KR102064559B1

KR102064559B1 - 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 snp 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102064559B1
Application number: KR1020180114782A
Authority: KR
Inventors: 홍기창; 강지훈; 김준모
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2020-01-09
Also published as: KR20190034124A

Abstract

본 발명은 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 SNP 마커로서 제공하는 STAT2, MYF6 및 TFCP2L1 유전자로부터 유래된 단일염기다형성은 모돈의 생애총생산성 형질과 높은 연관성을 나타내고 있으므로, 본 발명의 SNP 마커를 이용하면 유전자 검사를 통해 모돈의 생애총생산성을 조기에 예측할 수 있는 이점이 있다. 따라서, 본 발명은 우수한 모돈 선별 및 종의 개량에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

모돈의 생애총생산성 형질 예측용 SNP 마커 및 이의 용도{Novle Single Nucleotide Polymorphisms Markers for Predicting Lifetime Production Ability Trait of Sow and Uses Thereof}

본 발명은 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

2012년 농림업생산액은 46조 3,571억원이며 농림업에서 축산은 3분의 1을 넘는 높은 비중(약 35%)을 차지하고 있으며, 축산중에서도 양돈은 약 5조 3,482억원으로 큰 비중을 차지하고 있다. 국내 양돈산업은 2003년까지 지속적으로 성장하여 사육두수가 1990년 이후 2배이상 증가했으며 급증가추세가 멈춘 2004년이후에도 꾸준히 유지하여 2013년 1분기에 사상 처음으로 1000만두를 넘겼으며, 2014년 현재 991만 마리를 기록하고 있다. 또한, 1 인당 돈육소비량은 꾸준히 높은 수치를 유지하고 있어(19.2kg, 2012년 농림수산식품부) 국내육류소비시장에서 가장 큰 부분(47%, 육류유통수출입협회 2012)을 차지하고 있다. 이와 같이 양돈산업은 우리 국민들의 주요한 단백질공급의 원천으로서 매우 중요한 의미를 가지고 있다.

세계 주요 양돈 국가의 돼지고기 생산비를 살펴보면, 캐나다가 도체를 기준으로 ㎏당 1,749원으로 가장 낮았으며, 미국이 1,763원, 덴마크와 네덜란드는 각각 2,226원과 2,237원이었다. 통계 자료에 따르면 우리나라의 돼지고기 생산비는 3,218원으로 미국의 1.8배에 달하였으며, 덴마크와 네덜란드 등 유럽 국가들에 비해서는 1.4-1.5배 수준에 이르는 것으로 나타났다. 따라서 국내 농축산업이 외국농산물의 잠식으로부터 국내 생산기반 유지를 위해서는 기술개발로 생산성 향상을 통한 가격경쟁력의 확보가 시급한 실정이다.

대한민국의 양돈 생산력과 수준은 선진국에 훨씬 미치지 못하는 수준이다. 선진국과 비교한 돼지고기 1kg 생산비용에서 볼 수 있듯이 우리나라는 타국에 비해 사료비와 고정비가 많이 차지하고 있다. 선진국의 5배 이상(덴마크 243원, 한국 1,291원으로 약 5.3배) 높은 고정비의 약 80%를 가축비가 차지하고 있으며, 이는 농장에서 도태된 모돈을 대체하는 신규모돈 도입비가 매우 높기 때문이다. 우리나라의 모돈 갱신율은 40%(대한양돈협회, 2011)이상으로, 연간 상시모돈 사육두수가 100만두라고 가정하였을 경우, 매년 40만두의 모돈이 도태되고 있는 실정이다. 이러한 가운데 신규모돈 도입비는 평균 900,000원(대한한돈협회, 2012)에 육박하여 농가에 부담을 주는 요인이 되고 있다. 또한 우리나라의 모돈은 평균 2.8산차에 도태되고 있는데, 이는 스웨덴 4.4산차, 미국과 일본 3.8산차 정도로 이용하고 있다는 점과 비교하였을 경우 1에서 많게는 1.5산이 적게 이용되고 있는 실정이다. 이는 저조한 번식능력(모돈당 연간 출하자돈수 MSY수치 덴마크 28두, 한국 18두;pig international 2013)과 맞물려 모돈이 평생 생산할 수 있는 자돈의 수인 생애총생산성에 있어서 크나큰 격차를 불러일으킨다(생애총 출하자돈수 스웨덴 44두 vs 한국 22두로 2배 차이). 저조한 번식능력, 1 cycle 이상 차이나는 이용산차, 도태 시 감수해야하는 높은 교체비용으로, 종합적으로 열등한 수준에 머물러 있음을 알 수 있다. 모돈은 산차가 거듭됨에 따라 적게 낳고, 자돈은 작고 약하며, 설상가상으로 우리나라 모돈은 전 산차에 거쳐 외국에 비해 저조한 수치를 보이고 있음을 알 수 있다. 고산차모돈 사용의 문제점에 대해서는 도 1에서도 알 수 있다.

우리나라의 종돈 개량을 위한 능력검정은 현재 산육 형질 위주로 이루어져있으며, 상대적으로 모돈의 장수 및 다산성에 대한 개량의 효과는 낮은편이다. 따라서 번식관련 형질에 대한 정의가 통일되지 못하여 이에 대한 정비가 시급한 실정이며, 전산화가 이루어지지 않은 종돈장들이 존재하므로 기록 관리 및 육종가 추정에 어려움이 있다. 따라서, 번식관련 형질들의 표준화된 측정 방법을 강구하고, 번식 성적의 전산화 및 올바른 유전능력 평가 체계를 구축하여야한다. 그러나 번식능력의 유전력은 10% 내외로 낮은 편이므로 단시일 내에 높은 개량 효과를 얻기 어려우며 유전적 연결이 가능한 개량 단위도 적은 편이다. 하지만 분자유전학 기법의 도입으로 기존의 통계유전학적인 방법에 의한 개량이 어려웠던 형질에 대한 개량이 이루어지고 있고, 그 결과로 덴마크에서는 20년 사이에 복당산자수를 3두 이상 끌어올렸다. 산자수에 있어서 눈부신 발전을 이룩한 덴마크 역시 최근 모돈의 이용성에 대해 연구필요성이 꾸준히 제기되고 있다. 기존 분자유전학적 기법도입으로 안한 개량은 모돈의 산차에 따른 번식능력 저하에 포커스를 두고 있지 않기 때문이다. 단순 산자능력 뿐 아니라 다산하는 번식능력의 지속성의 향상은 양돈산업에 있어서 파급효과가 훨씬 더 클 것으로 판단되며, 이러한 생애총생산성 형질 역시 분자유전학적기법을 통해 충분히 개량이 가능할 것으로 보인다.

따라서, 생애총생산성 형질은 양돈산업에서 중요한 번식 형질로서 모돈이 가지고 있는 포유자돈수가 적을 시 돼지 번식농장의 자돈 생산성이 저하되어서 전체적인 양돈산업의 경제성 저하를 초래하므로, 생애총생산성 형질은 양돈농가 및 종돈회사에게 매우 중요하면서도 개량하기 힘든 표현 형질이기에 유전자 검사를 통한 예측법 개발이 필요하다.

이에, 모돈의 생산성과 연결된 형질을 확인하는 연구는 매우 중요한 부분으로서, 지금까지 많은 후보 유전자들에 대한 맵핑(mapping)이 이루어졌고, 유전적 형질에 대한 연관성을 밝히려고 노력해 왔으나, 현재 실효성 있는 결과를 얻지 못하고 있으며, 특히, 본 발명의 STAT2, MYF6 및 TFCP2L1 유전자 내 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 예측 방법에 대한 언급은 없다.

이러한 상황하에서, 본 발명자들은 상술한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고, 모돈의 품질 개선을 판단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 모돈의 생애총생산성 형질을 예측할 수 있는 바이오마커(biomarker)로서 STAT2, MYF6 및 TFCP2L1 유전자들 좌위 내 단일염기다형성(SNPs)을 선별하였고, 궁극적으로 상기 SNP에 의해 생애총생산성이 높은 모돈을 조기에 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 STAT2, MYF6 및 TFCP2L1 유전자 내 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) 마커를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 마이크로어레이를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 모돈의 생애총생산성 형질 예측 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 생애총생산성 형질이 우수한 모돈의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) 마커 조성물을 제공하며, 상기 SNP 마커는, STAT2 유전자(signal transducer and activator of transcription 2, GeneID: 396923)에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80820161)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; MYF6 유전자(myogenic factor 6, GeneID: 397005)에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs340349360)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 TFCP2L1 유전자(transcription factor CP2 like 1, GeneID: 100519339)에 위치하는 SNP로서, 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드가 T 또는 C인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80897790)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용된 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에 사용된 용어 "다형성(polymorphism)"은, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위(polymorphic site) 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 명세서에 사용된 용어 "대립유전자(allele)"는, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

즉, 단일염기다형성(single-nucleotide polymorphism, SNP)은 집단 내에서 또는 개체 내의 대립유전자 사이에 특정 좌위의 염기의 변화가 나타나는 것을 의미하며, 구체적으로, 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG,AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population)내에서, SNP는 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(nonsynonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다. SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 때때로 표현형에 직접적인 영향을 미치며, 자동화된 유전자형 규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000). 따라서, 본 발명의 SNP 연구는 가축, 특히 모돈 육성 프로그램에서 중요하다.

본 발명에서, 상기 SNP 마커는 STAT2 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80820161)를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 1의 서열을 포함하는 서열일 수 있다.

또한, 상기 SNP 마커는 MYF6 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs340349360)를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서 서열번호 2의 서열을 포함하는 서열일 수 있다.

또한, 상기 SNP 마커는 TFCP2L1 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드가 T 또는 C인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80897790)를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서 서열번호 3의 서열을 포함하는 서열일 수 있다.

상기 SNP 마커는 그 개개로도 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 마커로서 유용하며, 상기 마커를 조합하여 마커 수를 많이 포함할수록 예측의 정확도가 높아질 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생애총생산성 형질은 장수성, 번식효율성, 생애총 총산자수, 생애총 실산자수, 생애총 이유자돈수, 연간환산 생애총 총산자수, 연간환산 생애총 실산자수, 생산수명 및 도태산차로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 형질이다.

상기 용어 "생애총생산성 형질"이란, 돼지, 바람직하게는 모돈의 생산성 상태를 나타내는 다양한 표현 형질을 의미하는데, 상기 표현 형질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 장수성, 번식효율성, 생애총 총산자수, 생애총 실산자수, 생애총 이유자돈수, 연간환산 생애총 총산자수, 연간환산 생애총 실산자수, 생산수명 및 도태산차이다.

따라서, 본 발명의 가장 큰 특징은 생애총생산성 형질 중 장수성, 번식효율성, 생애총 총산자수, 생애총 실산자수, 생애총 이유자돈수, 연간환산 생애총 총산자수, 연간환산 생애총 실산자수, 생산수명 및/또는 도태산차를 예측할 수 있는 유전자 좌위로서 STAT2, MYF6 및 TFCP2L1 유전자 내의 단일염기다형성을 분석하여 모돈의 경제성과 관련된 생애총생산성을 예측할 수 있는 지표를 제공하며, 이러한 유전자 변이를 이용하여 생애총생산성이 높은 모돈을 조기에 판별한다는 것이다.

따라서, 본 발명의 SNP는 모돈의 생애총생산성을 조기에 예측 및 평가할 수 있는 유전자 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있으며, 상기 모돈의 생애총생산성 예측용 유전자 마커는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 목적 폴리뉴클레오티드인 SNP 부위의 검출 또는 증폭을 언급하면서 사용된 용어 "검출 또는 증폭할 수 있는 제제"는, 폴리뉴클레오티드내 SNP가 포함된 다형성 부위(polymorphic site)에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 다형성 부위를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 SNP가 포함된 다형성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

즉, 본 발명의 SNP가 포함된 다형성 부위에 특이적으로 결합하여 증폭할 수 있는 한, 임의의 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 SNP 마커에 결합하여 인식하는 데 사용되는 프로브는 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종(hybrid) 형태일 수 있다. 또한, 육안으로 인식가능하도록 하기 위해 프로브의 5’또는 3’ 말단에 형광 표지인자, 방사선 표지 인자 등을 추가로 부착할 수 있다.

본 발명의 용어 “프라이머”란, 짧은 자유 3’말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다.

본 명세서에서 사용된 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 타겟 서열의 증폭 또는 검출과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

또한, 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로는, 프로브는 혼성화의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 보다 구체적으로, 프로브는 디옥시리보뉴클레오타이드 이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 생애총생산성 형질은 5 번 염색체에 해당하는 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 포함된 2 종 SNP의 유전자형 및/또는 15 번 염색체에 해당하는 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 포함된 1 종 SNP의 유전자형에 의해 영향을 받는다.

상기 SNP의 유전자형은 STAT2 유전자에 위치하는 SNP 마커로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80820161)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; MYF6 유전자에 위치하는 SNP 마커로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs340349360)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 TFCP2L1 유전자에 위치하는 SNP 마커로서, 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드가 T 또는 C인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80897790)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 생애총생산성 형질은 STAT2 유전자에 위치하는 SNP로서, 상기 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드가 G인 SNP 부위 (GenBank SNP 데이터베이스 rs80820161)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 모돈이 일반 모돈 개체보다도 높은 수준의 생애총생산성을 나타내는 것을 확인하였으며, 이는 상기 개체가 상대적으로 우수한 형질을 갖는 모돈인 것으로 판단할 수 있다.

또한, 상기 생애총생산성 형질은 MYF6 유전자에 위치하는 SNP로서, 상기 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드가 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs340349360)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 모돈이 일반 모돈 개체보다도 높은 수준의 생애총생산성을 나타내는 것을 확인하였으며, 이는 상기 개체가 상대적으로 우수한 형질을 갖는 모돈인 것으로 판단할 수 있다.

또한, 상기 생애총생산성 형질은 TFCP2L1 유전자에 위치하는 SNP로서, 상기 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드가 T인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80897790)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 모돈이 일반 모돈 개체보다도 높은 수준의 생애총생산성을 나타내는 것을 확인하였으며, 이는 상기 개체가 상대적으로 우수한 형질을 갖는 모돈인 것으로 판단할 수 있다.

즉, 상술한 상기 모돈의 생애총생산성 우수 여부를 판단함에 있어서 SNP 부위에서 바람직하게는 rs80820161의 염기가 G; rs340349360의 염기가 A; 또는 rs80897790의 염기가 T일 경우 모돈의 생애총생산성이 우수한 것으로 판단할 수 있다.

또한, 추가적으로 rs80820161의 염기가 A; rs340349360의 염기가 C; 또는 rs80897790의 염기가 C일 경우 모돈의 생애총생산성이 우수하지 않은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명에서, 상기 형질의 수준을 판단하는 대상이 되는 돼지는 특별히 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 마이크로어레이 또는 키트를 제공한다.

구체적으로, 상기 키트는 이에 제한되지는 않으나 PCR(Polymerase Chain Reaction) 키트, DNA 분석용 (예, DNA 칩) 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 5 종 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 모돈의 생애총생산성 형질 수준을 판단할 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 일배체형의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 모돈의 생애총생산성 수준 판단용 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다. 상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 구체적인 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌 및 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이 또는 키트는 상술한 조성물을 이용하므로, 상술한 바와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성(SNP) 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 SNP 마커의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 모돈의 생애총생산성 형질 예측 방법을 제공하며, 상기 방법에서, 상기 (b) 단계의 SNP 마커는, 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상이다: STAT2 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80820161)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; MYF6 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs340349360)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 TFCP2L1 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드가 T 또는 C인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80897790)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계에서 SNP 마커인 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드의 유전자형이 G 또는 A인지 확인하고, 바람직하게는 G인 경우 높은 생애총생산성 형질을 갖는 모돈으로 예측한다.

또한, 상기 (c) 단계에서 SNP 마커인 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C 또는 A인지 확인하고, 바람직하게는 A인 경우 높은 생애총생산성 형질을 갖는 모돈으로 예측한다.

또한, 상기 (c) 단계에서 SNP 마커인 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T 또는 C인지 확인하고, 바람직하게는 T인 경우 높은 생애총생산성 형질을 갖는 모돈으로 예측한다.

이때, 상기 분리된 시료의 DNA는 개체로부터 분리된 시료로부터 수득할 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란, 생애총생산성 형질 수준을 확인하고자 하는 대상인 모돈을 의미하며, 상기 모돈으로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP의 다형성 부위의 유전자형을 분석함으로써 상기 돼지의 질형질 수준을 판단할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

상기 (a) 단계의 DNA로부터 상기 SNP의 다형성 부위를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (b) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(minisequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 변이 부위를 포함하는 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다. 이와 같은 변이 부위의 염기를 결정하는 것은 바람직하게는 DNA 칩을 통해 수행할 수 있다.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP의 유전적 변이를 검출할 수 있다.

본 발명의 방법은 상술한 SNP 마커를 이용하므로, 상술한 바와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 모돈의 생애총생산성 형질에 관여하는 단일염기다형성(SNP) 형질을 고정시키는 단계를 포함하는, 생애총생산성 형질이 우수한 모돈의 제조 방법을 제공하며, 상기 고정은 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드의 대립유전자를 G로 고정; 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드의 대립유전자를 A로 고정; 또는 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드의 대립유전자를 T로 고정하는 것이다.

또한, 상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 방법은 상술한 SNP 형질을 이용하므로, 상술한 바와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 SNP 마커로서 제공하는 STAT2, MYF6 및 TFCP2L1 유전자로부터 유래된 단일염기다형성은 모돈의 생애총생산성 형질과 높은 연관성을 나타내고 있으므로, 본 발명의 SNP 마커를 이용하면 유전자 검사를 통해 모돈의 생애총생산성을 조기에 예측할 수 있는 이점이 있다. 따라서, 본 발명은 우수한 모돈 선별 및 종의 개량에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1는 고산차모돈 사용의 문제점에 관한 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 PCIT (partial correlation and information theory) 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 3는 본 발명에 따라 구축된 모돈 생애총생산성에 대한 유전자 조절 네트워크 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 샘플 내 실험군 설정 및 분석

1-1. 샘플 수집 및 실험군 설정

생애총생산성 모돈의 우수성을 확인하기 위해 A 종돈장의 협조를 받아 랜드레이스 656두의 모돈의 번식정보와 시료를 사용하였다. 실험돈은 단일농장에서 2006년~2014년까지 태어난 모돈으로, 동일한 사육매뉴얼에 의해 길러졌으며 118 마리의 부돈, 311 마리의 모돈에 의해 가계를 구성하였다. 분석에 사용된 모돈의 생애총생산성 형질은 모돈이 도태되기까지의 번식기록을 통해 계산해냈으며 표 1(모돈의 생애총생산성 형질)에 나타내었다.

또한, 이를 통해 장수성(HL)과 번식효율성(HE)가 모두 높은 생애총생산성 우수개체(LEP)를 시험군으로 설정하고, 나머지 개체를 대조군으로 설정하였으며 이에 대하여 표 2(생애총생산성에 따른 집단분류)에 나타내었다.

형질명 (단위)	설명 (계산방법)
LPL (일)	생산수명 (첫분만일~도태일)
LNDPP (일)	평균 비생산일수 (비생산일수/도태산차)
LTNB (마리)	생애총 총산자수
LNBA (마리)	생애총 실산자수
LPW (마리)	생애총 이유자돈수
LTNB365 (마리)	연간환산 생애총 총산자수 (LTNB/LPL/365)
LNBA365 (마리)	연간환산 생애총 실산자수 (LNBA/LPL/365)
HL (0 또는 1)	장수성 여부 (도태산차 6이상 여부)
HE (0 또는 1)	효율성 여부 (LNBA365 상위25% 여부)
LEP (0 또는 1)	생애총생산성 우수여부 (HL과 HE 모두해당 여부)

연간환산 생애총실산자수 (Efficiency)		도태산차(Longevity)
		1 내지 5			6 이상
		n	%	카테고리	n	%	카테고리
High	(upper 25%)	37	5.6	LL-HE (Low Longevity- High Efficiency)	127	19.4	HL-HE (실험구) (High Longevity- High Efficiency)
Ordinary	(middle 50%)	241	36.7	LL-OE(Low Longevity- Ordinary Efficiency)	87	13.3	HL-OE (High Longevity- Ordinary Efficiency)
Low	(lower 25%)	164	25.0	LL-LE (Low Longevity- Low Efficiency)	-	-	HL-LE (High Longevity- Low Efficiency)

1-2. 실험군 분석

실험군으로 선정된 그룹의 형질 우수성을 알아보기 위해, SAS 9.4 (Institute Inc.,Cary,NC,USA)의 proc glm을 이용하여 분석하여 표 3(그룹별 모돈의 생애총생산성 특성)에 나타내었다. 표 3에서 알 수 있듯이 실험구로 선정된 그룹은 다른 그룹에 비해 1산차의 성적은 물론 모든 생애총생산성 형질에서 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 실험군만이 가지고 있는 유전특성을 발견하는 것이 모돈의 생애총생산성에 대한 유전특성을 알아내는 데 중요하다는 것을 알 수 있었다.

형질(Traits)	HL-HE (High Longevity- High Efficiency) (실험구)	HL-OE (High Longevity- Ordinary Efficiency)	LL-OE (Low Longevity- Ordinary Efficiency)	LL-LE (Low Longevity- Low Efficiency)	P-value
도태산차	7.20a(0.09)	6.80b(0.10)	3.84c(0.07)	1.83d(0.09)	<0.0001
LPL	940.41a(12.94)	891.23b(15.22)	469.64c(10.91)	171.55d(13.49)	<0.0001
LNDPP	7.18c(0.74)	8.10c(0.87)	12.04b(0.63)	15.06a(0.77)	<0.0001
TNB_1산차	12.46a(0.23)	11.00b(0.27)	11.28b(0.20)	9.65c(0.24)	<0.0001
NBA_1산차	11.63a(0.22)	9.91b(0.26)	10.37b(0.19)	8.66c(0.23)	<0.0001
LTNB	94.34a(1.12)	76.37b(1.32)	43.15c(0.95)	16.37d(1.17)	<0.0001
LNBA	85.98a(0.95)	67.67b(1.12)	39.45c(0.80)	14.89d(0.9)	<0.0001
LTNB/FP	13.18a(0.18)	11.23b(0.21)	11.70c(0.15)	9.54d(0.18)	<0.0001
LNBA/FP	12.02a(0.15)	9.96b(0.18)	10.46c(0.13)	8.63d(0.16)	<0.0001
LTNB365	26.80a(0.26)	22.40b(0.31)	18.73c(0.22)	10.39d(0.28)	<0.0001
LNBA365	24.44a(0.21)	19.86b(0.24)	17.16c(0.18)	9.39d(0.22)	<0.0001

실시예 2. SNP 칩 분석 및 전장유전체연관성분석(GWAS)

샘플인 656두의 모돈으로부터 얻은 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs)을 분석하기 위해, 총 656개 시료의 SNP 칩 분석을 Illunima PorcineSNP60 bead chip을 통해 진행하였다. QC기준은 PLINK 프로그램(http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink)을 이용하여 진행하였고, 결과적으로 콜레이트(call rate)가 90% 이하이거나 변이형 유전자빈도(minor allele frequency, MAF)가 5% 미만, Hardy-Weinberg equilibrium (H.W.E) (p < 0.001) 인 SNP들이 QC를 통해 제외되어 36,926개의 SNP를 선별하였다. 또한, 상기 QC를 통과한 36,926개의 SNP를 전장유전체연관성분석(GWAS)에 사용하였으며, 표 1에 소개된 10개의 형질을 분석에 사용하였다. GWAS 분석은 GCTA 프로그램의 mlma(linear mixed-model association analysis) command를 통해 실시하였다.

실시예 3. AWM (Association weight matrix) 제작

본 발명자들은 생애총생산성형질에 단편적으로 영향을 주는 SNP의 선발에 그치지 않고 종합적 유전자 조절 네트워크를 구성하기 위해, Fortes 등(2010)이 제안한 AWM (Association weight matrix)를 제작했으며, 이는 표 1에 나타난 10 개의 형질에 대한 36,926개 SNP의 GWAS결과(P-value 와 Z 표준화한 Additive effect)가 정리된 두 개의 10 X 36,926 행렬과, 36,926개 SNP 각각에 가장 가까운 유전자와 그 거리에 대한 정보를 우선적으로 필요로 한다. AWM은 아래과 같은 순서를 통해 제작하였다.

단계 1. P-value를 기준으로 한 SNP의 선발

(1) 핵심형질(case-control study결과)의 GWAS결과가 0.05 미만으로서 유의미한 SNP

(2) 핵심형질에 유의미하지는 않지만 다수의 형질(본 연구에서는 4개) 에 유의미한 SNP

(3) (1) 과 (2)를 선발

단계 2. SNP와 가장 가까운 유전자와의 거리를 기준으로 한 SNP의 선발

(1) Step1의 SNP중 유전자 코딩영역과의 거리가 2,500bp 이하(매우 가까움)인 SNP

(2) Step1의 SNP중 유전자 코딩영역과의 거리가 1.5Mb 이상(매우 멈)인 SNP

(3) (1)과 (2)를 선발

단계 3. 1 유전자-1SNP 선별

(1) 동일유전자가 연결된 SNP들에 대해 핵심형질에 더 유의미한 (P-value가 낮은) SNP를 선별

(2) 핵심형질에 대한 P-value가 같다면 평균 P-value가 낮은 SNP를 선별

단계 4. 매우 가까운 SNP는 해당 유전자를 대표하게 되므로 유전자이름으로 대체, 매우 먼 SNP는 SNP이름으로 유지

단계 5. 유전자(SNP)-Additive effect 행렬을 AWM으로 사용

상기 과정을 통해, 총 495개의 행(9개의 SNP + 486개의 유전자) 과 10개의 열을 가진 행렬이 만들어졌으며, 이를 통해 PCIT (partial correlation and information theory) 분석을 실시하여 도 2에 나타내었다.

실시예 4. 전사 인자(Transcription factor, TF) 유전자 선별

본 발명자들은 모돈 생애총생산성에 대한 유전자 조절네트워크를 구축하기 위해 495개의 유전자중 전사 인자(Transcription factor, TF)를 찾아 그 유전자들이 영향을 끼칠 수 있는 전사 인자 결합위치(Transcription factor binding site, TFBS)를 가진 표적유전자의 집단을 AWM에서 선별하였다. AWM에 존재하는 유전자 세트중 전사 인자로 알려진 유전자는 Animal transcription database(TFDB, http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/)의 정보를 이용해 선별하였으며, 모티프 서열이 존재하지 않는 5 개의 전사 인자를 제외하고 총 10 개의 전사 인자(HOXB6, MECOM, MYF6, PDX1, RAX, RORA, STAT2, TBX19, TFCP2L1 및 VDR)를 선택하였다.

실시예 5. 핵심 전사 인자 선별

본 발명자들은 전사 인자의 모티프가 유전자의 조절영역(upstream 2,000bp)에 부착되는지 meme-Suit site의 FIMO tool(http://meme-suite.org/tools/fimo)을 이용하여 확인하였다. 만들어진 전사 인자와 타겟유전자의 관계 네트워크에서 핵심 전사 인자를 선별하기 위해 Reverter 및 Fortes 가 2013년 제안한 방식을 이용해 redundancy를 고려하여 최상위 3개의 전사 인자(STAT2, MYF6, TFCP2L1)를 선별하였다. 최종 선별된 세 개의 전사 인자-표적유전자간 네트워크와 AWM네트워크와의 교집합을 추려내 모돈 생애총생산성에 대한 유전자 조절 네트워크를 구축하였고 이를 도 3에 나타내었다.

이중 핵심 유전자인 STAT2, MYF6, TFCP2L1의 주요 GWAS결과를 표 4(STAT2, MYF6, TFCP2L1 유전자가 생애총생산성형질에 미치는 영향)를 통해 보면 STAT2와 MYF6는 AWM제작 중 핵심형질에 유의하여 상기 실시예 3의 단계 1의 (1)에서 선별하였고, TFCP2L1 유전자는 상기 실시예 3의 단계 1의 (2)에 의해 선발하였음을 알 수 있었다. TFCP2L1 유전자는 실제로 생애총실산자수에 아주 유의미하게 영향을 끼치는 것을 확인할 수 있었다.

유전자 (SNP의 rs_id)	서열	A1	A2	case-control(LEP)				LNBA
유전자 (SNP의 rs_id)	서열	A1	A2	FREQ	B	SE	P	FREQ	B	SE	P
STAT2 (rs80820161)	CATAGTTCAGTTGGTCCAAGAAGTG[G/A]AAGAACAGCATGTTAGCCTTGGAAT(서열번호 1)	G	A	0.087	0.085	0.040	0.035	0.087	0.212	2.631	0.936
MYF6(rs340349360)	GGCCGCCACTCTGCGCGAGAGGAGG[A/C]GGCTGAAGAAAATCAACGAGGCCTT(서열번호 2)	C	A	0.298	-0.049	0.025	0.047	0.298	-0.354	1.609	0.826
TFCP2L1 (rs80897790)	TTTCCTGCTCTGCGGCTCCTGAAGC[C/T]TCAGTGTCTTCATCTGGAAAATGGA(서열번호 3)	T	C	0.063	0.085	0.044	0.056	0.063	8.689	2.893	0.003

실시예 6. 선별된 핵심 전사 인자 분석

본 발명자들은 LEP 형질에 유의한 STAT2 및 MYF6 유전자의 구체적인 분석을 위해 유전자형간 Odd ratio 비교를 실시하였고, Odds ratio 와 신뢰구간 (confidence interval)은 chi-square 테스트로 구하였다.

그 결과, STAT2 유전자의 GG 유전자형은 AA 유전자형에 비해 21.85배 LEP 모돈이 될 확률이 높은 것으로 나타났고 통계적으로도 유의하였다. GA 유전자형에 대해서 17.65배 LEP 모돈이 될 확률이 높았으며 이를 표 5(STAT2 유전자의 유전자형을 기준으로 한 모돈의 LEP 여부에 대한 통계분석결과)에 나타내었다.

	odds ratio	95% CI	Z	sig(P)
GG/GA	17.65	0.8200 to 380.0422	1.833	0.0668
GG/AA	21.85	1.0408 to 458.5847	1.986	0.047
GA/AA	1.22	0.7413 to 2.0210	0.79	0.4294

또한, 동일한 chi-square test 결과, MYF6 유전자의 AA 유전자형은 CA 유전자형에 비해 LEP 모돈이 될 확률이 1.5배 높은 것을 확인할 수 있었으며 이를 표 6(MYF6 유전자의 유전자형을 기준으로 한 모돈의 LEP 여부에 대한 통계분석결과)에 나타내었다.

	odds ratio	95% CI	Z	sig(P)
AA/CA	1.52	1.0068 to 2.3007	1.992	0.0464
AA/CC	1.72	0.7770 to 3.8051	1.338	0.181
CA/CC	1.13	0.5003 to 2.5516	0.294	0.769

한편, TFCP2L1 유전자는 LEP 특이 모돈에 대한 case-control study에는 유의하지 않았으나 SAS의 proc glm의 연관성 분석 결과, TC 유전자형과 TT 유전자형이 CC 유전자형에 비해 1산차번식성적, 평균비생산일수(LNDPP)를 제외한 다른 생애총생산성형질에서 우수한 것으로 나타났으며, 이를 표 7(TFCP2L1 유전자형에 따른 산자수형질)에 나타내었다.

형질(Traits)	CC (n=579)	TC (n=72)	TT (n=5)	P-value
도태산차	4.84^b (0.13)	5.79^a (0.26)	6.31^ab (0.93)	0.0005
LPL	607.0^b(18.3)	747.2^a (38.2)	816.5^ab (134.0)	0.0004
LNDPP	14.37 (0.86)	12.32 (1.80)	13.31 (6.30)	0.5050
TNB_1산차	11.25 (0.16)	11.59 (0.33)	10.87 (1.15)	0.5486
NBA_1산차	10.31 (0.15)	10.87 (0.32)	10.54 (1.13)	0.2041
LTNB	57.26^b (1.75)	70.11^a (3.65)	72.08^ab (12.80)	0.0011
LNBA	51.94^b (1.57)	63.32^a (3.28)	65.95^ab (11.47)	0.0011
LPW	47.01^b (1.73)	57.96^a (3.43)	59.12^ab (11.24)	0.0023
LTNB365	20.05^b (0.37)	22.46^a (0.78)	19.55^ab (2.72)	0.0068
LNBA365	18.22^b (0.33)	20.31^a (0.70)	18.05^ab (2.44)	0.0096

종합적으로, 본 발명자들은 다양한 모돈의 생애총생산성 형질중 장수성과 번식효율이 모두 우수한 모돈 특이적인 유전 변이 추적 및 유전자 조절 네트워크를 구축하여 핵심 조절유전자를 선별하였고, 상기 핵심유전자 중 STAT2 유전자 내 SNP 유전자형이 GG 및/또는 MYF6 유전자 내 SNP 유전자형이 AA인 모돈을 조기 선발하는 경우 농장의 생애총생산성을 향상시킬 수 있음을 제시한다. 또한, 상기 핵심유전자 중 TFCP2L1 유전자 내 SNP 유전자형이 CC인 모돈을 도태시킴으로써 생애총 산자수를 향상시킬 수 있음을 제시한다.

결론적으로, 본 발명의 STAT2, MYF6 및 TFCP2L1 유전자로부터 유래된 단일염기다형성을 이용한 높은 수준의 생애총생산성을 갖는 모돈의 예측 및 판별 방법을 이용하는 경우, 다양한 모돈의 생애총생산성 형질 중 특히 장수성과 관련된 도태 산차 및 번식효율성과 관련된 연간환산 생돈자돈수가 높은 모돈 특이적인 유전변이에 의해 생애총생산성이 높은 모돈을 조기에 선발할 수 있어 모돈의 생애총생산성이 늘어나게 된다. 또한, 모돈의 이용 산차가 늘어나 모돈의 이용성이 증대되고, 양돈생산비의 현격한 감소 효과로 이어져 양돈업계에서 유용하게 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 모돈 선발을 위한 유전적 마커로 유용하게 활용될 수 있다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Novle Single Nucleotide Polymorphisms Markers for Predicting Lifetime Production Ability Trait of Sow and Uses Thereof <130> KU1-95p-1 <150> KR 10-2017-0122656 <151> 2017-09-22 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs80820161 <400> 1 catagttcag ttggtccaag aagtggaaga acagcatgtt agccttggaa t 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs340349360 <400> 2 ggccgccact ctgcgcgaga ggaggaggct gaagaaaatc aacgaggcct t 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs80897790 <400> 3 tttcctgctc tgcggctcct gaagcttcag tgtcttcatc tggaaaatgg a 51

Claims

모돈의 생애총생산성 형질 예측용 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) 마커 조성물로서,
상기 SNP 마커는, STAT2 유전자(signal transducer and activator of transcription 2, GeneID: 396923)에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80820161)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
MYF6 유전자(myogenic factor 6, GeneID: 397005)에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs340349360)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
TFCP2L1 유전자(transcription factor CP2 like 1, GeneID: 100519339)에 위치하는 SNP로서, 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드가 T 또는 C인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80897790)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드이고;
상기 생애총생산성 형질은 장수성, 번식효율성, 생애총 총산자수, 생애총 실산자수, 생애총 이유자돈수, 연간환산 생애총 총산자수, 연간환산 생애총 실산자수, 생산수명 및 도태산차로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 형질인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
모돈의 생애총생산성 형질 예측용 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 조성물로서,
상기 SNP 마커는, STAT2 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80820161)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
MYF6 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs340349360)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
TFCP2L1 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드가 T 또는 C인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80897790)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드이고;
상기 생애총생산성 형질은 장수성, 번식효율성, 생애총 총산자수, 생애총 실산자수, 생애총 이유자돈수, 연간환산 생애총 총산자수, 연간환산 생애총 실산자수, 생산수명 및 도태산차로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 형질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 마이크로어레이로서,
상기 생애총생산성 형질은 장수성, 번식효율성, 생애총 총산자수, 생애총 실산자수, 생애총 이유자돈수, 연간환산 생애총 총산자수, 연간환산 생애총 실산자수, 생산수명 및 도태산차로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 형질인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
제3항의 조성물을 포함하는 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 키트로서,
상기 생애총생산성 형질은 장수성, 번식효율성, 생애총 총산자수, 생애총 실산자수, 생애총 이유자돈수, 연간환산 생애총 총산자수, 연간환산 생애총 실산자수, 생산수명 및 도태산차로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 형질인 것을 특징으로 하는 키트.
(a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성(SNP) 마커를 증폭시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 증폭된 SNP 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 모돈의 생애총생산성 형질 예측 방법으로서,
상기 (b) 단계의 SNP 마커는, STAT2 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80820161)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
MYF6 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs340349360)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
TFCP2L1 유전자에 위치하는 SNP로서, 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드가 T 또는 C인 SNP 부위(GenBank SNP 데이터베이스 rs80897790)를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드이고;
상기 생애총생산성 형질은 장수성, 번식효율성, 생애총 총산자수, 생애총 실산자수, 생애총 이유자돈수, 연간환산 생애총 총산자수, 연간환산 생애총 실산자수, 생산수명 및 도태산차로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 형질인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 (c) 단계에서,
상기 SNP 마커인 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드의 유전자형이 G 인 경우 높은 생애총생산성 형질을 갖는 모돈으로 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 (c) 단계에서,
상기 SNP 마커인 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드의 유전자형이 A인 경우 높은 생애총생산성 형질을 갖는 모돈으로 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 (c) 단계에서,
상기 SNP 마커인 돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T일 경우 높은 생애총생산성 형질을 갖는 모돈으로 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
모돈의 생애총생산성 형질에 관여하는 단일염기다형성(SNP) 형질을 고정시키는 단계를 포함하는, 생애총생산성 형질이 우수한 모돈의 제조 방법으로서,
상기 생애총생산성 형질은 장수성, 번식효율성, 생애총 총산자수, 생애총 실산자수, 생애총 이유자돈수, 연간환산 생애총 총산자수, 연간환산 생애총 실산자수, 생산수명 및 도태산차로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 형질이고;
상기 고정은 돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 23291033 번째 뉴클레오티드의 대립유전자를 G로 고정;
돼지의 5 번 염색체(Genbank numb: NC_010447.4)의 105712126 번째 뉴클레오티드의 대립유전자를 A로 고정; 및
돼지의 15 번 염색체(Genbank numb: NC_010457.4)의 35010372 번째 뉴클레오티드의 대립유전자를 T로 고정;하는 것을 특징으로 하는 방법.