KR101507219B1 - 한우 육량 증대용 바이오 마커로서의 ｐｌａｇ１ 유전자내의 ｓｎｐ의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한우 도체중 판단에 유용한 단일염기다형성(SNP) 마커, 이 SNP 마커를 사용한 한우의 도체중 판단용 키트 및 한우의 도체중 형질을 판단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 발굴하여 확인한 SNP 마커는 한우의 도체중 향상 형질과 강하게 관련되어 있으며, 도체중 증가 형질을 갖는 SNP 염기타입이 한우에서 극히 낮은 빈도로 나타남을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 발굴한 SNP 마커는 한우의 마커도움선발(Marker Assisted Selection; MAS) 시스템에서 유용한 바이오마커로 사용될 수 있으며, 육량이 증가된 한우의 개량에 효과적으로 기여할 수 있다.

Description

한우 육량 증대용 바이오 마커로서의 ＰＬＡＧ１ 유전자내의 ＳＮＰ의 용도{Use of SNP Marker in Hanwoo PLAG1 Gene for Improving Carcass Weight}

본 발명은 한우 도체중 판단에 유용한 단일염기다형성(SNP) 마커, 상기 SNP 마커를 포함하는 한우 도체중 판단용 키트, 및 상기 SNP 마커를 검출하는 단계를 포함하는 한우 도체중 형질을 판단하는 방법에 관한 것이다.

한우는 고기를 생산하는 육용종의 역할을 하는 우리나라 고유한 유전자원으로서 축산업을 대표하고 있다. 한우 고기의 맛과 풍미는 다른 외국 육우품종에서 느낄 수 없는 고유의 독특한 육질특성을 가지고 있으며, 한우가 가지고 있는 유전적 우수성을 발전시켜 우수한 소 품종으로 널리 알리기 위해 많은 연구와 노력을 기울이고 있다. 그러나, 한우는 체구가 작은 단점을 가지고 있기 때문에 성장 및 육량에 관련된 형질들이 외국 타 육우품종에 비해 현저히 떨어진다. 도체형질 중 하나인 도체중은 성장률 및 체형형질과 매우 높은 상관관계를 가지고 있기 때문에 한우의 도체중의 향상을 위한 노력이 절실히 필요하다. 종래 우리나라 한우육종산업에 이용되고 있는 전통적인 개량방법인 후대검증방법은 선발강도의 감소에 따라 선발의 정확성이 떨어지며, 큰 세대간격으로 인한 유전적 개량량 또는 선발반응에 한계를 가져 올 수 있는 단점이 있다. 또한 육종가 추정의 오차가 커질 수 있으며, 검정 관련 많은 사업비용이 요구된다. 이러한 단점을 보완하기 위해 국내외에서 많은 동물분자유전학적 연구가 진행되고 있으며, 향상된 마커도움선발(Marker Assisted Selection: MAS) 시스템 개발을 위해 형질관련 원인 유전자의 발굴을 통한 검증된 정확한 바이오 마커의 개발이 필요하다.

그 동안 연관지도 방법으로 QTL(quantitative trait locus) 지도를 작성하여, 후보유전자를 선발하고 원인유전자를 검증하기 위해서 주요 경제 형질에 관여하는 수천 개의 QTL이 보고되었지만 이중에 원인 유전자로 증명되어진 후보 유전자는 손꼽을 정도이다. 그 이유는 연관지도 방법으로는 초위성체(microsatellite: MS) 마커들을 이용한 분석법으로, 검색된 QTL 위치에 대한 신뢰구간은 형질에 크게 관여하는 QTL이라도 10 cM 이상의 신뢰구간을 가지고 있기 때문엔 QTL 영역이 너무 크며, 그 영역내의 수많은 후보유전자들을 선발하여 원인유전자 검출하는 작업은 너무 많은 오류를 범할 수 있으며 많은 경비와 시간이 소요된다. 이는 다음 육종단계 진행인 마커도움선발(marker assisted selection, MAS) 의 신뢰도를 떨어뜨려 개량사업의 큰 오류 및 손실을 가져올 수 있다. 이 때문에 이렇게 선발된 유전체 정보를 이용하여 국내에서도 한우개량에 활용하려는 연구는 수없이 시도해 왔으나, 개발된 마커의 그 효과가 미미하여 국내에서는 실제적인 선발과 개량에 활용된 경우가 없다. 그러나, 최근 생명공학기술의 발달로 소의 유전체 전장정보를 이용할 수 있게 되었으며, 고밀도로 염색체 전장에 심어놓은 단일염기변이(Single Nucleotide Polymorphism: SNP) 마커로 제작된 DNA칩의 개발로 수천 - 수만개의 유전변이를 단기간에 판독할 수 있게 되었으며, 형질별 QTL 영역은 1 - 2Mb 신뢰구간을 가지는 조밀한 영역을 선발할 수 있게 됨에 따라 원인유전자의 검출이 한층 쉬워졌다. 또한 선진국에서는 여기서 밝혀진 모든 유전변이의 유전자형을 이용하여 유전능력을 정확히 예측하는 것이 가능해졌다고 보고하였으며, 어린 송아지의 유전능력 예측은 혈통을 이용한 기존의 개량방법보다 정확도가 높은 것으로 보고하였다.

최근의 연구결과에 의하면 Pausch 등[1]은 독일의 Fleckvieh 소품종 1800두의 숫컷에서 전장분석을 통해 염색체 14번 내의 성장 및 체중관련 QTL를 탐색하였으며, 비교유전체학적(comparative genomics) 적용으로 사람의 키와 매우 밀접한 관련이 있는 8개의 강력한 후보유전자 PLAG1, MOS, CHCHD7, RDHE2, RPS20, LYN, TGS1, PENK를 QTL 영역 내에서 소개하였다.

그 후 Karim 등[2]은 Holstein-Friesian (HF) X Jersey 품종의 양방향교배로 생산된 F2 숫컷들을 대상으로 염색체 14번내의 성장, 체격, 체중 등에 관한 원인유전자를 찾기 위해 연구하였으며, PLAG1 유전자와 CHCHD7 유전자 사이의 유전자간 영역(intergenic region)에 소의 체중 및 체격에 대한 QTN(quantitative trait nucleotide)이 존재하며, 그 영역내의 많은 단일염기변이는 PLAG1 유전자의 3'UTR 영역의 단일염기변이와 매우 높은 연관불균형으로 존재함을 시사하였으며, 그 유전자의 기능을 규명하는 기능 유전체학(functional genomics) 적용으로 PLAG1 유전자에 의해 소의 체중 및 체격관련 형질이 변한다고 발표하였다. Hensen 등[3]은 마우스를 이용하여 PLAG1 유전자를 녹아웃(knockout) 시켜 PLAG1 유전자가 키, 체격 및 체중에 깊게 관여하는 원인 유전자로 소개하였다. 또한, Littlejohn 등[4]은 PLAG1 유전자내의 단일염기변이가 Holstein-Friesian (HF) 품종의 어린송아지 942두를 이용하여 어린송아지 때의 성장에 연관이 있음을 검증하였으며, Nishimura 등[5]은 일본의 육우집단인 화우(Japanese Black cattle) 품종 거세우 1156두 집단에서도 전장분석(genome-wide association study)을 통해 염색체 14번에서 도체중에 가장 중요한 동일한 영역의 QTL를 발견하였으며, PLAG1-CHCHD7 유전자간 영역에 도체중에 관련된 원인변이들을 검증 확인하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국등록특허 제10-0816993호

[1] Pausch H, Flisikowski K, Jung S, Emmerling R, Edel C, Gotz KU, Fries R: Genome-wide association study identifies two major loci affecting calving ease and growth-related traits in cattle. Genetics 2011, 187:289-297. [2] Karim L, Takeda H, Lin L, Druet T, Arias JA, Baurain D, Cambisano N, Davis SR, Farnir F, Grisart B, Harris BL, Keehan MD, Littlejohn MD, Spelman RJ, Georges M, Coppieters W: Variants modulating the expression of a chromosome domain encompassing PLAG1 influence bovine stature. Nat Genet 2011, 43:405-413. [3] Hensen K, Braem C, Declercq J, Van Dyck F, Dewerchin M, Fiette L, Denef C, Van de Ven WJ: Targeted disruption of the murine Plag1 proto-oncogene causes growth retardation and reduced fertility. Dev Growth Differ 2004, 46:459-470. [4] Littlejohn, M., Grala, T., Sanders, K., Walker, C., Waghorn, G., Macdonald, K., Coppieters, W., Georges, M., Spelman, R., Hillerton, E., Davis, S., Snell, R. (2012). Genetic variation in PLAG1 associates with early life body weight and peripubertal weight and growth in Bos taurus. Animal Genetics. [5] Nishimura, S., Watanabe, T., Mizoshita, K., Tatsuda, K., Fujita, T., Watanabe, N., Sugimoto, Y., Takasuga, A. (2012). Genome-wide association study identified three major QTL for carcass weight including the PLAG1-CHCHD7 QTN for stature in Japanese Black cattle. BMC genetics, 13(1), 40.

본 발명자들은 국내 한우집단에서 도체중 향상의 원인이 되고 선별 정확도가 높은 유전자의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 마커를 발굴하고자 하였다. 이를 위해 후대검정우(reference population) 418두 및 한우상업집단(validate population) 1,550두의 유전정보를 활용한 전장분석 및 한우염기서열을 사용한 SNP 마커 분석을 통해 도체중이 증가된 한우 선별에 매우 효과적으로 사용할 수 있는 SNP 마커를 발굴하는데 성공하였다.

따라서 본 발명의 목적은 한우 도체중 판단에 유용한 단일염기다형성(SNP) 마커를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 한우 도체중 판단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 한우 도체중 형질을 판단하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 한우의 도체중 판단에 유용한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 포함한 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 1의 128번째 염기를 포함하는 8-200개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 한우의 도체중 판단에 유용한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 포함한 폴리뉴클레오티드 세트로서, (a) 서열번호 1의 128번째 염기를 포함하는 8-200개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호 2의 228번째 염기를 포함하는 8-200개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 세트를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "한우(韓牛, Korean Cattle, Hanwoo)" 는 종래부터 한반도에서 운반용이나 농경용으로 사육해오던 재래종의 역우(役牛)를 말하는 것으로 한국소(Bos taurus coreanae)를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "도체중(carcass weight)"는 생체에서 두부, 내장, 족 및 가죽 등 부가식 부분을 제외한 무게를 의미하며, 본 명세서에서 용어 "육량"도 도체중과 실질적으로 동일한 의미를 갖으며, 혼용하여 기재한다.

본 명세서에서, 용어 "뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않는 한 자연의 뉴클레오디티의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 용어 "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP, 단일염기변이)"은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종(species)의 개체간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG) 처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNP는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 코딩 단백질의 아미노산 서열상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

본 발명에서 서열번호 1의 128번째 염기 위치로 특정되는 단일염기다형성은 한우의 14번 염색체 PLAG1 유전자 3′UTR 영역의 SNP이며 본 명세서에서 "rs109231213_C>G"으로도 표기하여 나타낸다. 상기 PLAG1 유전자의 SNP 마커인 rs109231213_C>G에서 C 대립 유전자가 한우 도체중 증가와 강한 관련성을 나타낸다.

본 발명에서 서열번호 2의 228번째 염기 위치로 특정되는 또 다른 단일염기다형성은 한우의 14번 염색체에 존재하며, Illumina Bovine SNP50K BeadChip(ILLUMINA Inc.)에서 제공되는 소 SNP 마커 중에 하나로서 본 명세서에서 "BTB-01280026_C>T"으로도 기재한다. 상기 SNP 마커 BTB-01280026_C>T에서 C 대립 유전자가 한우 도체중 증가와 강한 관련성을 나타낸다.

본 발명에서 서열번호 1의 128번째 염기 위치의 SNP 마커(rs109231213_C>G) 및 서열번호 2의 228번째 염기 위치의 SNP 마커(BTB-01280026_C>T)가 고려된 4가지의 반수체형(haplotype) 구조인, -GT-, -CC-, -CT-, 및 -GC- 중에서 -CC-의 반수체형 구조가 한우 도체중 증가와 강한 연관성을 나타내며, -GT- 반수체형 구조는 한우 도체중 감소와 강한 연관성을 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "연관 비평형(Linkage Disequilibrium)"이란 집단유전학에서 반드시 동일 염색체상에 존재하지는 않는 둘 이상의 유전자좌(loci)에서의 대립유전자의 비-무작위적 연관(non-random association)을 의미한다. 즉, 연관 비평형은 서로 다른 위치의 대립형질들간의 결합의 척도로서, 만약 각 유전자가 완전히 독립적으로 배합된다면, 유전자 집합은 아마도 연관 평형(linkage equilibrium)을 유지할 것이나, 어떤 대립유전자들은 서로 같이 발견되는 예가 많으며 즉, 무작위적으로 뒤섞이지 않으며, 이런 대립유전자는 연관 비평형상태에 있다. 이러한 연관 비평형 상태는 대립유전자들이 서로 근접하여 위치하거나, 대립형질들이 서로 모여 있으면 더 유리한 경우에 자연선택의 결과로 나타나는 것으로 해석되고 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 128번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 한우의 도체중 판단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 128번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (b) 서열번호 2의 228번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 한우의 도체중 판단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 서열번호 1의 128번째 염기는 C 또는 G 염기인 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 서열번호 1의 128번째 염기는 C 또는 G 염기이고, 상기 서열번호 2의 228번째 염기는 C 또는 T 염기인 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열번호 1의 128번째 염기를 포함하여 8-400개의 연속 뉴클레오티드로 구성되며, 보다 바람직하게는 상기 서열번호 1의 128번째 염기를 포함하여 8-300개의 연속 뉴클레오티드로 구성되며, 가장 바람직하게는 상기 서열번호 1의 128번째 염기를 포함하여 8-200개의 연속 뉴클레오티드로 구성된다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열번호 2의 228번째 염기를 포함하여 8-400개의 연속 뉴클레오티드로 구성되며, 보다 바람직하게는 상기 서열번호 2의 228번째 염기를 포함하여 8-300개의 연속 뉴클레오티드로 구성되며, 가장 바람직하게는 상기 서열번호 2의 228번째 염기를 포함하여 8-200개의 연속 뉴클레오티드로 구성된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오티드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오티드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오티드 또는 비-자연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오티드도 포함할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로서 사용한다.

본 발명에서의 프라이머는 주형인 폴리뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 주형 폴리뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 [예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소], DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 한우의 생물학적 시료에서 서열번호 1의 128번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성을 검출하는 단계를 포함하는 한우의 도체중 형질을 판단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 한우의 생물학적 시료에서 서열번호 1의 128번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성 및 서열번호 2의 228번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성을 검출하는 단계를 포함하는 한우의 도체중 형질을 판단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 서열번호 1의 128번째 염기는 C 또는 G 염기인 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 서열번호 1의 128번째 염기는 C 또는 G 염기이고, 상기 서열번호 2의 228번째 염기는 C 또는 T 염기인 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 서열번호 1의 128번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성 및/또는 서열번호 2의 228번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성의 검출은 상기 단일염기다형성의 반수체형(haplotype)을 검출하여 행하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 단일염기다형성의 검출은 유전자 증폭 방식 또는 마이크로어레이 방식으로 실시되는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상술한 단일염기다형성의 검출은 한우의 생물학적 시료로부터 추출한 핵산분자에서 SNP 염기 타입을 검출하는 단계를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "생물학적 시료"는 한우로부터 핵산분자를 얻을 수 있는 시료를 의미하며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 근육 또는 혈액이고, 가장 바람직하게는 혈액이다.

본 명세서에서 용어 "핵산분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

본 발명에서 상술한 SNP 염기 타입을 검출하는 단계는 뉴클레오티드 서열을 규명하는데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오티드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정한다.

본 발명에서 상술한 SNP 위치의 염기의 검출은 유전자 증폭 방식 또는 마이크로어레이 방식으로 실시될 수 있다.

본 발명이 유전자 증폭 방식으로 실시되는 경우, 바람직하게는 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 명세서에 기재된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기전사복제(self sustained sequtice replication)(WO 90/06995), 임의적 프라이밍 중합효소연쇄반응(arbitarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,009호 및 제5,861,245호), 핵산 염기전사 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 발명의 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시될 수도 있다. 본 발명의 방법이 마이크로어레이 방식에 의하는 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 방법에서 이용되는 프로브는 상기 나열한 본 발명의 SNP들을 포함하는 연속 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기판(substrate)상에 고정화된다. 바람직한 기판은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자성 비드 또는 비자성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다. 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단[예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)], 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다. 프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오티드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 본 발명의 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함하게 된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명은 한우 도체중 판단에 사용될 수 있는 단일염기다형성(SNP) 마커에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명의 SNP 마커는 한우의 14번 염색체 PLAG1 유전자 3′UTR 영역에 존재하는 SNP이며 이 위치의 특정 대립유전자가 한우 도체중 증가와 강한 관련성을 나타낸다.

(ⅲ) 본 발명은 한우의 14번 염색체에 존재하는 추가 SNP 마커를 제공하며, 2가지 SNP 마커를 조합하는 경우 도체중 증가 형질을 갖는 한우의 선별 정확도를 증가시킬 수 있다.

(iv) 본 발명의 SNP 마커에서의 특정 대립유전자형을 갖는 한우는 현저한 도체중 증가 형질을 보이며, 전체 한우 집단에서 낮은 빈도를 나타내므로, 본 발명의 SNP 마커를 사용하면 육량이 증대된 한우 선별 및 개량에 크게 이바지 할 수 있다.

본 발명은 한우 도체중 판단에 유용한 단일염기다형성(SNP) 마커, 이 SNP 마커를 사용한 한우의 도체중 판단용 키트 및 한우의 도체중 형질을 판단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 발굴하여 확인한 SNP 마커는 한우의 도체중 향상 형질과 강하게 관련되어 있으며, 도체중 증가 형질을 갖는 SNP 염기타입이 한우에서 극히 낮은 빈도로 나타남을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 발굴한 SNP 마커는 한우의 마커도움선발(Marker Assisted Selection; MAS) 시스템에서 유용한 바이오마커로 사용될 수 있으며, 육량이 증가된 한우의 선별 및 개량에 효과적으로 기여할 수 있다.

도 1은 후대검정우 497두에 대한 Illumina Bovine SNP50K BeadChip을 이용하여 additive method 분석법으로 수행한 전장분석결과를 Manhattan plot 표시한 도면이다(y축 3 = P-value = 0.001).
도 2는 후대검정우 497두에 대한 염색체 14번내의 1,235 SNPs와 PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이 통합 분석결과 Manhattan plot 표시한 도면이다(y축 4 = P-value = 0.0001).
도 3은 소 5품종에서 PLAG1 유전자의 3′UTR 단일염기변이와 PLAG1-CHCHD7 유전자간(intergenic) 영역내의 QTN과의 연관불균형 분석 결과를 보여준다.
도 4는 도체중에 가장 큰 영향을 미치는 PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이(rs109231213_C>G)를 포함한 염기서열 정보를 보여준다.
도 5는 Illumina Bovine SNP50K BeadChip 내 도체중에 가장 큰 영향을 미치는 BTB-01280026_C>T 단일염기변이를 포함한 염기서열 정보를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 한우 후대검정우 집단 497두에서 전장분석(Genome-Wide Association Study: GWAS)

국내 한우집단에서 한우도체중에 관련된 QTL를 검색하기 위해 먼저 한우집단에서 도체중 분석을 수행하였다. 아래 표 1에는 한우집단에서 후대검정우 418두와 한우상업집단 1,550두의 도체중을 측정하여 분석한 통계결과를 정리하여 나타내었다.

한우도체중에 관련된 QTL를 검색하기 위해 Illumina Bovine SNP50K BeadChip(55,074 SNPs)을 이용하였으며, 전장분석전 유전자형 quality control을 위해 (1) 성염색체에 존재하는 SNPs, (2) Call rate > 90％, (3) Minor Allele Frequency (MAF) > 0.05, (4) 하디와인버그(Hardy-Weinberg equilibrium) > 0.0001의 4가지의 조건에 만족하지 않는 단일염기변이마커를 제거한 후 총 35,987개의 SNP 마커들을 이용하여 전장분석을 수행하였다. 통계분석은 SNP variation suite (SVS) version 7 (Golden Helix Inc., Bozeman, MT) 소프트웨어를 이용하여, 혼합선형모형(Mixed) 분석을 수행하였으며, 도체중에 대해 도축차수, 도축일령, 아비정보는 고정변이, 공변량효과 및 랜덤효과를 설정하였다. 잔차는 각각 SNP들의 선형회귀분석 모델을 이용하여 처리하였으며, additive method에 따라 (DD=2, Dd=1, dd=0) 통해 대체효과를 추정하였다. 통계분석에 이용한 모델은 아래와 같다.

유의성 검증은 LRT (Likelihood ration test)를 이용하여 full model과 reduced model과의 비교 검증을 통해 P-value < 0.001 조건으로 QTL를 선발하였다(도 1).

도 1의 결과에서 나타난 바와 같이, Illumina Bovine SNP50K BeadChip 전장분석을 통해 한우 염색체 14번이 도체중에 대해 가장 유의적인 QTL 영역인 것으로 확인되었다.

실시예 2: 한우 후대검정우 집단 497두에서 선발된 염색체 14번의 QTL과 PLAG1 3'UTR 영역의 단일염기변이를 통합한 도체중에 관련된 연관성 분석 비교

실시예 1의 결과로부터 한우 염색체 14번이 도체중에 대해 가장 유의적인 QTL 영역으로 선발하였다. 따라서, llumina Bovine SNP50K BeadChip의 염색체 14번 전 영역에 분포되어 있는 1,235개의 단일염기변이들과 PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이와 통합하여 도체중에 가장 유의적인 단일염기변이를 검증하였다. 연관성 분석 모델은 실시예 1에서 사용한 모델을 이용하였다.

도 2에는 후대검정우 497두에 대한 염색체 14번내의 1,235개의 SNP와 PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이 통합분석한 결과를 Manhattan plot으로 표시하여 나타내었다. 아래 표 2에는 한우 염색체 14번 내의 도체중에 가장 유의적인 SNP 마커 효과를 정리하였다(P-value < 0.0001). PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이는 PCR-RFLP 방법을 이용하여 유전자형을 분석하였으며, 아래 표 3에 PLAG1 유전자의 3′UTR 영역내의 유전자형 분석관련 프라이머 및 제한효소에 관한 정보를 정리하여 나타내었다(표 3).

후대검정우 497두에서 llumina Bovine SNP50K BeadChip의 염색체 14번 전 영역에 분포되어 있는 1,235개의 단일염기변이들과 PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이와 통합하여 분석한 결과 PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이가 한우의 도체중과 가장 유의적인 효과를 나타내었으며 대립유전자 대체효과에서도 43kg의 가장 차이가 많이 나는 마커로 확인되었다. 하지만 C 대립유전자의 빈도가 0.08로 매우 낮은 것을 관찰할 수 있었는데, 이는 외국 육우품종 및 유우품종 보다 C 대립유전자의 빈도가 월등히 낮은 것이며, 한우 염색체 14번내의 24-25Mb의 마커들이 대부분 빈도가 극단적으로 낮은 것으로 나타났다.

실시예 3: PLAG1 유전자의 3′UTR과 PLAG1-CHCHD7 유전자간 영역내의 QTN과의 연관불균형 분석

PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이(rs109231213)와 PLAG1-CHCHD7 유전자간(intergenic) 영역내의 QTN 두 변이(SNP: rs210030313 및 VNTR: rs209821678) 간의 연관불균형(Linkage disequilibrium) 정도를 추정하기 위해 SNP variation suite (SVS) version 7 (Golden Helix Inc., Bozeman, MT) 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행하였으며, Stephens 등의 방법(A new statistical method for haplotype reconstruction from population data. Am J Hum Genet 68: 978-989, 2001)을 적용하여 단일염기변이간의 D'과 r²값을 추정하였다. 한우 PLAG1 유전자의 3′UTR 영역내의 단일염기변이 rs109231213은 PLAG1-CHCHD7 유전자간 영역내의 QTN 두 변이 SNP: rs210030313와 VNTR: rs209821678간의 완벽한 연관불균형인 것으로 나타났으며, 이는 C-CCG¹¹-G 반수체가 도체중에 대한 Q로 관찰되었다(도 3).

실시예 4: 한우 상업축군 집단 1,550두에서 PLAG1 유전자의 3′UTR 단일염기변이가 도체중에 미치는 영향 검증

한우 후대검정우 497두에서 전장분석을 통해 도체중에 가장 유의적인 효과가 나타난 Illumina Bovine SNP50K BeadChip에 포함된 단일염기변이 BTB-01280026_C/T와 PLAG1 유전자의 3′UTR 단일염기변이 rs109231213_C/G 두 마커가 상업축군 1,550 두의 도체중에 영향을 미치는지 검증하기 유전자형 분석을 수행하였다.

Illumina Bovine SNP50K BeadChip에 포함된 단일염기변이 BTB-01280026_C/T와, PLAG1 유전자의 3′UTR 단일염기변이 rs109231213_C/G의 두 마커는 PCR-RFLP 방법을 이용하여 유전자형을 분석하다. 아래 표 4에 BTB-01280026_C/T와 PLAG_rs109231213_C/G 단일염기변이들의 유전자형 분석관련 프라이머 및 제한효소 정보를 정리하여 나타내었다. 도체중과 연관성분석은 실시예 1에서 사용한 것과 같은 모델을 이용하여 분석하였다. 아래 표 5에 한우 상업축군 집단 1,550두에서 BTB-01280026_C/T와 PLAG_rs109231213_C/G 단일염기변이들과 연관성분석 결과를 나타내었다.

상기 표 5에서 보여지는 바와 같이 PLAG1 유전자의 3′UTR 단일염기변이rs109231213가 Illumina Bovine SNP50K BeadChip에 포함된 단일염기변이 BTB-01280026 보다 더 유의적인 효과를 나타내었으며, 대립유전자 대체효과 역시 PLAG_rs109231213 단일염기변이가 월등히 높은 것으로 나타났다(43.6 vs. 22.7kg).

또한 상기 후대 검정우집단과 동일하게 한우 상업축군에서도 PLAG_rs109231213_C/G 단일염기변이에서 도체중이 큰 C 대립유전자형 빈도가 0.12, BTB-01280026_C/T 단일염기변이에서 역시 도체중이 큰 C 대립유전자형 빈도가 0.10으로 매우 낮게 나타났다.

실시예 5: 한우집단에서 PLAG_rs109231213_C/G와 BTB-01280026_C/T 단일염기변이간의 연관불균형 및 반수체형 분석

PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이(rs109231213)와 Illumina Bovine SNP50K BeadChip에 포함된 단일염기변이(BTB-01280026)간의 연관불균형(Linkage disequilibrium) 정도를 추정하기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 SNP variation suite (SVS) version 7 (Golden Helix Inc., Bozeman, MT) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 아래 표 6은 PLAG_rs109231213_C/G 와 BTB-01280026_C/T 단일염기변이간의 연관불균형 분석결과를 정리하여 나타내었다. 아래 표 7은 PLAG_rs109231213_C/G와 BTB-01280026_C/T 단일염기변이간의 반수체형 구조 및 빈도를 나타내었다.

PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이(rs109231213)와 Illumina Bovine SNP50K BeadChip에 포함된 단일염기변이(BTB-01280026)간의 연관불균형(Linkage disequilibrium) 정도는 r²=0.36 이며 D′=0.61로 관찰되었다(표 6).

PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이(rs109231213)와 Illumina Bovine SNP50K BeadChip에 포함된 단일염기변이(BTB-01280026)간의 반수체형 구조는 4개로 나타났으며, 반수체형 1번(-GT-)는 한우집단내에 0.85의 빈도로 가장 높게 나타났으며, 반수체형 2번(-CC-)는 0.07로 그 빈도가 낮게 나타났으며, 반수체형 3번 (-CT-)은 0.05와 반수체형 4번(-GC-)는 0.03의 빈도로 나타났다(표 7).

실시예 6: 한우 후대검정우 집단(n=497)과 상업축군 집단(n=1,550)두에서 PLAG_rs109231213_C/G와 BTB-01280026_C/T의 반수체형과 도체중간의 연관성 분석

반수체형(haplotype)별 도체중과 연관성 분석은 SNP variation suite (SVS) version 7 (Golden Helix Inc., Bozeman, MT) 소프트웨어를 이용하여, 상기 실시예 1에서와 동일한 모형을 이용하여 분석하였으며, 반수체의 카피(copy) 수인(A _ijk = 0, 1, 2) additive method 에 따라 그 효과를 추정하였다.

상기 식에 의해 추정된 유전자형 최소자승 평균간에는 t 검증을 수행하였으며, 반수체형간의 표현형 차이는 contrast를 수행하여 반수체형 대체 효과(haplotype substitution effect) 값을 추정하였다. 아래 표 8에는 후대 검정우 축군(n=419)에서의 반수체형에 따른 한우의 도체중과 연관성 분석 결과를 정리하여 나타내었다.

PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이(rs109231213)와 Illumina Bovine SNP50K BeadChip에 포함된 단일염기변이 BTB-01280026간의 반수체형 구조는 4개 (-GT-, -CC-, -CT- 와 -GC-)로 나타났는데, 반수체형 1번과 2번에서는 반수체형의 카피(copy) 수에 따라 도체중과의 매우 유의적인 효과를 나타내었다. 즉, 반수체형 1번에서 -GT- 카피(copy) 수가 증가할수록 도체중이 감소하여 -GT- 카피 수를 가지고 있는 개체는 도체중이 낮아지는 개체인 것을 알 수 있었다. 또한, 반수체형 2번에서는 -CC- 카피를 가지고 있으면 도체중이 증가하여, -CC- 2 카피 수를 가지고 있는 개체는 도체중이 400kg 이상 나가는 개체들인 것으로 나타났다(표 8). 하지만 반수체형 2번의 -CC- 2 카피 수를 가지고 있는 개체가 2두 밖에 되지 않았기 때문에 좀 더 명확한 검증을 위하여 상업축군 집단에서 역시 반수체형별 도체중과의 연관성분석을 실시하였다(표 9). 분석 모형은 상기 실시예에서 설명된 같은 모델을 이용하여 분석하였다. 아래 표 9에는 상업축군(n=876) 에서의 반수체형에 따른 한우의 도체중과 연관성 분석결과를 정리하여 나타내었다.

상업축군에서 역시 반수체형 구조는 4개(-GT-, -CC-, -CT- 와 -GC-)로 나타났으며, 그 빈도 또한 후대 검정우집단과 비슷하게 나타났다. 상업축군에서 4개의 반수체형에 따른 도체중의 상가적인 효과가 후대검정우 집단에서의 효과와 동일하게 나타났으며, 역시 반수체형 1번에서 -GT- 카피(copy) 수를 가지고 있는 개체는 도체중이 낮아지는 개체인 것으로, 반수체형 2번에서는 -CC- 카피를 가지고 있으면 도체중이 증가하였고, -CC- 2 카피 수를 가지고 있는 개체는 도체중이 470kg 이상 나가는 개체들로 나타났다. 하지만, 상업축군에서도 그 빈도 매우 적어 반수체 2번 -CC- 형의 동형접합체인 경우 그 두수가 4두로 나타났다(표 9).

상기 표 10에는 후대검정우축군(n=419)과 상업축군(n=876)에서의 반수체형 대체효과를 추정하여 도체중과 연관성 분석 결과를 정리하여 나타내었다. 반수체 2번 -CC- 형은 그 빈도가 매우 낮지만 한우의 도체중에 매우 유의적인 효과를 나타내며, 다른 반수체형들에 비해 월등히 도체중이 높은 개체이다. PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 단일염기변이(rs109231213) 하나의 마커와 도체중간의 연관성 분석을 하였을 경우 보다 Illumina Bovine SNP50K BeadChip에 포함된 단일염기변이(BTB-01280026) 마커와의 LD 값을 통해 반수체형을 이용하여 분석하였을 경우에 그 효과는 더 커지는 것으로 나타났다. 후대검정우축군과 상업축군에서 모두 일관적인 패턴의 효과를 나타내었으며, 가장 빈도가 높은 반수체 1번 -GT- 형에 비해 반수체 2번 -CC- 형의 반수체형 대체효과는 50kg 이상 나타나는 것으로 관찰되었다(표 10).

상기의 결과로부터, 한우의 도체중에 가장 큰 영향을 미치는 PLAG1 유전자의 3′UTR 영역의 rs109231213_C>G 단일염기변이의 C 대립유전자는 도체중을 증대시키는 원인유전인자임을 한우집단에서 검증하였고, BTB-01280026_C>T 단일염기변이 마커와의 반수체 2번 -CC- 형의 효과는 PLAG1_rs109231213_C>G 단일염기변이 하나의 마커 효과 보다 도체중에서 더 높은 증대를 가져올 수 있는 것으로 검증하였다. 또한 한우집단에서는 선행 연구된 외국의 타 품종보다 PLAG1_rs109231213_C>G 단일염기변이 C 대립유전자의 빈도가 매우 낮게 나타나는 것으로 관찰할 수 있었는데, 이는 한우가 진화과정에 일어난 유전적 부동(Genetic drift) 또는 개량과정 외래종의 도입으로 인한 유전자의 흐름(Gene flow)에 의해 그 유전적 빈도가 다른 타 품종에 비해 크게 차이가 날 수도 있지만, 그 보다 한우는 역용종에서 육용종으로 바뀐 후 1980년대 이후부터 개량을 시작하였으며, 한우개량의 역사는 불과 20년 밖에 되지 않는 점을 미루어 볼 때 외국 타 품종들에 비해 개량의 시간이 매우 짧기 때문일 것이라 사료된다. 본 발명에서 새로이 검증된 PLAG1_rs109231213_C>G와 BTB-01280026_C>T 단일염기변이마커의 반수체 2번 -CC- 형의 반수체형 마커를 이용하여 한우의 체중 및 체격, 성장률에 대한 마커도움선발(Marker Assisted Selection: MAS) 시스템을 개발한다면, 보다 정확하고 효율적인 한우의 개량이 가능할 것이라 사료된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chung-Buk National University Industry Cooperation Foundation <120> Use of SNP Marker in Hanwoo PLAG1 Gene for Improving Carcass Weight <130> PN130145 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 374 <212> DNA <213> Hanwoo <400> 1 caagggctca acgtaggcac tcacttctca gaggtaacag tctgccattg ctaatgaaga 60 atacatgacg tctaaaagat ctcctccaat gtcgcctgga tctcagtagg ctggaagcaa 120 cttgggtsaa tatttttttt tgtattttaa cttacatact gggaagacag tgtgttttga 180 gacacgtaaa ccttgtaaaa aaaataaacc attgtaaaac cttatgaaaa gacacactga 240 ttctgtgcaa tatagcaaat tgataagaaa acactgtaaa actgtacctg tttaaaatac 300 cgtctaccat tcttgaacac aaagcattat acatcaaagg cctatatatc tatcctctaa 360 tggcacttga aaca 374 <210> 2 <211> 541 <212> DNA <213> Hanwoo <400> 2 tccagagaat tacctttgca gcctcaccct gatggtatgt atggagtaca gaacaacatt 60 ctttgggaga agatcttatt ttctagtatt atttcactcc tgtactccct acagatgaca 120 aagaacttgc ctgctttcat agtatatgac attagcatca catatatgag taccatatca 180 ttgaggattt ttctttcaat gggcttgtat aaccatttaa aaattctrtt cttgaaggtc 240 agttctttaa ggtggatttc ttaaagatca aacagctgaa ggatttagct ttattgttgc 300 ctattccatg gtgaaaaagg taagggttgg agtctatgac ctccattaag atgttaagga 360 ctgagatatt tctttagacg tggctggata tctgtagaat gtgtaatcct atgagaagta 420 aatttcagac ctaacagctt agcacatgcc taccaactga gcagagaacg tggaaggagg 480 ccagtgcctg gaagaaagta ctttcctacc ttaatattta ttcattctca aaacatccct 540 t 541 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 caagggctca acgtagg 17 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 tgtttcaagt gccattagag g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 tccagagaat tacctttgca g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 aagggatgtt ttgagaatga a 21

Claims (13)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1의 128번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 한우(Korean native cattle, Bos taurus coreanae)의 도체중 판단용 키트.
   
4. (a) 서열번호 1의 128번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (b) 서열번호 2의 228번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 한우(Korean native cattle, Bos taurus coreanae)의 도체중 판단용 키트.
   
5. 제 3 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 128번째 염기는 C 또는 G 염기인 것을 특징으로 하는 키트.
   
6. 제 4 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 128번째 염기는 C 또는 G 염기이고, 상기 서열번호 2의 228번째 염기는 C 또는 T 염기인 것을 특징으로 하는 키트.
   
7. 한우의 생물학적 시료에서 서열번호 1의 128번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성을 검출하는 단계를 포함하는 한우(Korean native cattle, Bos taurus coreanae)의 도체중 형질을 판단하는 방법.
   
8. 한우의 생물학적 시료에서 서열번호 1의 128번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성 및 서열번호 2의 228번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성을 검출하는 단계를 포함하는 한우(Korean native cattle, Bos taurus coreanae)의 도체중 형질을 판단하는 방법.
   
9. 제 7 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 128번째 염기는 C 또는 G 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제 8 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 128번째 염기는 C 또는 G 염기이고 상기 서열번호 2의 228번째 염기는 C 또는 T 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 단일염기다형성을 검출하는 단계는 유전자 증폭 방식 또는 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 7 항에 있어서, 상기 한우의 생물학적 시료에서 서열번호 1의 128번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성을 검출하는 단계는 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 한우의 생물학적 시료로부터 지놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
    (b) 상기 한우 지놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 사용하여 DNA를 증폭하는 단계;
    (c) 상기 증폭된 DNA를 제한효소 Hph I 를 처리하는 단계; 및
    (d) 상기 제한효소 Hph I 처리된 DNA를 분석하는 단계.
    
13. 제 8 항에 있어서, 상기 한우의 생물학적 시료에서 서열번호 1의 128번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성 및 서열번호 2의 228번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성을 검출하는 단계는 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 한우의 생물학적 시료로부터 지놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
    (b) 상기 한우 지놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트와 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 사용하여 DNA를 각각 증폭하는 단계;
    (c) 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 DNA를 제한효소 Hph I를 처리하고, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 DNA를 제한효소 DraR I를 처리하는 단계; 및
    (d) 상기 제한효소 Hph I 처리된 DNA와, 상기 제한효소 DraR I 처리된 DNA를 각각 분석하는 단계.
    

Images