KR101410986B1

KR101410986B1 - ApoE 유전자에 대한 단일 염기다형성 유전자형 분석 및 이를 이용한 판별방법

Info

Publication number: KR101410986B1
Application number: KR1020110038071A
Authority: KR
Inventors: 김동식; 변상진; 김광진; 김성열; 박한오
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2011-04-22
Publication date: 2014-06-27
Also published as: KR20120119849A

Abstract

본 발명은 ApoE 유전자에 대한 단일 염기다형성 유자자형 분석 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별용 프라이머/프로브 세트는 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 부위를 빠른 시간내에 효율적이고 정확하게 검출할 수 있어, 심혈관계질환 또는 알츠하이머병 연구에 크게 기여할 것이다.

Description

ApoE 유전자에 대한 단일 염기다형성 유전자형 분석 및 이를 이용한 판별방법{SNP genotyping assay set for ApoE genes and method of detecting ApoE using the same}

본 발명은 ApoE 유전자에 대한 단일 염기다형성 유전자형 분석 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것이다.

ApoE(apolipoprotein E) 유전자는 apo C-I, C-II 및 LDL 수용체 유전자와 연계되어 있으며, 유전자 다형성은 고지혈증 및 치매 등의 여러 질병의 발생과의 연관성이 밝혀져 있다.

알쯔하이머병 환자의 β-Amyloid 단백 합성과정에 분자적 매개 역할을 하며, ApoE e4의 경우 이런 결합 매개적 특성이 강할 것으로 추측되고 있으며, 또한 ApoE e4는 결합 형태의 차이로 인산화 과정에 변화를 초래하여 신경원 섬유뭉치의 형성 속도를 빠르게 하는 것 역시 보고된 바 있다.

인체의 ApoE 유전자는 19번 염색체의 장완에 위치하며 3가지 대립유전자 2, 3, 4의 동위형 E2, E3,E4가 존재하며 이들은 제112번째 및 158번째 아미노산이 달라짐으로 인해 구별된다. 이러한 3가지 대립유전자의 조합으로 6개의 다른 유전형으로 하기 표 1의 ApoE 유전자 다형성이 이루어지는데, 그 다형성은 심혈관계질환 및 알츠하이머병의 발생위험과 관계가 있다.

그 중, ApoE4 단백질은 알츠하이머병과 관상동맥 질환의 중요한 위험인자로 알려져 있으며, ApoE2 단백질은 반대로 알츠하이머병에 예방적인 효과가 있는 반면 제III형 고콜레스테롤혈증 환자의 대부분은 ApoE2의 동형접합체로 보고된 바 있어, ApoE 유전자의 다형성은 심혈관계질환 및 치매에 있어 중요한 의미를 가지고 있어 환자 뿐 아니라 건강한 일반인에서도 중요한 검사로 인식되고 있다.

한편, 분자 유전학에서 많이 사용되고 있는 단일 염기 다형성을 검출하는 SNP스코링 방법으로는 염기서열 분석법, PCR-SSCP(Polymerase chain reaction -Single stranded conformation polymorphism), 대립형질 특이적 혼성화(allele specific hybridization), 올리고리게이션(oligo-ligation)법, 미니-시퀀싱 (mini-sequencing) 그리고 효소 절단법에 의한 것들이 있다. DNA칩을 이용한 방법도 소개되고 있는데 원리적으로 대립형질 특이적 혼성화와 다르지 않고, 다만 올리고뉴클레오티드 프로브 등을 부착하는 고정상에 차별을 둔 것이다.

염기서열 분석법은 맥삼-길버트법과 생거법이 있으나 현재는 후자의 방법이 주로 사용되고 있다. 이 방법은 특정 위치의 유전변이 여부만을 조사하기 위한 방법이라기보다는 유전자 전체 또는 일부 부위의 염기서열을 밝히기 위한 방법이지만, 염기서열을 밝히면 특정 위치의 유전변이 여부도 확인할 수 있으므로 SNP스코링에 사용될 수 있다. 그러나, 조사하고자 하는 SNP의 변이만을 확인하는 것이 아니라 굳이 조사하지 않아도 되는 주변의 염기서열을 함께 읽는다는 면에서 비효율적이다.

PCR-SSCP(Orita, M. et.al, Genomics, 1989, 5:8874-8879)는 PCR로 분석하고자 하는 SNP를 포함하는 서열을 증폭한 후, 각각의 체인으로 분리시킨 다음, 폴리 아크릴 아마이드 젤에서 전기영동을 수행한다. 하나의 염기 차이에 의하여 DNA 체인의 2차 구조가 달라지므로 이 차이에 기인한 전기영동 이동속도 차이에 따라 염기변이 여부를 조사한다.

대립형질 특이적 혼성화는 나일론 필터 등에 부착된 프로브에 방사선동위원소 등으로 표지된 샘플 DNA를 혼성화하되, 온도 등 혼성화의 조건을 조절함으로써 염기변이의 여부를 조사하는 방법이다.

실시간 유전자 분석법(Real-Time Polymerase Chain Reaction)은 중합효소연쇄반응법의 일종으로 프라이머(primer) 및 프로브(Probe)를 이용하여 형광신호의 세기에 따라 증폭 여부를 확인하는 방법이다.

최근, 본 출원인 역시 대한민국 특허 제 2011-0004724호에서 “PCR을 통해서 타겟 유전자의 단일염기 다형성을 판별하는 방법”을 출원한바 있다.

본 발명의 목적은 ApoE 유전자에 대한 단일 염기다형성 유자자형 분석 및 이를 이용한 판별방법을 제공하기 위한 것으로, 보다 상세하게는 사람 ApoE(apolipoprotein E) 유전자 내 SNP(single nucleotide polymorphism)에 대한 효율적이고도 신뢰도가 높은 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별방법을 제공하기 위한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람의 ApoE(apolipoprotein E) 유전자 내 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는, 단일 염기다형성 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 사람의 ApoE(apolipoprotein E) 유전자 내 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는, 단일 염기다형성 판별용 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 ApoE 단일 염기다형성 판별용 프라이머 세트, ApoE 단일 염기다형성 판별용 프로브 또는 이들의 혼합 구성물을 포함하는, 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별용 키트를 이용하여 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성을 판별하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 사람의 ApoE(apolipoprotein E) 유전자 내 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는, 단일 염기다형성 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 ApoE 유전자는 서열번호 1로 기재된 유전자인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 ApoE 유전자 내 112번째 또는 158번째 아미노산을 코딩하는 코돈과 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 내지 15, 18 및 19로 기재된 프라이머로부터 선택된 2 이상의 프라이머가 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 ApoE SNP 112 대립형질의 정방향 프라이머는 서열번호 2 내지 7, 역방향 프라이머는 서열번호 8로 기재되는 염기서열이며, ApoE SNP 158 대립형질의 정방향 프라이머는 서열번호 9 내지 14, 역방향 프라이머는 서열번호 15로 기재되는 염기서열이고, 내부 양성 대조군 프라이머(Internal Positive Control)로 정방향 프라이머는 서열번호 18, 역방향 프라이머는 서열번호 19로 기재되어지는 염기서열로서, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 혼합하여 사용한다.

본 발명에 있어서, “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명은 사람의 ApoE(apolipoprotein E) 유전자 내 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는, 단일 염기다형성 판별용 프로브를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 16, 17 및 20으로 기재된 프로브로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 ApoE 단일 염기다형성 판별용 프라이머 세트, ApoE 단일 염기다형성 판별용 프로브 또는 이들의 혼합 구성물을 포함하는, 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 혼합 구성물은 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 혼합 구성물은 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은

1) 검사 대상의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

2) 상기 ApoE 단일 염기다형성 판별용 프라이머 세트, ApoE 단일 염기다형성 판별용 프로브 또는 이들의 혼합 구성물을 포함하는 키트를 이용하여 단계 1)에서 분리한 게놈 DNA상에 존재하는 다형성 부위를 검출하는 단계; 및

3) 단계 2)에서 검출된 다형성 부위의 유무를 비교하는 단계;

를 포함하는 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별방법을 제공한다.

본 발명의 시료에서 전체 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트/프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 본 발명에 따른 프라이머와 형광물질이 화학적으로 결합하여 있는 본 발명의 프로브를 사용함으로써 반응 결과를 실시간으로 모니터한다. 상기 프로브는 중합효소 연쇄반응 과정에서 ApoE SNP 112와 ApoE SNP 158에 상보적인 정방향 프라이머 각 2개와 역방향 프라이머와 같이 검체의 핵산에 있는 상보서열에 결합하게 되는데 위치는 프라이머에서 약간 떨어진 부분이다.

본 발명의 프로브는 양끝에 리포터(reporter)와 소광제(quencher)라는 형광물질이 붙어 있는 구조로서 리포터와 소광제가 근접하여 존재하면 형광을 서로 상쇄하여 리포터의 형광이 감지되지 않으나, 증폭이 진행됨에 따라 리포터가 소광제로부터 떨어지면 리포터의 형광이 감지되는 것이다. 따라서, 형광의 강도는 증폭 사이클이 증가함에 따라 점점 증가하게 된다. 각 증가된 형광의 검출값(Ct)의 차이(△Ct)를 통해 동형 접합자(homo-type)와 이형 접합자(hetero-type)를 구분하게 된다.

본 발명에 따른 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별용 프라이머/프로브 세트는 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 부위를 빠른 시간내에 효율적이고 정확하게 검출할 수 있어, 심혈관계질환 또는 알츠하이머병 연구에 크게 기여할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 ApoE 유전자의 염기서열을 보여주는 것이고,
도 2는 실시예1의 DNA 주형을 대상으로, 본 발명에 따른 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별용 키트를 이용하여 ExiGenotyperTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block 기기로 실시한 중합연쇄 반응을 수행한 결과이며,
도 3은 염기서열 분석법으로 단일염기 다형성이 검증된 임상검체(E2/E4 타입)를 대상으로, 본 발명에 따른 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별용 키트를 이용하여 실시간 중합 연쇄 반응을 수행한 결과이고,
도 4는 염기서열 분석법으로 검증된 ApoE 임상 검체 44개를 대상으로, ApoE SNP 112와 ApoE SNP 158의 동형 접합자와 이형 접합자의 검출값을 구하여 민감도와 특이도가 최적인 조건을 구한 그래프이며,
도 5는 본 발명에 따른 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별방법을 이용한 ApoE 유전자에 대한 단일 염기다형성 판별결과이고,
(A: ExiGenotyperTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block 기기로 실시한 중합연쇄 반응 결과, B: 전기영동 결과, C: 판별결과)
도 6은 ApoE genotyping을 자동 판별하기 위한 프로그램 흐름도이며,
도 7은 염기서열 분석법으로 검증된 ApoE 타입별 검체에 대한 테스트 결과이고,
(A: E2/E2, B: E2/E3)
도 8은 염기서열 분석법으로 검증된 ApoE 타입별 검체에 대한 테스트 결과이며,
(A: E2/E4, B: E3/E3)
도 9는 염기서열 분석법으로 검증된 ApoE 타입별 검체에 대한 테스트 결과이다.
(A: E3/E4, B: E4/E4)

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예 1] 주형 DNA 제조

실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하기 위해, 먼저 주형 DNA를 제조하였다. 구체적으로 사람의 ApoE((NC_000019.9: 서열번호 1)의 318 내지 933 bp(630 bp) 부분, 구체적으로 ApoE 유전자 내 112번째 또는 158번째 아미노산을 코딩하는 코돈인 ApoE SNP 112와 ApoE SNP 158 단일염기 다형성을 포함하며, 각각의 단일염기 다형성을 가진 주형 DNA 및 IPC(Internal Positive Control)(NM_002046.3) 659 내지 1019 bp(361 bp) 부분을 유전자 합성방법(NBiochem. Biophys. Res. Commun.1998, 248, 200-203)으로 합성하고, 그 중 일부를 pGEM-T-Easy Vector(Cat: A1360, Promega, 미국)에 클로닝하였다. 구체적으로 2× rapid ligation buffer(Promega사제, 미국) 5 ㎕, T-Easy Vector(Promega,미국) 1 ㎕, T4 DNA ligase 1 ㎕(Promega사제, 미국), 합성된 유전자 3 ㎕(8 ng)를 동일한 튜브에 넣어 혼합한 다음 37℃에서 1시간 정온배치하였다.

그 후, E. coli 만능세포(competent cell) 50 ㎕에 상기의 정온배치한 반응액 5 ㎕을 넣고 얼음 상에 40분간 놓아둔 뒤 42℃에서 40초 배양하고 다시 얼음 상에 2분 놓아두었다. 앰피실린, IPTG, X-Gal이 포함된 LB 플레이트에 상기 반응액을 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하였다. 색이 흰 콜로니를 취하여 LB 액체 배지에서 16시간 정도 배양한 후 원심분리하여 상층액은 버리고 Accuprep plasmid DNA prep kit(Bioneer사제, 한국)를 사용하여 펠릿으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA는 UV 분광계(Shimazu, 일본)로 농도와 순도를 측정한 다음 순도가 1.8 내지 2.0 사이인 것을 확인하고 사용하였다.

6.02×10²³×농도(UV 분광계로 측정된 농도 g/ml)/(3015＋630)×660[3015 bp: T-easy vector의 크기, 630 bp: Apolipoprotein E 주형 DNA의 크기] 주형 DNA의 카피수를 계산한 다음 1×TE buffer(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)로 ApoE SNP 112/158주형 4×10⁵ copy/reaction 과 IPC(GAPDH) 4×10⁵ copy/reaction으로 각각 희석하여 ApoE SNP 112 주형과 IPC주형, ApoE SNP 158 주형과 IPC 주형을 각각 1/2씩 섞어 사용시까지 -20℃에 보관하였다.

[ 실시예 2] 프라이머 및 탐침 디자인

상기 서열번호 1의 사람ApoE(NC_000019.9)의 염기서열 318 bp부터 933 bp 사이에서 각 단일 염기 다형성이 포함하고 일치하는 길이는 20 내지 22 mer, Tm 값은 60℃ 내지 65℃가 되도록 임의로 염기서열을 선택하여 정방향 및 역방향 프라이머로 하였다.

또한, 길이는 23 mer, Tm 값은 67 내지 72℃ 정방향과 역방향 프라이머 사이에서 임의로 염기서열을 선택하여 프로브로 하였고, Tm 값은 Primer3Plus 프로그램을 사용하여 체크하였다.

모든 프라이머/프로브는 하기 표 2와 같이 제작하였다.

상기의 모든 프라이머/프로브는 세트로 PCR 효율이 좋은 프라이머/프로브 세트를 조합하여(표 3, 표 4) ExiGenotyperTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국)을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행하였다.

구체적으로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 각각 20 pmol, 프로브 30 pmol, 10×PCR Buffer 5 ㎕, Taq polymerase 20 U, dNTP 20 mM, DEPC(Diethylpyrocarbonate)를 넣고 혼합한 후, 1 웰당 40 ㎕가 되도록하여 96-웰 플레이트에 분주하였다. 여기에 사용된 주형 RNA는 실시예 1에서 희석하고 ApoE SNP 112/158 주형을 각각 IPC 주형과 섞은 것을 5 ㎕씩 사용함으로써, 최종 총 용량이 50 ㎕이 되도록 하였다.

또한, ApoE SNP 112/158 프로브는 5’부위에 FAM 형광, 3’부위에는 BHQ1이 부착되도록 하고, IPC 프로브는 TAMRA-BHQ1이 부탁되도록 주문제작((주)바이오니아)하여 사용하였다.

95℃에서 10분간 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 65℃에서 30초씩 45 사이클을 반응시켰다. 구체적으로 실시예 1에서 합성하고 ApoE SNP 112/158 주형과 IPC 주형을 각각 1/2 섞은 합성 주형과 임상검체(E2/E4 type)를 선택하여 각각에 대해 ExiGenotyperTM Quantitative Thermal Block(도 2 및 도 3)을 사용하고, 최적의 프라이머/프로브 세트를 ApoE SNP 112 세트 1개(표 3, 세트 3), ApoE SNP 158 세트 1개(표 4, 세트 4)를 선택하였다.

[ 실시예 3] 진단 프로그램 테스트

상기 실시예 1과 실시예 2에서 선택된 합성 주형과 최적의 프라이머/프로브(세트3, 세트 4)를 ExiGenotyperTM Quantitative Thermal Block 기기로 이용하여 임상검체 44개를 대상으로 민감도와 특이도를 조사하여, 동형 접합자와 이형 접합자를 100% 판별하는 기준값을 통계적으로 구하였고(도 4), 이를 토대로 ApoE 유전형 판별 프로그램을 개발하였다.

기존의 상업적으로 판매중인 ApoE genotyping(씨젠, 한국) 제품과 비교하였으며, 비교결과는 바이오니아에서 개발한 ApoE 유전형 판별 프로그램의 결과와 정확성을 비교 하였다.

그 결과 도 5에서도 확인할 수 있듯이, 상기 실시예 2의 프라이머/프로브세트는 ApoE 유전자의 노인성 치매 관련 단일 염기 다형성을 제한 없이 효율적으로 검출할 수 있었고, 그 신뢰도 역시 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4] 임상 검체 테스트

상기 실시예 2의 표 3에서 최종적으로 선별한 프라이머/프로브 세트(세트 3, 세트 4)를 이용하여 염기서열 분석법으로 ApoE SNP 112와 ApoE SNP 158의 단일 염기 다형성이 판별되었고, ApoE의 6(E2/E2, E2/E3, E3/E3, E3/E4, E4/E4)가지 타입이 결정된 임상검체를 테스트 하였다.

테스트 결과는 형광의 사이클수(Ct)의 차이(△Ct)를 이용하여, 동형 접합자 와 이형 접합자를 판별하였다. 구체적으로는 △Ct± 2를 기준으로 하였다. 형광 사이클수 차이가 △Ct ±2보다 큰 값을 가지면 동형 접합자, 형광의 사이클 수 차이가 △Ct± 2보다 작은 값을 가지면 이형 접합자로 판별하였으며, 동형 접합자의 경우 1차적으로 형광값 차이가 △Ct± 2 보다 큰 값을 충족하며, 형광의 사이클 수(Ct)가 작은 값을 가지는 형광 검출 신호에 대한 동형 접합자로 정했다.

도 7의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별용 프라이머/프로브 세트는 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 부위를 빠른 시간내에 효율적이고 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였고, 이는 심혈관계질환 또는 알츠하이머병 연구에 유용하게 이용할 수 있음을 확인한 결과이다.

<110> BIONEER CORPORATION <120> SNP genotyping assay set for ApoE genes and method of detecting ApoE using the same <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3612 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(3612) <223> ApoE gene <400> 1 gggatccttg agtcctactc agccccagcg gaggtgaagg acgtccttcc ccaggagccg 60 gtgagaagcg cagtcggggg cacggggatg agctcagggg cctctagaaa gagctgggac 120 cctgggaacc cctggcctcc aggtagtctc aggagagcta ctcggggtcg ggcttgggga 180 gaggaggagc gggggtgagg caagcagcag gggactggac ctgggaaggg ctgggcagca 240 gagacgaccc gacccgctag aaggtggggt ggggagagca gctggactgg gatgtaagcc 300 atagcaggac tccacgagtt gtcactatca tttatcgagc acctactggg tgtccccagt 360 gtcctcagat ctccataact ggggagccag gggcagcgac acggtagcta gccgtcgatt 420 ggagaacttt aaaatgagga ctgaattagc tcataaatgg aacacggcgc ttaactgtga 480 ggttggagct tagaatgtga agggagaatg aggaatgcga gactgggact gagatggaac 540 cggcggtggg gagggggtgg ggggatggaa tttgaacccc gggagaggaa gatggaattt 600 tctatggagg ccgacctggg gatggggaga taagagaaga 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agccctgcct 1500 ggggcacaca aggacactca atacatgctt ttccgctggg cgcggtggct cacccctgta 1560 atcccagcac tttgggaggc caaggtggga ggatcacttg agcccaggag ttcaacacca 1620 gcctgggcaa catagtgaga ccctgtctct actaaaaata caaaaattag ccaggcatgg 1680 tgccacacac ctgtgctctc agctactcag gaggctgagg caggaggatc gcttgagccc 1740 agaaggtcaa ggttgcagtg aaccatgttc aggccgctgc actccagcct gggtgacaga 1800 gcaagaccct gtttataaat acataatgct ttccaagtga ttaaaccgac tcccccctca 1860 ccctgcccac catggctcca aagaagcatt tgtggagcac cttctgtgtg cccctaggta 1920 ctagatgcct ggacggggtc agaaggaccc tgacccacct tgaacttgtt ccacacagga 1980 tgccaggcca aggtggagca agcggtggag acagagccgg agcccgagct gcgccagcag 2040 accgagtggc agagcggcca gcgctgggaa ctggcactgg gtcgcttttg ggattacctg 2100 cgctgggtgc agacactgtc tgagcaggtg caggaggagc tgctcagctc ccaggtcacc 2160 caggaactga ggtgagtgtc cccatcctgg cccttgaccc tcctggtggg cggctatacc 2220 tccccaggtc caggtttcat tctgcccctg tcgctaagtc ttggggggcc tgggtctctg 2280 ctggttctag cttcctcttc ccatttctga ctcctggctt tagctctctg gaattctctc 2340 tctcagcttt gtctctctct cttcccttct gactcagtct ctcacactcg tcctggctct 2400 gtctctgtcc ttccctagct cttttatata gagacagaga gatggggtct cactgtgttg 2460 cccaggctgg tcttgaactt ctgggctcaa gcgatcctcc cgcctcggcc tcccaaagtg 2520 ctgggattag aggcatgagc caccttgccc ggcctcctag ctccttcttc gtctctgcct 2580 ctgccctctg catctgctct ctgcatctgt ctctgtctcc ttctctcggc ctctgccccg 2640 ttccttctct ccctcttggg tctctctggc tcatccccat ctcgcccgcc ccatcccagc 2700 ccttctcccc gcctcccact gtgcgacacc ctcccgccct ctcggccgca gggcgctgat 2760 ggacgagacc atgaaggagt tgaaggccta caaatcggaa ctggaggaac aactgacccc 2820 ggtggcggag gagacgcggg cacggctgtc caaggagctg caggcggcgc aggcccggct 2880 gggcgcggac atggaggacg tgtgcggccg cctggtgcag taccgcggcg aggtgcaggc 2940 catgctcggc cagagcaccg aggagctgcg ggtgcgcctc gcctcccacc tgcgcaagct 3000 gcgtaagcgg ctcctccgcg atgccgatga cctgcagaag cgcctggcag tgtaccaggc 3060 cggggcccgc gagggcgccg agcgcggcct cagcgccatc cgcgagcgcc tggggcccct 3120 ggtggaacag ggccgcgtgc gggccgccac tgtgggctcc ctggccggcc agccgctaca 3180 ggagcgggcc caggcctggg gcgagcggct gcgcgcgcgg atggaggaga tgggcagccg 3240 gacccgcgac cgcctggacg aggtgaagga gcaggtggcg gaggtgcgcg ccaagctgga 3300 ggagcaggcc cagcagatac gcctgcaggc cgaggccttc caggcccgcc tcaagagctg 3360 gttcgagccc ctggtggaag acatgcagcg ccagtgggcc gggctggtgg agaaggtgca 3420 ggctgccgtg ggcaccagcg ccgcccctgt gcccagcgac aatcactgaa cgccgaagcc 3480 tgcagccatg cgaccccacg ccaccccgtg cctcctgcct ccgcgcagcc tgcagcggga 3540 gaccctgtcc ccgccccagc cgtcctcctg gggtggaccc tagtttaata aagattcacc 3600 aagtttcacg ca 3612 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 112C(112FCW-1) <400> 2 cgcggacatg gaggacgagc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 112C(112FCW-2) <400> 3 cgcggacatg gaggacgttc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 112C(112FCW-3) <400> 4 ggcgcggaca tggaggacgt tc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 112T(112FTW-1) <400> 5 atgccgatga cctgcagaat t 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 112T(112FTW-2) <400> 6 ggcgcggaca tggaggacgt tt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 112T(112FTW-3) <400> 7 ggcgcggaca tggaggacgt tt 22 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 112 R(112R) <400> 8 cagcttgcgc aggtgggag 19 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 158C(158FCW-1) <400> 9 cgatgccgat gacctgcaga tgc 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 158C(158FCW-2) <400> 10 atgccgatga cctgcagaat c 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 158C(158FCW-3) <400> 11 gcgatgccga tgacctgcag aatc 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 158T(158FTW-1) <400> 12 cgatgccgat gacctgcaga tgt 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 158T(158FTW-2) <400> 13 atgccgatga cctgcagaat t 21 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 158T(158FTW-3) <400> 14 gcgatgccga tgacctgcag aatt 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 158R(158R) <400> 15 cggctgccca tctcctccat 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 112 probe(112Pr) <400> 16 ctggtgcagt accgcggcga ggt 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoE 158 probe(158Pr) <400> 17 cccgcacgcg gccctgttcc acc 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC(GF) <400> 18 tggcatggcc ttccgtgtcc 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC(GR) <400> 19 cgacgcctgc ttcaccacct tc 22 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPC(GPr) <400> 20 cagcttgcgc aggtgggag 19

Claims

서열번호 4 및 7로 구성된 112 SNP 판별용 정방향 프라이머, 서열번호 8로 구성된 112 SNP 판별용 역방향 프라이머 및 서열번호 16으로 구성된 112 SNP 판별용 프로브를 포함하는 사람의 ApoE 유전자 내 SNP 판별용 키트.
제 1항에 있어서,
서열번호 9 및 12로 구성된 158 SNP 판별용 정방향 프라이머, 서열번호 15로 구성된 158 SNP 판별용 역방향 프라이머 및 서열번호 17로 구성된 158 SNP 판별용 프로브를 추가로 포함하는 사람의 ApoE 유전자 내 SNP 판별용 키트.
제 1항에 있어서,
서열번호 2, 3, 5 및 6으로 이루어진 112 SNP 판별용 정방향 프라이머와 서열번호 10, 11, 13 및 14로 이루어진 158 SNP 판별용 역방향 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 한 종 이상의 프라이머를 추가로 포함하는 사람의 ApoE 유전자 내 SNP 판별용 키트.
제 2항에 있어서,
서열번호 2, 3, 5 및 6으로 이루어진 112 SNP 판별용 정방향 프라이머와 서열번호 10, 11, 13 및 14로 이루어진 158 SNP 판별용 역방향 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 한 종 이상의 프라이머를 추가로 포함하는 사람의 ApoE 유전자 내 SNP 판별용 키트.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 18로 이루어진 IPC 정방향 프라이머, 서열번호 19로 이루어진 IPC 역방향 프라이머 및 서열번호 20으로 이루어진 IPC 프로브를 추가로 포함하는 사람의 ApoE 유전자 내 SNP 판별용 키트.
1) 검사 대상의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
2) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 키트를 이용하여 단계 1)에서 분리한 게놈 DNA상에 존재하는 다형성 부위를 검출하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 검출된 다형성 부위의 유무를 비교하는 단계;
를 포함하는, 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별방법.
1) 검사 대상의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
2) 제 5항의 키트를 이용하여 단계 1)에서 분리한 게놈 DNA상에 존재하는 다형성 부위를 검출하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 검출된 다형성 부위의 유무를 비교하는 단계;
를 포함하는, 사람 ApoE 유전자의 단일 염기다형성 판별방법.
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