 프라이머 10μM 농도의 1㎕ 존재하에 30분간 반응하여 cDNA를 합성하였다.
상기 합성한 cDNA를 100fM에서 1aM농도까지 희석하였다.
상기 표 7의 단일핵산 및 프라이머가 각각 10μM 농도의 0.5㎕ 존재하에서, 상기 합성한 후 희석한 각각의 cDNA 2㎕, 1U 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche사 제조) 4㎕를 넣고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 63~64℃에서 60초, 95℃에서 10초였으며 45 사이클을 수행하였다. 이에 관한 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.
그 결과, miRNA 1aM 농도의 희석한 cDNA 2㎕(약 1 카피)만을 사용하여 각각의 miRNA 분석이 가능한 것을 확인하였다.
실시예 6-2: 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 실시간 let-7 miRNA 특이도 검출
상기 표 7의 단일핵산 및 프라이머가 각각 10μM 농도 0.5㎕ 존재하에, 1pM 농도의 let-7d cDNA 2㎕에 1/10씩 100fM에서 1aM 농도까지 희석한 let-7a cDNA 2㎕ 첨가하고, 1U 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche사 제조) 4㎕를 넣고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 63~64℃에서 60초, 95℃에서 10초였으며 45 사이클을 수행하였다. 이에 관한 결과를 도 13에 나타내었다.
그 결과, 1pM 농도의 let-7d cDNA 2㎕에 1/10씩 100fM에서 1aM 농도까지 희석한 let-7a cDNA 2㎕씩 첨가한 실험군에서 100fM에서 1fM 농도까지는 안정적으로 분석할 수 있음을 확인하였다. 이는 이형체(isoform)의 miRNA를 0.1%까지 특이도를 유지하면서 분석 가능함을 보여준다.
실시예 6-3: 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 실시간 miRNA 34a, miRNA 34b 및 miRNA 34c 분석
miRNA 34는 3종류의 이형체(isoform)가 존재하는데 이들 이형체를 구별하는 것이 상당히 어려운 것으로 알려져 있다. 본 실시예에서는 miRNA 34a, miRNA 34b, 및 miRNA 34c의 유전자 발현 여부를 측정하기 위해 표 8과 같이 IDT에 의뢰하여 단일핵산과 프라이머, RT-프라이머를 합성 및 제조하였다. 단일핵산의 경우 5'-말단에는 FAM(fluorescein succinimidyl ester) 및 HEX(hexachloro-fluorescein)을, 그리고 3'-말단에는 3IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와 구별하기 위해 첨자 "r"로 표시하였다.
miRNA 34a, miRNA 34b, 및 miRNA 34c 분석에 이용한 단일핵산 및 프라이머
단일핵산 또는 프라이머명 서열 서열번호
miRNA 34a 단일핵산 56FAM/-TTGGCAGTGTCTTAGCTGrGTT-/3IABkFQ 27
miRNA 34a 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTAC-3' 28
miRNA 34a RT 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTAC-3' 29
miRNA 34b 단일핵산 5HEX/-GTCTAGGCAGTGTCATTAGCTGrATT-/3IABkFQ 30
miRNA 34b 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTC-3' 31
miRNA 34b RT 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTC-3' 32
miRNA 34c 단일핵산 56FAM/-CCAGGCAGTGTAGTTAGCTGrATT-/3IABkFQ 33
miRNA 34c 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTGC-3' 34
miRNA 34c RT 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTGC-3' 35
각각의 miRNA는 Invitrogen사의 poly-(A) tailing kit와 Roche사의 Nxtscript RT kit (총 20㎕)를 이용하여 40℃에서 RT 프라이머 10μM 농도의 1㎕ 존재하에서, 60분간 반응하여 cDNA를 합성하였고, 합성한 cDNA를 1pM에서 1aM농도 (약 106~100 카피)까지 7개 농도를 1/10씩 희석하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. PCR은 각각의 합성 cDNA, 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche사), 단일핵산, 프라이머를 넣고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 반응 조건, 95℃에서 5분, 95℃에서 10초, 65℃에서 1분으로 45 사이클을 수행하였다.
그 결과, miRNA 34a, miRNA 34b 및 miRNA 34c 모두에서 1pM부터 10aM농도 (약 106~101 카피)까지 정상적인 PCR 효율로 측정이 가능한 것을 확인하였다.
이에 관한 결과는 도 14 내지 도 16에 나타내었다.
실시예 6-4: 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 실시간 miRNA 34a, miRNA 34b 및 miRNA 34c 특이도 검출
상기 실시예 6-3에서 miRNA 34a, miRNA 34b 및 miRNA 34c 단일핵산이 각각의 이형체(isoform)를 구분할 수 있는 것을 확인하였고, 본 실시예에서는 증폭하고자 하는 miRNA가 다른 이형체 miRNA과 섞여 있을 때 어느 정도의 비율까지 원하는 이형체를 구분할 수 있는지를 확인하였다. 108 (100pM) miRNA 34a 혹은 miRNA 34b 이형체에 107 부터 104 또는 103 (10pM~10fM 또는 10pM~1fM) 농도까지 1/10씩 희석한 miRNA 34c를 혼합하였고, miR-34c 단일핵산과 프라이머를 이용하여 특이도 검출을 중합효소 연쇄반응 (PCR)로 진행하였다.
PCR은 각각의 합성 cDNA, 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche사 제조), 단일핵산, 프라이머를 넣고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정하여 반응 조건, 95℃에서 5분, 95℃에서 10초, 65℃에서 1분으로 45 사이클을 수행하였다.
이에 관한 결과는 도 17 및 도 18에 나타내었다.
그 결과, miRNA 34c가 이형체를 최대 0.001%까지 특이도를 유지하며, 구분이 가능함을 확인하였다.
실시예 7: 단일핵산 구조에 따른 분석 방법
본 발명에 따른 단일핵산(2형)의 돌연변이 검출시 특이성을 높이고자, G12D의 3가지 유형, 구체적으로 단일핵산의 리보뉴클레오타이드(RNA)의 위치에 따라 돌연변이(mutant) 검출능을 알아보기 위해 R1DrMR2, R1rDMR2, R1DMrDR2 유형을 하기 표 9와 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다. 각각 단일핵산의 5'-말단에는 FAM을, 그리고 3'-말단에는 3IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오타이드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
KRAS 유전자 G12D의 3가지 유형(R1DrMR2, R1rDMR2, R1DMrDR2)에 대한 단일핵산
단일핵산 서열 서열번호
G12D-R1DrMR2 FAM/-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGrATG-/3IABkFQ 36
G12D-R1rDMR2 FAM/-CTTGTGGTAGTTGGAGCTrGAT-/3IABkFQ 37
G12D-R1DMrDR2 FAM/-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGArTGG-/3IABkFQ 38
* R1 및 R2: DNA올리고(DNAoligo), D: DNA, r: RNA, M: 돌연변이(mutation)
실시예 7-1: G12D 단일핵산 유형(G12D-R1DrMR2, G12D-R1rDMR2, G12D-R1DMrDR2)에 따른 G12D 돌연변이 유전자와 KRAS 야생형 유전자 분석
단일핵산 서열번호 36 내지 38과 프라이머 서열번호 18을 10μM 농도의 0.5㎕씩 준비하고, 0.5U RNase H, AptaTaq Master(Roche 제조) 3.6㎕, Aspc-1(G12D 돌연변이형)와 HT-29(KRAS 야생형)에서 추출한 총 게놈 DNA 30ng을 첨가한 후 3차 증류수로 총 부피가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이때, 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 10초, 64℃에서 60초를 45 사이클 반응하고, 사이클마다 실시간으로 시그널(FAM)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 19 내지 도 21에 나타내었다.
단일핵산의 세가지 구조에 따라 KRAS 야생형 유전자에 대한 특이성에서 다른 결과를 보이나, 세가지 구조 모두 점 돌연변이(point mutation)의 구분이 가능함을 확인하였다.
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10th of sequence. <400> 5 ctgcagaagu gcctggca 18 <210> 6 <211> 16 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single Nucleic Acid for detecting ApoE gene <220> <223> RNA is located in 8th of sequence. <400> 6 gcagaagcgc ctggca 16 <210> 7 <211> 16 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single Nucleic Acid for detecting G13D mutation of KRAS gene <220> <223> RNA is located in 9th of sequence. <400> 7 agctggtgac gtaggc 16 <210> 8 <211> 16 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single Nucleic Acid for detecting wild type of KRAS gene <220> <223> RNA is located in 9th of sequence. <400> 8 agctggtggc gtaggc 16 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting G13D mutation of KRAS gene <400> 9 cctgctgaaa atgactgaat ataaact 27 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting G13D mutation of KRAS gene <400> 10 tcgtccacaa aatgattctg aattag 26 <210> 11 <211> 20 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting ApoE gene <220> <223> RNA is located in 18th of sequence. <400> 11 cggtcatgga ggacgtgugc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting ApoE gene <220> <223> RNA is located in 18th of sequence. <400> 12 gcggatatgg aggacgtgcg 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting ApoE gene <220> <223> RNA is located in 19th of sequence. <400> 13 ctggtacact gccaggcact t 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting ApoE gene <220> <223> RNA is located in 18th of sequence. <400> 14 ctggtacact gccaggcgat tc 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting codon mutation of KRAS gene <220> <223> RNA is located in 21th of sequence. <400> 15 acttgtggta gttggagctg utg 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting codon mutation of KRAS gene <220> <223> RNA is located in 21th of sequence. <400> 16 aacttgtggt agttggagct ugt 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting codon mutation of KRAS gene <220> <223> RNA is located in 21th of sequence. <400> 17 aacttgtggt agttggagct agt 23 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting codon mutation of KRAS gene <400> 18 catattcgtc cacaaaatga ttctg 25 <210> 19 <211> 18 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting mutation of EGFR gene <220> <223> RNA is located in 16th of sequence. <400> 19 ccgtgcagct catcaugc 18 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting mutation of EGFR gene <400> 20 ccttgtgtta aaggacatag tccag 25 <210> 21 <211> 24 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting isoform of let-7a gene <220> <223> RNA is located in 22th of sequence. <400> 21 gctgcttgag gtagtaggtt guat 24 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting isoform of let-7a gene <400> 22 gccgctgagg tagtaggt 18 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer for detecting isoform of let-7a gene <400> 23 gctaacgtct gtacttcgtc atttaact 28 <210> 24 <211> 24 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting isoform of let-7d gene <220> <223> RNA is located in 22th of sequence. <400> 24 gctgctagag gtagtaggtt gcat 24 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting isoform of let-7d gene <400> 25 gccgctgagg tagtaggt 18 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer for detecting isoform of let-7d gene <400> 26 gctaacgtct gtacttcgtc atttaact 28 <210> 27 <211> 21 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting isoform of miRNA 34a gene <220> <223> RNA is located in 19th of sequence <400> 27 ttggcagtgt cttagctggt t 21 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting isoform of miRNA 34a gene <400> 28 gtctcgacgt tctttttttt ttttac 26 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer for detecting isoform of miRNA 34a gene <400> 29 gtctcgacgt tctttttttt ttttac 26 <210> 30 <211> 25 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting isoform of miRNA 34b gene <220> <223> RNA is located in 23th of sequence <400> 30 gtctaggcag tgtcattagc tgatt 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting isoform of miRNA 34b gene <400> 31 gtctcgacgt tctttttttt ttttc 25 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer for detecting isoform of miRNA 34b gene <400> 32 gtctcgacgt tctttttttt ttttc 25 <210> 33 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting isoform of miRNA 34c gene <220> <223> RNA is located in 21th of sequence <400> 33 ccaggcagtg tagttagctg att 23 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting isoform of miRNA 34c gene <400> 34 gtctcgacgt tctttttttt ttttgc 26 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer for detecting isoform of miRNA 34c gene <400> 35 gtctcgacgt tctttttttt ttttgc 26 <210> 36 <211> 22 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting mutation of KRAS gene <220> <223> RNA is located in 20th of sequence. <400> 36 cttgtggtag ttggagctga tg 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting mutation of KRAS gene <220> <223> RNA is located in 19th of sequence. <400> 37 cttgtggtag ttggagctga t 21 <210> 38 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid for detecting mutation of KRAS gene <220> <223> RNA is located in 21th of sequence. <400> 38 cttgtggtag ttggagctga tgg 23

Claims (10)

  1. 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산으로서,
    상기 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)이며,
    상기 단일핵산은 ⅰ) X-Y-Z의 구조를 가지며,
    ⅱ) 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고,
    ⅲ) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며,
    iv) 상기 Y는 단일 표적 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA로서 단일 표적 유전자와 혼성화시 절단 효소에 의해 절단되며,
    상기 X는 10 내지 30개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, 상기 Z는 1 내지 3개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, 상기 단일 표적 유전자와 단일핵산이 혼성화된 후 절단 시약에 의해 Y가 절단될 때 Z는 단일 표적 유전자로부터 분리되지만 X는 분리되지 않고 프라이머 및 프로브로 작동하는 것을 특징으로 하는, 단일핵산.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전적 변이 검출은 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 것인, 단일핵산.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍인 것인, 단일핵산.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단일핵산은 단일 표적 유전자의 유전적 변이로서 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 검출하는데 있어서, ⅰ) 핵산 중 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 RT 프라이머; ⅱ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머; ⅲ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 역방향 프라이머; ⅳ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머; 또는 ⅴ) 검출하고자 하는 핵산(DNA 또는 RNA)을 실시간으로 확인하기 위한 프로브로 사용되는 것인, 단일핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일핵산을 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 효소를 더 포함하는 키트로,
    상기 효소는 RNaseH, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ 또는 RNase T2의 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase)인, 키트.
  7. a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계;
    b) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일핵산(promer)을 제조하는 단계;
    c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 단일핵산, 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및
    d) 상기 단계 c)에서 증폭된 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 단계 a)의 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산은 시료로부터 검출하고자 하는 RNA 또는 DNA이거나, 상기 RNA를 역전사 중합효소로 증폭하여 얻은 cDNA인 것인, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 단계 c)의 절단시약은 RNaseH, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ 또는 RNase T2의 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase)인, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 유전적 변이 검출은 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 것인, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법.
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