KR102173458B1

KR102173458B1 - 국내산 소의 신체충실지수 예측용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102173458B1
Application number: KR1020190132106A
Authority: KR
Inventors: 김종주; 이윤미
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2020-11-03

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 부터 서열번호 12까지 각 61번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측용 SNP 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

국내산 소의 신체충실지수 예측용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이의 용도{Single nucleotide polymorphism marker composition for prediction of body condition score of domestic cow and uses thereof}

본 발명은 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

가축개량은 전통적으로 개량목표 달성에 적합한 가축을 종축으로 선발하고 선발한 가축을 적절한 교배체계를 통하여 능력이 우수한 후대를 생산하는 방식으로 이루어져 왔다. 우수한 개체를 선발하는 기술은 단순히 선발하고자 하는 개체의 표현형에 근거하여 선발하던 방식에서 개체 자신의 능력과 혈연관계가 있는 개체의 능력을 모두 이용하여 개체별 유전능력을 추정하고 이를 바탕으로 선발하는 방법으로 발전해 왔다.

국내산 소의 체중 관련 형질에 있어서, 마르거나 과비된 몸 상태를 판단하기 위해 신체충실지수(body condition score, BCS)가 하나의 지표로 사용되고 있으며, 비유 또는 번식단계에 따라서 적합한 BCS를 유지하는 것이 중요하다. 신체충실지수의 과다한 감소 및 과비할 경우 경제적 손실 및 질병의 발병 가능성이 높아진다. 국내산 소의 적합한 신체충실지수를 알기 위해 대용량 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 정보를 활용해 국내산 소의 신체충실지수를 규명할 필요가 있다.

신체충실지수(BCS)는 암소의 임신 및 포유능력을 측정하는 지표로 사용되며, 비만정도를 1(마름)에서부터 5(비만)의 척도로 나타내는 지수이다. 젖소의 평균 BCS는 3.0~3.5로 나타나며, 3.0 미만일 경우 유량감소와 재임신이 어려울 수 있으며, 3.5 초과일 경우 난산, 유열(milk fever), 또는 사료효율 저하를 가져올 수 있다. 따라서, 신체충실지수에 관련하는 주요 유전자 또는 유전자 주변의 genetic marker를 발굴한다면, 경산우(송아지를 생산하는 암소) 또는 미경산우의 선별 여부에 주요 지표로 활용할 수 있을 것이다.

한편, 한국등록특허 제1823209호에는 '단일염기다형성 마커를 포함하는 한우 품종 판별용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1980815호에는 '소의 도체형질 판별용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 국내산 소의 신체충실지수 예측용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 국내산 소 667두의 시료를 수집하고 게노믹 DNA를 추출하여 Illumina bovine 50k chip을 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석을 수행하였다. 수집된 SNP를 두 단계로 전장유전체연관분석(genome-wide association study)을 수행한 결과, 신체충실지수에 대해서 통계적 유의성을 가지는 12개의 SNP 마커를 도출함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 부터 서열번호 12까지 각 61번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 국내산 소 개체의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 각 SNP 위치(서열번호 1 부터 서열번호 12까지 각 61번째) 염기의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 국내산 소의 신체충실지수 예측 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치(서열번호 1 부터 서열번호 12까지 각 61번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수 예측용 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용하면 국내산 소의 신체충실지수를 신속하게 예측 또는 판별할 수 있으므로, 암소를 경산우(송아지를 생산하는 암소) 또는 미경산우용으로 선별하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 부터 서열번호 12까지 각 61번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 12는 상기 각각의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 서열번호 1 내지 12는 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열이다. 용어 "다형성 서열(polymorphic sequence)"이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 1 부터 서열번호 12 까지 모두 61번째로, 다형성 염기 정보는 표 4의 염기서열 정보에 [/]로 표시하였다.

본 발명의 SNP 마커를 국내산 소의 신체충실지수 예측에 이용할 수 있는 것은 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 61번째 염기(뉴클레오티드)의 유전자형이 C, 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 T, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 A, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 T, 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 8로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 T, 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 11로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 C, 또는 서열번호 12로 표시되는 염기서열의 61번째 염기의 유전자형이 A으로 확인될 경우, 소의 신체충실지수 3.0 내지 3.5 (1~5 score 기준)와 상기 SNP 마커의 각 유전형이 통계적 유의성을 보였기 때문이다.

본 발명에 있어서, 상기 국내산 소는 한우 또는 젖소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 국내산 소의 신체충실지수 예측용 SNP를 구성하는 각 단일 SNP의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 8개 이상의 연속 염기이며, 더욱 바람직하게는 15개 이상의 연속 염기이며, 가장 바람직하게는 서열번호 1 내지 12의 각 염기서열이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다. 프라이머의 제작은 당업계에 공지된 소프트웨어 또는 웹 서비스를 통해 이루어질 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수 예측용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 국내산 소의 신체충실지수 예측용 키트는 하기 프로브 또는 마이크로어레이가 포함된 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한,

국내산 소 개체의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 부터 서열번호 12까지 각 61번째) 염기의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측 방법을 제공한다.

본 발명의 예측 방법은 국내산 소 개체의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료는 근육, 표피, 혈액 또는 털 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB(Cetyl trimethylammonium bromide) 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함한다.

분리된 DNA의 염기서열의 결정은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 디데옥시법에 의한 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나, SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 혼성화의 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA 만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으며, 그외 전기적 신호 검출방법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 예측 방법에 있어서, 상기 분리된 게놈 DNA 주형에서, 서열번호 1의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 2의 61번째 염기의 유전자형이 T, 서열번호 3의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 4의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 5의 61번째 염기의 유전자형이 A, 서열번호 6의 61번째 염기의 유전자형이 T, 서열번호 7의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 8의 61번째 염기의 유전자형이 T, 서열번호 9의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 10의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 11의 61번째 염기의 유전자형이 C, 또는 서열번호 12의 61번째 염기의 유전자형이 A이면 국내산 소의 신체충실지수가 3.0 내지 3.5인 것으로 예측하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 부터 서열번호 12까지 각 61번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측용 프로브를 제공한다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 매칭되거나 일부 미스매치로 실질적으로 매칭되는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오티드인 서열번호 1 내지 12의 각 61번째 위치의 뉴클레오티드를 포함하는 8 내지 100 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에서 국내산 소의 신체충실지수 예측용 마이크로어레이는 본 발명의 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다. "마이크로어레이"란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. 용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 국내 소 시료 수집 및 Illumina bovine 50k chip 분석

시료는 국내산 소 667두의 시료(혈액 또는 모근)를 수집하여 게노믹 DNA를 추출하여 Illumina bovine 50k chip(Illumina, 미국)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 SNP 분석을 실시하였다. 분석에 사용된 소 667두의 신체충실지수는 5점 score 기준으로 분류하면 다음과 같다: BCS 1: 1 마리, BCS 1.5: 1 마리, BCS 2: 19 마리, BCS 2.5: 119 마리, BCS 3: 301 마리, BCS 3.5: 184 마리, BCS 4: 33 마리, BCS 4.5: 9 마리, BCS 5: 0 마리. 상기 신체충실지수 점수는 국립축산과학원의 평가지침에 근거한 것이다.

실시예 2. SNP Chip을 이용한 전장유전체연관분석(genome-wide association study, GWAS) 분석

소의 신체충실지수 예측용 분자마커를 개발하기 위해 사용한 SNP 자료 수집 현황을 정리하면 하기 표 1과 같으며, 최종적으로 2017~2018년도의 상보적인 SNP를 포함하여 49,203개의 SNP를 정리하였다. 그 후, 중복개체 및 의심되는 중복개체를 제거하여 2,329 개체를 정리하였다.

SNP 자료 수집 현황

	No. ids	row_snp	최종 SNP 수
2017_1	642	46,163	46,133
2017_2	1,160	54,057	54,027
2017_3	921	53,218	50,345
2018_1	500	54,609	52,856
	500	54,609	52,856
	92	54,609	52,856
2018_2	129	53,218	51,249
2018_2	75	53,218	51,249

검정형질은 SNP 정보를 가진 개체와 그 외의 개체를 포함하였으며, 25개의 선형심사 자료로 2010년에 개정된 1~9점의 단계로 점수화된 한국종축개량협회의 표준평가방법을 적용하였다.

먼저, 수집된 SNP 자료에 대한 QC(Quality Control)를 수행하였다. 구체적으로는 최종적으로 정리된 49,203개의 SNP, 2,329 개체 대상 중 유전적 쌍둥이 개체 제거를 위해 IBS(Identity by State) 테스트를 진행하였다. 전체 집단을 대상으로, PLINK 프로그램(http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/)을 이용하여 각 개체간의 동일 마커에서 유전자형의 유사성을 판별하였고, 해당 유사성이 100% 또는 99% 이상인 경우 쌍둥이 개체로 판별하여 해당 개체를 제거하였다. 그 결과, 쌍둥이 개체가 총 21쌍(42두)으로 확인되어 이를 제거하였다.

다음으로, 분석에 이용할 상염색체 마커 49,203개에 대하여 다음의 3가지 QC 기준을 적용하였다: 유전자형 call rate 90% 이상, HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium) p-value > 0.000001 및 MAF(Minor allele frequency) > 0.01. 상기 조건을 만족하지 못하는 마커를 제거하고 남은 38,720개의 마커를 추후 분석에 사용하였다. 또한, 분석에 이용한 2,287두에 대하여 개체 유전자 마커 call rate 90% 이상을 만족하지 못하는 81두 개체는 제거하고 최종 2,206두를 이용하였다.

최종 ISB 테스트 및 QC 결과

Method	contesnt	remove
IBS test	유전체 마커 이용한 쌍둥이 개체 검사	42두
SNP QC	ID call rate 90% 이하	81두
	SNP call rate 90% 이하	510
	HWE p-value <10^-6	1,113
	MAF <0.01	8,860

실시예 3. GBLUP(Genomic best linear unbiased prediction)을 이용한 GWAS 분석

분석형질 중 1산차 데이터 667두만 이용하여, animal model에서 SNP 정보를 활용한 개체들간의 G matrix(GCTA software)를 사용하였다. 외형 형질에 대하여 아래와 같은 일반 선형 모델(animal model)을 적용하였다.

Y = Xb + Za + e

[Y: 표현형 벡터, b: 고정효과로 y 절편, 비유단계(12), 월령그룹(3), e: 잔차벡터, a: 임의 효과로 개체효과, 농가-분만연도-분만계절, 농가]

분석은 상용 animal model을 수행하는 ASREML 4.0 프로그램(https://www.animalgenome.org/bioinfo/resources/manuals/ASReml3/asreml_release_notes.htm)을 구동하여, 분석형질에 대해 single trait model를 사용하여 표현형 잔차(공변이)를 수집하였고, 각 표현형 잔차로 PLINK 프로그램을 이용하여 single marker simple regressin 분석을 실행하였다.

Y_residual = β₀ + β_addX + e

[Y: 표현형의 잔차, β₀: y 절편, e: 잔차벡터, β_i: SNP효과 크기값(add=상가적), X: 효과 계수 matrix로 additive AA, AB, BB 유전자형에 대하여 1, 0, -1 값을 부여함]

상기와 같은 연관분석 결과, 유의수준이 1×10^-3 이하인 p 값을 가진 SNP를 해당 형질과 통계적 유의도를 가진 연관성을 보인다고 판단하여 이들을 선별하였다. 그 결과, 하기 표 4과 같은, 국내산 소의 신체충실지수 형질에 대하여 유의적인 12개의 SNP를 확인할 수 있었다.

GWAS 분석을 통해 선별된 최종 SNP 마커

SNP_id	SNP(MinorA/MajorB)	Chr	Estimate	S.E.	-logP	σ2(SNP)/σ2(trait)
ARS-BFGL-NGS-24608	[C/T]	2	0.144	0.041	3.275	0.012
ARS-BFGL-NGS-119503	[T/C]	4	0.168	0.045	3.699	0.015
Hapmap34214-BES4_Contig204_631	[T/C]	4	-0.137	0.040	3.136	0.011
ARS-BFGL-NGS-72008	[C/T]	5	0.156	0.043	3.559	0.014
Hapmap34169-BES10_Contig488_621	[A/G]	5	0.183	0.053	3.282	0.013
BTA-74965-no-rs	[T/G]	5	0.200	0.056	3.370	0.014
Hapmap31932-BTC-042947	[T/C]	6	-0.190	0.057	3.029	0.012
ARS-BFGL-NGS-23438	[T/C]	13	0.184	0.049	3.719	0.015
ARS-BFGL-NGS-43096	[C/A]	13	0.155	0.044	3.284	0.013
ARS-BFGL-NGS-115958	[T/C]	19	-0.142	0.042	3.121	0.015
Hapmap52235-ss46526582	[A/C]	22	-0.162	0.043	3.745	0.015
BTA-54207-no-rs	[G/A]	22	-0.191	0.055	3.285	0.013
Estimate: 해당 형질에 대한 SNP의 Regression coefficient (SNP 효과)=βi: SNP효과 크기값(add=상가적) S.E. : Standard error of snp estimate -logP : 해당 검정 통계량에 대한 p값에 -log 취한값 σ2(SNP)/σ2(trait) : 표현형 분산 중 각 해당 snp로 설명되어지는 비율

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Single nucleotide polymorphism marker composition for prediction of body condition score of domestic cow and uses thereof <130> PN19381 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 1 atcacctgtg acaatactgt atgtgctggt gtgtgtgtgc atttcagatc tagcaggtga 60 tttaggcctg atttggctaa cagtagaatt tttcttcttt tctcatttcc gtatcaccaa 120 t 121 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 2 acggccacac tacctgatac cctctcatca ccaggcccct ggactgccct tacacaaggg 60 cgcagccagc ctccagtcga ccgtgctgtg atcgaacact tgcaacacca tactgacctt 120 c 121 <210> 3 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 3 gagcgactga tctaatctga tctgattcag gactttccca gtaatttagt agatagggat 60 cggcctgcca atgtagggga catgggtttg atccctggtc caggaagact ccacgtaccc 120 c 121 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 4 gagcgactga tctaatctga tctgattcag gactttccca gtaatttagt agatagggat 60 tggcctgcca atgtagggga catgggtttg atccctggtc caggaagact ccacgtaccc 120 c 121 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 5 tcttttatct taagaatccg ttatgtgtga ccacagccag ttagtttcat gtaacttcca 60 gaactgaaaa atccacacat ccaaatttct gttagcttga tttgtctctc tcacttgaga 120 a 121 <210> 6 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 6 ataaacaaga ttattcgaaa gaatacttta gtggtgtcta atactaatta agattattgg 60 gaaagaaacc taagggaatc aaaagaacaa agccagatgt atgttatagc aagataggca 120 g 121 <210> 7 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 7 agtcatgata ttgcagctct ttagccagat actatgaccc ataatatagg gtttaactgg 60 cgacaaaccg gtgtacgaag atatacatga atacgggatt gcttgctttt attcatgtca 120 g 121 <210> 8 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 8 aaagtgaaaa catgttttgg aactagttct gggtggtggc cacacagtgt tgtgaaggta 60 ctaagaatgc tacaaattgt acatttgtaa atgattaatt ttatgccatg tgaatttcat 120 c 121 <210> 9 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 9 atgagggtga aacggatgtt gagggagtcg atccgtagat tccactctgg cctctgctcg 60 acatctctga aacggtctct gggattctcc agtttgctgg atctcaggtg ggctggaaat 120 g 121 <210> 10 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 10 gggtcttatt tgtcccccaa aaggaatccc ataggtgtga tggcccagcc ccggctgccc 60 cgtctgctct ctgtcctaat ggatttgcct cttctggaca tttcatttca atggactcgt 120 a 121 <210> 11 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 11 gatccaagct ccattgtccc tttgatagat ggggggacag aaggttttaa aggaaatgcc 60 cgggtgattc tgcctggaat gactgcttgt attgaatgca cgctggaact atatccacca 120 c 121 <210> 12 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 12 agtgacattc attcattaac actatatact gagtgttgtg aggcagacaa taagaagcct 60 ataagtagat ggacttgata atttcagatc ataagtgctt caaagaagaa gaacttgatt 120 g 121

Claims

서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 서열번호 1 부터 서열번호 12까지 각 61번째의 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측용 SNP 마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 국내산 소의 신체충실지수 예측용 SNP 마커 조성물.
제1항에 기재된 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트.
제3항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측용 키트.
국내산 소 개체의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 각 61번째의 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측 방법.
제5항에 있어서, 상기 서열번호 1의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 2의 61번째 염기의 유전자형이 T, 서열번호 3의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 4의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 5의 61번째 염기의 유전자형이 A, 서열번호 6의 61번째 염기의 유전자형이 T, 서열번호 7의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 8의 61번째 염기의 유전자형이 T, 서열번호 9의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 10의 61번째 염기의 유전자형이 C, 서열번호 11의 61번째 염기의 유전자형이 C, 또는 서열번호 12의 61번째 염기의 유전자형이 A이면 신체충실지수가 3.0 내지 3.5인 것을 특징으로 하는 국내산 소의 신체충실지수 예측 방법.
서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 서열번호 1 부터 서열번호 12까지 각 61번째의 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측용 프로브.
제1항에 기재된 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 국내산 소의 신체충실지수(body condition score) 예측용 마이크로어레이.