CN110734983A - 一种与苏淮猪肌内脂肪性状相关的snp标记及检测方法和应用 - Google Patents

一种与苏淮猪肌内脂肪性状相关的snp标记及检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP标记及检测方法和应用。所述SNP标记位于猪5号染色体上的CNTN1基因的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪5号染色体含rs81302978核苷酸位点的分子标记，且具有A/G多态性，所述SNP标记与苏淮猪肌内脂肪含量极显著关联(P<0.01)。一种用于检测所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。本发明提供的SNP标记与苏淮猪肌内脂肪相关，可以通过鉴定该SNP标记来筛选高肌内脂肪苏淮猪品系，所得的高肌内脂肪苏淮猪品系具有重要的经济效益与社会价值。

Description

一种与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP标记及检测方法和 应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP标记及检测方法和应用。
背景技术
肌内脂肪(Intramuscular Fat,IMF)是猪肉品质评价中最重要的指标之一。一般肉用型猪的肌内脂肪含量在3.0％-4.0％为理想值，2.0％-2.9％为较理想值，1.5％-2.0％为尚可接受值，小于1.5％为较低值。肌内脂肪主要存在于肌外膜和肌束膜，甚至肌内膜上，主要成分是磷脂和甘油三脂。有研究表明肌内脂肪含量可以影响肌肉的滴水损失、熟肉率、嫩度、质地、风味、多汁性等重要肉质指标。近年来，伴随着经济增长，人们生活品质快速提升，对猪肉品质的要求也从数量转变为同时追求质量和数量，市场需求方向的转变引导着猪育种思路的改变。因此对猪肌内脂肪选育提高可以有效的改善猪肉的品质，满足消费者对高品质猪肉的需求。
猪肌内脂肪性状属于相对较高遗传力性状(h2＝0.52)。传统的选育方法虽然对肌内脂肪选育可以起一定帮助，但活体测定难度大，准确性低，屠宰测定费时费力且选育周期长，进展比较慢。鉴别出与肌内脂肪性状相关的分子标记，使用标记辅助选择(MAS)手段或全基因组选择(GS)能加快猪肌内脂肪性状的遗传改良，并有效的提高猪肉品质。
苏淮猪是由淮安市淮阴种猪场、南京农业大学、江苏省畜牧总站和淮安市农业委员会等单位于1998年开始培育，2011年3月25日获得国家畜禽遗传资源委员会新品种授权，证书为“(农01)新品种证字第18号”。苏淮猪是在新淮猪基础上再导入大白猪血统，通过横交、多世代选育而成，含新淮猪血统50％，大白猪血统50％。近期的一些研究发现，苏淮猪肌内脂肪变异系数较大，且肌内脂肪含量平均值为(1.99±0.04)％，而根据众多的研究结果表明，3.0％-4.0％的肌内脂肪含量是新鲜优质猪肉的一个理想范围。由此可见，对苏淮猪肌内脂肪的持续选育已迫在眉睫。
根据国际猪QTL数据库网站(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index)知，目前在猪5号染色体上定位到影响肌内脂肪含量的QTL有5个，置信区间多在10-20cM，无法确定真正的主效基因及其关键变异位点，因此难以直接应用于种猪选育改良。
发明内容
本发明的目的在于针对猪传统肌内脂肪选育耗时费力，选育效果不佳，提供与苏淮猪肌内脂肪相关的SNP标记并将其开发为分子标记。
本发明的另一个目的在于提供用于检测上述SNP标记的引物对和检测方法。
本发明的另一个目的在于提供上述SNP标记的用途。
一种开发与苏淮猪肌内脂肪性状相关的分子标记的方法，以含有与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述的SNP位点转化为分子标记；所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪5号染色体rs81302978核苷酸位点，所述SNP位点与苏淮猪肌内脂肪性状显著相关；所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO：2，下游引物：SEQ ID NO：3，所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第110位，存在A/G多态性，GG型个体肌内脂肪含量极显著高于AG型和AA型。
按照上述的方法得到的分子标记，所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第110位，存在A/G多态性。
一种用于检测所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。
一种检测所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点的方法，包括以下步骤：
(1)取苏淮猪的组织样品并提取基因组DNA；
(2)用已提取的苏淮猪基因组DNA为模板，使用上游引物为：SEQ ID NO：2和下游引物为：SEQ ID NO：3进行PCR扩增；
(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点位于SEQ ID NO：1第110位，判读该位点的A/G多态性。
与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点在筛选肉色红度值高的苏淮猪品系中的应用，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪5号染色体rs81302978核苷酸位点，且具有A/G多态性，所述SNP标记与与苏淮猪肌内脂肪性状显著相关。
本发明所述的分子标记在筛选肌内脂肪含量高的苏淮猪品系中的应用。
本发明所述的引物对在筛选脂肪含量高的苏淮猪品系中的应用。
一种筛选脂肪含量高的苏淮猪品系的方法，包括检测苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪5号染色体rs81302978核苷酸位点的基因型，选育rs81302978核苷酸位点的GG型个体作为种猪。
有益效果：
本发明提供的SNP标记与苏淮猪肌内脂肪含量显著相关，基于该SNP开发的分子标记及引物可用于SNP的检测。因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选高肌内脂肪苏淮猪品系，所得的高肌内脂肪含量苏淮猪品系具有重要的经济效益与社会价值。
附图说明
图1为高低肌内脂肪群体间GWAS分析的曼哈顿图，最显著的位点为CNTN1基因rs81302978位点。
图2为CNTN1基因rs81302978位点扩增胶图。
图3为CNTN1基因rs81302978位点分型图示例。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：
1试验动物来源
江苏省淮安市淮阴种猪场
2提取苏淮猪基因组DNA
采集330头苏淮猪组织样本4份/头，其中1份用于个体DNA提取；
参考天根生物科技公司组织DNA提取试剂盒说明书，提取按以下步骤顺序进行：
①先在缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入68mL和200mL无水乙醇，充分混匀。
②采集组织样约100mg置于2mL EP管内，完全剪碎后加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
③加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
④加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑤加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑥将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，随后以12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
⑦向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中
⑧向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，以12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑨重复操作步骤⑧。
⑩将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
Figure BDA0002224853080000051
将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。
经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μL于-20℃下保存备用。
3、目的片段PCR扩增与测序
用已提取的DNA为模板，根据所设计的引物，进行PCR扩增：取DNA模板1μL、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示的引物各1μL、PCR Mix试剂22μL(1.1×T3 SuperPCR Mix,擎科生物)；设置PCR扩增体系：
Figure BDA0002224853080000052
PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小约330bp，电泳图见图2，将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用DNAman软件与GenBank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读rs81302978位点的基因型，4统计分析
利用SAS软件一般线性模型进行基因型对表型的影响效应分析。分析模型为
Yijnkl＝ui+Gj+Sn+Bk+Dl+eijkl
其中：Yijnkl为猪的肌内脂肪含量；ui代表群体表型均值；Gj代表SNP的基因型固定效应；Sn代表性别的固定效应；Bk是批次固定效应；Dl是日龄的协变量；eijkl为残差。
5结果
表1给出了rs81302978变位点A/G在苏淮猪群体中对肌内脂肪含量的影响效应。由表1可知，rs81302978位点三种基因型之间肌内脂肪含量有极显著差异(P<0.01)，其中GG型个体肌内脂肪含量极显著高于AG型和AA型(P<0.01)，AG型个体肌内脂肪含量高于AA型个体，但是差异不显著。由此可见，在苏淮猪群体中，继代选育rs81302978位点的GG型个体，均可逐步提高苏淮猪群体肌内脂肪含量，达到提高苏淮猪肉质性能的目的。
表1 CNTN1基因rs81302978位点与苏淮猪肌内脂肪的关联分析
Figure BDA0002224853080000061
注：字母A，B，C代表每一行不同字母之间极显著差异(P<0.01)。
序列表
<110> 南京农业大学
南京农业大学淮安研究院
<120> 一种与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP标记及检测方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 329
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccttatgta gcccctcatc acttttggta aactacaatg gtattctatt aaaaacattg 60
cgttaatctg gaatctatca aatctatcct ccagccaaaa aatctggtca tataactctt 120
gatgaaatct ttaaatacct cattctctgt ggaatagctt caaactcttt aacaacgtta 180
aaaatattgt gtataatcag gattttaaca gttttaaaaa agagtcctat attaatcaga 240
tttcatataa ttaaccttat cacctattgt ttccaaaatt ctcataatat agatacttca 300
gtttctccag cgtatcaagt gatggcctg 329
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccttatgta gcccctcatc a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggccatca cttgatacgc 20

Claims (8)

1.一种开发与苏淮猪肌内脂肪性状相关的分子标记的方法，其特征在于以含有与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述的SNP位点转化为分子标记；所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪5号染色体rs81302978核苷酸位点，所述SNP位点与苏淮猪肌内脂肪性状显著相关；所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO：2，下游引物：SEQ ID NO：3，所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于SEQID NO：1所示核苷酸序列第110位，存在A/G多态性，GG型个体肌内脂肪含量极显著高于AG型和AA型。
2.按照权利要求1所述的方法得到的分子标记，其特征在于所述的分子标记序列如SEQID NO：1所示，所述的SNP位点位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第110位，存在A/G多态性。
3.一种用于检测权利要求1中所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点的引物对，其特征在于上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。
4.一种检测权利要求1中所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取苏淮猪的组织样品并提取基因组DNA；
(2)用已提取的苏淮猪基因组DNA为模板，使用上游引物为：SEQ ID NO：2和下游引物为：SEQ ID NO：3进行PCR扩增；
(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点位于SEQ ID NO：1第110位，判读该位点的A/G多态性。
5.与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP位点在筛选肉色红度值高的苏淮猪品系中的应用，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪5号染色体rs81302978核苷酸位点，且具有A/G多态性，所述SNP标记与与苏淮猪肌内脂肪性状显著相关。
6.权利要求2所述的分子标记在筛选肌内脂肪含量高的苏淮猪品系中的应用。
7.权利要求3所述的引物对在筛选脂肪含量高的苏淮猪品系中的应用。
8.一种筛选脂肪含量高的苏淮猪品系的方法，其特征在于包括检测苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪5号染色体rs81302978核苷酸位点的基因型，选育rs81302978核苷酸位点的GG型个体作为种猪。
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