CN111455071B - 猪8号染色体上与二花脸猪全部胎次总产仔数相关的snp标记的检测方法与应用 - Google Patents

猪8号染色体上与二花脸猪全部胎次总产仔数相关的snp标记的检测方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了猪8号染色体上与二花脸猪全部胎次总产仔数相关的SNP标记的检测方法与应用。所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪8号染色体上rs342939847核苷酸位点，且存在A/C多态性，所述SNP标记与二花脸猪全部胎次的总产仔数显著相关(P＝0.0418)。一种用于检测本发明所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。本发明提供的SNP标记与二花脸母猪的总产仔数相关，因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选高产的二花脸母猪品系，所得的二花脸母猪高产品系具有重要的经济效益与社会价值。

Description

猪8号染色体上与二花脸猪全部胎次总产仔数相关的SNP标记 的检测方法与应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及猪8号染色体上与二花脸猪全部胎次总产仔数相关的SNP标记的检测方法与应用。
背景技术
在猪的商业化品系选育中，繁殖性状如产仔数、乳头数等在母系猪的选育中尤为重要。产仔数作为母猪重要的生产性状之一，反映了母猪繁殖力水平、猪场生产水平和经济效应。二花脸猪是我国优秀地方猪种，因产仔数高而闻名于世；最高窝总产仔数记录为42头，平均为15.69头。产仔数作为能繁母猪重要的生产性状之一，反应了能繁母猪繁殖力水平；然而产仔数是受多基因调控的低遗传力的数量性状，传统选育方法基于表型选择，育种进展缓慢；近年来利用分子标记辅助选育(MAS)技术在和全基因组选择育种(GS)技术能极大提高选择的准确性，并且大大缩短选育世代，提高育种效率。因此通过基因组水平鉴别影响二花脸母猪的产仔数的基因位点，可为稳定提高二花脸猪的产仔数提供重要分子标记。
从国际猪QTL数据库网站(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index)可知，目前在猪除10、11号染色体及性染色体上没有定位到影响总产仔数的QTL，其它常染色体上都已定位到影响总产仔数的QTL，但大部分是利用微卫星标记定位的QTL，置信区间多在10-20cM，无法确定真正的主效基因及其关键变异位点，难以直接应用于种猪选育改良，因此找到影响产仔数的分子标记位点才是提高产仔数的关键。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，产仔数的低遗传力，提供一种基于与二花脸母猪总产仔数相关的SNP标记开发分子标记的方法。
本发明的另一个目的在于提供用于检测上述SNP标记的引物和检测方法。
本发明的另一个目的在于提供上述SNP标记的用途。
一种与二花脸母猪总产仔数性状相关的SNP标记，所述SNP标记位于国际猪基因组11.1版本参考序列8号染色体上rs342939847(即猪8号染色体上泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)基因5’UTR处rs342939847位点)，且存在A/C多态性，所述SNP标记与二花脸母猪全部胎次的总产仔数(Total number born,TNB)显著相关。rs342939847位点具有CC基因型的二花脸母猪的全部胎次的总产仔数显著高于具有AA基因型的二花脸母猪。
一种基于本发明所述的SNP开发分子标记的方法，以含有所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以二花脸母猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述的SNP标记转化为分子标记。
其中，所述的引物对上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示，所述的分子标记序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP位点位于SEQ ID NO.1的第176位，存在A/C多态性。
按照本发明所述的方法得到的分子标记，所述的分子标记序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP位点位于SEQ ID NO.1的第176位，存在A/C多态性。
一种用于检测所述的与二花脸母猪总产仔数相关的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO.2，下游引物为：SEQ ID NO.3。
一种检测所述的SNP标记的方法，包含PCR扩增二花脸母猪基因组中含有所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的A/C多态性。
本发明所述的检测SNP标记的方法，优选包括以下步骤：
(1)取每头二花脸母猪的耳组织样品并提取总DNA；
(2)用已提取的二花脸母猪基因组DNA为模板，使用所述的引物进行PCR扩增；
(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在SEQ ID NO：1第176位的A/C多态性。
步骤(2)所述的PCR扩增进一步优选反应体系为：DNA模板1μL、SEQ ID NO：2和SEQID NO：3所示的引物各1μL、PCR Mix试剂22μL；其中所述DNA模板浓度为30ng/μL，所述引物的浓度为10nM/μL，所述PCR Mix试剂为南京擎科生物技术有限公司的1.1×T3 Super PCRMix试剂；PCR扩增的反应程序为：预变性98℃2min；变性98℃10s；退火60℃10s，延伸72℃10s，35个循环；延伸72℃2min。
本发明所述的SNP标记、所述的分子标记、引物对在筛选高产二花脸母猪品系中的应用。
一种筛选高产二花脸母猪品系的方法，包括检测二花脸母猪rs342939847核苷酸位点的基因型，在二花脸母猪群体中，选育rs342939847核苷酸位点的CC型个体作为种猪。
有益效果：
本发明提供的一个新的与二花脸母猪全部胎次的总产仔数相关的SNP标记，因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选高产的二花脸母猪品系和包含二花脸配套系母猪品系，所得的二花脸母猪高产品系和二花脸配套系母猪品系具有重要的经济效益与社会价值。
附图说明
图1为使用本发明的引物扩增UCHL1基因5’UTR的琼脂糖凝胶电泳图。
注：M：2000bp Marker，1、2、3、4和5为二花脸不同个体的目的片段，大小均为719bp。
图2为rs342939847突变位点不同基因型的测序结果峰图。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
1、实验动物来源
江苏常州焦溪二花脸猪专业合作社、常熟市二花脸猪保种场和苏州苏太企业有限公司。
计算327头二花脸母猪的估计育种值(Estimated breeding value，EBV)，计算模型为
使用DMU软件进行总产仔数育种值(EBVTNB)和产活仔数(Number born alive，NBA)育种值(EBVNBA)的估计，模型如下：
Yijklmno＝μ+Hi+(HYS)j+PAk+Pl+Gm+An+Bo+eijklmno
其中Yijklmno为母猪产仔数的估计育种值；μ为总体均值，Hi为场的固定效应，(HYS)j为场年季的随机效应；PAk为胎次的固定效应；Pl为母猪的永久环境效应；Gm为基因型的固定效应；An为个体的加性遗传效应；Bo为与配公猪的随机效应；eijklmno为残差。
2、提取基因组DNA
采集327头母猪的耳组织样品，放置于装有75％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。使用传统酚/氯仿法提取耳组织基因组DNA，所需试剂包括：
裂解液(实验室配备)
蛋白酶K(德国MERCK生物科技有限公司)
Tris饱和酚(北京索莱宝生物科技有限公司)
Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(北京索莱宝生物科技有限公司)
氯仿(江苏永华精细化学品有限公司)
无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)
3M乙酸钠(北京索莱宝生物科技有限公司)
具体步骤如下所述：
(1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2mL离心管中；
(2)加入裂解液(自己配备)800μL，及蛋白酶K 30μL(20mg/mL)；
(3)样品置于55℃恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；
(4)加入Tris饱和酚800μL，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；
(5)取650μL上清加Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；
(6)取550μL上清，加氯仿800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；以下步骤换1.5mL的离心管
(7)取450μL上清，加无水乙醇800μL，3M乙酸钠40μL，混摇6min，4℃1000r/min离心8min；
(8)弃上清留下DNA沉淀团，加入1000μL 70％乙醇，混摇5min，4℃1000r/min离心5min，弃上清(如需要可重复一次)；
(9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；
(10)样品加100μL超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过Nanodrop-2000分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到30ng/μL于-20℃下保存备用。
3、目的片段PCR扩增与测序分析
用已提取的DNA为模板，根据所设计的引物，进行PCR扩增，扩增体系为：1.1×T3Super PCR Mix试剂22μL，DNA模板1μL(30ng/μL)、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物各1μL(10nM/μL)；设置PCR扩增体系为：预变性98℃2min；变性98℃10s；退火60℃10s，延伸72℃10s，35个循环；延伸72℃2min。
4、以327头的二花脸群体对UCHL1基因rs342939847位点进行分型验证，扩增序列的引物信息如表1所示。
表1.UCHL1基因rs342939847位点目的片段引物序列信息
Figure GDA0003659195650000051
5、将PCR扩增产物进行一代测序，测序结果用DNAman软件与GenBank中猪基因组片段序列比对、分析，用Chromas软件进行位点分型，用SAS软件(9.4版本)进行基因型与产仔数的影响效应分析。
利用SAS软件的混合线性模型进行基因型与产仔数的关联性分析，模型如下：
Yijklmno＝μ+Hi+(HYS)j+PAk+Pl+Gm+An+Bo+eijklmno
其中Yijklmno为母猪的产仔数表型；μ为总体均值，Hi为场的固定效应，(HYS)j为场年季的随机效应；PAk为胎次的固定效应；Pl为母猪的永久环境效应；Gm为基因型的固定效应；An为个体的加性遗传效应；Bo为与配公猪的随机效应；eijklmno为残差。由于样本量相对较小且考虑的因素相对较多，可能会导致计算结果不会收敛，在这种情况下，将与配公猪的随机效应剔除再进行了计算；显著性的P值经过10000次的随机抽样校正。
表2是rs342939847A/C突变位点多态性与纯种二花脸群体产仔数的影响效应分析结果；由表2可知：rs342939847位点多态性显著影响了二花脸猪全部胎次的TNB(P＝0.0418),与全部胎次的NBA趋向于显著(P＝0.0868)。在二花脸猪全部胎次的TNB中，rs342939847位点的CC基因型个体与AA型个体、AC型个体相比较：TNB平均分别增加0.82头(P<0.05)和0.33头；并且该位点多态性在二花脸猪总产仔数表现为CC>AC>AA基因型的加性效应。由此可见，在二花脸猪种中，继代选育rs342939847位点的CC型个体均可逐步提高二花脸母猪全部胎次的TNB，达到提高二花脸母猪繁殖性能的目的。
表2.UCHL1基因rs342939847位点多态性与二花脸母猪全部胎次的产仔数关联分析
Figure GDA0003659195650000052
注：不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同的小写字母表示差异不显著。
序列表
<110> 南京农业大学
南京农业大学淮安研究院
<120> 猪8 号染色体上与二花脸猪全部胎次总产仔数相关的SNP 标记的检测方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 719
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agctttcggc taactggcat ggccaaatgc atgggtttcc agaaacttcg cgaaaaatta 60
gactccatca caaggactgc tccacacact caaggaacgc ccaccaacaa aacacatctc 120
cacaaccgcc agattatctc accagcaagt gagactgcaa ggtttggggg cttggaggta 180
ccactccgtg ctgcgtatgg gggggttcgc gcccatttgg cggcgactga ccgtttcccc 240
tcgcttggtt ttgcccctgc tccccctgcg caggcaccca cagtgcgtca ggccggcgct 300
ttatagcggc aggctgggcg gctccacttg ctgtttttcg tcttctttgg gttgcggttc 360
ctctcggctt ttgcgaagat gcagctcaaa ccgatggaga ttaacccgga ggtgagtgtc 420
aggtgcacgg ttacccaggg agtgtagggc cgagggtcag ccctcaccag gtagcggtat 480
cgctgactgc ttttattttt gcattttttt ctttgcattt gcctttcaga tgctgaacaa 540
agtgagtgac ggctcgtgct gcctctctcc ccctcccctg gaggcgcagg ggctgagcgg 600
cgccttgcgc gctccagagg cggtggggct ggggcgccct ccctctgccc ctgcatcagg 660
tccggcgatg actctgcgaa acgggtcggc ggtgggatgg agaaggctgg gctcagatg 719
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctttcggc taactggcat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catctgagcc cagccttctc 20

Claims (3)

1.一种SNP标记的检测试剂在筛选高产二花脸母猪品系中的应用， 其特征在于所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列8号染色体上rs342939847核苷酸位点，且具有A/C多态性，所述 SNP标记与二花脸母猪全部胎次的总产仔数显著相关。
2.SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对在筛选高产二花脸母猪品系中的应用，其特征在于包括利用所述的引物检测二花脸母猪国际猪基因组11.1版本参考序列8号染色体上rs342939847核苷酸位点的基因型，在二花脸母猪群体中选育rs342939847核苷酸位点的CC型个体作为种猪。
3.一种筛选高产二花脸母猪品系的方法，其特征在于包括检测二花脸母猪国际猪基因组11.1版本参考序列8号染色体上rs342939847核苷酸位点的基因型，在二花脸母猪群体中选育rs342939847核苷酸位点的CC型个体作为种猪。
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