KR102451403B1

KR102451403B1 - ＡｐｏＥ 유전자의 ＳＮＰ 분석을 위한 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법

Info

Publication number: KR102451403B1
Application number: KR1020200039708A
Authority: KR
Inventors: 남영현; 김남효; 김현미
Original assignee: 주식회사 누리바이오
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2022-10-07
Also published as: KR20210122498A

Abstract

본 발명은 ApoE(apolipoprotein E) 유전자의 단일염기다형성 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, X-Y-Z의 구조를 가지며, ApoE 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 단일핵산을 사용하여 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 실시간으로 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 절단시약에 의해서만 절단되는 단일핵산(promer)을 이용한 ApoE 유전자의 SNP를 실시간으로 검출하는 방법은 종래 프로브를 이용한 유전적 변이 검출 방법에 비해 보다 정확하게 측정할 수 있는 이점이 있다. 또한, ApoE 유전자의 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4 및 E3/E4 표현형을 신속 정확하고 간단하게 구분할 수 있어, ApoE 유전자형에 의한 다양한 질환, 예컨대 알츠하이머 및 심혈관계 질환의 진단, 치료제 선택 및 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＡｐｏＥ 유전자의 ＳＮＰ 분석을 위한 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법{Promer for real-time detection for SNP analysis of ApoE gene and detection method using the same}

본 발명은 ApoE(apolipoprotein E) 유전자의 SNP 분석을 위한 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, X-Y-Z의 구조를 가지며, 112 및 158번 코돈에서 단일염기다형성을 보이는 ApoE 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 단일핵산을 사용하여 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 실시간으로 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.

유전자 변형에 있어 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 변형은 가장 일반적인 형태이며, 다양한 질병을 유발시키는 원인으로 작용한다(Barreiro LB, et al., Methods Mol. Biol., 578:255-276, 2009; Beaudet L. et al., Genome Res., 11(4):600-608, 2001). 이에 유전자 변형에 의한 여러 질병들을 조기에 진단하기 위해 SNP 검출을 통한 진단 방법은 매우 효율적이며 빠른 진단을 가능하게 한다. 따라서 SNP를 정확하게 검출하기 위한 많은 방법들이 제시되어 왔으며, 현재에도 이와 관련된 많은 연구가 진행되고 있다(Ermini ML. et al., Biosen. & Bioele., 61:28-37, 2014; K. Chang et al., Biosen. & Bioele., 66:297-307, 2015).

구체적으로, 다수의 유전자 분석을 위한 가장 보편적으로 사용하는 방법으로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하는 방법, 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, Multiplex PCR) 방법이 있다.

상기 중합효소 연쇄반응은 템플레이트(template) DNA와 결합할 수 있으며, 형광물질과 소광물질이 결합된 프라이머 또는 프로브를 임의로 설계함으로써 검출하고자 하는 유전자의 원하는 부위만을 정확하게 증폭할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 통상 한번의 반응으로 하나의 관심 유전자만을 증폭 및 분석할 수 있어 증폭하고자 하는 관심 유전자가 다수일 경우에는 동일한 작업을 반복해서 수행하여야 하는 번거로움이 있다.

상기 다중 중합효소 연쇄반응은 여러 개의 중합효소 연쇄반응을 한 튜브에서 수행함으로써 다수의 유전자 영역을 동시에 분석할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 여러 개의 프라이머 또는 프로브를 한 튜브에서 동시에 사용함에 따라 프라이머 또는 프라이머들 간의 교차반응이 발생하게 되기 때문에 한 번에 증폭할 수 있는 유전자 영역의 수에는 한계가 있다. 또한, 반응 조건을 찾기 위한 많은 노력과 시간을 필요로 하고 민감도 및 특이도에서 좋은 결과를 얻을 수 없다는 단점이 있다(Hardenbol P. et al., Nat. Biotechnol., 21(6):673-678, 2003).

최근에는 다중 중합효소 연쇄반응을 사용하지 않고 공통 프라이머를 사용하여 다수의 유전자 영역을 동시에 증폭하여 대량 분석을 가능하게 하는 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 대표적인 기술로는 동시에 여러 유전자 영역의 단일염기다형성(SNP)을 분석할 수 있는 SNPlex, Goldengate assay, molecular inversion probes(MIPs) 등이 있다.

그러나, 상기 SNPlex, Goldengate assay, molecular inversion probes(MIPs) 등과 같은 방법들은 첫 번째 튜브에서 반응시킨 생성물의 일부를 두 번째 튜브로 옮겨 반응을 수행해야 하거나, 여러 종류의 효소를 이용하기 때문에 서로 다른 샘플들 간의 오염이 발생될 수 있으며, 실험 방법이 복잡한 문제점이 있다. 또한, 형광표지가 부착된 프로브의 개수만큼의 단일염기다형성만이 검출 가능하므로 분석하고자 하는 단일염기다형성의 개수가 증가할수록 분석 비용이 높아지는 문제가 있다.

한편, ApoE(apolipoprotein E) 유전자는 apo C-I, C-Ⅱ 및 LDL 수용체 유전자와 연계되어 있으며, 유전자 다형성은 고지혈증 및 치매 등의 여러 질병의 발생과의 연관성이 밝혀져 있다.

알츠하이머 환자의 β-아밀로이드(β-Amyloid) 단백 합성과정에 분자적 매개 역할을 하며, ApoE e4의 경우 이런 결합 매개적 특성이 강할 것으로 추측되고 있으며, 또한 ApoE e4는 결합 형태의 차이로 인산화 과정에 변화를 초래하여 신경원 섬유뭉치의 형성 속도를 빠르게 하는 것 역시 보고된 바 있다.

인체의 ApoE 유전자는 19번 염색체의 장완에 위치하며 3가지 대립유전자 2, 3, 4의 동위형 E2, E3,E4가 존재하며 이들은 제112번째 및 158번째 아미노산이 달라짐으로 인해 구별된다. 이러한 3가지 대립유전자의 조합으로 6개의 다른 유전형으로 ApoE 유전자 다형성 (표 7 참조)이 이루어지는데, 그 다형성은 심혈관계질환 및 알츠하이머병의 발생위험과 관계가 있다.

그 중, ApoE4 단백질은 알츠하이머병과 관상동맥 질환의 중요한 위험인자로 알려져 있으며, ApoE2 단백질은 반대로 알츠하이머병에 예방적인 효과가 있는 반면 제Ⅲ형 고콜레스테롤혈증 환자의 대부분은 ApoE2의 동형접합체로 ApoE 유전자의 다형성은 심혈관계질환 및 치매에 있어 중요한 의미를 가지고 있어 환자 뿐 아니라 건강한 일반인에서도 중요한 검사로 인식되고 있다.

이에, 본 발명자들은 ApoE 유전자의 SNP에 의한 유전자 변형을 실시간으로 검출하는데 있어서 낮은 민감도와 특이도를 증가시켜 ApoE 유전자 변형으로 인해 유발되는 질환을 간단하고 정확하게 진단할 수 있는 방법을 오랫동안 연구하여 오던 중, 본 발명자들의 단일핵산을 활용할 경우 높은 민감도 및 높은 특이성을 나타내어 ApoE 유전자 변형에 의한 다양한 질환, 예컨대 알츠하이머 및 심혈관계 질환 진단에 매우 유용함을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

Barreiro LB, et al., Methods Mol. Biol., 578:255-276, 2009 Beaudet L. et al., Genome Res., 11(4):600-608, 2001 Ermini ML. et al., Biosen. & Bioele., 61:28-37, 2014 K. Chang et al., Biosen. & Bioele., 66:297-307, 2015 Hardenbol P. et al., Nat. Biotechnol., 21(6):673-678, 2003

본 발명의 하나의 목적은 ⅰ) X-Y-Z의 구조를 가지며, ⅱ) 단일염기다형성 부위를 포함한 ApoE 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, ⅲ) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 상기 Y는 ApoE 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA인 것을 특징으로 하는, ApoE 유전자의 단일염기다형성 검출용 단일핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 ApoE 유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 확인을 위해 프로브(probe)로만 사용하는 경우 상기 단일핵산은 (a) 상기 X는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (b) 상기 Z는 1 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 하는, ApoE 유전자의 단일염기다형성 검출용 단일핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일핵산을 프라이머(primer) 및 프로브(probe)로 동시에 사용하는 경우 (c) 상기 X는 10 내지 30개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (d) 상기 Z는 1 내지 5개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 하는, ApoE 유전자의 단일염기다형성 검출용 단일핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일핵산을 포함하는, ApoE 유전자의 단일염기다형성 실시간 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계; b) 상기 ApoE 유전자의 단일염기다형성 검출용 단일핵산을 제조하는 단계; c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 1형 단일핵산, ApoE 유전자 특이적 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합하거나 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 2형 단일핵산, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 증폭된 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, ApoE 유전자의 단일염기다형성 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 ApoE 유전자의 단일염기다형성 검출용 단일핵산(promer)을 제공한다.

상세하게는, 상기 단일핵산은 ⅰ) X-Y-Z의 구조를 가지며, ⅱ) 단일염기다형성 부위를 포함한 ApoE 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, ⅲ) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 상기 Y는 단일 표적 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA로서 ApoE 유전자와 혼성화시 절단 시약에 의해 절단된다.

이때, 상기 단일핵산이 ApoE 유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 확인하기 위한 프로브(probe)로만 사용하는 경우 (a) 상기 X는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (b) 상기 Z는 1 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 하고, 상기 단일핵산이 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 확인하기 위한 프라이머(primer) 및 프로브(probe)로 동시에 사용하는 경우 (c) 상기 X는 10 내지 30개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (d) 상기 Z는 1 내지 5개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 단일핵산은 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 확인하기 위해 프로브로만 사용될 경우에 ApoE 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 X 및 Z도 ApoE 유전자로부터 분리되어 프로브로 작동하는 것을 특징으로 하거나, ApoE 유전자의 단일염기다형성을 확인하기 위해 프라이머 및 프로브로 동시 사용될 경우 ApoE 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 Z는 ApoE 유전자로부터 분리되지만 상기 X는 분리되지 않고 프라이머와 프로브로 동시 작동하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 단일핵산을 포함하는, ApoE 유전자의 단일염기다형성 실시간 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계; b) 상기 ApoE 유전자의 단일염기다형성 검출용 단일핵산을 제조하는 단계; c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 1형 단일핵산, ApoE 유전자 특이적 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합하거나 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 2형 단일핵산, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 증폭된 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, ApoE 유전자의 단일염기다형성 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 실시간으로 검출하는 방법은 종래 qPCR을 이용한 SNP 분석 방법과 비교하여 단일공간에서 2곳의 단일염기다형성의 측정이 가능하여 보다 간단하고 정확하게 측정할 수 있는 이점이 있다. 즉, 본 발명에 따른 단일핵산은 절단시약에 의해서만 절단되고, 단일공간에서 2곳의 단일염기다형성 측정이 가능하여 종래 프로브를 이용한 ApoE 유전자의 SNP 검출 방법에 비해 보다 정확하게 측정할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 단일핵산을 이용하여 SNP와 같은 유전적 변이 분석시, 용융온도(melting temperature) 분석과 같은 별도의 확인 과정 필요없이 바로 분석이 가능하다.

따라서, 본 발명의 단일핵산(promer) 및 이를 이용한 ApoE 유전자의 단일염기다형성 실시간 검출 방법은 ApoE 유전자의 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4 및 E3/E4 표현형을 신속 정확하게 구분할 수 있어, ApoE 유전자에 의한 다양한 질환, 예컨대 알츠하이머 및 심혈관계 질환의 진단, 치료제 선택 및 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산을 이용하여 ApoE 유전자 단일염기다형성을 확인한 도로, 상세하게는 ApoE 단일핵산 1형(서열번호 3 내지 6)를 이용하여 ApoE 유전자 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4 구분이 가능함을 확인한 PCR 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산을 이용하여 ApoE 유전자 단일염기다형성을 확인한 도로, 상세하게는 ApoE 단일핵산 2형(서열번호 7 내지 10)을 이용하여 ApoE 유전자 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4 구분이 가능함을 확인한 PCR 결과이다.

본 발명은 ApoE(apolipoprotein E) 유전자의 단일염기다형성 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일염기다형성(SNP)을 보이는 ApoE 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 단일핵산을 사용하여 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 실시간으로 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 ApoE 유전자의 단일염기다형성 실시간 검출용 단일핵산을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 단일핵산은 ⅰ) X-Y-Z의 구조를 가지며, ⅱ) 단일염기다형성 부위를 포함한 ApoE 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, ⅲ) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.

이때 부착되는 탐지 가능한 마커의 위치는 특정 부위에 국한하지 않으며, 절단 시약에 의해 Y 부위 절단 시 탐지 가능한 마커가 분리되는 위치라면 어느 곳이든 가능하다.

또한, 상기 단일핵산은 실시간 검출을 목적으로 하는 단일염기다형성 부위를 포함한 ApoE 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합하여 복합체를 형성, 증폭시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 단일핵산은 ApoE 유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 탐지하는 핵산을 의미한다. 여기서, 단일염기다형성(SNP) 탐지 시 프로브(probe)로만 사용되는 단일핵산은 "1형 단일핵산" 또는 "단일핵산 1형"으로 표현할 수 있으며, 프라이머(primer)와 프로브(probe)로 동시에 사용되는 단일핵산은 "2형 단일핵산" 또는 "단일핵산 2형"으로 표현할 수 있다. 상기 1형 단일핵산은 2형 단일핵산과 달리 프로브(probe)로 작동 가능하며, 2형 단일핵산은 1형 단일핵산과 달리 프라이머(primer)와 프로브(probe)로 동시에 사용 가능하다.

구체적으로, 1형 단일핵산이 ApoE 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 X 및 Z도 ApoE 유전자로부터 분리되어 프로브로 작동 가능하며, 2형 단일핵산이 ApoE 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 Z는 ApoE 유전자로부터 분리되지만 상기 X는 분리되지 않고 프라이머와 프로브로 동시 작동하는 것을 특징으로 한다.

하나의 구체적 예로서, 상기 1형 단일핵산은 서열번호 3, 4, 5 및 6으로 구성된 것일 수 있으며, 상기 2형 단일핵산은 서열번호 7, 8, 9 및 10으로 구성된 것일 수 있다.

본 발명의 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 각각의 X, Y, 및 Z는 다양한 개수의 뉴클레오티드(nucleotide)를 가질 수 있다.

상기 Y는 ApoE 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA이며, 절단 시약에 의해 절단되는 부위이다.

여기서, 절단 시약은 DNase, RNase, 헬리카제(helicase), 엑소뉴클리아제 및 엔도뉴클리아제 같은 효소효소를 매개로 한 절단이 이루어지는 것이 바람직하나, 기타 공지된 절단시약이 사용되어도 무방하다.

상기 X는 1형 단일핵산의 경우 4 내지 20개, 바람직하게는 4 내지 19개, 보다 바람직하게는 4 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 5 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 17개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 16개, 가장 바람직하게는 6 내지 15개의 염기서열로 구성되는 DNA이다.

하나의 구체적인 예로서, 112번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산의 X는 5'-GC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'로 구성된 염기서열(서열번호 27)일 수 있으며, 또한 상기 염기서열에서 3' 말단을 기준으로 4개 이상, 바람직하게는 4개 내지 20개를 포함하는 서열로서 구성될 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 112번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산의 X 부위는 하기 표 1의 서열을 포함할 수 있다.

서열번호	서열
11	5‘-C GTG-3’
12	5‘-AC GTG-3’
13	5‘-GAC GTG-3’
14	5’-G GAC GTG-3’
15	5‘-AG GAC GTG-3’
16	5‘-GAG GAC GTG-3’
17	5‘-G GAG GAC GTG-3’
18	5‘-TG GAG GAC GTG-3’
19	5‘-ATG GAG GAC GTG-3’
20	5'-C ATG GAG GAC GTG-3'
21	5'-AC ATG GAG GAC GTG-3’
22	5'-GAC ATG GAG GAC GTG-3’
23	5'-G GAC ATG GAG GAC GTG-3’
24	5'-CG GAC ATG GAG GAC GTG-3’
25	5'-GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3’
26	5'-C GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3’
27	5'-GC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3’

다른 하나의 구체적인 예로서, 158번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산의 X는 5'-AT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'로 구성된 염기서열(서열번호 54)일 수 있으며, 또한 상기 112번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산의 X와 같이 상기 서열번호 54의 염기서열에서 3' 말단을 기준으로 4개 이상, 바람직하게는 4개 내지 20개를 포함하는 서열로서 구성될 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 158번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산의 X 부위는 하기 표 2의 서열을 포함할 수 있다.

서열번호	서열
38	5‘-G AAG-3’
39	5‘-AG AAG-3’
40	5‘-CAG AAG-3’
41	5’-G CAG AAG-3’
42	5‘-TG CAG AAG-3’
43	5‘-CTG CAG AAG-3’
44	5‘-C CTG CAG AAG-3’
45	5‘-AC CTG CAG AAG-3’
46	5‘-GAC CTG CAG AAG-3’
47	5'-T GAC CTG CAG AAG-3'
48	5'-AT GAC CTG CAG AAG-3’
49	5'-GAT GAC CTG CAG AAG-3’
50	5'-C GAT GAC CTG CAG AAG-3’
51	5'-CC GAT GAC CTG CAG AAG-3’
52	5'-GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3’
53	5'-T GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3’
54	5'-AT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3’

또한, 상기 X는 2형 단일핵산인 경우 10개 내지 30개, 바람직하게는 11개 내지 30개, 보다 바람직하게는 12 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 13 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 14 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 16 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 16 내지 29개, 보다 더 바람직하게는 16 내지 28개, 보다 더 바람직하게는 16 내지 27개, 보다 더 바람직하게는 16 내지 26개, 보다 더 바람직하게는 16 내지 25개, 보다 더 바람직하게는 16 내지 24개, 보다 더 바람직하게는 16 내지 23개, 보다 더 바람직하게는 16 내지 22개, 보다 더 바람직하게는 16 내지 21개, 가장 바람직하게는 16 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이다.

하나의 구체적인 예로, 112번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 2형 단일핵산의 X는 5'-GCC CGG CTG GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'로 구성된 염기서열(서열번호 37)일 수 있으며, 또한 상기 염기서열에서 3' 말단을 기준으로 10개 이상, 바람직하게는 10개 내지 30개를 포함하는 서열로서 구성될 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 112번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 2형 단일핵산의 X 부위는 하기 표 3의 서열을 포함할 수 있다.

서열번호	서열
17	5'-G GAG GAC GTG-3'
18	5'-TG GAG GAC GTG-3'
19	5'-ATG GAG GAC GTG-3'
20	5'-C ATG GAG GAC GTG-3'
21	5'-AC ATG GAG GAC GTG-3'
22	5'-GAC ATG GAG GAC GTG-3'
23	5'-G GAC ATG GAG GAC GTG-3'
24	5'-CG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
25	5'-GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
26	5'-C GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
27	5'-GC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
28	5'-GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
29	5'-G GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
30	5'-TG GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
31	5'-CTG GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
32	5'-G CTG GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
33	5'-GG CTG GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
34	5'-CGG CTG GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
35	5'-C CGG CTG GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
36	5'-CC CGG CTG GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'
37	5'-GCC CGG CTG GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'

다른 하나의 구체적인 예로, 158번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 2형 단일핵산의 X는 5'-CTC CTC CGC GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'로 구성된 염기서열(서열번호 64)일 수 있으며, 또한 상기 염기서열에서 3' 말단을 기준으로 10개 이상, 바람직하게는 10개 내지 30개를 포함하는 서열로서 구성될 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 158번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 2형 단일핵산의 X 부위는 하기 표 4의 서열을 포함할 수 있다.

서열번호	서열
44	5‘-C CTG CAG AAG-3’
45	5‘-AC CTG CAG AAG-3’
46	5‘-GAC CTG CAG AAG-3’
47	5'-T GAC CTG CAG AAG-3'
48	5'-AT GAC CTG CAG AAG-3’
49	5'-GAT GAC CTG CAG AAG-3’
50	5'-C GAT GAC CTG CAG AAG-3’
51	5'-CC GAT GAC CTG CAG AAG-3’
52	5'-GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3’
53	5'-T GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3’
54	5'-AT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3’
55	5'-GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'
56	5'-C GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'
57	5'-GC GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'
58	5'-CGC GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'
59	5'-C CGC GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'
60	5'-TC CGC GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'
61	5'-CTC CGC GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'
62	5'-C CTC CGC GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'
63	5'-TC CTC CGC GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'
64	5'-CTC CTC CGC GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'

상기 1형 단일핵산에서 Z부위는 1 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 20개, 보다 바람직하게는 3 내지 20개, 보다 더 바람직하게는 4 내지 20개, 보다 더 바람직하게는 4 내지 19개, 보다 더 바람직하게는 4 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 4 내지 17개, 가장 바람직하게는 4 내지 16개 등의 염기서열로 구성되는 DNA이다.

하나의 구체적인 예로서, 112번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산의 Z는 5‘-GCG GCC GCC TGG TGC AGT AC-3’로 구성된 염기서열(서열번호 84)일 수 있으며, 또한 상기 염기서열(서열번호 84)에서 5‘ 기준으로 1개 이상을 포함하는 서열로서 구성될 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 112번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산의 Z 부위는 하기 표 5의 서열을 포함할 수 있다.

서열번호	서열
65	5‘-G-3’
66	5‘-GC-3’
67	5‘-GCG-3’
68	5‘-GCG G-3’
69	5‘-GCG GC-3’
70	5‘-GCG GCC-3’
71	5’-GCG GCC G-3‘
72	5’-GCG GCC GC-3‘
73	5’-GCG GCC GCC-3‘
74	5’-GCG GCC GCC T-3‘
75	5’-GCG GCC GCC TG-3‘
76	5’-GCG GCC GCC TGG-3‘
77	5’-GCG GCC GCC TGG T-3‘
78	5’-GCG GCC GCC TGG TG-3‘
79	5’-GCG GCC GCC TGG TGC-3‘
80	5’-GCG GCC GCC TGG TGC A-3‘
81	5’-GCG GCC GCC TGG TGC AG-3‘
82	5’-GCG GCC GCC TGG TGC AGT-3‘
83	5’-GCG GCC GCC TGG TGC AGT A-3‘
84	5’-GCG GCC GCC TGG TGC AGT AC-3‘

다른 하나의 구체적인 예로서, 158번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산의 Z는 5‘-GCC TGG CAG TGT ACC AGG CC-3’로 구성된 염기서열(서열번호 104)일 수 있으며, 또한 상기 염기서열(서열번호 104)에서 5‘ 기준으로 1개 이상을 포함하는 서열로서 구성될 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 158번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산의 Z 부위는 하기 표 6의 서열을 포함할 수 있다.

서열번호	서열
85	5‘-G-3’
86	5‘-GC-3’
87	5‘-GCC-3’
88	5‘-GCC T-3’
89	5‘-GCC TG-3’
90	5’-GCC TGG-3‘
91	5’-GCC TGG C-3‘
92	5’-GCC TGG CA-3‘
93	5’-GCC TGG CAG-3‘
94	5’-GCC TGG CAG T-3‘
95	5’-GCC TGG CAG TG-3‘
96	5’-GCC TGG CAG TGT-3‘
97	5’-GCC TGG CAG TGT A-3‘
98	5’-GCC TGG CAG TGT AC-3‘
99	5’-GCC TGG CAG TGT ACC-3‘
100	5’-GCC TGG CAG TGT ACC A-3‘
101	5’-GCC TGG CAG TGT ACC AG-3‘
102	5’-GCC TGG CAG TGT ACC AGG-3‘
103	5’-GCC TGG CAG TGT ACC AGG C-3‘
104	5’-GCC TGG CAG TGT ACC AGG CC-3‘

또한, 상기 2형 단일핵산에서 Z 부위는 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 내지 4개의 염기서열로 구성되는 DNA이다.

하나의 구체적인 예로서, 112번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 2형 단일핵산의 Z는 5‘-G-3’(서열번호 65), 5’-GC-3’(서열번호 66), 5‘-GCG-3’(서열번호 67), 5‘-GCG G-3’(서열번호 68), 또는 5-GCG GC-3’(서열번호 69)일 수 있다.

다른 하나의 구체적인 예로서, 158번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 2형 단일핵산의 Z는 5‘-G-3’(서열번호 85), 5’-GC-3’(서열번호 86), 5‘-GCC-3’(서열번호 87), 5‘-GCC T-3’(서열번호 88), 또는 5-GCC TG-3’(서열번호 89)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상술한 단일핵산으로서 X 및 Z를 구성하는 염기 개수에 따라 이들 각각의 단일염기다형성(SNP) 검출을 특이적이며 민감하게 탐지할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, ApoE 단일핵산(서열번호 3 내지 6, 및 서열번호 7 내지 10)을 이용하여 ApoE 유전자 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4 구분이 명확하게 가능함을 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 1 및 2).

본 발명에 있어서, 상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.

상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서 탐지 가능한 마커로 형광쌍을 사용하는 경우, 형광물질과 소광물질의 위치는 X 또는 Z에 위치한 형태이거나 Y 부위에 위치할 수 있으며, 그 어느 것에 한정되는 것은 아니다. 하나의 예로서, 형광물질은 X에 위치하고 소광물질은 Y 또는 Z에 위치할 수 있다.

본 발명의 단일핵산은 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 확인하는데 있어서, ⅰ) 핵산 중 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 RT 프라이머; ⅱ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머; ⅲ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 역방향 프라이머; ⅳ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머; 또는 ⅴ) 검출하고자 하는 핵산(DNA 또는 RNA)을 실시간으로 확인하기 위한 프로브로 사용될 수 있다.

특히, 본 발명의 단일핵산을 RNA(miRNA 등 포함)를 cDNA로 합성 및 증폭하기 위한 RT 프라이머; 또는 정방향 프라이머와 프로브; 또는 역방향 프라이머와 프로브로 사용하는 경우에, cDNA 합성시 RT 프라이머를 루프형태로 제작하거나 폴리 A를 형성하는 과정이 필요하지 않고 검출하고자 하는 RNA와 혼성화되어 cDNA를 합성하고 탐지하고자 하는 RNA(miRNA 등 포함)를 증폭 및 실시간 검출할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일핵산을 포함하는, ApoE 유전자의 단일염기다형성 실시간 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 단일핵산을 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 확인하기 위한 키트로 사용하는 경우, 상기 키트는 본 발명의 단일핵산 이외에 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소는 단일핵산의 Y 부위를 특이적으로 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 예를 들어 Y 부위가 DNA인 경우 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소 등을 사용하는 것이 바람직하며, Y 부위가 RNA인 경우 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2 등을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 단일핵산을 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 확인하기 위한 키트로 사용하는 경우, 상기 키트는 본 발명의 단일핵산 및 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소 이외에 DNA의 증폭반응에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다.

상기 증폭반응에 필요한 시약은 예를 들어, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermusaquatiucs(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcusliteralis 또는 Phyrococcusfuriosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg²⁺), 완충용액, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH₂O)을 들 수 있다. 또한, 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등이 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계; b) 상술한 단일핵산을 제조하는 단계; c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 1형 단일핵산, ApoE 유전자 특이적 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합하거나 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 2형 단일핵산, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 증폭된 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, ApoE 유전자의 단일염기다형성 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 실시간으로 검출하는 방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계이다.

본 발명에 있어서, 상기 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산은 시료로부터 검출하고자 하는 RNA 또는 DNA이거나, 상기 RNA를 역전사 중합효소로 증폭하여 얻은 cDNA일 수 있다.

상기 시료는 생물학적 시료이거나, 생물학적 시료로부터 분리된 RNA, DNA 또는 이들의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 혈액, 타액, 뇨, 분변, 조직, 세포 및 생검 표본으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 또는 보관된 생물학적 시료로부터 분리된 RNA, DNA 또는 이들의 단편일 수 있다. 그러나, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.

상기 보관된 생물학적 시료는 당업계에 통상적으로 알려진 보관방법으로 1주일 이상, 1년 이상, 예를 들면 1년 내지 10년 동안 보관되거나, 냉동 보관, 또는 포르말린으로 고정된 조직을 상온에서 보관한 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 시료로부터 RNA 또는 DNA의 추출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다.

b) 상기 단일핵산을 제조하는 단계이다.

본 발명에 있어서, 단일핵산은 전술한 바와 같으며, 상세하게는 ⅰ) X-Y-Z의 구조를 가지며, ⅱ) 단일염기다형성 부위를 포함한 ApoE 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, ⅲ) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.

상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

c) ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계이다.

본 발명에 있어서, 상기 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체의 증폭은 상기 수득한 표적 핵산, 상기 제조한 1형 단일핵산, ApoE 유전자 특이적 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합하거나 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 2형 단일핵산, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 ApoE 유전자 특이적 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 구성된 것일 수 있으나, ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트라면 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 절단시약은 효소를 매개로 한 절단이 이루어지는 것이 바람직하나, 기타 공지된 절단시약이 사용되어도 무방하다. 이때, DNase, RNase, 헬리카제(helicase), 엑소뉴클리아제 및 엔도뉴클리아제 같은 효소들에 의해 촉매되는 RNA 또는 DNA의 절단을 표시하기 위하여, "효소매개 절단(enzyme-mediated cleavage)"이라는 용어를 사용한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 혼성화된 프로브의 닉(nick) 생성 및 절단은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제인 리보뉴클리아제에 의해서 수행되는 것이 보다 바람직하다. 리보뉴클리아제는 이중 가닥 DNA-RNA 혼성화 가닥으로부터 리보 핵산(ribonucleic acid)에서 닉을 생성하고 절단시키는 이중 가닥 리보뉴클리아제인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 절단시약은 이에 제한되지는 않으나, RNaseH, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ 또는 RNase T2의 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase)일 수 있다.

d) 상기 증폭된 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계이다.

본 발명에 있어서, 단일핵산 단편의 양 측정은 다양한 검출방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따라 분리된 단일핵산의 단편은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정되는 것이 바람직하며, 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정으로 이루어질 수 있다.

상기 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정은 당업계에 공지된 형광 표지자 검출이 가능한 모든 측정 장치를 이용할 수 있으며, 예를 들어 트라이애드 멀티모드 디텍터(TRIAD Multimode Detector), 활락/빅터 형광(Wallac/Victor fluorescence) 또는 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer), LightCycler96, Applied Biosystems 7500, 또는 Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler 등을 이용하여 이루어질 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.

본 발명에 따라 절단된 단일핵산 단편의 양 측정과 검출방법은 단일핵산 또는 반응액 내로 유입된 표지 또는 탐지 가능한 마커의 종류에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 단일핵산은 Y 부위가 절단된 후 증폭하는 단계에 의해 Y 부위의 유전적 변이 구별을 용이하게 하므로, 이후의 핵산 증폭 반응을 통해 돌연변이 확인을 가능하게 한다. 즉, 본 발명의 단일핵산에서 Y 부위와 표적 핵산의 단일염기다형성 부위에 확인하고자 하는 유전자형의 단일핵산이 혼성화를 형성하도록 하였을 경우, Y 부위가 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위와 정확하게 상보적인 결합을 한 경우에만 절단되고 이후에 증폭 반응이 수행되기 때문에 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 명확하게 확인할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단일핵산에서 Y 부위와 표적 핵산의 단일염기다형성 부위가 혼성화를 형성하도록 하였음에도 Y 부위가 상보적인 결합을 하지 않은 경우라면 Y 부위가 절단되지 않으므로 증폭 반응이 일어나지 않으며, 이는 표적 핵산에 측정하고자 하는 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위가 확인하고자 하는 유전자형이 아님을 의미하게 된다.

본 발명에 쉽게 이용할 수 있는 신장반응, 즉 핵산 증폭반응은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 즉, 상기 표적 핵산의 증폭은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA), 핵산가닥 전치 증폭(strand displacement amplification; SDA) 또는 핵산서열기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)을 포함하지만 상기 방법에 국한되지 아니한다. 상기 핵산 증폭 산물은 DNA 또는 RNA이다.

일반적으로, 표적 핵산의 증폭 및 상기에서 기술한 단일핵산의 절단에 의한 탐지를 동시에 가능하도록, 반응 혼합액에 표적 핵산, 단일핵산, 핵산 증폭 반응의 구성물 및 절단 효소가 포함된다. 각 증폭반응은 완충액 조건, 프라이머, 반응온도 및 단일핵산 절단 조건 등을 각각 개별적으로 최적화시키는 것이 필요하다. 핵산 증폭반응과 연계하여 본 발명의 검출방법을 사용하면 표적 핵산을 탐지하는 민감도와 속도가 현저하게 개선될 것이다.

한편, 본 발명의 ApoE 유전자의 단일염기다형성 실시간 검출용 단일핵산이 알츠하이머 및 심혈관계 질환 등과 관련된 ApoE 유전자의 단일염기다형성을 신속 정확하게 검출 및 탐지할 수 있음을 확인한 바, 상기 단일핵산은 ApoE 유전자형에 의한 다양한 질환, 예컨대 알츠하이머 및 심혈관계 질환을 진단하기 위한 키트 또는 조성물에 적용가능하며, 실시간으로 ApoE 유전자형에 의한 관련 질환 진단을 수행하여 알츠하이머 등과 같은 관련 질환 발생 여부에 대한 정보를 제공하는데 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 1형 단일핵산을 이용한 ApoE 분석

1형 단일핵산을 아포리포단백질 E(Apolipoprotein E, ApoE) 유전자의 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4를 분석하는데 이용하였다.

인간 염색체 19번에 위치한 ApoE 유전자는 심혈관계 및 알츠하이머 질병과 관련된 유전자이다. ApoE 유전자는 코돈(codon) 112(cys/arg), 코돈 158(cys/arg)의 DNA의 단일염기다형성(SNP)[게놈 DNA 위치 586(T/C), 724(T/C)번째]에 의해 세 가지의 대립 유전자 이형체(isoform)인 ApoEε2, ApoEε3, ApoEε4를 가지게 되며, 이 대립 유전자의 조합에 의해 6종의 표현형(E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4)을 갖게 된다.

ApoE 다형성	코돈 112	코돈 158
ApoE2/2	Cys(TGC)	Cys(TGC)
ApoE3/3	Cys(TGC)	Arg(CGC)
ApoE4/4	Arg(CGC)	Arg(CGC)
ApoE2/3	Cys(TGC)	Cys(TGC)/Arg(CGC)
ApoE2/4	Cys(TGC)/Arg(CGC)	Cys(TGC)/Arg(CGC)
ApoE3/4	Cys(TGC)/Arg(CGC)	Arg(CGC)

상기 ApoE 유전자의 각 6종의 표현형을 구분하기 위하여, 5'-말단을 각각의 형광 염료(dye)가 부착된 4종의 개선된 형태의 1형 단일핵산을 이용하여 4-plex로 분석이 가능하도록 하였다. 기존의 분석법에서는 통상적으로 4-plex에 의한 분석법의 민감도 및 특이도를 충족시키기 쉽지 않았으나, 본 발명에서는 이에 대하여 충족할 만한 결과를 보여주었다.

상세하게는 ApoE 유전자의 코돈 112 및 코돈 158의 대립 유전자형에 대한 SNP 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 1형 단일핵산과 프라이머(primer)를 하기 표 8과 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다. 여기서 1형 단일핵산의 경우 X-Y-Z의 구조를 가지는 프로브로서 5'-말단에는 각각 6-FAM, HEX, TexasRed, Cy5를, 그리고 각 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다. 112번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산은 서열번호 3 및 4이며, 158번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 1형 단일핵산은 서열번호 5 및 6이다.

ApoE 특이적 프라이머 세트 및 4종의 ApoE 단일핵산(1형)

프라이머명/프로브명	서열	서열번호
ApoE_F 프라이머	5'-GAAGGCCTACAAATCGGAACT-3'	1
ApoE_R 프라이머	5'-GCCACCTGCTCCTTCAC-3'	2
ApoE 단일핵산 1	56-FAM/-GAGGACGTGrUGCGGCC-/3IABkFQ	3
ApoE 단일핵산 2	5-HEX/-GAGGACGTGrCGCGGCC-/3IABkFQ	4
ApoE 단일핵산 3	5-TexRd/-CTGCAGAAGrUGCCTGGCA-/3IABkFQ	5
ApoE 단일핵산 4	5-Cy5/-GCAGAAGrCGCCTGGCA-/3IABkFQ	6

분석을 위하여 한국세포주은행으로부터 인간 세포주 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 분양받았고, 이로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 수득하였다. 6종의 표현형에 대한 분석을 위하여, 동형 표현형은 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 사용하였고, 이형 표현형은 각 게놈 DNA의 혼합형인 PC3+A549(E2/E3), PC3+U937(E2/E4), A549+U937(E3/E4)을 고농도로 반응당 32ng (약 10⁴ 카피(copy))으로 포함되도록 하여 분석에 사용하였다.

상기 표 8의 ApoE 단일핵산 1, 2, 3, 4 각각의 0.2μM, 0.15μM, 0.15μM, 및 0.075μM과, ApoE 정방향 및 역방향 프라이머 각각의 0.35μM의 최종농도 존재하에서, 상기 정량한 게놈 DNA, 0.5U RNase-H, AptaTaq DNA Master(Roche) 4㎕, GC rich solution(Roche) 3㎕, nuclease-free water로 총 부피(total volume)가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 15초, 65℃에서 70초로 45 사이클(cycle)을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.

그 결과, 한 개의 반응 웰(well)에서 ApoE 각 대립 유전자의 조합 6종에 대한 분석이 가능한 것을 확인하였다. 이 결과에서 단일염기다형성의 호모 또는 헤테로인 경우 개선된 프로브(probe) 형태를 사용할 경우 구분능이 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 2형 단일핵산을 이용한 ApoE 분석

ApoE 유전자의 코돈(codon) 112 및 코돈 158의 대립 유전자형에 대한 SNP 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 사용하였다. 하기 표 9와 같이, IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 2형 단일핵산을 제조하였다.

여기서, 2형 단일핵산의 경우 X-Y-Z의 구조를 가지는 프라이머 및 프로브로서, 5'-말단에는 각각 6-FAM, HEX, TexasRed를, 그리고 각 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다. 112번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 2형 단일핵산은 서열번호 7 및 8이며, 158번 코돈의 SNP를 검출하기 위한 2형 단일핵산은 서열번호 9 및 10이다.

4종의 ApoE 단일핵산(2형)

단일핵산명	서열	서열번호
ApoE 단일핵산1	56-FAM/-CGGTCATGGAGGACGTGrUGC-/3IABkFQ	7
ApoE 단일핵산2	5TexRd-XN/-GCGGATATGGAGGACGTrGCG-/3IABkFQ	8
ApoE 단일핵산3	56-FAM/-CTGGTACACTGCCAGGCArCTT-/3IABkFQ	9
ApoE 단일핵산4	5HEX/-CTGGTACACTGCCAGGCrGATTC-/3IABkFQ	10

분석을 위하여 한국세포주은행으로부터 인간 세포주 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 분양받았고, 이로부터 게놈 DNA를 수득하였다. 6종의 표현형에 대한 분석을 위하여, 동형 표현형은 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 사용하였고, 이형 표현형은 각 게놈 DNA의 혼합형인 PC3+A549(E2/E3), PC3+U937(E2/E4), A549+U937(E3/E4)을 고농도로 반응당 32ng(약 10⁴ 카피)으로 포함되도록 하여 분석에 사용하였다.

상기 표 9의 ApoE 단일핵산 1, 2, 3, 4 각각의 0.375μM, 0.1μM, 0.25μM, 및 0.25μM의 최종농도 존재하에서, 상기 게놈 DNA와 0.1ng의 내열성 RNase H, 그리고 AptaTaq DNA Master w/o MgCl₂(Roche) 4㎕, GC rich solution(Roche) 4㎕, 2.75mM MgCl₂, 62.5nM Low ROX에 nuclease-free water로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 64℃에서 55초로 40 사이클을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 ApoE 각 대립 유전자의 조합 6종에 대한 분석에서, 코돈 112의 586T 변이와 코돈 158의 724T 변이의 경우 형광 염료 차이에 의한 분석이 아닌 동일 형광 염료에 의한 종료점(end point) 형광 값의 차이로 구분이 가능한 제한점이 있었지만, 1형 단일핵산과 더불어 2형 단일핵산도 단일염기다형성의 호모 또는 헤테로의 구분능이 우수함을 확인할 수 있었다.

<110> NuriBio Co., Ltd. <120> Promer for real-time detection for SNP analysis of ApoE gene and detection method using the same <130> PA-20-0124 <160> 104 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE_F primer <400> 1 gaaggcctac aaatcggaac t 21 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE_R primer <400> 2 gccacctgct ccttcac 17 <210> 3 <211> 16 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid type 1 for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <220> <223> RNA is located at 10th of sequence <400> 3 gaggacgtgu gcggcc 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid type 1 for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <220> <223> RNA is located at 10th of sequence <400> 4 gaggacgtgc gcggcc 16 <210> 5 <211> 18 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid type 1 for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <220> <223> RNA is located at 10th of sequence <400> 5 ctgcagaagu gcctggca 18 <210> 6 <211> 16 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid type 1 for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <220> <223> RNA is located at 8th of sequence <400> 6 gcagaagcgc ctggca 16 <210> 7 <211> 20 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid type 2 for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <220> <223> RNA is located at 18th of sequence <400> 7 cggtcatgga ggacgtgugc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid type 2 for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <220> <223> RNA is located at 18th of sequence <400> 8 gcggatatgg aggacgtgcg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid type 2 for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <220> <223> RNA is located at 19th of sequence <400> 9 ctggtacact gccaggcact t 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single nucleic acid type 2 for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <220> <223> RNA is located at 18th of sequence <400> 10 ctggtacact gccaggcgat tc 22 <210> 11 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 11 cgtg 4 <210> 12 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 12 acgtg 5 <210> 13 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 13 gacgtg 6 <210> 14 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 14 ggacgtg 7 <210> 15 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 15 aggacgtg 8 <210> 16 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 16 gaggacgtg 9 <210> 17 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 17 ggaggacgtg 10 <210> 18 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 18 tggaggacgt g 11 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 19 atggaggacg tg 12 <210> 20 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 20 catggaggac gtg 13 <210> 21 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 21 acatggagga cgtg 14 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 22 gacatggagg acgtg 15 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 23 ggacatggag gacgtg 16 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 24 cggacatgga ggacgtg 17 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 25 gcggacatgg aggacgtg 18 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 26 cgcggacatg gaggacgtg 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 27 gcgcggacat ggaggacgtg 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 28 ggcgcggaca tggaggacgt g 21 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 29 gggcgcggac atggaggacg tg 22 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 30 tgggcgcgga catggaggac gtg 23 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 31 ctgggcgcgg acatggagga cgtg 24 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 32 gctgggcgcg gacatggagg acgtg 25 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 33 ggctgggcgc ggacatggag gacgtg 26 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 34 cggctgggcg cggacatgga ggacgtg 27 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 35 ccggctgggc gcggacatgg aggacgtg 28 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 36 cccggctggg cgcggacatg gaggacgtg 29 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 37 gcccggctgg gcgcggacat ggaggacgtg 30 <210> 38 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 38 gaag 4 <210> 39 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 39 agaag 5 <210> 40 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 40 cagaag 6 <210> 41 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 41 gcagaag 7 <210> 42 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 42 tgcagaag 8 <210> 43 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 43 ctgcagaag 9 <210> 44 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 44 cctgcagaag 10 <210> 45 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 45 acctgcagaa g 11 <210> 46 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 46 gacctgcaga ag 12 <210> 47 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 47 tgacctgcag aag 13 <210> 48 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 48 atgacctgca gaag 14 <210> 49 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 49 gatgacctgc agaag 15 <210> 50 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 50 cgatgacctg cagaag 16 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 51 ccgatgacct gcagaag 17 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 52 gccgatgacc tgcagaag 18 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 53 tgccgatgac ctgcagaag 19 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 54 atgccgatga cctgcagaag 20 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 55 gatgccgatg acctgcagaa g 21 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 56 cgatgccgat gacctgcaga ag 22 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 57 gcgatgccga tgacctgcag aag 23 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 58 cgcgatgccg atgacctgca gaag 24 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 59 ccgcgatgcc gatgacctgc agaag 25 <210> 60 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 60 tccgcgatgc cgatgacctg cagaag 26 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 61 ctccgcgatg ccgatgacct gcagaag 27 <210> 62 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 62 cctccgcgat gccgatgacc tgcagaag 28 <210> 63 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 63 tcctccgcga tgccgatgac ctgcagaag 29 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 64 ctcctccgcg atgccgatga cctgcagaag 30 <210> 65 <211> 1 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 65 g 1 <210> 66 <211> 2 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 66 gc 2 <210> 67 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 67 gcg 3 <210> 68 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 68 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Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 75 gcggccgcct g 11 <210> 76 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 76 gcggccgcct gg 12 <210> 77 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 77 gcggccgcct ggt 13 <210> 78 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 78 gcggccgcct ggtg 14 <210> 79 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 79 gcggccgcct ggtgc 15 <210> 80 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 80 gcggccgcct ggtgca 16 <210> 81 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 81 gcggccgcct ggtgcag 17 <210> 82 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 82 gcggccgcct ggtgcagt 18 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 83 gcggccgcct ggtgcagta 19 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 112 codon of ApoE gene <400> 84 gcggccgcct ggtgcagtac 20 <210> 85 <211> 1 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 85 g 1 <210> 86 <211> 2 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 86 gc 2 <210> 87 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 87 gcc 3 <210> 88 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 88 gcct 4 <210> 89 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 89 gcctg 5 <210> 90 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 90 gcctgg 6 <210> 91 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 91 gcctggc 7 <210> 92 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 92 gcctggca 8 <210> 93 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 93 gcctggcag 9 <210> 94 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 94 gcctggcagt 10 <210> 95 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 95 gcctggcagt g 11 <210> 96 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 96 gcctggcagt gt 12 <210> 97 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 97 gcctggcagt gta 13 <210> 98 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 98 gcctggcagt gtac 14 <210> 99 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 99 gcctggcagt gtacc 15 <210> 100 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 100 gcctggcagt gtacca 16 <210> 101 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 101 gcctggcagt gtaccag 17 <210> 102 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 102 gcctggcagt gtaccagg 18 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 103 gcctggcagt gtaccaggc 19 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z part of Single nucleic acid for detecting SNP in 158 codon of ApoE gene <400> 104 gcctggcagt gtaccaggcc 20

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ApoE 유전자의 6종 표현형의 동시 및 실시간 검출용 키트로서,
상기 키트는 서열번호 1 및 2의 ApoE 유전자 특이적 프라이머 세트, 서열번호 3 내지 6의 단일핵산, 및 절단효소, 또는 서열번호 7 내지 10의 단일핵산 및 절단효소로 이루어지고, 상기 절단효소는 RNaseH, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ 또는 RNase T2의 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase)인 것을 특징으로 하는 키트.
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a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계;
b) 서열번호 1 및 2의 ApoE 유전자 특이적 프라이머 세트 및 서열번호 3 내지 6의 단일핵산, 또는 서열번호 7 내지 10의 단일핵산을 제조하는 단계;
c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 서열번호 3 내지 6의 단일핵산, 서열번호 1 및 2의 ApoE 유전자 특이적 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합하거나 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 서열번호 7 내지 10의 단일핵산, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및
d) 상기 단계 c)에서 증폭된 ApoE 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, ApoE 유전자 6종의 표현형의 동시 및 실시간 검출 방법.
제21항에 있어서,
상기 단계 a)의 단일염기다형성 부위를 포함하는 표적 핵산은 시료로부터 검출하고자 하는 RNA 또는 DNA이거나, 상기 RNA를 역전사 중합효소로 증폭하여 얻은 cDNA인 것인, ApoE 유전자 6종의 표현형의 동시 및 실시간 검출 방법.
제21항에 있어서,
상기 단계 c)의 절단시약은 RNaseH, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ 또는 RNase T2의 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase)인, ApoE 유전자 6종의 표현형의 동시 및 실시간 검출 방법.
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