KR20190091708A - 한우육의 동일성 확인용 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한우육의 동일성 식별(판별)용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 시중에 유통되는 한우육의 개체 동일성을 판별할 수 있는 단일염기다형성(SNP) 마커; 이를 이용한 한우육의 동일성 판별용 조성물; 키트; 마이크로어레이 및 이를 이용한 한우육의 동일성을 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용하는 경우 한우육의 동일성 유무를 종래 기술 대비 쉽고 빠르고 정확하게 판별할 수 있는바, 한우육의 동일성 검사 비용 및 시간을 기존기술에 비해 50%이상 획기적으로 줄임에 따라 외국산 장비 및 시약에 대한 외화를 절약할 수 있다. 또한, 기존의 분석시장이 고가의 장비와 시약을 사용함에 따라 공공기관 및 일부업체에서만 분석이 한우의 동일성 검사가 시행되고 있어 소고기의 부정유통차단에 효과가 제한적인데, 본 기술개발을 통해 대형유통업체(롯데마크, 홈플러스 등) 및 대형 식재료 공급업체(삼성에버렌드, 아워홈, 등)에서 자체 모니터링 시스템으로 활용할 수 있다.

Description

한우육의 동일성 확인용 바이오 마커 및 이의 용도{Biomarkers for Individual confirmation of Hanwoo Beef and uses thereof}

본 발명은 한우육의 동일성 식별(판별)용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 시중에 유통되는 한우육의 개체 동일성을 판별할 수 있는 단일염기다형성(SNP) 마커; 이를 이용한 한우육의 동일성 판별용 조성물; 키트; 마이크로어레이 및 이를 이용한 한우육의 동일성을 판별하는 방법에 관한 것이다.

건강에 대한 관심이 늘어나면서 식육에 대한 소비자들의 요구도 단순히 양적인 측면에서 안정성과 질 위주로 변화하고 있으며, 특히 생산지(브랜드) 그리고 생산에서 소비에 이르는 유통과정상의 신뢰성을 중요하게 생각하고 있다. 이런 변화에 따라 유럽연합에서는 유통되는 소고기에 대한 생산이력제를 실시하여 개체번호, 생산지, 생산자 등 다양한 정보를 표시함으로써 축산물의 신뢰성을 높이고 있다. 최근 들어 한우육의 경우에도 수량적인 측면보다는 축산물의 안정성과 품질, 제품을 구매하는 데 있어서 제품의 진위성 등에 초점이 맞춰지고 있다.

생산이력체계는 계속적으로 개체별 송아지의 성장과정에서 일어나는 능력, 관리, 질병 등에 대한 기록이 이루어지고 도축·가공 과정과 소비자들에게 유통되는 과정에도 최초 송아지에 부여했던 고유번호(이표번호)가 유지되어 출생에서 소비자 식탁까지 전과정이 전산시스템으로 운영되는 컴퓨터정보기술을 기반으로 하는 체계이다.

그러나 이와 같은 생산이력체계는 소의 고유번호가 가진 정보에만 의존하기 때문에 고유번호가 오기/유실된 경우 추적이 불가능하다는 단점이 있다. 따라서, 생산이력체계가 효과적으로 작동하기 위해서는 생명공학기술을 접목시킬 필요가 제기되었고, 기존에는 혈액형 및 생화학적인 지표의 다형성 분석방법을 사용하였으나 이런 기법들은 분석을 위해 사용되는 조직들이 한계가 있다는 단점을 가지고 있다. 더구나 소에 있어서 혈액형 검사는 정확한 부계혈통을 결정하지 못하는 단점이 있다. 이로 인해 최근 들어 DNA 다형성에 기초한 다양한 유전적 분석 방법들이 개발되었으며, 이를 이용하여 품종간 및 개체간의 동정이 이루어지고 있다.

최근의 생산이력체계는 소 DNA 마커를 이용한 유전자 감식기법이 활용되고 있다. DNA 마커는 MS(microsatellite)와 SNP(single nucleotide polymorphsim)로 나눌 수 있으며, 현재까지 MS 마커가 소 유전자 감식을 위해 주로 이용되어져 왔다. 전 세계적으로 이러한 MS 분석은 매우 광범위하게 이루어지고 있으며, 국내에서 또한 학술적 연구와 더불어 쇠고기 이력 추적시스템, 한우와 수입육 판별법 개발 등에 많이 사용되고 있으나, 최종 결과값은 모두 소수점을 갖는 숫자로 표기되어지므로 타 연구결과와의 데이터 공유는 매우 힘든 실정이다. 즉, 동일한 PCR산물을 동일한 분석기기에서 계속적으로 반복하여 분석한다 해도 크기(bp)는 매번 달라지게 된다. 그렇기 때문에 그러한 데이터는 통합하여 관리하거나, 동일성을 알아보고자 할 때는 매우 비효율적인 시스템이다. 이에, 최근에는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, 이하 ‘SNP’라 약칭함)으로 대체되고 있는 실정이다. SNP는 유전형이 단순하고 분석방법이 다양하기 때문에 좋은 마커를 많이 발굴해 내면 생산이력제로의 이용이 충분히 가능하기 때문에 많은 국가에서 SNP를 이용한 생산이력제 시스템 개발을 시도하고 있다.

그러나, 2011년 농림수산검역검사본부에서는 한우확인 시험법의 표준화에 대한 연구를 실시하면서 그동안 개발된 한우확인시험법이 모두 고가의 외국산 장비를 활용하고 있으며, 일회 분석비용이 500만원이상 고비용임을 지적하였다. 농림수산식품기술기획평가원에서 수행하고 개발완료한 “한우생산이력제 체계 구축을 위한 SNP Kit 개발 및 산업화” 과제의 경우에서도 한우개체인식에 있어서 일루미나사의 Golden Gate Assay법을 사용하고 있어 분석장비와 시약이 모두 고가의 외국산을 사용하고 있는 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자는 한우의 생산이력체계를 효과적으로 운용하기 위한 한우의 개체식별(동일성) 검사 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였으며, 한우동일성검사용 마커를 단계적인 과정을 통해 선발하였다. 최종적으로 선발된 SNP 마커를 대상으로 개체식별력이 높은 마커들로부터 순차적으로 유전자 좌위 특이적 프라이머를 제작하였고, 이러한 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 통해 한우육의 동일성을 평가한 결과, 선발된 SNP 마커가 한우육의 동일성 유무를 효과적으로 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1507219호

따라서 본 발명의 목적은 한우육의 동일성 판별을 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 바이오마커를 이용하여 한우육의 동일성을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 총 20개의 프라이머쌍으로 이루어진 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 프라이머 세트를 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 서열번호 1의 101번째 위치; 서열번호 2의 101번째 위치; 서열번호 3의 101번째 위치; 서열번호 4의 101번째 위치; 서열번호 5의 101번째 위치; 서열번호 6의 101번째 위치; 서열번호 7의 101번째 위치; 서열번호 8의 101번째 위치; 서열번호 9의 101번째 위치; 서열번호 10의 101번째 위치; 서열번호 11의 101번째 위치; 서열번호 12의 101번째 위치; 서열번호 13의 101번째 위치; 서열번호 14의 101번째 위치; 서열번호 15의 101번째 위치; 서열번호 16의 101번째 위치; 서열번호 17의 101번째 위치; 서열번호 18의 101번째 위치; 서열번호 19의 101번째 위치; 및 서열번호 20의 101번째 위치로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 한우육의 동일성 판별을 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 21과 22의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 57과 58의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 서열번호 59와 60의 서열을 갖는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 마이크로에레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 검체 시료로부터 핵산 분자를 분리하는 단계, 및 (b) 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 1의 101번째 위치; 서열번호 2의 101번째 위치; 서열번호 3의 101번째 위치; 서열번호 4의 101번째 위치; 서열번호 5의 101번째 위치; 서열번호 6의 101번째 위치; 서열번호 7의 101번째 위치; 서열번호 8의 101번째 위치; 서열번호 9의 101번째 위치; 서열번호 10의 101번째 위치; 서열번호 11의 101번째 위치; 서열번호 12의 101번째 위치; 서열번호 13의 101번째 위치; 서열번호 14의 101번째 위치; 서열번호 15의 101번째 위치; 서열번호 16의 101번째 위치; 서열번호 17의 101번째 위치; 서열번호 18의 101번째 위치; 서열번호 19의 101번째 위치; 및 서열번호 20의 101번째 위치로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계를 포함하는, 한우육의 동일성을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계는 분리된 핵산 분자를 주형으로 하고, 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행함으로써 표적 서열을 증폭한 후 증폭 산물을 검출하는 과정을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 21과 22의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 57과 58의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 서열번호 59와 60의 서열을 갖는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 반응 조건은 95℃에서 15분 1회 진행하고, 95℃에서 20초와 60℃에서 40초 및 72℃에서 60초를 30회 반복한 후, 72℃에서 3분 1회 진행될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 핵산 분자는 12.5~100ng의 양으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 21 내지 서열번호 60으로 구성되는, 한우육의 동일성 판별을 위한 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 제12항의 프라이머 세트, 멀티플렉스 PCR 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용하는 경우 한우육의 동일성 유무를 종래 기술 대비 쉽고 빠르고 정확하게 판별할 수 있는바, 한우육의 동일성 검사 비용 및 시간을 기존기술에 비해 50%이상 획기적으로 줄임에 따라 외국산 장비 및 시약에 대한 외화를 절약할 수 있다. 또한, 기존의 분석시장이 고가의 장비와 시약을 사용함에 따라 공공기관 및 일부업체에서만 한우의 동일성 검사가 시행되고 있어 소고기의 부정유통차단에 효과가 제한적인데, 본 기술개발을 통해 대형유통업체(롯데마크, 홈플러스 등) 및 대형 식재료 공급업체(삼성에버렌드, 아워홈, 등)에서 자체 모니터링 시스템으로 활용할 수 있다.

도 1a 내지 도 1t는 본 발명의 SNP 마커를 포함하는 컨센서스 서열(consensus sequence) 정보이다.
도 2는 어닐링 온도(annealing temperature) 및 반복 구간에 따른 증폭 효율 및 특이도 비교한 멀티플렉스 PCR 결과이다.
도 3은 DNA polymerase의 농도에 따른 증폭효율 및 특이도 비교한 멀티플렉스 PCR 결과이다.
도 4a 및 4b는 DNA 농도에 따른 민감도 비교한 멀티플렉스 PCR 결과이다. Set-A 및 Set-B는 각각 본 발명의 SNP 마커 10개 및 1개의 컨트롤 마커(control marker)를 포함한다.
도 5는 본 발명의 SNP 마커 10개 및 1개의 컨트롤 마커(control marker)를 포함하는 SetA 및 SetB를 이용하여 한우육 시료(1차 7두, 2차 15두의 DNA 시료)를 대상으로 재현성 실험을 진행한 멀티플렉스 PCR 결과이다.

본 발명은 한우육의 동일성 판별을 위한 바이오커에 관한 것이다.

본 발명의 SNP 마커는 소(bovine)에 적용되며, 가장 바람직하게는 한우(hanwoo)에 적용된다. 본 발명의 명세서에서 용어 "한우(韓牛, Korean Cattle, Hanwoo)" 는 종래부터 한반도에서 운반용이나 농경용으로 사육해오던 재래종의 역우(役牛)를 말하는 것으로 한국소(Bos taurus coreanae)를 의미한다.

본 발명에서 "동일성" 이라 함은 고유 개체에 따른 동일성을 의미한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 위치; 서열번호 2의 101번째 위치; 서열번호 3의 101번째 위치; 서열번호 4의 101번째 위치; 서열번호 5의 101번째 위치; 서열번호 6의 101번째 위치; 서열번호 7의 101번째 위치; 서열번호 8의 101번째 위치; 서열번호 9의 101번째 위치; 서열번호 10의 101번째 위치; 서열번호 11의 101번째 위치; 서열번호 12의 101번째 위치; 서열번호 13의 101번째 위치; 서열번호 14의 101번째 위치; 서열번호 15의 101번째 위치; 서열번호 16의 101번째 위치; 서열번호 17의 101번째 위치; 서열번호 18의 101번째 위치; 서열번호 19의 101번째 위치; 및 서열번호 20의 101번째 위치로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 한우육의 동일성 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커에 관한 것이다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 총 20개의 SNP 중 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 한우육의 동일성 판별을 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제"란, 시료에 포함된 해당 SNP를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxylgroup)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 21과 22의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 57과 58의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 서열번호 59와 60의 서열을 갖는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 본 발명의 SNP에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 이외에 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 키트는 DNA 증폭을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 키트는, 본 발명의 SNP에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 및 멸균증류수 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 마이크로에레이에 관한 것이다.

상기 마이크로어레이는 본 발명의 상기 조성물을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.

마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 검체 시료로부터 핵산 분자를 분리하는 단계, 및 (b) 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 1의 101번째 위치; 서열번호 2의 101번째 위치; 서열번호 3의 101번째 위치; 서열번호 4의 101번째 위치; 서열번호 5의 101번째 위치; 서열번호 6의 101번째 위치; 서열번호 7의 101번째 위치; 서열번호 8의 101번째 위치; 서열번호 9의 101번째 위치; 서열번호 10의 101번째 위치; 서열번호 11의 101번째 위치; 서열번호 12의 101번째 위치; 서열번호 13의 101번째 위치; 서열번호 14의 101번째 위치; 서열번호 15의 101번째 위치; 서열번호 16의 101번째 위치; 서열번호 17의 101번째 위치; 서열번호 18의 101번째 위치; 서열번호 19의 101번째 위치; 및 서열번호 20의 101번째 위치로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계를 포함하는, 한우육의 동일성을 판별하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.

본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich(1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법(Allele specific PCR)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열 변화가 단일-가닥 분자 내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 (b) 단계는 분리된 핵산 분자를 주형으로 하고, 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행함으로써 표적 서열을 증폭한 후 증폭 산물을 검출하는 과정을 통해 이루어질 수 있다.

상기 프라이머는 서열번호 21과 22의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 57과 58의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 서열번호 59와 60의 서열을 갖는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 멀티플렉스 PCR 반응 조건은 95℃에서 15분 1회 진행하고, 95℃에서 20초와 60℃에서 40초 및 72℃에서 60초를 30회 반복한 후, 72℃에서 3분 1회 진행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 핵산 분자는 12.5~100ng의 양으로 사용될 수 있다.

일반적인 PCR과는 달리 유전자형을 분석하는 Allele specific PCR은 단 하나의 염기차이에 의해 증폭 유무가 결정되어야 하기 때문에 PCR 반응조건의 설정 난이도가 매우 높으며, 이를 바탕으로 한 번의 반응 시 다수의 유전자 좌위를 특이적으로 증폭하는 Multiplex Allele specific PCR은 핵심 단백질인 핵산중합효소 (DNA polymerase), 완충용액 (Buffer), 프라이머의 길이 및 서열 변형, 중합효소 연쇄 반응의 조건 등이 매우 까다롭고 정확하게 설정되어야 한다.

본 발명에서는 이러한 PCR 반응조건을 최적화하기 위하여 다양한 실험을 진행하였으며, 상기와 같은 멀티플렉스 PCR 반응 조건을 규명하였다.

본 발명에 따르면, 서열번호 1 내지 서열번호 20의 101 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일염기다형성(SNP)의 유전자형을 비교하였을 때 20개의 SNP가 100% 일치하는 경우 동일 개체로 판단하며, 100% 일치하지 않는 경우 별개의 개체로 판단한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 21 내지 서열번호 60으로 구성되는, 한우육의 동일성 판별을 위한 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 제11항의 프라이머 세트, 멀티플렉스 PCR 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 키트에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

재료

한우육 DNA (축산물품질평가원, 농협중앙회), One-Step 2X multiplex PCR Mix (Misogene), oligonucleotide (Bionics), 50 ~ 500mM Tris-HCl (pH 9.0), 1 ~ 10mM MgCl2, 10 ~ 500mM (NH4)2SO4, 0.001 ~ 0.1% BSA, Hot start DNA polymerase (2.5U/ul), Genomic DNA Prep Kit (Nanohelix), HPLC water (Merck)

실시예 1: 한우육 개체 식별 검사를 위한 SNP 마커 발굴

한우 개체식별(동일성) 검사용 SNP (single nucleotide polymorphism) 마커를 선발하기 위해서 Illumina 50K 칩으로부터 다형성이 높은 마커들을 염색체별로 총 400개를 선발하여, 연관불균형(linkage disequilibrium, LD) 분석을 수행하였다. 이어서, 염색체별로 선발된 마커들 간의 LD 분석을 통해 연관이 없는 마커들 총 338개를 선발하였다. 선발한 총 338개 마커 중 유전자내에 속하는 SNP들과 한 염색체당 최소 3개 이상의 SNP 마커를 선발하였다. 최종적으로 110개의 마커를 선발하여 콘센서스 서열(consensus sequence)을 획득하였다.

실시예 2: 개체식별용 염색체/ 마커간 염기서열의 선정 및 검증

한우 개체식별(동일성) 검사용 SNP (single nucleotide polymorphism) 충북대학교에서 최종 선발된 110개 SNP 좌위들의 염기서열을 확인하여, multiplex PCR용 20개의 서열을 선정하였으며 SNP 주변 양방향 500bp 의 추가적인 염기서열을 기반으로 염기 특이적 프라이머 쌍을 제작하였다. 이 과정에서 각 마커들의 개체식별력을 확인하고 최소의 마커수량으로 최대의 개체식별력을 확보하기 위해 각 좌위의 발생빈도 (allele frequency)를 확인 및 비교하였으며 이론상으로 하나의 마커가 갖는 최대의 개체식별력은 0.5 이다. 또한, 분석 결과는 전통적인 PCR 결과 확인 방식인 전기영동법으로 확인하기 때문에 각 SNP 좌위가 On/Off로 표시되게 된다. 따라서 이배체 (Diploid)의 염색체를 갖는 소의 경우에 각 마커의 SNP는 우성 동형접합체 (Dominant homozygote), 열성 동형접합체 (Recessive homozygote), 이형접합체 (Heterozygote) 로 존재할 수 있으며 0.5에 최대한 근접하는 개체식별력을 적용하기 위해서는 이형접합체와 우성 동형접합체 또는 이형접합체와 열성 동형접합체의 발생빈도가 1:1인 것이 가장 이상적인 개체식별 결과를 확인할 수 있는 마커이다. 이를 바탕으로 0.5의 발생빈도를 갖는 20개의 마커를 모두 활용할 경우 이론적으로 (0.5)^-20 = 9.5×10^-7, 즉 1/1,000,000의 개체식별력을 확보할 수 있다. 최종 선발된 20개 마커의 major/minor allele 및 발생 빈도는 하기 [표 1]에서 자세히 나타내었다.

개체식별용 마커의 유전자 좌위형과 발생 빈도

Marker	BTA	Position	Allele	MAF	HWE P-value	Genotype DDCount	Genotype DdCount	Genotype DD+DdCount	Genotype ddCount	Genotype dd-(DD+Dd)Count
BTA-97386-no-rs	2	5,015,333	A/G	0.29	0.2030	49	293	342	343	1
ARS-BFGL-NGS-1759	7	29,901,239	A/G	0.28	0.1425	48	296	344	344	0
Hapmap52688-rs29024581	7	71,440,821	A/C	0.28	0.0329	43	300	343	343	0
AY856094-rs17871190	29	9,160,939	A/G	0.28	0.1425	48	296	344	344	0
DQ786763-rs29020472	12	11,824,653	A/G	0.28	0.1089	47	297	344	344	0
AY937242-rs17872223	23	27,306,795	A/G	0.28	0.1425	48	296	344	344	0
ARS-BFGL-NGS-16742	3	43,720,374	A/G	0.29	0.1903	49	294	343	343	0
AY842472-rs29001941	3	40,399,136	C/G	0.28	0.0177	41	300	341	341	0
ARS-BFGL-NGS-64672	1	76,248,393	A/G	0.29	0.1291	48	297	345	343	-2
AY844963-rs17871338	5	98,102,349	A/G	0.28	0.0605	45	299	344	344	0
ARS-BFGL-NGS-27058	20	712,232	A/G	0.28	0.1103	47	296	343	342	-1
BTB-01862906	7	30,776,835	A/G	0.28	0.1425	48	296	344	344	0
FASN16024	19	51,400,139	A/G	0.28	0.0734	46	299	345	343	-2
ARS-BFGL-NGS-105341	6	27,360,392	A/G	0.28	0.0111	40	303	343	344	1
AY858890-rs29002256	17	29,936,157	C/G	0.28	0.0338	43	298	341	339	-2
ARS-BFGL-NGS-3730	18	33,640,224	A/C	0.28	0.0585	45	299	344	343	-1
Hapmap57867-rs29020442	28	45,144,385	A/G	0.28	0.2007	49	294	343	345	2
AY914316-rs17871403	18	48,812,014	A/C	0.28	0.2007	49	294	343	345	2
ARS-BFGL-NGS-80643	27	17,007,677	A/G	0.28	0.1425	48	296	344	344	0
BTA-35813-no-rs	14	83,945,172	A/C	0.28	0.1089	47	297	344	344	0

BTA: Bovine chromosome, MAF: Minor allele frequency

실시예 3: 한우육 DNA의 추출

축산물품질평가원과 농협중앙회의 협조로 제공된 한우육 시료에서 DNA를 분리하였으며 Nanohelix 사의 Genomic DNA Prep Kit (Cat No. GCTN200)을 사용하였다. DNA의 정량 분석은 Spectrophometer ND-1000(Nanodrop, USA)을 이용하였으며, 260 ~ 280nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도 및 순도를 확인하였다. 추출한 DNA는 멸균 증류수를 이용하여 모두 50ng/ul로 보정한 후 실험 사용 전까지 20℃에 보관하였다.

실시예 4: SNP 마커를 이용한 프라이머 제작 및 Multiplex PCR set up

충북대학교에서 최종 선발된 110개 SNP 마커를 대상으로 개체식별력이 높은 마커들부터 순차적으로 유전자 좌위 특이적 프라이머 (Allele specific primer)를 제작하였으며 증폭효율 및 검출 민감도, 유전자 좌위에 대한 증폭 특이도가 높은 SNP 마커 후보군을 선정한 후 Multiplex PCR set up을 진행하였다. 일반적인 PCR과는 달리 유전자형을 분석하는 Allele specific PCR은 단 하나의 염기차이에 의해 증폭 유무가 결정되어야 하기 때문에 PCR 반응조건의 설정 난이도가 매우 높으며, 이를 바탕으로 한 번의 반응 시 다수의 유전자 좌위를 특이적으로 증폭하는 Multiplex Allele specific PCR은 핵심 단백질인 핵산중합효소 (DNA polymerase), 완충용액 (Buffer), 프라이머의 길이 및 서열 변형, 중합효소 연쇄 반응의 조건 등이 매우 까다롭고 정확하게 설정되어야 한다. 또한, 각 SNP 마커의 주변 염기서열에 따라 증폭 효율 및 최적 조건등이 각각 달라질 수 있기 때문에 한 번의 반응에 사용되는 각 마커들 또한 경쟁적 저해반응 및 primer dimer등의 형성 여부 등을 고려하여 최적의 조합을 구성하였다. 참고로, 이러한 최적의 조합을 구성하는 것은 당업계에서 통상의 기술자가 종래 기술로부터 용이하게 도출할 수 없는 범위로서 프라이머 길이/서열 변형, PCR 반응 조건, DNA 및 DNA polymerase의 농도 등은 반드시 실험을 통해 규명되어져야 한다. 추가로 PCR 반응의 정상 작동 여부를 확인하기 위해 소의 특이적 유전자 부위를 선정하여 internal control 마커로 사용하였다.

최종 선발된 마커의 염기 특이적 프라이머 서열 및 증폭 산물의 크기 등의 정보는 하기 [표 2]에서 자세히 나타내었다.

개체식별용 후보 마커의 유전자 좌위 특이적 프라이머 정보

순번	마커	프라이머 서열		서열번호	증폭 사이즈 (bp)
Set-1	BTA-97386-no-rs	정방향	GGTGTTTGCATCCAAATGAGAAAC	21	500
		역방향	GCTGTGACATGATTGATGTTGTGAC	22
Set-2	ARS-BFGL-NGS-1759	정방향	TGGGGACACATCACTTAACAGATG	23	450
		역방향	CATGGGCCAATATTGAACCACAAC	24
Set-3	Hapmap52688-rs29024581	정방향	CACAGAGTATTTGAAGTAGGCATCA	25	400
		역방향	CTAGAGCAAGGATTTTACCCTTAAT	26
Set-4	AY856094-rs17871190	정방향	CACTTCTGACAGCTCAGCCGAAAG	27	350
		역방향	GAGGGGAAAGAGCTGCATCTCAAT	28
Set-5	DQ786763-rs29020472	정방향	CTTCTGGCCCAGAGACTCAAATCTA	29	300
		역방향	GTTTAGATGCTCGGGGTTTCTGT	30
Set-6	AY937242-rs17872223	정방향	CAAAAATCCTTGCCTTCATGAGA	31	250
		역방향	TCCTTGGGGCATCTAAGCTGTTA	32
Set-7	ARS-BFGL-NGS-16742	정방향	TGCAAACCAGGAGAGCTCCACG	33	200
		역방향	CTGTGCAGATTGTATACTGTGTAAA	34
Set-8	AY842472-rs29001941	정방향	GTCTAGAGCACCTGTTTCCATCTC	35	150
		역방향	TCTCTCATAGCTTCTCAGGGCAC	36
Set-9	ARS-BFGL-NGS-64672	정방향	AAGCAAAAGTTTCTTATTCATGCATA	37	125
		역방향	ACCATTGCTTTATCACTGAATTCA	38
Set-10	AY844963-rs17871338	정방향	CTGTAGATGTTAACTGGTAACTAA	39	100
		역방향	CAGAGTATGAGCTAAAAACGGAC	40
Set-11	ARS-BFGL-NGS-27058	정방향	CCTGTTGCTGAGAGAAGCATGCA	41	500
		역방향	AATGAATTAGGAGCAGCATCCATGAAG	42
Set-12	BTB-01862906	정방향	AGGACTCACTCCCTTTACCCTAA	43	450
		역방향	ACTCTTCAGTAATTGTATACTTAGTG	44
Set-13	FASN16024	정방향	TGGTGTCCACCAGCGACGTTATCA	45	400
		역방향	GTGGTCAGACCCCAGCGGAGGCC	46
Set-14	ARS-BFGL-NGS-105341	정방향	TGAATCAGCACCAGAGACGAACA	47	350
		역방향	GAGTGGTTCTGGGCAATCTGTTTT	48
Set-15	AY858890-rs29002256	정방향	AGTTTACCCTTTTACTAATAGCGTC	49	300
		역방향	ATACACAAACAAAATTAGAAAGCA	50
Set-16	ARS-BFGL-NGS-3730	정방향	AACTGGATAGTTATGATGGCATGTG	51	250
		역방향	ATCGTGAGGATGTGATGCAGTAAG	52
Set-17	Hapmap57867-rs29020442	정방향	TGCAGTGCTGGCACGATTGAGACTCG	53	200
		역방향	TTGTTTAGAGAAAGCCCTCACTGGT	54
Set-18	AY914316-rs17871403	정방향	GAGCCGGCTGAGGATGAAAGGACTC	55	175
		역방향	AGTGGCCTCCTCTCTGTGGATGG	56
Set-19	ARS-BFGL-NGS-80643	정방향	CGTGGGCCATCTATAAATCTCGCA	57	125
		역방향	TGGGGCCAGTAAAATTGTAGAGC	58
Set-20	BTA-35813-no-rs	정방향	GCCGGGGTGATGGGGGAAAGGTA	59	100
		역방향	TCTCTGTGGATAGCACATGCAGG	60

<4-1> PCR condition 설정

PCR 반응액은 genomic DNA 2 ul (50ng/ul), One-step 2X multiplex PCR Mix 10 ul, 혼합된 primer mixture 3 ul를 혼합한 후 멸균된 증류수를 첨가하여 최종 20 ul가 되도록 준비하였다. 최적화된 PCR 반응 온도 및 시간은 95℃에서 15 분 1회, 95℃에서 20초와 60℃에서 40초 및 72℃에서 60초를 30회 반복한 후 72℃에서 3분 1회 진행하는 것으로 결정하였다. 최종 반응 산물의 확인을 위해 5ul의 반응 산물을 3% 아가로스 젤에 로딩하여 250V에서 30분간 전기영동을 진행한 후 UV trans-illuminator로 결과를 확인하였다.

선행 실험에서 프라이머의 결합 온도인 어닐링 온도(annealing temperature)를 55℃ 및 58℃로 진행한 결과에서 증폭 효율은 증가하였으나 각 마커들의 특이도가 현저하게 낮아지는 현상이 확인되었고 분석 결과의 정확성을 높이기 위해 특이도가 유지되는 60℃ 이상의 어닐링 온도를 대상으로 PCR 반응 조건을 추가로 확인하였다. 또한, 증폭 산물을 형성하는 반복 구간은 30 cycle로 결정하였으며 32 cycle로 실험을 진행한 결과에서는 전체 마커의 증폭 효율이 증가하나 비 특이적 증폭산물이 발생하며 각 마커간의 증폭 효율이 크게 차이가 나는 것을 확인하였다.

그 결과는 도 2에서 자세히 나타내었다. 증폭 효율이 높은 어닐링 온도는 60 내지 64℃ 범위가 적절하며, 최적의 어닐링 온도는 60℃가 바람직하다고 판단되었다.

<4-2> DNA polymerase Unit 결정

PCR 반응에서 핵심이 되는 DNA polymerase는 일반적으로 0.5 ~ 5 unit을 사용하여 실험을 진행하며 각 제조사마다 제공하는 농도(unit) 및 활성이 다르므로 사용자의 목적에 따라 충분한 실험이 필요하다.

본 연구에서는 국내 제조사인 ㈜미소진 에서 생산하고 있는 One-step 2X multiplex PCR Mix (MO-OMP)를 기본 반응시약으로 사용하였으며 TaqDNA polymerase, MgCl2 등의 핵심 반응 재료들을 임의의 농도로 첨가하여 반응을 최적화하였다. 반응 조성물들의 최종 단계인 DNA polymerase를 농도별로 확인하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, DNA polymerase 사용량은 1.5~2.5 Unit 범위가 적절하며, 최적의 DNA polymerase 사용량은 2 Unit이 가장 바람직하다고 판단되었다.

<4-3> DNA 농도에 따른 증폭 민감도 확인

본 실험에서는 DNA 농도에 따른 증폭 한계를 확인하기 위해 50ng/ul의 DNA 원액을 1/2씩 순차적으로 희석하여 최대 400ng부터 최소 6.12ng 까지 증폭 결과를 비교하였다. 실험 진행은 각각의 시료를 대상으로 Set A 10개 마커, Set B 10개 마커와 각 set에 internal control marker 를 1개씩 추가하여 총 22개 마커를 사용하였다. 즉, 상기 Set A 및 Set B에 본 발명의 마커 20개가 포함된다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 12.5ng의 DNA를 사용한 실험군까지 안정적인 증폭 산물을 확인할 수 있었으며 6.12ng에서는 일부 마커의 증폭 산물이 확인되지 않았다. 또한, 400ng의 DNA를 사용한 5번 시료(#5)의 실험 결과에서 600bp의 크기에 해당하는 internal control marker의 증폭 효율이 저하되는 현상을 확인하였으며 고농도의 DNA를 사용할 경우에 오히려 반응 효율이 낮아질 수 있음을 확인하였다. 따라서 정확한 결과 판정을 위한 DNA 사용은 실험자 간의 편차 및 DNA 추출, 희석 등의 오차가 발생하더라도 실험 결과에 줄 가능성이 가장 적은 100ng의 DNA를 기준으로 설정하였으며 전체 20개 마커의 증폭 유무를 모두 확인할 수 있도록 시료를 선정하여 5개 시료에 대한 증폭 민감도를 확인하였다.

<4-4> 재현성 실험

최종 선정된 마커의 특이도, 민감도 및 반응 안정성을 확인하기 위해 1차 7두, 2차 15두의 DNA 시료를 대상으로 재현성 실험을 진행하였다.

실험 진행은 각각의 시료를 대상으로 Set A 10개 마커, Set B 10개 마커와 각 set에 internal control marker 를 1개씩 추가하여 총 22개 마커를 사용하였다. 즉, 상기 Set A 및 Set B에 본 발명의 마커 20개가 포함된다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 재현성 실험 결과에서 각 마커들이 정상적으로 증폭된 것을 확인하였으며 중복되는 개체는 확인되지 않았다.

이러한 결과를 통해 본 발명의 20개의 마커가 한우육의 동일성 유무를 효과적으로 판별할 수 있는 바이오마커로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Biomarkers for Individual confirmation of Hanwoo Beef and uses thereof <130> NPDC-66341 <160> 60 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 1 caggacagct gtgttattca gcttgatgat ggccatggac tctttgtcat aagcacttcc 60 acttccatct tcctttagcc catatataca agacacatca rttacaacat caatcatgtc 120 acagcaaagt tcatatgact gcatatccac aggagaactg tctgttgcaa tgtagatttt 180 gctgacaaca ttgaagagaa a 201 <210> 2 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 2 gttagacatg gcccttggtg ctggagatag aagtgtgaat aacataagtc actttctttc 60 tagagctatg ttctatttgg ggacacatca cttaacagct rcctggcctg ttgctcactt 120 ttctctttta taaaaatgat acagtaattg ctgtatttac ttttaagata gtaagacagt 180 tactgagaaa tttctgtaaa g 201 <210> 3 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/C <400> 3 gtggccatta tgttttctaa atcaaaccaa aaatgtaaat gctagggcca caagaacact 60 aatgagggaa aaataccaca gagtatttga agtaggcatc mttttccaaa gttcaactat 120 ttattattac tatatgcata tactttcagt ataaaagagc tagaaatcta gttgtaaaat 180 atattcaaac tattaaaaat a 201 <210> 4 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 4 catcataggt aggaggaggg ggyggcccac tgctcagccc agctaattct cttgacttgc 60 aggcggagac tgaggctcaa caagggggct tcagcaaccc rtggagatgc agctctttcc 120 cctcacatcc aattcagtgc ttttattgag ttattgactt ttattgagtt attgctgcat 180 gtgaaccata gaayggaggc a 201 <210> 5 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 5 aacatgattg gagaaggtga cagacacatg caggtacygc ttgaattsrc yttacctctt 60 gagggggcac rttaagttat caattatttg cagatgccac rgtcatagaa gcttctggcc 120 cagagactca aatgtwgttt gctaaaacag ctaaaataat gtggggactc aggaaaagac 180 aagtctatcr tttgacatag t 201 <210> 6 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 6 atctggaaac tagtatcacc aaggagttga gcatacattc aaacatttat tgaacactta 60 ctatatactt ggcattgttc taggttctgt gaatacagtt rtgaacaaaa cagagcaaaa 120 atccttgcct tcatgggrta gggaatgggg agacagacaa tatacataat aaataactaa 180 atgtattttt tgtgttaaga g 201 <210> 7 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 7 agttgcaagc agaagggctg aaactctcag ggccactaat attctctaag gcattaatat 60 gcaaattagg aaattaatat gcaaaccagg agagctcccc rctcctaccc ggccaggtca 120 gtgcacagct tgggaaggtg gactgcactt ttgtgcagag agaaacttcg tccagacaga 180 agcagcccta tgctagggtg c 201 <210> 8 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> G/C <400> 8 acagtttgca ggstggggcc tgttggattt gaatctggag tctattaatt actaattgta 60 tatcttgctg ctcagatgtc tagagcacct gtttccatat stgtaaaacy gagttgggag 120 ctgagactgt gactgaggag ggaaggcagr agactattgc tgctccgttc ctccctacct 180 ctgacagctg ctgggctccc t 201 <210> 9 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 9 aggaaatgtg gtgctcatcc tatcttctca ggcctcagcc tgatactaag ggttccttaa 60 tctatgataa tactcaagca aaagtttctt attcatgcag ragaggccca gcagcaaagg 120 ccaccatgtt attatctggg aataacctga gtgtggcttc catgttcctg tctaggtgaa 180 ttcagtgata aagcaatggt a 201 <210> 10 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 10 ttttttacaa gcttatacac tgcaattata aatgtcttaa acagactctt tgtatgtttt 60 aaatcttgtt tttccttctg tagatgttaa ctggtaacca rtgtacaaaa gggttggatc 120 tcaccttcag gatatctgaa atttacagtt tattgtccgt ttttagctca tactctgtat 180 acttctgtag gtacatgtat t 201 <210> 11 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 11 cccgacccca gggttaacct ggacacggct gggctggccc cagggaggtg ggctgagctg 60 ttcctttcgg ttccccagcc tgttgctgag agaagcattc rgtctcaccc atggcctgtg 120 attgctctgt caaatcaatt cgagagacta taaagatata agagctgaac agcaccagca 180 ggagactcca ttttttttcc t 201 <210> 12 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 12 tactgtctgc tccttcctgc ttctgagact gcactgcttg tttgcagttt taagtcatca 60 tattcttatg tgtcagtcag gactcactcc ctttacccca ratttgtagt cagtatctct 120 tcaagagtca ctactgcagc ccaggctctt ctctcctctg ggactgccct gcccttcttc 180 tggagaaatg cctgttttcc a 201 <210> 13 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 13 atcccctccc actgtctgtc ccacaggcta ccaagccagg caggtccacg agtggagacg 60 ccagggtgtg caggtcctgg tgtccaccag cgacgtcagc rcactggatg gcacccggag 120 ccttatcact gaggccgccc agcttgggcc cgtgggaggc atcttcaacc tggccgtggt 180 gaggacggct ttagaggggc t 201 <210> 14 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 14 gtcaagacct ggaatgaaac ctcattcagg tcctgtccca caaagacctc aaagaccagt 60 ggaaaaggac cccctcactg aatcagcacc agagacgacc rctgcaacaa gggccccacg 120 gaggtgtgat tccaccgaca gaatccctac aggagggagg gatgtactgc ctcaggtctt 180 catcttttca ccattgttta a 201 <210> 15 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> G/C <400> 15 cctaacataa attcctagaa gttgaagttc taagtgaaaa tatattccca attaacatac 60 tctagaatgg ttgtaaagtt taccctttta ctaatagcat stgcttttct acgtccttac 120 caacactggt tattataaat cttttctttg atagattgag aascaaaaaa tattatttta 180 atgtcattat taaggtcatc a 201 <210> 16 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/C <400> 16 caaaggacag gagccatccg aagcaccctc tggcagtggt tttgcagtga atgaacagtg 60 gaagaatgga caaggcactt ggcgagggcc gtggagctga mttactgcat cacatcctca 120 cgataaaggt gggagcagac ttttgtcccc acatgcatac acatgagaaa atgaggccaa 180 gagcgttggt tggaatgact g 201 <210> 17 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 17 caggcaagtt gtctttgagt taaaccaaaa ttgggccaga ggactgagaa attgttcaag 60 gtctcacagg catgatgcag tgctggcacg attgagacac ragttcctcc aactcctaaa 120 cctgtgcttg tgaataacac gcaatgttga ggatgtttag ggaccagcca tgagcgtgag 180 gacctgcaca caggaacacc g 201 <210> 18 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/C <400> 18 cygccacggg gctcttgctg gaaatctcag ctgccaaggt gaaagccgca tcaagcatgc 60 tctccttgtc tgggaagagc cggctgagga tgaaaggaat mggaaatcag gcaatctgag 120 aagagctctc ctctccctcc catggatgaa gaagtgacya atcgcagtag aaagtggaag 180 acagcactgg tgaaatggac c 201 <210> 19 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/G <400> 19 atatttattc ttaacatggt aaaacttcag gatttgtagt atttacatag ctcccaacca 60 tttccattgc tgcaagacgt gggccatcta taaatctcac rtggtaatca ctgacatttg 120 tctttgttat tgtcacctgg tatcttcatc aatgtcaaaa taagagtctt aaaaatgaag 180 ctctacaatt ttactggccc c 201 <210> 20 <211> 201 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> variation <222> (101) <223> A/C <400> 20 acccaggtca agtggaagca agaccccacc cttcctgact gtaactgggg cctacgttta 60 ctctgatccc atcacacagc cggggtgatg ggggaaagat maaagaggga ggagataact 120 gtcccttaca gacagtgaca aaccccccat ctcaccctgc atgtgctatc cacagagacc 180 actagaagag ctggacttcc a 201 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of BTA-97386-no-rs <400> 21 ggtgtttgca tccaaatgag aaac 24 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of BTA-97386-no-rs <400> 22 gctgtgacat gattgatgtt gtgac 25 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of ARS-BFGL-NGS-1759 <400> 23 tggggacaca tcacttaaca gatg 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of ARS-BFGL-NGS-1759 <400> 24 catgggccaa tattgaacca caac 24 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of Hapmap52688-rs29024581 <400> 25 cacagagtat ttgaagtagg catca 25 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of Hapmap52688-rs29024581 <400> 26 ctagagcaag gattttaccc ttaat 25 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of AY856094-rs17871190 <400> 27 cacttctgac agctcagccg aaag 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of AY856094-rs17871190 <400> 28 gaggggaaag agctgcatct caat 24 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of DQ786763-rs29020472 <400> 29 cttctggccc agagactcaa atcta 25 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of DQ786763-rs29020472 <400> 30 gtttagatgc tcggggtttc tgt 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of AY937242-rs17872223 <400> 31 caaaaatcct tgccttcatg aga 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of AY937242-rs17872223 <400> 32 tccttggggc atctaagctg tta 23 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of ARS-BFGL-NGS-16742 <400> 33 tgcaaaccag gagagctcca cg 22 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of ARS-BFGL-NGS-16742 <400> 34 ctgtgcagat tgtatactgt gtaaa 25 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of AY842472-rs29001941 <400> 35 gtctagagca cctgtttcca tctc 24 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of AY842472-rs29001941 <400> 36 tctctcatag cttctcaggg cac 23 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of ARS-BFGL-NGS-64672 <400> 37 aagcaaaagt ttcttattca tgcata 26 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of ARS-BFGL-NGS-64672 <400> 38 accattgctt tatcactgaa ttca 24 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of AY844963-rs17871338 <400> 39 ctgtagatgt taactggtaa ctaa 24 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of AY844963-rs17871338 <400> 40 cagagtatga gctaaaaacg gac 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of ARS-BFGL-NGS-27058 <400> 41 cctgttgctg agagaagcat gca 23 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of ARS-BFGL-NGS-27058 <400> 42 aatgaattag gagcagcatc catgaag 27 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of BTB-01862906 <400> 43 aggactcact ccctttaccc taa 23 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of BTB-01862906 <400> 44 actcttcagt aattgtatac ttagtg 26 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of FASN16024 <400> 45 tggtgtccac cagcgacgtt atca 24 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of FASN16024 <400> 46 gtggtcagac cccagcggag gcc 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of ARS-BFGL-NGS-105341 <400> 47 tgaatcagca ccagagacga aca 23 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of ARS-BFGL-NGS-105341 <400> 48 gagtggttct gggcaatctg tttt 24 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of AY858890-rs29002256 <400> 49 agtttaccct tttactaata gcgtc 25 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of AY858890-rs29002256 <400> 50 atacacaaac aaaattagaa agca 24 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of ARS-BFGL-NGS-3730 <400> 51 aactggatag ttatgatggc atgtg 25 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of ARS-BFGL-NGS-3730 <400> 52 atcgtgagga tgtgatgcag taag 24 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of Hapmap57867-rs29020442 <400> 53 tgcagtgctg gcacgattga gactcg 26 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of Hapmap57867-rs29020442 <400> 54 ttgtttagag aaagccctca ctggt 25 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of AY914316-rs17871403 <400> 55 gagccggctg aggatgaaag gactc 25 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of AY914316-rs17871403 <400> 56 agtggcctcc tctctgtgga tgg 23 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of ARS-BFGL-NGS-80643 <400> 57 cgtgggccat ctataaatct cgca 24 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of ARS-BFGL-NGS-80643 <400> 58 tggggccagt aaaattgtag agc 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of BTA-35813-no-rs <400> 59 gccggggtga tgggggaaag gta 23 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of BTA-35813-no-rs <400> 60 tctctgtgga tagcacatgc agg 23

Claims (12)

1. 서열번호 1의 101번째 위치; 서열번호 2의 101번째 위치; 서열번호 3의 101번째 위치; 서열번호 4의 101번째 위치; 서열번호 5의 101번째 위치; 서열번호 6의 101번째 위치; 서열번호 7의 101번째 위치; 서열번호 8의 101번째 위치; 서열번호 9의 101번째 위치; 서열번호 10의 101번째 위치; 서열번호 11의 101번째 위치; 서열번호 12의 101번째 위치; 서열번호 13의 101번째 위치; 서열번호 14의 101번째 위치; 서열번호 15의 101번째 위치; 서열번호 16의 101번째 위치; 서열번호 17의 101번째 위치; 서열번호 18의 101번째 위치; 서열번호 19의 101번째 위치; 및 서열번호 20의 101번째 위치로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 한우육의 동일성 판별을 위한 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 프라이머는 서열번호 21과 22의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 57과 58의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 서열번호 59와 60의 서열을 갖는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 키트.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 마이크로에레이.
6. (a) 검체 시료로부터 핵산 분자를 분리하는 단계, 및
   (b) 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 1의 101번째 위치; 서열번호 2의 101번째 위치; 서열번호 3의 101번째 위치; 서열번호 4의 101번째 위치; 서열번호 5의 101번째 위치; 서열번호 6의 101번째 위치; 서열번호 7의 101번째 위치; 서열번호 8의 101번째 위치; 서열번호 9의 101번째 위치; 서열번호 10의 101번째 위치; 서열번호 11의 101번째 위치; 서열번호 12의 101번째 위치; 서열번호 13의 101번째 위치; 서열번호 14의 101번째 위치; 서열번호 15의 101번째 위치; 서열번호 16의 101번째 위치; 서열번호 17의 101번째 위치; 서열번호 18의 101번째 위치; 서열번호 19의 101번째 위치; 및 서열번호 20의 101번째 위치로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계를 포함하는, 한우육의 동일성을 판별하는 방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 (b) 단계는 분리된 핵산 분자를 주형으로 하고, 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행함으로써 표적 서열을 증폭한 후 증폭 산물을 검출하는 과정을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 프라이머는 서열번호 21과 22의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56의 서열을 갖는 프라이머쌍; 서열번호 57과 58의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 서열번호 59와 60의 서열을 갖는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항에 있어서,
   상기 멀티플렉스 PCR 반응 조건은 95℃에서 15분 1회 진행하고, 95℃에서 20초와 60℃에서 40초 및 72℃에서 60초를 30회 반복한 후, 72℃에서 3분 1회 진행하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제7항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 12.5~100ng의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 서열번호 21 내지 서열번호 60으로 구성되는, 한우육의 동일성 판별을 위한 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트.
12. 제11항의 프라이머 세트, 멀티플렉스 PCR 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 포함하는 한우육의 동일성 판별을 위한 키트.

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