KR102368835B1

KR102368835B1 - 한우의 육량 관련 hspb1 유전자의 유전형 결정용 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102368835B1
Application number: KR1020200126146A
Authority: KR
Inventors: 이윤석; 공홍식; 이홍구; 이원희
Original assignee: 한경대학교 산학협력단
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2022-03-02

Abstract

본 발명은 서열번호 2 내지 5의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 한우의 육량 관련 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 유전형 결정용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 HSPB1 유전자의 유전형 결정용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 HSPB1 유전자의 유전형 결정 방법에 관한 것이다.

Description

한우의 육량 관련 HSPB1 유전자의 유전형 결정용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer sets for determining genotype of HSPB1 gene related to meat of Korean native cattle and uses thereof}

본 발명은 한우의 육량 관련 HSPB1 유전자의 유전형 결정용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 한우의 육량 관련 HSPB1 유전자의 유전형을 결정하는 방법에 관한 것이다.

최근 한우산업은 지방선호도가 전보다 좀 덜해진 소비트랜드로 변화고 있다. 이러한 이유로 2019년 12월 1일부터 소고기 등급 제도가 개선되었는데, 근내지방도 기준을 완화하여 육질등급 결정방식을 일부 바꾸었고, 1종의 육량산식을 6종으로 개발하여 도체중량이 크면서 정육량과 정육율이 우수한 소의 변별력을 강화하였다(축산물품질평가원, 2020). 이러한 변화된 육류등급제에 따른 육량 및 육질의 극대화 방안 관련 더 정밀한 사양관리 시스템의 필요성이 대두되고 있다.

HSPB1 (Heat shock protein beta-1)은 많은 척추동물의 근육에서 발현되는 27 kDa 작은 열 충격 단백질(sHSP)로, 근육에서 HSPB1의 일반적인 기능은 생리적 스트레스로부터의 세포 보호, 세포 사멸의 억제 및 샤페론 활성이다. 또 최근 연구에서는 HSPB1이 근육 성장 및 발달과 밀접한 관련이 있는 육우의 사료효율과 관련이 있다고 보고되었다. HSPB1은 비육우의 생산성 향상을 위한 중요한 유전자이다.

이에 본 발명에서는 한우의 육량과 관련된 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 SNP (single nucleotide polymorphism) 다형성을 효율적으로 확인할 수 있는 대입유전자 특이적 프라이머 세트를 제작하고, 이를 활용하여 한우 HSPB1 유전자의 유전형을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.

한편, 한국공개특허 제2017-0049298호에는 HSPB1과 HSPB6의 단백질 수준을 이용한 '한우에서 영양 수준과 사료효율 개선 관련 바이오마커 단백질 및 그 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0059135호에는 소 유전자 ALB, VIM, HBB, FASN, COL6A3, ANXA2, ANXA5, ACTB, Tublin alpha-1B chain, TUBA1A, HBA, ACTA1, ACTA2, EHD2, COL6A2, HSPB1, DES, PLIN4, TUBB5, LUM, TF, FABP4, CKB, TKT, LDHB, APOA1, LGALS1, COL6A1, LAMB2, LAMC1, SERPINA3-2, IDH1, KRT7, HSPG2, YWHAG, ATP5B, HSPA1B, A2M, FGB, C3, PRELP, ALODA, TPM2 및 TPM1로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상 유전자의 발현을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 '소 육량등급 예측용 조성물 및 이를 이용한 예측방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 소 HSPB1 유전자의 SNP 다형성에 기반한 '한우의 육량 관련 HSPB1 유전자의 유전형 결정용 프라이머 세트 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 한우의 육량과 관련된 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 SNP 다형성을 효율적으로 판별할 수 있는 대립유전자 특이적 프라이머 세트를 고안하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 산물의 크기 판별을 통해 HSPB1 유전자의 유전형을 쉽게 확인할 수 있는 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2 내지 5의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 한우의 육량 관련 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 유전형 결정용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 한우에서 육량 관련 HSPB1 유전자의 유전형 결정용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 한우 개체에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물의 유전형을 분석하는 단계;를 포함하는, 한우의 육량 관련 HSPB1 유전자의 유전형을 결정하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 1,001번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한우의 육량 관련 HSPB1 유전자의 유전형 결정용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 한우의 육량 관련 HSPB1 유전자의 유전형 결정용 프라이머 세트는 대립유전자 특이적 프라이머 세트를 포함하여, HSPB1 유전자의 단일염기다형성(SNP)에 따라 각기 다른 크기의 증폭 산물이 생성되도록 하였다. 본 발명의 상기 방법은 종래 SNP 염기를 포함하는 증폭 산물에 제한효소를 처리하고 전기영동을 통해 유전형을 확인하던 방법에 비해 시간이 단축되는 효과가 있다.

도 1은 HSPB1 유전자 내 SNP를 기반으로 설계된 SNP 대립유전자에 특이적인 프라이머의 위치 및 상기 프라이머를 사용한 allele-specific PCR 실험원리에 대한 모식도이다. O.F, Outer forward primer; O.R, Outer reverse primer; I.F, Inner forward primer; I.R, Inner reverse primer.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 제작하기 위해 사용한 주형 서열(서열번호 1)로, 빨간색으로 표시된 염기가 SNP 다형성 위치이다.
도 3은 외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트의 농도비(2:1, 4:1, 6:1)에 따라 PCR을 수행한 후 전기영동한 결과이다.
도 4는 외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트의 농도비(6:1, 6:2, 6:3)에 따라 PCR을 수행한 후 전기영동한 결과이다.
도 5는 한우 10두의 게노믹 DNA를 이용한 대립유전자 특이적 PCR 결과 및 염기서열 분석 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 내지 5의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 한우의 육량 관련 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 유전형 결정용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2 내지 5의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 소 유래 HSPB1 유전자의 2,352번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기의 유전형을 결정하는 프라이머 세트이다. 상기 서열번호 6의 염기서열은 GenBank accession no. AC_000182.1의 서열에서 34,858,406 부터 34,861,075 까지의 염기서열이다.

본 발명에 따른 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드는 외부(outer) 프라이머 세트이고, 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드는 내부(inner) 프라이머 세트이다.

상기 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 외부 프라이머 세트는 SNP 위치 염기를 포함하는 HSPB1 유전자 부위를 표적으로 하는 프라이머 세트로, 상기 프라이머 세트에 의한 증폭 산물(319 bp)은 증폭 반응 그 자체에 대한 대조구로 기능한다. 또한, 상기 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 내부 프라이머 세트는 각 염기서열의 3' 말단 염기가 HSPB1 유전자의 SNP 염기에 특이적(상보적)으로 디자인된 것으로(도 1 참고), 각각 서열번호 2 또는 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 세트를 이루어 표적 서열을 증폭한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드는 3' 말단 염기가 HSPB1 유전자의 SNP 위치 염기 C에 특이적으로 결합되도록 고안된 것으로, 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 세트를 이루어 222 bp의 증폭 산물이 생성되고, 상기 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드는 3' 말단 염기가 HSPB1 유전자의 SNP 위치 염기 T에 특이적으로 결합되도록 고안된 것으로, 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드와 프라이머 세트를 이루어 148 bp의 증폭 산물이 생성된다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2 내지 5의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(27개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 2 내지 5의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명에 있어서, 상기 한우는 바람직하게는 거세한우일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 한우에서 육량 관련 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 유전형 결정용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 외부(outer) 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 내부(inner) 프라이머 세트를 포함하고, 상기 외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트가 몰농도 기준 5.5~6.5 : 2.5~3.5의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 키트에 있어서, 상기 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충용액 등을 포함할 수 있으며, 염화마그네슘을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

한우 개체에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물의 유전형을 분석하는 단계;를 포함하는, 한우의 육량 관련 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 유전형을 결정하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 유전형 결정 방법에 있어서, 상기 한우 개체에서 게놈 DNA를 분리하는 단계는 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 한우 개체의 시료 즉, 한우의 혈액, 각종 체액, 모근, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등으로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어 질 수 있다. 포유동물로부터 체액 및 조직, 생검 등을 획득하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 유전형 결정 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 외부(outer) 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 내부(inner) 프라이머 세트를 포함한다. 상기 외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트는 몰농도 기준 5.5~6.5 : 2.5~3.5의 비율로 혼합된 것일 수 있고, 바람직하게는 외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트가 몰농도 기준 6 : 3의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 유전형 결정 방법에 있어서, 상기 증폭 반응은, 95℃에서 10분간 반응; 95℃에서 30초, 63℃에서 30초 및 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 35회 반복; 및 72℃에서 5분간 반응;하는 단계로 이루어진 것일 수 있다. 본 발명에 따른 상기 증폭 반응 조건은 내부 및 외부 프라이머 세트가 상호 교차 반응하지 않으며, HSPB1 유전자의 SNP 위치 염기를 정확하게 증폭시킬 수 있는 최적화된 조건이다.

본 발명의 유전형 결정 방법에 있어서, 상기 증폭 단계 산물의 유전형 분석은 겔 전기영동을 통해 수행될 수 있고, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 HSPB1 유전자의 유전형 결정 방법에 있어서, 겔 전기영동을 통해 증폭 단계 산물이 319 bp와 148 bp의 2개 밴드를 나타내면 TT 유전형으로, 증폭 단계 산물이 319 bp, 222 bp 및 148 bp의 3개 밴드를 나타내면 CT 유전형으로, 증폭 단계 산물이 319 bp와 222 bp의 2개 밴드를 나타내면 CC 유전형으로 결정할 수 있는 것이다. 상기 CC 유전형은 다른 유전형에 비해 도체 특성 중 등지방 두께가 얇고, 육량 비율이 높다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 1,001번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한우의 육량 관련 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 유전형 결정용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 소 유래 HSPB1 유전자의 전체 서열 중에서 1,352번째 염기부터 시작하여 HSPB1 유전자의 3' 인접(flanking) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 서열번호 1의 염기서열에서 1,001번째 SNP 다형성은 T/C이다.

본 발명의 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 SNP 특이적 프라이머 제작

본 발명에 사용된 한우 게노믹(genomic) DNA는 농장에서 채취한 꼬리털 모근조직에서 AccuPrep^® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 추출하였다.

본 연구를 수행하기 위해 ensemble (http://www.ensembl.org)에서 HSPB1 유전자 내 SNP (rs110832311)를 검색하여 이에 대한 염기서열을 얻었다. 그 후, PRIMER 1 (http://primer1.soton.ac.uk)을 프라이머 설계 도구로 사용하였고, primer design for tetra-primer ARMS-PCR 프로그램을 사용하였다. Ensemble에서 얻은 염기서열을 입력하여 SNP 위치, 대립유전자, 증폭 크기의 범위를 설정하였다. 설계된 SNP 대립유전자에 특이적인 프라이머에 대한 정보는 하기 표 1과 같다.

도 1에 개시된 바와 같이 외부 정방향 프라이머(outer forward primer)와 외부 역방향 프라이머(outer reverse primer)가 결합하여 319bp의 산물이 증폭되고, 상기 산물은 증폭 반응의 대조구(control)로 기능한다. 또한, 3' 말단에 C 염기가 위치한 내부 정방향 프라이머(inner forward primer)와 외부 역방향 프라이머가 결합하여 C 대립유전자에 대해 222bp가 증폭되고, 3' 말단에 A 염기가 위치한 내부 역방향 프라이머(inner reverse primer)와 외부 정방향 프라이머가 결합하여 T 대립유전자에 대해 148bp가 증폭된다. 즉, 증폭 산물의 크기를 통해 유전자형을 알 수 있게 된다.

HSPB1 유전자의 SNP 특이적 프라이머

유전자	rs number	SNP		염기서열(5'→3') (서열번호)	증폭 크기(bp)
HSPB1	rs110832311	C/T	O.F	GCACGGCTACATTTCCCGTTGCTTCAC (2)	control : 319 C allele : 222 T allele : 148
			O.R	TTACTTGTTTTCCGGCTGTTCGGACTTCCC (3)
			I.F	TAACTCTCGTCTACCCTCTTTGCCCGGC C (4)
			I.R	GTCCACACCGGGGGGCAGCAT A (5)

O.F, Outer forward primer; O.R, Outer reverse primer; I.F, Inner forward primer; I.R, Inner reverse primer; Italic & bold letter, SNP specific nucleotide.

실시예 2. HSPB1 유전자의 SNP 특이적 프라이머 세트를 이용한 유전형 검증을 위한 증폭 반응의 조건 최적화

상기 표 1에서 제작한 SNP 특이적 프라이머를 이용하여 HSPB1 유전자의 SNP 위치의 유전형을 결정하기 위해, 외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트의 혼합 비율 최적 조건을 테스트하였다.

증폭 반응은 거세우 5두의 조직 DNA 주형, IP-pro Taq DNA polymerase (Labopass, Korea) 시약 및 C1000 Touch™ Thermal Cycler (Bio-rad, USA) 장비를 이용하여 수행하였다. 대립유전자 특이적인 PCR을 위한 PCR 반응물의 조성표는 하기 표 2와 같으며, PCR 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 초기 변성(initial denaturation) 10분 → [95℃에서 변성 30초, 63℃에서 결합(annealing) 30초, 72℃에서 신장(extension) 1분]의 과정을 35회 반복 → 72℃에서 최종 신장 5분. 증폭 산물은 1.5% 아가로스 겔을 이용하여 100V에서 40분간 전기영동하여 확인하였다.

대립유전자 특이적인 PCR을 위한 PCR 반응 조성

Components	Concentration		Volumes (㎕)
Components	Stock	Working	x1	x5
DNA Template	-	-	3	-
10X Reaction buffer	10X	1X	5	50
dNTP	each 2.5 mM	0.2 mM	4	40
Primer Mixture (O.F+O.R+I.F+I.R each 10pmole)	each 10 μM	each 0.2 μM	4	20
Taq DNA polymerase	2.5 U	2.5 U	4	5
ddH₂O	-	-	33	165
Total	-	-	50

도 3은 외부 프라이머 세트 : 내부 프라이머 세트의 농도비를 각각 2:1, 4:1, 6:1로 배합[반응물(50㎕)에 10μM 농도의 프라이머가 첨가되었을 때의 수행(working) 농도(0.2μM)를 기준으로 0.4μM : 0.2μM / 0.8μM : 0.2μM / 1.2μM : 0.2μM로 배합]하여 PCR한 후 전기영동한 결과이다. 상기 결과를 통해 외부 프라이머 세트의 농도를 내부 프라이머 세트의 농도보다 높게 배합할 경우 대조구 크기(319 bp)가 뚜렷하게 증폭되었음을 알 수 있었다. 다만, 대립유전자에 대한 증폭 산물이 약하게 확인되어, 대립유전자 특이적 산물을 보다 높은 농도로 증폭하기 위해 내부 프라이머 세트의 농도를 높여야 할 것으로 판단되었다.

외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트의 농도비(6:1, 6:2, 6:3)를 조절[반응물(50㎕)에 10μM 농도의 프라이머가 첨가되었을 때의 수행(working) 농도(0.2μM)를 기준으로 1.2μM : 0.2μM / 1.2μM : 0.4μM / 1.2μM : 0.6μM으로 배합]하고 PCR을 수행한 후 증폭 산물을 분석한 결과, 6:3 비율에서 대조구 증폭 산물(319 bp)과 대립유전자에 대한 특이적인 증폭 산물(222 bp)이 가장 뚜렷하게 증폭되었음을 알 수 있었다(도 4). 다만, 319 bp보다 크게 나타나는 다중 밴드를 최소화하기 위해 특이성이 높은 Hotstart Taq DNA polymerase 제품(BIONEER, Korea)으로 중합효소를 변경하였다.

실시예 3. HSPB1 유전자의 유전형 검증

상기 실시예 2를 통해 확인한 외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트의 농도비가 6:3 조건과, Hotstart Taq DNA polymerase를 이용하여 한우 10두의 등심조직으로부터 추출한 gDNA를 이용하여 대립유전자 특이적인 PCR을 수행하여 HSPB1 유전자의 유전형을 검증하였다.

그 결과 도 5에 개시된 바와 같이 모든 시료에서 예측된 대조구 증폭 산물 및 SNP 특이적인 증폭 산물(C allele : 222bp, T allele : 148bp, control : 319bp)이 증폭되었고, 대립유전자 특이적인 PCR이 성공적으로 수행되었음을 알 수 있었다. 또한, 상기 각 시료의 증폭 산물을 시퀀싱을 통해 분석한 결과, 전기영동 결과와 동일한 유전형이 확인되어, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 분석 시스템이 HSPB1 유전자의 유전형을 판별하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. HSPB1 유전자의 유전형과 도체 특성

상기 실시예 3를 통해 확인한 HSPB1 유전자의 유전형과 도체(carcass) 특성과의 상관관계를 분석하였다. 그 결과, 하기 표 3에서 확인되는 것과 같이, 한우 집단에서 HSPB1 유전자 내 g.2352 T>C SNP (rs110832311) 변이는 육량 형질과 관련이 있으며, 특히, CC 유전형에서 등지방 두께(back fat thickness)가 다른 유전형에 비해 유의하게 낮은 반면, 육량 비율(meat ratio)에서는 다른 유전형보다 유의하게 높음을 알 수 있었다. 즉, g.2352 T>C SNP (rs110832311)는 한우의 육량 형질과 관련되어 있으며 특히 CC 유전자형에서 우수한 육량 형질을 나타냄을 알 수 있었다.

HSPB1 유전자의 g.2352 T>C SNP가 도체 특성에 미치는 영향

Carcass traits	Genotype (Number of animals)
	g.2352 T>C SNP
	CC (42)	CT (91)	TT (57)	p-value
Back fat thickness, mm	12.09.63a	14.48.42b	14.31.53b	0.004
Rib eye area, cm²	96.31.4	93.96.95	94.41.18	0.362
Carcass weight, kg	459.64.65	464.92.5	461.64.63	0.776
Meat ratio¹	65.37.47a	63.44.32b	63.68.4b	0.002
^{a, b} Means with the same superscript in the same row for each quality are not significantly different (P<0.05) ¹ Meat ratio = 68.184 - [0.625 ×Back fat thickness (mm)] + [0.13 ×Ribeye area (cm²)] - [0.024 Carcass weight (kg)], Korean native cattle

<110> Hankyong Industry Academic Cooperation Center <120> Primer sets for determining genotype of HSPB1 gene related to meat of Korean native cattle and uses thereof <130> PN20238 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2001 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 1 atcaagattg ctgggagaat gtcaatgacc tcaggtatgc agatgacacc accctgatgg 60 cagaaagtga agaggaatta aagagcctct tgatgaacgt gaaagaggaa agtgaaaaag 120 ctggcttaaa actcaacatt cagaaaatga agatcatggc atccagtccc atcacttcat 180 agaaaataga tggggaaaca gtgacagcct ttattttctt gggctccaaa atcactgcca 240 atagtgacta cagccatgaa attaaaagat gcttgttcct tggaaggaaa gcaatgacaa 300 acctaggaag catattaaaa agcagagaca ctactttgtc catctagtca aagctatggt 360 ttttctagta gtcatgtatg gatgtgagag ttggaccata aagaaggctg agcaccaaag 420 aatagatgcc ttcaaactgt ggtgttgaac aagactcttg agagcccctt ggacagcaag 480 gagatcaagc caatcaatcc taaaggaaat caaccctgaa tattcattag aaggactgat 540 gctgaagcta cacctccacc cctttgggca cccccgtcga ggtcctagct cccaggcagg 600 gtccgcggag ggggcgtgat ttaggttccg aggacaactt ccacccccac cccccactcg 660 ccaagcccct gaacccgaac tttccaaaag cttctgagtt cccgggacag tctcgggcac 720 ccagatccct ccgtcagtct tgccagcccg gagtcctggc caccaggtgg ggtgcgtttg 780 gctgcgagcc agcggcgagg ccgccctttc ccgcctcctc tgacctactt cccctccccc 840 tcctcccagg caagcacgag gaaaggcagg acgagcacgg ctacatttcc cgttgcttca 900 ctcgcaaata cacgtgagtc ctggctccgg atctgggggg cgggggcggg cgcgcgggga 960 cgcccttgtg tgtaactctc gtctaccctc tttgcccgtc taggctgccc cccggtgtgg 1020 accccaccct ggtctcctcc tctctgtccc ctgagggcac gctcaccgtg gaggccccgt 1080 tgcccaagtc agccacccag tcggccgaga tcaccattcc cgtcaccttc caggcgcgtg 1140 cccagcttgg cggccccgaa gccgggaagt ccgaacagcc ggaaaacaag taaagaccct 1200 tagcccagcg gcccagccca caagtagcca tcactgacca tcctcacccg ccaaacctct 1260 atgttctttt gatacgttta ccttctgttt ttctcaaata aagtttgaag ccaccgccag 1320 tcactgcctc agagcctggt gtttttgtga aggaagaggg gttggtgctg gtttgacgtt 1380 tgctgagggc ccgttgggca ccaggcccca ggctgggtcc tgtgggtgca gtgccatccg 1440 tcactgggca cagccctggc ctcctgtgcc ccttgttcat taagagagaa gcagtgattg 1500 ttcaccagag ttaaaaggcc cagagcctgc aggggagcag gggaaactat gagaggcact 1560 tgacccaggc ttgggcactc aggaaccacc tgggcaaggg ggcaggtgag gggagatagg 1620 gcagggctgg gggagagggc ttcctgggag ctcagactcc ggacttcatc atagaggggc 1680 tgggccaggt agacgggagg ggaagtgtgg ccaccacagg aggctttctg aggggcaatt 1740 cccccagccc gtgtaggcag catgggacct gggtcctcag gtccgagagt gccccgtaga 1800 gagtgatgag caggtgtggc ttaggttttg gtgggagagg caaagaccag atgggggaag 1860 cggtggccgc aggagggcct gccttgcctg tccctgccag gagcggccat gcctgccttg 1920 gccctctcct ttgtctgtgc cctccccacc accgtctcct acccactcac tgtctccctg 1980 atgaagcagg gtctgggaag a 2001 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcacggctac atttcccgtt gcttcac 27 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttacttgttt tccggctgtt cggacttccc 30 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 taactctcgt ctaccctctt tgcccggcc 29 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtccacaccg gggggcagca ta 22 <210> 6 <211> 2670 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 6 tgccccctgg cccgtcattg ccattaatag agacctgaaa caccgcctgc taaaaatacc 60 cggctggaga cccataaaag cgctgcgggg tccggcgccc gccacttctc tcgcttctcc 120 gagcctcctc cggacgcacc cagaccagcc agcatggccg agcgccgagt gcccttctcg 180 ctcctgcggg gccccagctg ggaccctttc cgcgactggt atccggccca cagccgcctc 240 ttcgaccagg ccttcgggct gccccggctg cccgaggagt ggtcgcagtg gctgagccac 300 agcggatggc cgggctacgt gcgcgcgctg cccgccgcag cgatcgaggg tcccgcctac 360 aaccgcgcgc tcagccggca gctcagcagt ggggtctccg agatccagca gaccgccgac 420 cgctggcgcg tgtccctgga cgtcaaccac ttcgcccccg aggagctgac ggtcaagacc 480 aaggacggcg tggtggagat cactggtgag cacccccgcc ctccgcccca gggaccccgg 540 cccctcgctt ctcgcgggtc ccggggaaga gccccgggtt gaaatgtggg cggggagcgg 600 ggagagggga acgctggaaa gtgaaaactt agccgaggac ggacggtggg gggtggggag 660 cccccggagc ggagcccggc ctcttcgccc aacccctggt ctgtattctc tggagttggg 720 gtttgctggg agttcctaag gaatctttta gccctaaaaa gtctccacta aggaaagcaa 780 cgcccccttc cagcggagac cccccccccc cgcctcaacc ccagccctcc gacctgagga 840 cctggccccc aagggaccag accccccccc gggcttcacc caccctgctt cgtcagggag 900 acagagaggg ggtcggacac ggtggtgggg agggcacaga caaaggagag ggccaaggcg 960 ggcatggccg ctcctggcag ggacaggcaa ggcaggccct cctgcggcca ccgcttcccc 1020 catctggtct ttgcctctcc caccaaaacc taagccacac ctgctcatca ctctctacgg 1080 ggcactctcg gacctgagga cccaggtccc atgctgccta cacgggctgg gggaattgcc 1140 cctcagaaag cctcctgtgg tggccacact nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1200 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1260 nnnnnnnnnn gaaagaagta ccacaacact tatttcactt atatgcagag taatcgtgca 1320 atatgttggg ctggatgaag cacaaagctg aatcaagatt gctgggagaa tgtcaatgac 1380 ctcaggtatg cagatgacac caccctgatg gcagaaagtg aagaggaatt aaagagcctc 1440 ttgatgaacg tgaaagagga aagtgaaaaa gctggcttaa aactcaacat tcagaaaatg 1500 aagatcatgg catccagtcc catcacttca tagaaaatag atggggaaac agtgacagcc 1560 tttattttct tgggctccaa aatcactgcc aatagtgact acagccatga aattaaaaga 1620 tgcttgttcc ttggaaggaa agcaatgaca aacctaggaa gcatattaaa aagcagagac 1680 actactttgt ccatctagtc aaagctatgg tttttctagt agtcatgtat ggatgtgaga 1740 gttggaccat aaagaaggct gagcaccaaa gaatagatgc cttcaaactg tggtgttgaa 1800 caagactctt gagagcccct tggacagcaa ggagatcaag ccaatcaatc ctaaaggaaa 1860 tcaaccctga atattcatta gaaggactga tgctgaagct acacctccac ccctttgggc 1920 acccccgtcg aggtcctagc tcccaggcag ggtccgcgga gggggcgtga tttaggttcc 1980 gaggacaact tccaccccca ccccccactc gccaagcccc tgaacccgaa ctttccaaaa 2040 gcttctgagt tcccgggaca gtctcgggca cccagatccc tccgtcagtc ttgccagccc 2100 ggagtcctgg ccaccaggtg gggtgcgttt ggctgcgagc cagcggcgag gccgcccttt 2160 cccgcctcct ctgacctact tcccctcccc ctcctcccag gcaagcacga ggaaaggcag 2220 gacgagcacg gctacatttc ccgttgcttc actcgcaaat acacgtgagt cctggctccg 2280 gatctggggg gcgggggcgg gcgcgcgggg acgcccttgt gtgtaactct cgtctaccct 2340 ctttgcccgt ctaggctgcc ccccggtgtg gaccccaccc tggtctcctc ctctctgtcc 2400 cctgagggca cgctcaccgt ggaggccccg ttgcccaagt cagccaccca gtcggccgag 2460 atcaccattc ccgtcacctt ccaggcgcgt gcccagcttg gcggccccga agccgggaag 2520 tccgaacagc cggaaaacaa gtaaagaccc ttagcccagc ggcccagccc acaagtagcc 2580 atcactgacc atcctcaccc gccaaacctc tatgttcttt tgatacgttt accttctgtt 2640 tttctcaaat aaagtttgaa gccaccgcca 2670

Claims

서열번호 2 내지 5의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 한우의 육량 관련 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 유전형 결정용 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 소 유래 HSPB1 유전자의 2,352번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기의 유전형을 결정하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 한우에서 육량 관련 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 유전형 결정용 키트.
제3항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 외부(outer) 프라이머 세트와 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 내부(inner) 프라이머 세트가 몰농도 기준 5.5~6.5 : 2.5~3.5의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 키트.
한우 개체에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물의 유전형을 분석하는 단계;를 포함하는, 한우의 육량 관련 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 유전형을 결정하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 외부(outer) 프라이머 세트와 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 내부(inner) 프라이머 세트가 몰농도 기준 5.5~6.5 : 2.5~3.5의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 증폭 단계 산물의 유전형 분석은 겔 전기영동을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 1,001번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한우의 육량 관련 HSPB1 (heat-shock protein beta-1) 유전자의 유전형 결정용 SNP 마커 조성물.