KR101520502B1 - 돼지의 단일뉴클레오타이드다형성 마커 및 이를 이용한 국내산 돈육의 원산지 판별방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 국내산 돈육의 원산지 판별에 유용하게 이용될 수 있는 단일뉴클레오타이드다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 마커, 이를 이용한 국내산 돈육의 원산지 판별 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 단일뉴클레오타이드 변이에 의한 SNP 마커를 사용하면 돈육 제품의 원산지를 추적할 수 있도록 개별 돼지의 고유한 DNA 지문 정보를 생성할 수 있을 뿐만 아니라 이를 통해 모돈과 웅돈을 식별하여 농장원산지를 확인할 수 있고, 돼지의 생산으로부터 돈육제품으로의 소비까지 이력 추적이 가능한 효과가 있다.

단일뉴클레오타이드다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 마커, 국내산 돈육, 원산지 판별

Description

돼지의 단일뉴클레오타이드다형성 마커 및 이를 이용한 국내산 돈육의 원산지 판별방법{Single Nucleotide Polymorphism Markers in Swine and Method for Determination of Domestic Pork Origin by Using the Same}

본 발명은 돼지의 단일뉴클레오타이드다형성 마커 및 이를 이용한 국내산 돈육의 원산지 판별방법에 관한 것이다.

가축에 있어서 개체의 확인이나 혈통관계의 정확한 정보를 제공하기 위해서 DNA 마커를 이용하는 연구가 국내외적으로 이루어지고 있다. 기존에는 초위성체 (Microsatellite) 마커를 이용하여 친자감별 및 개체추적이 이루어 졌으나 고가의 분석가격과 판독하는 과정에서 높은 에러율이 문제점으로 부각이 되고 있다.

하지만 최근 연구 결과에 따르면 단일염기다형(SNP) 마커들을 이용하여 유전자형을 적은 비용으로 대량 분석하는 것이 가능하여 이를 축산물의 이력추적이나 원산지 식별에 적용하고 있다 (Anderson and Garza, 2006; Rohrer er al., 2007; Baruch and Weller, 2008). 또한 2009년 Takeshi Honda 는 소에서 모의실험을 수행 하였는데 유용한 단일염기다형마커들 50개를 선발 (MAF:q, 0.25≤q≤0.35) 하여 양방향교배의 소 집단에서 98 ~ 99% 의 친자감별 추정가를 제시하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 돼지집단에서 51 개의 신규 단일뉴클레오타이드다형성 마커를 발견하고 이를 이용하여 개체식별을 위한 효율성 검증을 수행하였으며, 돈육의 원산지 식별을 위해 상기 51개의 마커를 적용한 결과 혈통관계를 정확하게 예측할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지의 단일뉴클레오타이드다형성 마커를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 이용한 국내산 돈육의 원산지 판별방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면 에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열의 264번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 2 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 3 서열의 496번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 4 서열의 219번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 5 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 6 서열의 290번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 7 서열의 267번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 8 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 9 서열의 370번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 10 서열의 117번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 11 서열의 171번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 12 서열의 143번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 13 서열의 196번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 14 서열의 295번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 15 서열의 228번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 16 서열의 143번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 17 서열의 131번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 18 서열의 423번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 19 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 20 서열의 230번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 21 서열의 247번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 22 서열의 225번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 23 서열의 384번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 24 서열의 431번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 25 서열의 272번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 26 서열의 306번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 27 서열의 327번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 28 서열의 344번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 29 서열의 109번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 30 서열의 349번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 31 서열의 115번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 32 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 33 서열의 411번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 34 서열의 198번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 35 서열의 171번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 36 서열의 378번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 37 서열의 237번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 38 서열의 239번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 39 서열의 61번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 40 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 41 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 42 서열의 215번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 43 서열의 269번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 44 서열의 290번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 45 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 46 서열의 58번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 47 서열의 263번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 48 서열의 184번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 49 서열의 171번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 50 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 또는 서열목록 제 51 서열의 175번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 돈육의 원산지 판별에 유용한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명자들은 돼지집단에서 51 개의 신규 단일뉴클레오타이드다형성 마커를 발견하고 이를 이용하여 개체식별을 위한 효율성 검증을 수행하였으며, 돈육의 원산지식별을 위해 상기 51개의 마커를 적용한 결과 혈통관계를 정확하게 예측할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 SNP 마커는 돼지(swine)에 적용되며, 가장 바람직하게는 국내산 돼지에 적용된다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 용어 "핵산분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990))

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 돈육의 원산지를 판별하는 방법을 제공한다: (a) 원산지를 추적하고자 하는 돈육에서 핵산분자를 분리하는 단계; (b) 상기 제 1 항에 기재된 서열목록 제 1 서열 내지 제 51 서열의 상기 지정된 위치의 뉴클레오타이드에 해당하는 단일뉴클레오타이드다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)의 마커의 염기타입을 확인하여 데이터 베이스에 저장하는 단계; 및 (c) 이미 저장되어 있는 부모의 마커를 이용하여 돈육의 원산지를 분석하는 단계.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산분자는 돈육의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻는다.

본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Rogers & Bendich (1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다 (참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 식물체로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브 는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 서열목록 제 1 서열 내지 제 51 서열 중 어느 하나의 서열의 SNP 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 유전자 증폭은 본 발명의 SNP 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍(primer pair)을 기본적으로 이용한다.

본 발명의 명세서에서 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭 (참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822)), 리가아제 체인 반응 (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응 (Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어 체인 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다. 증폭기술이 적용되는 경우에, 본 발명의 SNP 염기를 확인하기 위해 적합한 프라이머를 디자인하는 것이 중요하다. PCR에 의한 증폭 반응의 조건 및 사용되는 시약과 효소는 당업계에서 통상적으로 공지된 것을 사 용할 수 있다.

이상에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명은 국내산 돈육의 원산지 판별에 유용하게 이용될 수 있는 단일뉴클레오타이드다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 마커, 이를 이용한 국내산 돈육의 원산지 판별 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 단일뉴클레오타이드 변이에 의한 SNP 마커를 사용하면 돈육 제품의 원산지를 추적할 수 있도록 개별 돼지의 고유한 DNA 지문 정보를 생성할 수 있을 뿐만 아니라 이를 통해 모돈과 웅돈을 식별하여 농장원산지를 확인할 수 있고, 돼지의 생산으로부터 돈육제품으로의 소비까지 이력 추적이 가능한 효과가 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 돼지의 개체식별과 혈통추정에 이용할 DNA 마커 contents 의 효율성 분석

가축의 개체식별과 혈통추정을 이용할 효육적인 DNA 마커 선택은 마커들간의 독립성과 Hardy-Weinberg 평형을 전제 조건으로 한다. 이 두가지 조건을 만족시켜야만이 친자 감별의 모의 실험과 실제 자료의 친자 감별 분석 결과를 통계량으로 나타내는 최우도 값 또는 LOD값이 의미가 있다. 하지만 많은 마커를 수행해야 할 경우 어떤 마커들간에는 동일 염색체에 가까운 거리에 위치하여 독립적이지 못하며, 자료수가 작을 경우 또는 해당 마커 특성에 따라 Hardy-Weinberg를 만족시키지 못하는 경우가 있다. 이러한 경우 친자 감별 분석 수행에 앞서, 미리 Hardy-Weinberg 평형 조건을 만족시키거나 서로 독립적인 마커를 선별해야만 돼지의 친자감별에 이용할 수 DNA 마커 Contents 를 구축 할 수 있을 것이다.

실시예 2. 가축의 친자추정에 이용할 효육적인 DNA 마커 선택은 마커들간의 다형성 정보 분석을 위해 Likelihood method 적용(Barrett JC et al., 2005).

2-1. 하디-와인버그 평형 ( HWE ) 검증

하디-와인버그 평형검사 목적은 실험에 사용된 시료의 선별이 잘 이루어 져있는지 또는 집단의 유전자형 또는 유전자형의 빈도가 일정하게 유지되고 있는지를 검사하기 위해 수행한다. 또한 무작위적으로 교배를 하는 큰 집단에서는 유전자형 빈도를 변화시키는 요소가 없으면, 집단의 유전형 빈도 및 유전자형 빈도는 세대가 바뀌어도 변하지 않고 일정하게 유지된다는 법칙으로 유전자형 빈도를 이용하여 유전자형 빈도를 설명 할 수 있다.

하디와인버그 평형상태의 기대값

MM = p² x N; MN = ²pq x N; NN = q² x N

MM, MN, NN: 각각에 해당하는 유전자형

실제로 관측된 값과 하디와인버그 평형상태에 있을 때의 기댓값과의 차이는 χ² 검증방법을 이용하여 평가한다.

χ² = ∑((관측값 - 기댓값)²/기대값

이 값은 χ² 분포표에서 자유도가 1일 때 유의수준 1%에 해당하는 F-value값이 3.84 (P-value <0.01) 보다 작으면 유의적이지 않음을 알수 있으며, 즉, 관측값과 기댓값 사이에는 유의적인 차이가 없므로 집단의 하디와인버그 평형을 평가 할 수 있다.

2-2. 이형접합성 (heterozygosity) 검증

특정한 좌위에서 유전변이의 정도를 알아보는 가장 간단한 방법은 이형접합성(heterozygosity) 정도를 측정하는것이다. Hetrozygosity 는 특정 좌위에 대해 무작위적으로 선정된 사람의 유전자형이 이형접합(hterozygous)일 확률로 하디와인버그 평형 상태를 가정했을때 heterozygosity, H는 다음과 같이 구할 수 있다.

H = 1 - p² -q² = 2p(1-p)

위 식은 SNP 와 같은 bi-allele 마커의 경우 변환된 식으로 SNP 마커의 유전자형 빈도를 각각 p, q (q=1-q) 라고 한다.

일반적으로 heterozygosity가 높은 마커일수록 정보력이 높은 (informative) 마커라고 할 수 있다. 하기 [표 1]에서 나타난 것처럼 본 특허에서 개발한 SNP 마커는 유전자형이 집단에 높은 다형성정보지수를 관찰할 수 있었다.

[표 1] 돼지에서 개체식별 및 백분율 테스트에 사용한 마커들

실시예 3. 가축의 친자추정을 이용할 효육적인 DNA 마커 선택은 마커들간의 독립성 분석을 위해 Stephens method 적용 (Stephens er al., 2001).

마커들 간의 독립성을 측정하는 방법으로는 가장 많이 쓰이는 2가지 방법인 D' 과 r² 값을 사용하는 것이다. 두 가지 측정치 모두 0 (no linkage)에서 1(complete linkage) 사이의 값을 갖게 된다.

1)〔D'〕- D prime

A₁B₁ = p₁ x q₁

A₁B₂ = p₁ x q₂

A₂B₁ = p₂ x q₁

A₂B₂ = p₂ x q₂

A, B: 각각의 유전자

p_1, q_1, p_2, q₂; 각각의 대립유전자

D 값을 구하는 공식은 다음과 같다.

D = P₁₁P₂₂ - P₁₂P₂₁

만약 두 마커가 완벽한 연관된 형태라면 D 값은 0 을 취한다. 하지만 연관된 정도는 그 외의 값을 취하며 일반적으로 D 보다 더 많이 사용하는 측정치에는 D' 이 있는 데 그 식은 아래와 같다.

D' = D/D_max,

D_max = min(p¹q²,p²q¹), if D>0

max(-p¹,q¹,-p²q²), if D<0

D_max; D의 최대값을 나타낸다.

2)r² - r-square

마커간의 연관성 및 독립성 검증으로 측정할 수 있는 다른 방법은 r² (상관관계)를 이용한 방법이 있는데 두 마커간의 통계적인 상관성(correlation)이 얼마나 있느냐를 나타내는 척도로서 다음과 같이 구할 수 있다.

r² =

p¹q²,p²q¹; 각각의 대립유전자를 의미한다.

표 2에서 나타난 것처럼 각각의 마커간의 연관성이 있는 마커는 하나도 발견할 수 없었다(r2 > 0.3).

[표 2] 돼지 51개의 SNP 마커간의 상관관계

실시예 4. 51개의 SNP 마커들을 적용하여 돼지집단에서 친자감별추정 (1세대와 2세대).

4-1. 친자 추정 유전자형 분석

1세대 자손과 2세대의 친자를 추정하기 위해 유전자형을 분석을 하였으며 DNA 마커를 이용한 친자감별 프로그램으로서, 현재 널리 사용하고 있는 CERVUS 3.0 프로그램은() 를 이용하여 분석을 하였다.

4-2. 생물학적 통계분석

Botstein method를 이용하여 각 마커의 PIC 값을 다음과 같이 계산하였다.

PIC =1-∑ni=1pi2-2∑n-1i=∑nj=I+1pi+2pj2

pi, pj 는 각각 "1" 와 "2" 의 대립유전자가 나타나는 확률이며 n은 대립유전자의 개수이다.

친자감별시 확률적인 표현을 위해서 Aickin method 를 이용하여 paternity index (PI) 및 probability of paternity (PP) 를 사용하였으며 계산방법은 다음과 같다.

1) Statistical frequency (SF): ∂

2) Paternity Index (PI) or Likelyhood Ratio (LR): β/∂

3) Probability of Paternity (PP): [β/(β+∂)] x 100(%)

이 경우 SF는 전체 집단에서 무작위로 개체를 선택했을 때 부계가 될 수 있는 확률(∂) 이다. PI 혹은 LR 은 무작위로 선택한 개체가 부계일 확률(β)에 대하여 생물학적 부계로 추정되고 있는 개체가 친부일 확률(β)의 비이다(β/∂). PP 는 PI 를 백분율로 표현한 것이다.

<통계요약>

위의 통계적 결과로 나타나는 신뢰구간 95% ~ 100%를 유의 구간으로 두었고 1세대 자손 총 62두의 유전자형들은 분석을 통해 찾은 아비정보와 어미정보의 유전자형 일치도는 100%를 나타내었다. 원래의 귀표에 의해 사전에 알고 있는 1세대와 2세대의 혈통관계를 51 개의 단일염기다형의 통계적 분석을 통해 추정한 혈통관계를 비교한 결과 모두 일치하는 것을 관찰할 수 있었다.

실시예 5. 51개의 SNP 마커들을 적용하여 돼지집단에서 친자감별추정 (2세대와 3세대).

5-1. 2세대 자손과 3세대의 친자를 추정하기 위한 유전자형 분석

2세대 자손과 3세대의 친자를 추정하기 위해 유전자형을 분석을 하였으며 DNA 마커를 이용한 친자감별 프로그램으로서, 현재 널리 사용하고 있는 CERVUS 3.0 프로그램은 () 를 이용하여 분석을 하였다.

<Intact pedigree output file>

Offspring ID; 자손의 개체 ID

Typed loci: 대상 개체에서 유전자형 값이 기록된 마커 수

5-2. 생물학적 통계분석

Botstein method를 이용하여 각 마커의 PIC 값을 다음과 같이 계산하였다.

PIC =1-∑ni=1pi2-2∑n-1i=∑nj=I+1pi+2pj2

pi, pj 는 각각 "1" 와 "2" 의 대립유전자가 나타나는 확률이며 n은 대립유 전자의 개수이다.

친자감별시 확률적인 표현을 위해서 Aickin method를 이용하여 paternity index(PI) 및 probability of paternity(PP) 를 사용하였으며 계산방법은 다음과 같다.

(1) Statistical frequency (SF): ∂

(2) Paternity Index (PI) or Likelyhood Ratio (LR): β/∂

(3) Probability of Paternity (PP): [β/(β+∂)] x 100(%)

이 경우 SF는 전체 집단에서 무작위로 개체를 선택했을 때 부견이 될 수 있는 확률(∂) 이다. PI 혹은 LR은 무작위로 선택한 개체가 부견일 확률(β)에 대하여 생물학적 부경으로 추정되고 있는 개체가 친부일 확률(β)의 비이다(β/∂). PP 는 PI 를 백분율로 표현한 것이다.

<통계 요약>

위의 통계적 결과로 나타나는 신뢰구간 95% - 100%를 유의구간으로 두었고 2 세대 자손들 총 346두의 유전자형들은 분석을 통해 찾은 아비정보와 어미정보의 유전자형 일치도는 100% 일때 314두로 나타내었고, 95% 이상 일치할 때는 아비정보 어미정보 모두 346두로 친자를 추정함을 보였다. 통계적 분석을 통하여 51개의 단일염기 다형마커들을 이용하여 혈연관계를 추정할 수 있는 능력은 98.121~ 에서 98.463%의 친자를 식별률을 나타내었다.

<통계 요약>

위의 통계적 분석결과 51개의 마커를 이용하여 아비정보와 어미정보를 모르는 자손들의 부모를 추정 할 수 있는 능력은 거의 100% 에 흡사하게 나왔으며 이결과는 기존에 보고된 결과 보다 높은 추정력을 보였다.

실시예 6. PCR 프라이머(primer)

본 발명의 SNP 분석에 사용된 PCR 프라이머의 뉴클레오타이드 서열에 대한 정보는 다음과 같다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Single Nucleotide Polymorphism Markers in Swine and Method for Determination of Demestic Pork Origin by Using the Same <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 358 <212> DNA <213> Pig <400> 1 ttcacaggcg atgcctatgt catcctgaag acggtgcagc tgaggaacgg gaacctgcag 60 tatgacctcc actactggct gggtgaggct ggcccccacc ccrgtccctc cacctccacc 120 ccagcccctc tgctgcagag cacagacctt tgagtcatgg tctccaggaa gcgcccatga 180 gaattacggg actgttgagc atcaagtgtg tgccaggccc ttggttatgt gttcccaaga 240 ctctagagcc acctgcccaa gttyagactt cagctctgcc ctttggcaag atatccagtg 300 tctctgtgaa gtggacatga tgatcgcacc agaccacctc ataggactgt tgtgaggg 358 <210> 2 <211> 470 <212> DNA <213> Pig <400> 2 gagaaagtcc agactcggct ggaggagacc caggcgctgc tgcggaagaa ggagaagtca 60 ggcaccttcc cgggcccctg ctycctgcac ccccctcatr ccagcagctc cctgcctcct 120 agcccaggcc cttctgtagt aagactctcc ccagggggac agacttcctt ccccattgat 180 ggccccctgg tctcattgca rtyggagcct cttctgcccc tggctcctca ccagcagggc 240 tactccaagg acctgtcagg actgagaatt aggggcagag ccacggkgaa gggacactgc 300 ccaagcccgg gttctcttcc gcagagagtt tgaggagacg atggatgcac ttcaggctga 360 cattgaccag ctggaggcag agaaggcaga gttaaagcaa cggctgaaca gccagtccaa 420 gcgcacaatc gaggggatcc ggggaccccc tccctcgggt attgctaccc 470 <210> 3 <211> 551 <212> DNA <213> Pig <400> 3 gtgaggtaat cctttatttt cttacattca cttttgaagt attgacttcc tttttttagt 60 ctkttgtgat atatgcagat atcacccaaa gtaaaatgtr ttgagaaaat rgcagagctt 120 taacatctgc tgaacttctg aaattattaa ttttaatttt agattgtact gtgctctttt 180 gtttccacta ctgttgagca aasgaaaaca ccgatgtaga aaaaaagtag ctttgctcta 240 ttgtgcacta cagaatagta gagacacatt tttattagca gctgtggaaa aaaaatgttt 300 ctttttgtag gaggggcatt acagcagctt ttgtgccatc cctaatccat tttaaaattt 360 atttctaggg aaacagtgct cttaaaacat tggaaatgaa tccttgtacc ccaaataatg 420 ttgaggttct ggaaactcga tcagcagttc ctaaaataga agatacagaa ataatctctc 480 cagtagctga gcgtcyggaa gagagctctg atgcagaacc cgaaaaccat gtggttgtat 540 cctattgtcc a 551 <210> 4 <211> 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gtctttggat 420 gcaagtgtcc acgctagtcc tccacaacaa a 451 <210> 14 <211> 454 <212> DNA <213> Pig <400> 14 taccgcgtgc agggccgggc ggtgctgccc atccggtgga tggcctggga gtgtatcctc 60 atggtgagag gccctgccac aggcaggcag ggaggggagg ttaggggaac actkgctgcc 120 actcaaagct ctgggatctc attcagtcac ttgccttccc tggactgcat ttcctcatct 180 ctaaagtgaa ggtttggayc aatgctctat acgggagctc aagggactgg agaaagcagg 240 gaggtatggt gtgatgggaa agggtcttac aagagcgagt gtgagagatg gagtsagggc 300 agcagagagc aagagagata aggaggctag aaacagaagg caatgagttg ggagtcagga 360 ccagaaaatg ggggaaggat gggtagaaac gggaagcggt gaggactaga gccagagaag 420 agcagcaggc ttagtgggag agggccagct aagg 454 <210> 15 <211> 608 <212> DNA <213> pig <400> 15 ctgattccct ctctttctcc tataaactac tccgacctga aagttttcaa gagatgggac 60 atgggacatt gctctgctct cattaaggtg agacatatgg cagtctttct ctctgtcctt 120 ctttctgttc cacccagact tttttgatat gtcactcacg tatagcaaca tctcatcatt 180 cccagctata gctacatgtc agctcatggg ttcctctatc acaaaacyta agatctggaa 240 ggaactgatg gaaggaattg aaggtacatg 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17 <211> 393 <212> DNA <213> pig <400> 17 atgtagtcgg gggtgtagcc cattccaaag agggagctgg tgggatgcag gtggcarggc 60 atacctgtcc ggatattcac atactcccca attccctagg gaagagaccc agcaggtgac 120 cgcatcagca maacaccsca cacctggcca gctaccccat cccttcatac tgttttgaca 180 ccggcttttg ggggagcccc agggttgcag gctgtacaat gagaaaggaa gaactctgcc 240 ctggtacaaa gcatcaggcc aggaaggggc tcaccttgag cttggctgcc tggtgaaaat 300 argcagcaca gatacacttc ctgacaatgt cccagtcggt gccacacgag gccaggctca 360 tccgctgctg caccatgatg tccttgagct gaa 393 <210> 18 <211> 508 <212> DNA <213> pig <400> 18 gctggcggct gtgtggcatc gtgagctggg gcaccggctg tgccctggcc caaaagccag 60 gcgtctacac caaagtcagt gacttccggg agtggatctt ccaggccata aaggtgaaay 120 ttgagtccag atgggagcca gagggcagga gggtttggga caccaarcaa gaaagggggg 180 agttcccact gtggctcagt gggttaagaa cccaactaat agccatgaag atggatayta 240 gtttgatccc yggtctcact cagtgggtta aggatccaaa gttgcttcca cctgtggtgt 300 aggcyggcag ytgcagctcc aattcaaccc ctagcctggg agcttccata tgccacragt 360 gtagccctaa aataaatcaa 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tgaagacaca gcaaaagggg aacagatggg attcattctt 240 gtaacgtgaa ctctagaaat aatttctgga gcagtcgagt gtcttctccc tagacctccg 300 tttcctttaa ttcccaccct gagccaggca ccacacccca gacctctcac cggagataga 360 cctcagcgcg ggctgcmcca tggggattca ggggtggttc ctcttggccc tctccctgct 420 ggtggtagcg gaacttatag tgctggcagc gctgggctcc aggcagctgc tctgccagga 480 agat 484

Claims (2)

1. 서열목록 제 1 서열의 264번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 2 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 3 서열의 496번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 4 서열의 219번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 5 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 6 서열의 290번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 7 서열의 267번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 8 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 9 서열의 370번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 10 서열의 117번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 11 서열의 171번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 12 서열의 143번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 13 서열의 196번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 14 서열의 295번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 15 서열의 228번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 16 서열의 143번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 17 서열의 131번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 18 서열의 423번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 19 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 20 서열의 230번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 21 서열의 247번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 22 서열의 225번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 23 서열의 384번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 24 서열의 431번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 25 서열의 272번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 26 서열의 306번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 27 서열의 327번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 28 서열의 344번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 29 서열의 109번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 30 서열의 349번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 31 서열의 115번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 32 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 33 서열의 411번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 34 서열의 198번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 35 서열의 171번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 36 서열의 378번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 37 서열의 237번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 38 서열의 239번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 39 서열의 61번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 40 서열의 251번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 41 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 42 서열의 215번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 43 서열의 269번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 44 서열의 290번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 45 서열의 256번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 46 서열의 58번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 47 서열의 263번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 48 서열의 184번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 49 서열의 171번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 50 서열의 287번째 뉴클레오타이드, 및 서열목록 제 51 서열의 175번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 돈육의 원산지 판별에 유용한 조성물.
2. 다음의 단계를 포함하는 돈육의 원산지를 판별하는 방법:

   (a) 원산지를 추적하고자 하는 돈육에서 핵산분자를 분리하는 단계;

   (b) 상기 제 1 항에 기재된 서열목록 제 1 서열 내지 제 51 서열의 상기 지 정된 위치의 뉴클레오타이드에 해당하는 단일뉴클레오타이드다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)의 마커의 염기타입을 확인하여 데이터 베이스에 저장하는 단계; 및

   (c) 이미 저장되어 있는 부모의 마커를 이용하여 돈육의 원산지를 분석하는 단계.