KR20230061708A - 삽살개의 고관절 형질 판별용 마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 삽살개의 고관절 형질 판별용 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 마커로 삽살개의 고관절 관련 질병을 조기에 예측 또는 진단하여 고관절 질병에 대해 위험성이 없는 우수한 삽살개를 선발 및 육종하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

삽살개의 고관절 형질 판별용 마커 조성물 및 이의 용도{Marker composition for discriminating hip joint trait of Canis familiaris and uses thereof}

본 발명은 삽살개의 고관절 형질 판별용 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

개의 고관절 관련 질병은 체중을 지탱하는 동안 고관절이 이완되어 점차 손상되면서 결국 고관절 이형성증(고관절 탈구), 퇴행성 관절 질환, 골관절염 등으로 발전한다. 이러한 고관절 질병은 많은 개에서 문제가 되고 있으며, 특히 대형견에서 더욱 심하다. 개의 고관절 질병에 대한 가장 좋은 대처 방안은 조기 진단을 통해 선택적인 교배와 번식을 통해 질병의 발생률을 줄여나가는 것이다.

개의 고관절 상태를 평가하는 다양한 방법 중에서, 방사선 촬영을 통해 대퇴골두(caput ossis femoris)가 관골구(acetabulum)에서 이탈되는 정도를 측정하여 수치화한 DI(distraction index)라는 정량적 지표를 확인하는 방법이 널리 사용되고 있다. DI는 고관절에 대해 합격 또는 불학격을 판정하는 점수가 아니라 고관절의 이완성 정도를 나타내는 척도로, DI가 0에 가까울수록 팽팽한 고관절이고, 1에 가까울수록 고관절이 매우 느슨함을 의미한다.

한국의 대표적인 개 품종인 진돗개의 고관절 이형성증에 대한 이전 연구 결과에 따르면, 0.3 이하의 DI를 나타낸 고관절은 퇴행성 관절 변화의 가능성이 극히 미약하고, DI가 0.3 이상으로 증가하면 할수록 향후 퇴행성 관절 질환의 발생 가능성이 높아지며, DI가 0.7 이상이면 대부분의 개체에서 퇴행성 관절 질환이 진행된 것으로 알려져 있다. DI를 통해 고관절의 이완성을 평가하는 방법은 생후 4개월령 이상의 어린 개체에서도 사용할 수 있고, 특히 생후 6개월 이후에는 DI가 일정하게 유지되기 때문에 번식 관리에 보다 효과적으로 사용될 수 있다는 장점이 있다. DI와 퇴행성 관절 질환의 발생 가능성 간의 상관관계는 개의 품종에 따라 차이가 있으므로, 다양한 개 품종에 따른 연구가 필요하다.

한편, 한국등록특허 제1777161호에 고관절이형성증을 진단받은 질병군과 임상정 증상이 없는 정상군 간의 SNP에 기반한 '개의 고관절이형성증을 예측 또는 진단하기 위한 멀티플레스 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 예측 또는 진단 방법'이 개시되어 있으나, 고관절의 불안정성을 측정하는 지표인 DI(Distraction index)에 대해 통계적 유의성을 가지는 본 발명의 '삽살개의 고관절 형질 판별용 마커 조성물 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 한국 삽살개 204두의 시료를 수집하고 게노믹 DNA를 추출하여 Illumina Caine 170K SNP array를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석을 수행하였다. 수집된 SNP를 두 단계로 전장유전체연관분석(Genome-wide association study)을 수행한 결과, 고관절의 불안정성을 측정하는 지표인 DI(Distraction index)에 대해 통계적 유의성을 가지는 19개의 SNP 마커를 도출함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 각각 이루어진 19개의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 염기서열 중 26번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 삽살개 개체의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 각 26번째의 SNP 위치 염기의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질을 판별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 각각 이루어진 19개의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 염기서열 중 26번째에 위치한 SNP 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 프로브 및 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 SNP 마커는 기존의 영상검사와 DNA 유전자형 검사와 병행함으로써 검사 결과에서 나타날 수 있는 오류를 최소화하고 정확도를 향상시킬 수 있으며, 비용과 시간적 손실도 최소화시킬 수 있어 삽살개의 고관절 질병을 조기에 예측 또는 진단하는데 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 SNP 마커를 활용한 유전적 정보의 예측을 통해 고관절 질병에 대한 위험성이 없는 우수한 삽살개를 선발 및 육종하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 개의 고관절 이형성증을 측정하는 지표인 DI(Distraction index)에 대해 통계적 유의성을 가지는 SNP에 대한 p-value 값을 맨하탄 플롯(Manhattan plot)과 Q-Q 플롯으로 나타낸 그림이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 각각 이루어진 19개의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 염기서열 중 26번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 19는 각 염기서열의 26번째에 위치한 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 서열번호 1 내지 19는 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열이다. 용어 "다형성 서열(polymorphic sequence)"이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명에서 용어 "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않는 한 자연이 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 1 부터 19까지 모두 26번째로, 다형성 염기 정보는 표 2의 염기서열 정보에 [/]로 표시하였다.

본 발명의 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 고관절 관련 형질은 고관절의 불안정성을 측정하는 지표인 DI(Distraction index)일 수 있다. 상기 DI는 방사선 검사에서 확인된 고관절의 불안정성 정도를 수치화하여 나타낸 것으로, DI가 높을수록 고관절의 불안정성이 증가하여 고관절 이형성증의 발생률이 증가할 수 있음을 의미한다. 삽살개의 경우 DI 평균값(고관절 정상)은 0.5이고, DI 값이 0.7 이상일 경우에는 고관절 이형성증 발생률이 높다고 판단할 수 있다.

본 발명의 SNP 마커 조성물은 DI에 대해서 통계적 유의성을 가지는 19개의 SNP 마커를 포함하고 있는 것으로, 상기 19개의 SNP 마커를 동시에 이용하면 삽살개의 고관절 형질을 더욱 효율적으로 판별할 수 있다.

본 발명의 SNP 마커를 삽살개의 고관절 형질 판별에 이용할 수 있는 것은, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 26번째 염기(뉴클레오티드)의 유전자형이 A, 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 G, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 A, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 G, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 G, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 G, 서열번호 8로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 G, 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 T, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 G, 서열번호 11로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 G, 서열번호 12로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 A, 서열번호 13으로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 A, 서열번호 14로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 15로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 G, 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 A, 서열번호 17로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 G, 서열번호 18로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 A, 또는 서열번호 19로 표시되는 염기서열의 26번째 염기의 유전자형이 C로 확인될 경우, 고관절 정상과 상기 SNP 마커의 각 유전형이 통계적 유의성을 보였기 때문이다.

본 발명에 따른 삽살개의 고관절 형질 판별용 SNP를 구성하는 각 단일 SNP의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 8개 이상의 연속 염기이고, 더욱 바람직하게는 15개 이상의 연속 염기이며, 가장 바람직하게는 서열번호 1 내지 19의 각 염기서열이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 이루어진 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다. 프라이머의 제작은 당업계에 공지된 소프트웨어 또는 웹서비스를 통해 이루어질 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 삽살개의 고관절 형질 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있고, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

삽살개 개체의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 각 26번째의 SNP 위치 염기의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 삽살개 개체의 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료는 근육, 표피, 혈액 또는 털 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함한다.

분리된 DNA의 염기서열의 결정은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 디데옥시법에 의한 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나, SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 혼성화의 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA 만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으며, 그외 전기적 신호 검출방법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 각각 이루어진 19개의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 염기서열 중 26번째에 위치한 SNP 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 프로브를 제공한다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 매칭되거나 일부 미스매치로 실질적으로 매칭되는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오티드인 서열번호 1 내지 19의 각 26번째 위치의 뉴클레오티드를 포함하는 8 내지 100개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다.

일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에서 삽살개의 고관절 형질 판별용 마이크로어레이는 본 발명의 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다. "마이크로어레이"란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. 용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해서 상세하게 설명한다. 하기의 특정한 예시 및 실시예는 발명의 일부 구현예를 포함하는 것으로 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 여기에서 설명되는 특정 실시예로 제한되지 않고, 본 발명이 속한 기술 분야에 있어 통상의 기술자가 다양하게 구현할 수 있다는 것을 포함하는 것은 자명하다. 따라서 본 명세서에 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 실시예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예 1. 국내 삽살개 시료 수집

(재)한국삽살개재단으로부터 204두의 삽살개 시료를 수집하고, DNA를 추출하여 Illumina Caine 170K SNP array를 이용하여 제조사의 지시에 따라 SNP 분석을 실시하였다. 고관절 관련 형질로서 고관절의 불안정성을 측정하는 지표인 DI(Distraction index) 평가 결과를 수집하였다.

실시예 2. 유전자형 분석

삽살개를 대상으로 고밀도 Illumina Caine 170K SNPs 어레이를 이용하여 분석하였다. 각각의 SNP에 대하여 DI(Distraction index)와 전장연관분석(GWAS)을 수행하였다.

고관절 형질에 대하여 SNP 정보를 활용한 개체들간의 G-matrix(Genome relationship matrix)를 이용한 일반화선형혼합모형(Generalized Linear Mixed Model Association test)을 적용한 전장 유전체 연관분석을 실시하였다.

Y = Xb + Za + SNPp + e

[Y: 표현형 벡터, b: 고정효과로 y 절편, 성별(2), 월령, e: 잔차벡터, a: 임의 효과로 개체효과, p: SNP 효과 크기값(add=상가적)]

분석은 상용 animal model을 수행하는 R 4.1.0 프로그램(https://www.r-project.org/)을 구동하였다.

상기와 같은 연관분석을 통해 유의수준이 1×10^-4 이하인 p 값을 가진 SNP를 해당 형질과 통계적 유의도를 가진 연관성을 보인다고 판단하여 이를 선별하였다.

그 결과, DI에 대해 유의적인 SNP 19개를 확인하였으며(표 1 및 도 1), 상기 SNP의 염기서열 정보는 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 1에서 Estimate는 Minor allele를 기준으로 SNP 효과 크기값을 추정한 것으로 대립유전자 대체 효과(allele substitution effect)를 나타낸다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Marker composition for discriminating hip joint trait of Canis familiaris and uses thereof <130> PN21358 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 1 tgatcaagca attgcttttt cctcamtact tattaaaaat atttccttta t 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 2 tgttgaggat caaaaaaaat ccagarggtg cttatttcat aatttctata c 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 3 aactattggg cctatgtcaa aataaraagc ttctgcacaa tgaaggaaca a 51 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 4 tggaatgttg ctgctccctc cagagsagaa gtactttctc agatttggtt c 51 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 5 gactatattt gagaaaaata tatgcrtgaa tatatccaaa gagtactcct t 51 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 6 ttatattacc agaagtagaa ttgctmgggg ttatacagta gttctatttt t 51 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 7 cctggcaacc attaatctct ttactrtctc catagttttg ccttttctag g 51 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 8 gaggcaggaa tcaccacatt aagaarattt caaacagtaa caacgcaaaa c 51 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 9 tttaagggtc tgcttcctca tatgtwaaat gagagagtac ttgagttctc a 51 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 10 ttctcggatg ttagggaaag agctcrtatt ctgagcatag acatacggag a 51 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 11 gaaaagtagg ttcatgatat tgtgtrgaag taggattatt tgctttgcca t 51 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 12 gataagaggg gactatggca agttaraagc gctcatcaat agccggaaaa g 51 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 13 tccattaaaa aaagcacttg actcargttt tttttttttt ttaactgagg t 51 <210> 14 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 14 tccttattcc tttccaagtc tagctmgatt gcagagttaa gtttctgatt a 51 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 15 atatccataa attatcaaca caatgrgaaa tttggagagg agaggtcacc c 51 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 16 gtcacaggag tttctgtccc catagrgctg ggtcatgcac cctctcaaca a 51 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 17 gattcgatat gaaacaaaat ggacargtgc cataaaggaa aacccaagtg g 51 <210> 18 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 18 tataagtgaa gccttgtttt gatagratgc tttattacct gaaaatgatc a 51 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 19 atatccataa attatcaaca caatgrgaaa tttggagagg agaggtcacc c 51

Claims (8)

1. 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 각각 이루어진 19개의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 염기서열 중 26번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 SNP 마커 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 고관절 형질은 DI(Distraction index)인 것을 특징으로 하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 SNP 마커 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 SNP 마커 조성물.
4. 제1항에 기재된 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트.
5. 제4항의 프라이머 세트를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 키트.
6. 삽살개 개체의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 각 26번째의 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질을 판별하는 방법.
7. 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 각각 이루어진 19개의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 염기서열 중 26번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 프로브.
8. 제1항에 기재된 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 삽살개의 고관절 형질 판별용 마이크로어레이.

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