KR101351990B1

KR101351990B1 - 한우 동일성검사를 위한 단일염기다형성 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101351990B1
Application number: KR1020110128050A
Authority: KR
Inventors: 신형두
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2011-12-02
Filing date: 2011-12-02
Publication date: 2014-01-16
Also published as: KR20130061797A

Abstract

본 발명은 한우의 한우의 개체인식 및 혈통확인에 유용한 SNP 마커를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 SNP 마커를 이용하여 한우의 개체인식 또는 혈통확인 방법 및 한우의 개체인식 또는 혈통확인용 키트를 제공한다. 본 발명의 SNP를 이용하면 한우의 개체인식 및 혈통을 간편한 방법으로 판단할 수 있으며, 이를 토대로 한우의 개체별 추적이 가능하여 효율적으로 생산이력체계를 운용할 수 있다.

Description

한우 동일성검사를 위한 단일염기다형성 및 그의 용도{Single Nucleotide Polymorphisms for Individual Identification of Hanwoo and Use Thereof}

본 발명은 한우 동일성검사를 위한 단일염기다형성 및 그의 용도에 관한 것이다.

건강에 대한 관심이 늘어나면서 식육에 대한 소비자들의 요구도 단순히 양적인 측면에서 안정성과 질 위주로 변화하고 있으며, 특히 생산지(브랜드) 그리고 생산에서 소비에 이르는 유통과정상의 신뢰성을 중요하게 생각하고 있다. 이런 변화에 따라 유럽연합에서는 유통되는 소고기에 대한 생산이력제를 실시하여 개체번호, 생산지, 생산자 등 다양한 정보를 표시함으로써 축산물의 신뢰성을 높이고 있다. 최근 들어 한우육의 경우에도 수량적인 측면보다는 축산물의 안정성과 품질, 제품을 구매하는 데 있어서 제품의 진위성 등에 초점이 맞춰지고 있다. 즉, 소비자는 광우병과 같이 사람과 소가 공통으로 가지는 질병을 차단시켜 안전성이 입증된 소고기를 구매하려 한다.

한편, 우리나라 한우산업은 외국산 소고기의 수입개방에 따른 위기감으로 농가들의 산업적 기반이 위협받고 있다. 이러한 현상은 FTA 체결로 인한 값싼 미국산 소고기가 수입됨에 따라 가격면에서 이들과의 경쟁이 불가능하다는 사실에 근거를 두고 있다. 이로 인해 한우가 가격 경쟁력을 갖추고 안전성을 확보하여 시장에서 살아남기 위해 원산지표시제와 생산이력제를 적극적으로 도입하려는 추세이다.

최근 식량산업에서는 원산지표시(originality)와 함께 생산이력체계(traceability)가 국가, 지역, 농가에 따라 농산물을 차별화할 수 있는 중요한 관리방법으로 제시되고 있으며 일부 선진국에서는 이미 관련 기술을 실제 농산물 관리에 도입하여 활용하고 있다. 생산이력체계는 계속적으로 개체별 송아지의 성장과정에서 일어나는 능력, 관리, 질병 등에 대한 기록이 이뤄지고 도축·가공 과정과 소비자들에게 유통되는 과정에도 최초 송아지에 부여했던 고유번호(이표번호)가 유지되어 출생에서 소비자 식탁까지 전과정이 전산시스템으로 운영되는 컴퓨터정보기술을 기반으로 하는 체계이다. 그러나 이와 같은 생산이력체계는 소의 고유번호가 가진 정보에만 의존하기 때문에 고유번호가 오기/유실된 경우 추적이 불가능하다는 단점이 있다. 따라서, 생산이력체계가 효과적으로 작동하기 위해서는 생명공학기술을 접목시킬 필요가 제기되었고, 기존에는 혈액형 및 생화학적인 지표의 다형성 분석방법을 사용하였으나 이런 기법들은 분석을 위해 사용되는 조직들이 한계가 있다는 단점을 가지고 있다. 더구나 소에 있어서 혈액형 검사는 정확한 부계혈통을 결정하지 못하는 단점이 있다. 이로 인해 최근 들어 DNA 다형성에 기초한 다양한 유전적 분석 방법들이 개발되었으며, 이를 이용하여 품종간 및 개체간의 동정이 이루어지고 있다. 최근의 생산이력체계는 소 DNA 마커를 이용한 유전자 감식기법이 활용되고 있다. DNA 마커는 MS(microsatellite)와 SNP(single nucleotide polymorphsim)로 나눌 수 있으며, 현재 MS 마커(ISAG, International Society for Animal Genetics)가 소 유전자 감식을 위해 주로 이용되고 있다.

소의 유전체 중 40% 정도의 염기서열이 반복적으로 이루어지는 MS DNA의 반복염기서열로 밝혀져 이러한 반복염기서열에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. MS는 단순서열반복(simple sequence repeats; SSRs), 짧은 탠덤 반복(short tandem repeats; STRs) 또는 단순서열길이다형성(simple sequence length polymorphisms; SSLPs)으로도 불리며 이들은 2 내지 6 개 정도의 염기서열이 반복되는 DNA군으로 게놈 내에 골고루 분포하고 매우 높은 다형성을 나타내는 비암호화 DNA 서열에 해당한다(Zajc I and Sampson J., J Hered 90:104-107, 1999). MS 변이는 반복 단위(repeat units)의 수에 있으며 이들 반복 단위 수의 차이는 DNA 복제 시 일어난 ‘슬리피지(slippage)’에 의한 것으로 알려져 있다. 즉, DNA 중합효소(polymerase)가 반복 영역(repeat region)을 복사할 때 ‘슬리피지’가 일어남으로서 반복(repeat)의 수를 바꾸게 된다. 다양한 반복의 수는 이러한 슬리피지가 반복된 결과로 볼 수 있으며 이외에 감수분열시 불균등한 교차(unequal crossing)에 의해서도 일어날 수 있다고 한다. 특정 좌위(loci)에서 반복단위의 반복수를 따라 개체간의 다양성이 인정되는데(Koreth J, O'Leary JJ and McGee, J Pathol 179:239-248, 1996), 반복수에 품종간 다형이 있는 경우에 인접영역에 설계한 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 행하면, PCR 산물 길이에 다형이 관찰되고, DNA 다형을 검출하는 것이 가능해진다. MS를 이용한 다형검출 마커는 MS 마커라고 불리우고 있다(O. Parn명, X. Chen, S. R. McCouch, Mol . Gen . Genet . 252:597-607, 1996). 현재 소에서 약 천 개의 MS 좌위가 밝혀져 있으며, 이들의 특성 및 염색체 상의 위치파악이 이루어져 왔다. 이들 중 품종간, 개체간 다형성이 높은 MS 마커들을 선별하여 혈통검정을 위한 수단으로서 사용하고 있다. 그러나, 현재 주로 이용되는 MS 마커는 분석조건(기기, 시약, 실험자 등)에 따라 결과가 일정치 않아 사후에 한우개체인식 분석을 할 경우 결과가 부정확할 가능성이 매우 높다.

최근 한우판별 SNP 마커가 개발되어 한우와 수입육 구별에 사용되고 있으나 생산이력제를 위한 유전자검사에 사용할 수 없어서 1회 검사로 한우판별과 한우개체인식, 혈통확인이 가능한 유전자 검사법의 개발이 필요하다. 이에 본 발명에서는 유전자 지노타이핑 실험의 재현성이 뛰어나고 분석이 용이한 SNP 세트를 개발하였다.

SNP(Single Nucleotide Polymorphism)란 인종간 또는 연령간, 성별간, 염색체가 갖고 있는 염기 서열 중 개인 편차를 나타내는 염기변이를 말하여, 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이로 DNA 서열 다형성 중에서 가장 많이 존재한다. SNP 유전자는 기존의 마커들에 비해 보다 촘촘하고 안정한 맵을 작성할 수 있다는 점과 새로운 기술, 특히 DNA 칩을 포함하는 고효율기술(high-throughput technology)에 보다 적합한 특성, 즉 탐색에서 분석에 이르는 전 과정이 컴퓨터에 의해 고속으로 자동화될 수 있다는 점이 SNP의 차별화된 특성이라고 할 수 있다. 예를 들면, SNP 유전자는 고효율 지노타이핑(high-throughput genotyping)에 매우 유용하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 한우의 생산이력체계를 효과적으로 운용하기 위한 한우의 개체인식 및 혈통확인 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, NCBI 소(bovine) SNP 데이터베이스에 등록되어 있는 SNP 가운데 대립유전자빈도(allele frequency) 정보를 갖는 SNP를 선별하여 지노타이핑한 후 다수의 한우집단에서 각각의 한우개체를 구별해 낼 수 있는 SNP를 선별하여 이들이 한우 개체인식 및 혈통확인에 있어 판별의 정확도가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 한우(Hanwoo)의 동일성검사에 유용한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 한우의 개체인식 또는 혈통확인 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 한우의 개체인식 또는 혈통확인용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제96서열 중 어느 한 서열의 26 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되는 한우(Hanwoo)의 동일성검사에 유용한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명자들은 한우의 생산이력체계를 효과적으로 운용하기 위한 한우의 개체인식 및 혈통확인 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 다수의 한우집단에서 각각의 한우개체를 구별해 낼 수 있는 SNP를 선별하고, 이들이 한우 개체인식 및 혈통확인에 있어 판별의 정확도가 있음을 확인하였다.

본 발명의 SNP 마커는 소(bovine)에 적용되며, 가장 바람직하게는 한우(hanwoo)에 적용된다. 본 발명의 명세서에서 용어 "한우(韓牛, Korean Cattle, Hanwoo)" 는 종래부터 한반도에서 운반용이나 농경용으로 사육해오던 재래종의 역우(役牛)를 말하는 것으로 한국소(Bos taurus coreanae)를 의미한다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명에서 96개의 각 SNP들을 한우의 개체인식 또는 혈통확인에 사용할 수 있는 것은 상기 각 SNP 변이 위치에서 특정의 염기가 상기 형질과 관련하여 높은 빈도로 나타나는 것에 근거한 것이다.

본 발명은 상기 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제96서열에서 각 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중가닥의 gDNA(genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다.

본 발명의 SNP는 마이너 대립유전자 빈도(minor allele frequency; MAF)가 한우에서 0.4 이상이다. 대립유전자 빈도는 한 개체군내에서 하나의 특정한 대립유전자의 비율을 말하며, 이 대립유전자가 변할 때 진화가 진행되는 것을 의미한다. 또한, 한 대립유전자의 빈도가 증가할 때, 교체 대립유전자의 빈도는 감소한다. 이러한 변화가 개체군의 일부 또는 그 종 전체에 전파된다면 그 결과로 진화가 진행된다.

본 발명의 MAF 0.4 이상의 SNP는 메이저 대립유전자(major allele) 뿐만 아니라 마이너 대립유전자(minor allele)의 출현빈도가 높아 한우 개체확인을 위한 유전적 다양성이 충분하다. 또한 MAF 0.4 이상의 SNP 가운데 HWE P-value 0.01 이하의 SNP를 제거하여 실험의 불확실성을 제거하였으며, C/G 또는 A/T 형의 SNP를 제거하여 DNA 염기서열을 역으로 읽었을 때 나타날 수 있는 오류를 사전에 제거하고, 연관불평형 분석을 통해 동일한 정보를 가진(r² > 0.2) SNP는 제외하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 한우의 개체인식 또는 혈통확인 방법:

(a) 한우로부터 핵산분자를 분리하는 단계; 및

(b) 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제96서열 중 어느 한 서열의 26 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일염기다형성(SNP)의 염기서열을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계.

본 명세서에서 용어 “핵산분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, NewYork(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산분자는 한우의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻는다.

본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich(1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)) 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열 변화가 단일-가닥 분자 내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 식물체로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오타이드인 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제96서열 중 어느 한 서열의 26 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100 개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화 될 수 있는 서열을 포함한다.

보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다.

혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명 방법의 단계 (b)는 대립형-특이 유전자 증폭 방법에 의해 실시될 수 있다. SNP가 유전자 증폭 방법에 적용되는 경우, 특히 SNAP(single nucleotide amplified polymophism)라 통칭된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 유전자 증폭은 SNP 뉴클레오타이드인 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제96서열 중 어느 한 서열의 26 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍(primer pair)을 기본적으로 이용한다.

본 발명의 명세서에서 “프라이머(primer)”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭(참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al.(EP 329,822)), 리가아제 연쇄 반응(LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560(1989)), 중합효소 리가아제 연쇄 반응(Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR(WO 90/01069), 리페어 연쇄 반응(EP 439,182), 3SR(Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA(U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다. 증폭기술이 적용되는 경우에, 본 발명의 SNP 염기를 확인하기 위해 적합한 프라이머를 디자인하는 것이 중요하다.

본 발명은 (ⅰ) SNP 뉴클레오타이드인 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제96서열 중 어느 한 서열의 26 번째 뉴클레오타이드에 인접한 서열과 어닐링하며, (ⅱ) 3′말단의 뉴클레오타이드가 상기 SNP 뉴클레오타이드로부터 -1 위치의 뉴클레오타이드와 매칭되도록 디자인된 지노타이핑(genotyping) 프라이머를 이용하여 SNP 뉴클레오타이드의 염기 타입을 분석하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 증폭 반응액 중에 각각 상이한 색의 형광을 나타내도록 표지된 다이데옥시아데노신트리포스페이트(ddATP), 다이데옥시사이토신트리포스페이트(ddCTP), 다이데옥시구아노신트리포스페이트(ddGTP) 및 다이데옥시티미딘트리포스페이트(ddTTP)를 포함하여 증폭 반응을 시킬 수 있다.

상기와 같이 디자인한 지노타이핑 프라이머와 반응기질로서 ddATP, ddCTP, ddGTP 및 ddTTP를 반응액에 포함시켜 증폭 반응시키면 지노타이핑 프라이머의 3’말단으로부터 타깃 SNP 뉴클레오타이드와 매칭되는 1개의 염기만이 익스텐션(extension)되며, 익스텐션된 염기의 타입은 형광에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 이러한 방법에 의해 SNP 뉴클레오타이드의 타입을 결정할 수 있다.

PCR에 의한 증폭 반응의 조건 및 사용되는 시약과 효소는 당업계에서 통상적으로 공지된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 SNP 마커를 한우의 개체인식 및 혈통확인에 사용할 수 있은 근거는 상기 SNP 변이 위치에서 특정의 염기가 상기 형질을 갖는 한우에서 높은 빈도로 나타나는 것에 기초한 것이다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제96서열의 26 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일염기다형성(SNP)의 지노타입(AA, AB 또는 BB 형)을 비교하였을 때 96개의 SNP가 100% 일치하는 경우 동일 개체로 판단하며, 100% 일치하지 않는 경우 별개의 개체로 판단한다.

본 발명에 따르면, 상기 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제96서열의 26 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일염기다형성(SNP)의 대립유전자(A 또는 B 형)를 비교하였을 때 96개의 SNP가 100% 일치하는 경우 혈통관계가 성립되는 것으로 판단하며, 100% 일치하지 않는 경우 혈통관계가 성립되지 않는 것으로 판단한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 의하면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제96서열 중 어느 한 서열의 26 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 한우의 개체인식 또는 혈통확인용 키트를 제공한다.

상기 프라이머는 (ⅰ) SNP 뉴클레오타이드인, 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제96서열 중 어느 한 서열의 26 번째 뉴클레오타이드에 인접한 서열과 어닐링하며, (ⅱ) 3’ 말단의 뉴클레오타이드가 상기 SNP 뉴클레오타이드로부터 -1 위치의 뉴클레오타이드와 매칭되는 지노타이핑 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트에서 각각 상이한 색의 형광을 나타내도록 표지된, 다이데옥시아데노신트리포스페이트(ddATP), 다이데옥시사이토신트리포스페이트(ddCTP), 다이데옥시구아노신트리포스페이트(ddGTP), 다이데옥시티미딘트리포스페이트(ddTTP)를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu))로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 한우의 개체인식 및 혈통확인에 유용한 SNP 마커를 제공한다.

(b) 본 발명은 한우의 개체인식 또는 혈통확인 방법 및 한우의 개체인식 또는 혈통확인용 키트를 제공한다.

(c) 본 발명의 SNP를 이용하면 한우의 개체인식 및 혈통을 간편한 방법으로 판단할 수 있으며, 이를 토대로 한우의 개체별 추적이 가능하여 효율적으로 생산이력체계를 운용할 수 있다.

도 1은 진클래스2 소프트웨어(GeneClass2 software)를 이용한 한우개체인식 및 혈통확인의 정확도를 나타낸다. 96개 SNP를 이용한 개체인식검사에서 오류의 확률은 1.1x10^-34이었으며, 혈통확인검사에서 오류발생의 확률은 1.7x10^-18로 분석되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: SNP 유전자 개발 및 검증용 시료

농협젖소개량사업부의 한우 종모우 200 두, 축협서울공판장에서 한우 후대송아지 612 두 및 수입육 148 두 등 총 960 두를 SNP 유전자 개발 및 검증 실험에 이용하였다.

실시예 2: 후보 SNP 선발 및 지노타이핑( genotyping )

NCBI 소(Bovine) SNP 데이터베이스(http://ftp.hgsc.bcm.tmc.edu/pub/data/Btaurus/snp/Btau20040927/bovine-snp.txt)에 등록되어있는 SNP 가운데 대립유전자빈도(allele frequency) 정보를 가진 SNP 3,072개를 선발하였다.

선발된 3,072개의 SNP를 Golden-Gate Assay(Illumina, CA, USA) 방법을 이용하여 지노타이핑(genotyping)하였다. Golden-Gate Assay는 SNP 지노타이핑(genotyping)을 위한 비드어레이 기술(BeadArray Technology)로서 모든 SNP가 하나의 OPA(Olig Pool All)로 구성되며, 대립유전자 특이적 프라이머 신장(Allele Specific Primer Extension) 방법으로 증폭된 올리고들을 Veracode Bead에 혼성화(hibridization)시키고 형광스캐너인 비드익스프레스 리더(BeadXpress Reader)를 통해 읽어진 SNP 각각의 강도 데이터(intensity data)는 지놈스튜디오 소프트웨어(GenomeStudio Software)를 이용하여 자동으로 지노타입(genotype)이 결정된다. Golden-Gate Assay는 단일염기연장(Single Base Extension)이나 Taqman 방법으로 실험가능한 규모(100개 이하 SNP) 이상의 SNP를 지노타이핑하기 위한 최적의 방법으로서, 본 발명에 사용하였다.

한우 및 수입육 시료로 구성된 96 웰 플레이트를 이용하여 스트렙타비딘(streptavidin)과 비오틴(biotin)을 넣어 소 DNA를 활성화시키고 활성화된 DNA에 대립유전자 특이적 올리고(allele specific oligo), 좌위 특이적 올리고(locus specific oligo), 범용 PCR 프라이머(universal PCR primer) 올리고풀(oligo pool)을 넣어 혼성화하였다. 각 SNP에 특이적으로 결합된 올리고와 프라이머는 연장(extension), 리게이션(ligation) 과정을 거쳐 PCR 반응을 한 후 각 SNP 별로 특이적으로 생성된 형광 프로브(probe)를 비드칩(Bead Chip)에 붙이고 비드익스프레스 리더 (BeadXpress Reader)(Illumina)를 이용하여 형광이미지(scanning image)를 구현하였다. 지놈스튜디오 소프트웨어(GenomeStudio Software)(Illumina software, 형광이미지분석)를 이용하여 형광이미지를 기초로 각 SNP의 지노타입(genotype)을 결정한 후 통계분석에 이용하였다(Oliphant, A., Barker, D.L., Stuelpnagel, J.R. and Chee, M.S. BeadArray technology: enabling an accurate, cost-effective approach to high-throughput genotyping. Biotechniques, Suppl, 56-8, 60-1, 2002 참조).

실시예 3: SNP 유전자 발굴 및 검정(통계분석)

지노타이핑(Genotyping)이 성공적으로 완료된 2,852개 SNP의 MAF(Minor Allele Frequency)를 계산한 결과 MAF 0.4 이상, HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium) P-value 0.01 이하 SNP를 제거하여 실험의 불확실성을 제거하였으며, C/G 또는 A/T 형의 SNP를 제거하여 DNA 염기서열을 역으로 읽었을 때 나타날 수 있는 오류를 사전에 제거하고, 연관불평형 분석을 통해 동일한 정보를 가진(r² > 0.2) SNP는 제외하였다. 최종 96개의 SNP를 개체인식 유전자 세트로 선발하였다. 한우개체인식은 96개의 SNP 유전자의 각각의 지노타입(AA, AB 또는 BB 형)이 100% 일치하는 경우 동일 개체, 100% 일치하지 않는 경우 독립된 개체로 판별하였다. 또한 동일한 96개 유전자 세트는 후대소의 혈통확인에도 이용되었다. 종모우 200 두와 후대소 612 두를 무작위로 섞어 개체 정보를 알 수 없는 조건에서 유전자형을 비교하였다. 종모우의 대립유전자(A 또는 B 형) 중 1개가 후대소와 일치할 경우 그 대립유전자는 종모우로부터 유전된 것으로 보고, 96개 유전자 모두에서 일치할 경우 혈통관계가 성립된 것으로 보았다. 유전형비교는 진클래스2 소프트웨어(GeneClass2 software)를 이용하여 분석하였다. 진클래스2 소프트웨어를 이용한 분석결과는 도 1에 표시하였다. 96개 SNP를 이용한 개체인식검사에서 오류의 확률은 1.1x10^-34이었으며, 혈통확인검사에서 오류발생의 확률은 1.7x10^-18로 분석되었다.

한우 개체인식 SNP 유전자 96개의 MAF 및 HWE(Hardy-Weinberg equilibrium)

서열번호	SNPID	MAF	HWE
1	ID003	0.438	0.88
2	ID006	0.463	0.253
3	ID023	0.495	0.23
4	ID030	0.485	0.445
5	ID033	0.403	0.691
6	ID037	0.41	0.587
7	ID042	0.45	0.721
8	ID044	0.46	0.49
9	ID049	0.425	0.638
10	ID052	0.435	0.754
11	ID059	0.498	0.944
12	ID067	0.478	0.81
13	ID071	0.475	0.916
14	ID073	0.406	0.989
15	ID080	0.43	0.425
16	ID082	0.435	0.584
17	ID086	0.413	0.937
18	ID103	0.428	0.167
19	ID116	0.43	0.61
20	ID118	0.413	0.508
21	ID127	0.495	0.23
22	ID129	0.473	0.38
23	ID139	0.418	0.976
24	ID146	0.488	0.141
25	ID147	0.42	0.474
26	ID148	0.495	0.291
27	ID165	0.5	0.231
28	ID175	0.423	0.153
29	ID179	0.455	0.702
30	ID180	0.415	0.336
31	ID182	0.423	0.761
32	ID184	0.473	0.799
33	ID191	0.445	0.271
34	ID197	0.45	0.286
35	ID203	0.445	0.808
36	ID219	0.468	0.579
37	ID222	0.403	0.201
38	ID227	0.413	0.428
39	ID236	0.423	0.241
40	ID238	0.445	0.166
41	ID246	0.428	0.421
42	ID253	0.453	0.608
43	ID260	0.438	0.469
44	ID263	0.475	0.698
45	ID269	0.425	0.856
46	ID283	0.418	0.234
47	ID290	0.448	0.512
48	ID302	0.41	0.36
49	ID310	0.428	0.605
50	ID317	0.435	0.404
51	ID329	0.473	0.799
52	ID332	0.478	0.966
53	ID344	0.5	0.526
54	ID354	0.463	0.26
55	ID358	0.473	0.412
56	ID360	0.408	0.895
57	ID362	0.498	0.29
58	ID375	0.401	0.944
59	ID385	0.45	0.831
60	ID388	0.403	0.174
61	ID389	0.408	0.3
62	ID392	0.43	0.224
63	ID405	0.48	0.707
64	ID414	0.425	0.915
65	ID417	0.46	0.656
66	ID424	0.49	0.72
67	ID431	0.413	0.937
68	ID434	0.435	0.375
69	ID445	0.44	0.767
70	ID455	0.47	0.467
71	ID461	0.47	0.657
72	ID476	0.42	0.659
73	ID477	0.453	0.82
74	ID498	0.488	0.731
75	ID511	0.465	0.669
76	ID518	0.493	0.946
77	ID519	0.433	0.104
78	ID537	0.488	0.615
79	ID544	0.478	0.276
80	ID563	0.49	0.72
81	ID574	0.41	0.26
82	ID581	0.485	0.842
83	ID584	0.418	0.542
84	ID590	0.401	0.823
85	ID605	0.413	0.278
86	ID614	0.433	0.85
87	ID620	0.443	0.866
88	ID633	0.463	0.77
89	ID635	0.445	0.808
90	ID639	0.473	0.756
91	ID640	0.406	0.78
92	ID653	0.468	0.153
93	ID656	0.448	0.711
94	ID666	0.46	0.656
95	ID670	0.41	0.587
96	ID681	0.468	0.402

한우개체인식 및/또는 혈통확인용 SNP 유전자 96개의 서열 정보는 표 2와 같다.

한우 개체인식 및/또는 혈통확인용 SNP 유전자 96개의 플랭킹 서열(flanking sequence) 정보

서열번호	SNPID	플랭킹 서열 (좌[A/B]우)
1	ID003	ATTTAATGTGAGGGACTGGCCATTT[A/C]TGGCAGTGATTTCTTTATCAGTCTC
2	ID006	GCTCTGCTCTTAGAAATCAAAAACC[A/G]TCTCCCACACTTCCCTTCCAGACTT
3	ID023	ATGTTATCTTCATTGCATTCATTCT[A/G]CTTGGGGTTGTTGTCCTTATTGGAT
4	ID030	TGCTCTACCCTGATGACTTCATGCA[A/G]TGATGGTGAGACATGAGAACTAGGA
5	ID033	CTGACTCCATACATTCTGAAAGACT[A/G]TTTTGAAAAGAGTCTAGCAAGCAGC
6	ID037	GTATCATTTATGGGCAGGCTGGTAT[T/C]GGGTCAACTGTGACATCACACTCCG
7	ID042	TTGTTGGTACAGTAGCAGTCAAGTA[A/G]GAACTATACTGTTACGCCTGACCCC
8	ID044	GGTGCCTCTCACCAAGAAAATGAGG[T/C]GAAAACACACTTTAATATGAAATTG
9	ID049	TTCCTTCTTTTGTTAGACTATTGCC[T/C]ACTACAGGGTAGCAGGAGCAGGATC
10	ID052	AGGTTTGGAATGTGGGGTTGGTCAT[A/G]TCAAGTCTGGGAAGCTTATTAAACT
11	ID059	AGGCACAAGTGTCGCTACTTGTTTA[A/G]GTAGTGACTCGTATAGCTAGCCATA
12	ID067	GAGATTGGATGCTTAGTTGCTCAGA[T/C]TGAGAGAGGTGAATGAAGCCTGATT
13	ID071	GGGGGCATGACCATATCGCCATAAG[T/G]TTGTCACAGGAAGAGCTATGCTTAC
14	ID073	AGGGCCAAAATTTGAACTTGGACTA[T/C]CTGGTTCCCACACATATATATTTAA
15	ID080	AGTTCCAGGGTATATTCTGGAATCT[A/G]TATGTGCTGTGAAGGTCCTGAATCG
16	ID082	TCATGGCCGCAAGGTTACAAATTGC[A/G]AACTCAATGTCCTAATGTCAACACA
17	ID086	TGGTGGTAGGGGGTGGTCTGGTTTC[A/G]TGGTCAGAGACCTAGCAATCAGCTA
18	ID103	GGGATCTGACTGCTTCCTCACAGCT[A/G]TGTCTTTTCTCATAAACTTTCCCTT
19	ID116	TGACTCCTAATCTCACTGCCAGAAT[A/G]TGGGAGGCTTCAGGGCATCTGCTAT
20	ID118	CTTTTCAGATAAAACCCTAAGAATT[A/G]GTTCTCAGGGCCAACTCCTAATTTC
21	ID127	TTTAAGATGAAATGCATGCTTGTCT[A/G]TTAAATCAGGGGGAAAAAGAGGCCT
22	ID129	TCCTTTTGTTTCACGTATAAAAGAC[A/G]AGGGGACTTTTGCAAGTCTTCCCTC
23	ID139	GATCTCCAAGGGGTGTGAAGAGAGA[T/C]TCCACTGCATAAGTGATATTCAGAG
24	ID146	CTGGCCCCACCCAACTTCAGAGTCC[A/G]TGTTTTTCATGTCCTATTGCCTTGT
25	ID147	TTTTATAGCCGAAGTGTGGTAGGAA[A/G]TAGGCCCCAAGTTCCCTTGGCAACA
26	ID148	CAGAACACACAGTGAGACATAAACA[T/C]AAAATGCTGGTATTTGGTGCAATGC
27	ID165	CAAATATATACAGACACAGAGTCGC[A/G]GAAGCAGTCACGGTAGACCCAGGCC
28	ID175	AGGACGCAAGGAAGTACAACAGAAG[T/C]AAACACAGCAGGCCAGAACTCTGCT
29	ID179	GAGTAACAGCGCTTTAATTAGGATA[T/C]TATAGGAAGTGGGGCCCACGGCGGC
30	ID180	CCACGGTCTTGGAGAACCTGAAGTT[A/G]GAGTTGACCCGTGAACACATCCCTG
31	ID182	ATTAAGCCTATTTTCAAGAGCAGTT[T/G]TAGAGTCACGGGAAAATTGAGGGGA
32	ID184	GATTAAGGCCACAAAATTAAGGTCA[T/C]AAAGCTAGCAAGTTGCAAAGCAGAA
33	ID191	TTTAAGGAAATTAAATTGCACCCCA[T/C]ACCTAAGTATTTTTCAGTTTTTCTC
34	ID197	TTCAGGGAGAGAGGACTCAGTGATG[A/G]TGCCTGGGTTCAAAAACTGGGTGGG
35	ID203	ACGGCCTCTGACACCTATGGGAACA[T/G]GTCTATGAGCTGGTGAGCAGTGCTT
36	ID219	TGGCCAAGTTTTAATCTGCAATATT[A/G]AGGAAAATTCAGCACTCATCCAATG
37	ID222	TCATAACACGTTCTTATTTAAAAAT[A/C]AAGTTAGGCCTCCTTGCTTGAGTGG
38	ID227	GGAAGTATGGACAATGTAGACTGGG[A/G]ATATGAGTGAGAAAGAAGCTGATTT
39	ID236	TCTGCCTTTTTCCTCCTAGAGTCTA[T/C]TGGTTAGAGCCAGAAAAAAAGAGGA
40	ID238	AATAAATAACGCAGAATATAGCGAA[T/C]GCATGCCGTGAGCAGCAGGCTGAGG
41	ID246	AAATGTTTTTACACTCATTGATTCA[T/G]AGGAATTCTGTGGTCTGGGATGTCA
42	ID253	ACTTTTGGCACACACTAAACATGGA[T/C]ATTTATTGAGCTTTTATGGATTTCA
43	ID260	TGCTTGTATAAGGCCAAAACTGAGG[A/G]GAGTTTTATGGAAGCTAGACACCAT
44	ID263	TTGAAATATTCAGGTAGGGCCAATG[T/C]AATCCTAAAGAGCCTTATAAGACGT
45	ID269	GGCAGGGCCCGCCTCATTAGGTGGC[A/G]TGAGGATGCAGAGAGACAAGTACAT
46	ID283	GCCAATGCTTGATTCACACTAAACA[A/G]TTAGTATATGTGATTTTCTGTCCTT
47	ID290	AGACAGGATCAGCTTTGCATACAGA[T/C]AAATACTGCTGTACTTTGTGGAGAT
48	ID302	CTAAATTTAGGTCCTGGTTCTGCTA[T/C]AGCCCTGTTGTCTCAGACGTTTTCT
49	ID310	GCAACATGACACTTGATTCTTGATT[A/G]TCTCTTCCAGATGCAGAGTCAACTG
50	ID317	ATGAGCCATCACTCTAAATAGCACA[A/G]TGATAAAGGCCACTTGAAGAGTACC
51	ID329	AGGCAAAACCCTGTATTATAAATTA[T/C]AGCACACAAAGCTGAATTTGACCTA
52	ID332	TTGGTAGATAGAATCCTGTCCAGGT[A/G]TGTTGTCTCTAACAGAGAGATGCAA
53	ID344	TTGAGGAGGTCAGATGATTGCTCCT[A/G]TCAAGAGAGAATGGTCCTCAAAGCT
54	ID354	GGTAGAAATGACTTTGGGCTGAATT[T/C]TGAAGGACAGCCAGAAGTTTACCTA
55	ID358	GCCTTTTGGCTCCGAAAGAAAGGCA[T/G]CAATGAGCCAGAGGTCCTCTAATCT
56	ID360	AACACAGGCCTTGAAATAGGAAGAC[A/G]GGAGGAATGGGTTTCGGGTTGTCAG
57	ID362	AGCACCTTTTAGATGGCATTTCATA[T/C]CTTCATCTTGCTCTTTTAACACAAC
58	ID375	AAATTGTTCTTGCATAAGCACACAA[T/G]GACAGAGGTTTTATCTGTTTCGTCT
59	ID385	TTTTATGAAACTTCTTTTTGCAGGT[A/G]GATGTTAAAGGCCGAACAGGGAGTG
60	ID388	TTTGCATCCTAAAAATAAATAAAAG[T/G]CTCCAATTATAAATGTGGGGCTTCA
61	ID389	CTCAACTCAGTTTAAAGTGCTACAG[T/C]GTTGGCCCCAGAAGACCTTGCTGTA
62	ID392	AACCACTGTCACGTGAGGACACTCA[T/C]GTGTCCTAGTGGAGAGGGCCACCTG
63	ID405	ACTAAAACCAAACCAGGTTTAATAG[T/G]CTCACTTCCTCAAGCTTCTTCTCAC
64	ID414	ACCTGCAGGACTGGCCATCCTAAAT[T/C]ACCACAGAGCTCCACTCTACTTTAG
65	ID417	GGAAACATGGCCAAAAGCGAAGGAC[T/C]GTCACAGACTGAGGGAATAAAAATG
66	ID424	CAATGAAATCGCCTGTTGGACTTTG[A/C]GGTCACTTTCATCAGGCTCATGAAA
67	ID431	AAGAAATGTGAATGCAGTTTTTCTT[A/G]TGGGTCAATTGGCTTTTCTAGGAGG
68	ID434	AGTCTTGGAGGTTCCCAGAGCCCCA[A/G]ACACTCCCTAAAGCTCTGTAGGGAT
69	ID445	AAAAGATGTCTTCTTTCCCATCCAT[T/C]GTCTTTCTCAAGATGATTTTATATG
70	ID455	GGACAGGGCCCAAAATCAGTAAAAC[A/G]TTTATCCTCAGGGCTCAGAGATATC
71	ID461	CACAGGTTTAAGAATTTTGTCTTCA[T/C]TCTGAGAGCAAGTCTTTACACCACT
72	ID476	GGCCGATATAAGTCATCCTCACTCT[A/C]TTTTGCTCTTTCTTTCAGGAAAGGG
73	ID477	TGGAAAGACCAGAAGGGAATTTCTA[A/G]ATAATTCTAATCCAACTAGTGGCCC
74	ID498	ATCAAATTTTTCACAGTGATTTCAC[A/G]TGCAGTGATTCAAAGACTGTGGAAA
75	ID511	CATTGTGAAAAACATTGTGATAGTC[A/C]TGGACCTGAAGAATTACAAGTGTGT
76	ID518	GGCCTCAGTGTTACAGGAGAAGCAT[A/C]TGTATTGGATACCAAGCATTTATCT
77	ID519	AAGCAGGCCTCTATCAGGACAGAAA[A/G]TCAAGGCTGGCTAAGCAAATGGTAC
78	ID537	GCCAGAAAAAGCCATGCCCTTACCT[T/C]AATAGTTTCATGAGTTGTGTTTTGT
79	ID544	GAGGCCACTGTAACTACACTGCCTG[A/G]TGTTCACCCAGCCTTTCACACAAGG
80	ID563	GGAAGGATGCCAACTTAACAGATGA[A/G]CAGAAAGTGCCAAGGCCAAGAGTCC
81	ID574	TTTTGCCACATGGAGAAAATTGACT[T/C]GGACAGAGCTACCATGATTATTGCT
82	ID581	CTCCTCTTCCTTAAGGAGCCCCCAG[A/G]TTTTCCCAGTACTGCTCCTTTTGCC
83	ID584	TGTACTGTCTCCTTAAGAAGGGCCT[A/G]TGTTTTCAGAGGCTATAGCATAGGA
84	ID590	CCTGACCCTGTGAGCAGATACTGTT[A/C]CTGTTAACATGGAAACCCTAAACTC
85	ID605	AGCAATTTTTACTCCAGTAATTTTA[T/C]CTTTCTAATGCCACCTGTTGTCTGA
86	ID614	GGGAAGTCCTTTCGGAATCCAAGTG[A/G]TTATGTCAGGATACTGCTGTGCAGA
87	ID620	GAATGTTAGACCCATATGTGCATCA[A/G]AGGTAAGAGATATCTTTAGAGGGAC
88	ID633	CCCAGCTCAGGCTAGAGCCACACAG[A/G]ATCTCCCTGCTGGTTAGTTATTTCC
89	ID635	TGCTTCACTATCATCGTAGCAAGCT[A/G]TTTTCTTCTATCACACAGCAACCTC
90	ID639	GCATATTTTATTCTTATTTGGCCAC[A/G]ACTGCCATCATTCAGCTCCTTATCT
91	ID640	ACACAAGAAATCAGAACATTTGTTC[T/C]TCTGGGCCACAGGGAATACTGGTGT
92	ID653	CAAAATGAACGTGTTATAATTATTA[T/C]AATTGTGGAAAGACCTCCAGGCCCC
93	ID656	ACAGCCATGGACCCCACATGAGTGT[A/G]ATACCTGCATCTGCACTTCTCTGCC
94	ID666	ATGTGGTTTCTACTCCCACTTTTTC[T/C]CTCTGCACACGGATGGAGATGAGAC
95	ID670	CACAACTCTCCACCTTATCTTTCCT[A/G]TTAGCTTGGCCAATAGAGAGTGGAT
96	ID681	ATGTGCTGGAAAGAGCTCAGTGTTA[A/C]AGAGTCAAGAATGTAATTTGAGCTG

표 2에서 [A/B]는 염기 A가 염기 B로 점돌연변이된 SNP임을 의미한다.

실시예 4: 한우 개체인식 및 혈통확인 결과

총 96개 SNP 유전자 세트의 실증성 검증을 위해 한우 812 두에서 한우 개체인식 능력을 검사하였다. 한우별 96개 SNP 유전자의 각 지노타입(AA, AB 또는 BB 형)을 비교하였을 때 96개의 SNP 유전자가 서로 100% 일치하는 경우 동일 개체, 100% 일치하는 않는 경우 독립된 개체로 하였다. 분석결과 812두의 한우 가운데 지노타입이 100% 일치하는 경우는 없었다(1차 검정). 지노타입이 같은 개체가 없음을 확인한 후 2차 검정을 실시하였다. 2차 검정(재검정)은 시료의 정보를 알 수 없는 조건에서 1차 개체인식 SNP 유전자의 결과와 동일한 지노타입을 보이는 개체를 찾아냄으로서 한우 개체인식 SNP 유전자의 검정력을 확인하기 위해 수행하였다. 분석결과, 2차 검정으로 한우 812 두 모두 1차 검정결과와 일치하는 개체를 각각 확인할 수 있었으며 이는 96개의 SNP 유전자 세트가 한우 개체인식 SNP 유전자로서 활용 가능하며 결과의 재현성이 우수함을 보인 것이다.

한우 개체인식 SNP 유전자로서의 활용성 검정과 동시에 혈통확인 능력도 검정하였다. 본 발명을 위한 한우 812 두 확보 시 종모우 200 두와 후대소 612 두를 포함시켰으며, 후대소 612 두는 무작위로 섞어 개체 정보를 알 수 없는 조건에서 지노타입을 비교하였다. 종모우의 대립유전자(A 또는 B 형) 중 1개가 후대소와 일치할 경우 그 대립유전자는 종모우로부터 유전된 것으로 보고, 96개의 SNP 유전자 모두에서 일치할 경우 혈통관계가 성립된 것으로 보았다. 분석결과, 후대소 612 두 전체에서 96개 SNP 유전자의 대립유전자(A 또는 B 형)가 100% 일치하는 종모우를 찾아낼 수 있었으며 이 결과로 본 발명의 한우 개체인식 SNP 유전자 세트가 한우 혈통확인에도 이용 가능함을 보였다.

실시예 5: 한우판별 마커와 개체인식 및 혈통확인용 유전자 세트의 통합 분석(통계분석)

기존에 사용되고 있는 한우판별마커 90개와 본 발명의 한우개체인식 및 혈통확인마커를 통합하여 GoldenGate Assay를 실시한 결과 한우 812 두와 수입육 148 두를 100% 정확도로 판별하였다.

현재 한우 생산이력체계는 최초 송아지에 부여했던 고유의 이표번호를 한우의 출생에서 소비까지 전산시스템으로 운영하는 컴퓨터정보기술을 기반으로 하는 체계이다. 그러나 이와 같은 생산이력체계는 한우의 고유번호가 오기/유실된 경우나 도축 후 유통과정에서는 추적이 불가능하다. 따라서 최근의 생산이력체계는 소 DNA 마커를 이용한 유전자 감식기법을 도입하는 추세이다. 그러나 현재 주로 이용되는 MS(microsatellite) 마커는 분석조건(기기, 시약, 실험자 등)에 따라 결과가 일정치 않아 사후에 한우개체인식 분석을 할 경우 결과가 부정확할 가능성이 매우 높다. 이에 본 발명에서는 유전자 지노타이핑 실험의 재현성이 뛰어나고 분석이 용이한 SNP를 이용한 유전자 세트를 개발하였다.

본 발명에서 다수의(96개) SNP 유전자를 이용한 것은 유전자의 개수가 증가할수록 정확도는 기하급수적으로 높아지기 때문이며, 최근 분석기술의 발달로 유전자 개수 증가에 따른 분석비용 증가라는 단점을 극복할 수 있는 여러 가지 방법이 개발되었기 때문이다.

본 발명에서 개발한 SNP 유전자 세트를 이용하여 국내 약 200만 두 한우의 유전형을 각각 데이터베이스화하여 체계화시킨다면 현재의 한우생산이력체계의 단점을 보완하여 고유 이표번호가 없는 모근, 혈액, 고기 상태에서도 한우 개체인식이 가능할 것이며, 정확한 한우 혈통확인을 통하여 정부기관의 한우육종/관리사업에 기반 기술로 이용될 것이다. 추가로 한우판별을 동시에 검사함으로써 한우가 아닌 소가 한우로 둔갑하여 관리되는 것을 사전에 방지할 수 있을 것이다. 또한 전체 한우유전자가 데이터베이스에 등록됨으로서 고의로 오기되어 유통되는 수입육을 선별해 내는 등 쇠고기 원산지 판별이 가능할 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

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다음의 단계를 포함하는 한우의 개체인식 또는 혈통확인 방법:
(a) 한우로부터 핵산분자를 분리하는 단계; 및
(b) 서열목록 제1서열의 26 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일염기다형성(SNP)의 염기서열을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계.
제 3 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 핵산분자는 한우의 근육, 표피, 혈액, 뼈 또는 장기로부터 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식 또는 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 서열목록 제1서열의 26 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일염기다형성(SNP)의 지노타입(AA, AB 또는 BB 형)을 비교하였을 때 100% 일치하는 경우 동일 개체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 서열목록 제1서열의 26 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일염기다형성(SNP)의 대립유전자(A 또는 B 형)를 비교하였을 때 100% 일치하는 경우 혈통관계가 성립되는 것을 특징으로 하는 방법.
서열목록 제1서열의 26 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 한우의 개체인식 또는 혈통확인용 키트.
제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 서열목록 제2서열 내지 서열목록 제96서열 중 어느 한 서열의 26 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일염기다형성(SNP)의 염기서열을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제2서열 내지 서열목록 제96서열 중 어느 한 서열의 26 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.