CN111705140B

CN111705140B - 体重性状相关的SNPs分子标记及其在湖羊辅助育种中的应用

Info

Publication number: CN111705140B
Application number: CN202010595953.2A
Authority: CN
Inventors: 曹宇浩; 姜俊芳; 蒋永清; 吴建良; 单慧丽
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2040-06-28
Also published as: CN111705140A

Abstract

本发明属于分子标记领域，具体涉及一种体重性状相关的湖羊SNPs分子标记、相关引物对、试剂盒，以及它们在湖羊分子标记辅助育种中的应用，进一步涉及一种筛选湖羊体重性状的方法及其在湖羊分子标记辅助育种中的应用。本申请与湖羊体重性状相关的SNPs分子标记，该SNPs分子标记选自以下的分子标记中一种或多种：1）包括位点位于SEQ ID NO:1的第200bp位点的SNP，其为T或A，与湖羊雌性的初生体重显着相关；2）包括位点位于SEQ ID NO:1的第228bp位点的SNP，其为G或A，与湖羊雌性的初生体重显着相关；3）包括位点位于SEQ ID NO:2的第203bp位点的SNP，其为G或A,与湖羊雌性的周岁体重显着相关。

Description

体重性状相关的SNPs分子标记及其在湖羊辅助育种中的应用

技术领域

本发明属于分子标记领域，具体涉及一种体重性状相关的湖羊SNPs分子标记、相关引物对、试剂盒，以及它们在湖羊分子标记辅助育种中的应用，进一步涉及一种筛选湖羊体重性状的方法及其在湖羊分子标记辅助育种中的应用。

背景技术

自20世纪中叶以来，我国绵羊遗传改良经历了地方品种的选优培育和提纯，杂交改良地方品种，再到新品种培育，生产方向也从“毛主肉辅”向“肉主毛辅”转变。目前国内畜牧养殖业中养羊业的发展速度仅次于家禽养殖^[1]。

我国虽然开展了多项肉用绵羊新品种的培育研究工作，并培育了巴美肉羊^[2]、昭乌达肉羊^[3]和察哈尔羊^[4]等具有自主知识产权的肉羊品种。但在育种工作中还是存在“重引进，轻选育”的现象^[1]。以湖羊、小尾寒羊为例，这两个品种是我国著名的多胎绵羊品种，但是这些品种毛用价值不高，产肉性能偏低，不能满足羊肉消费市场的需求。因此，进行遗传改良，提高养羊的生产效率是绵羊选育工作中亟待解决的问题，也是摆在广大动物遗传育种研究者面前的一项刻不容缓的任务。

在人类单倍体型图计划、多物种基因组信息的陆续公布，商业化中高密度SNP芯片的出现和基因数据分析方法的成熟的大背景下，基于全基因组范围内搜寻与动物重要经济性状相关联的遗传变异研究，为分子育种研究带来了新思路和新途径，而全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)已成为复杂性状功能基因鉴定的分析方法和手段之一。人们已经在与绵、山羊经济性状上开展了很多GWAS的研究^[5-29]。OvineSNP50BeadChip芯片由Illumina公司与国际羊基因组协会专家联合开发，包含54241个SNP位点，平均每46kb有一个标记，覆盖整个绵羊基因组。该芯片已经成为绵、山羊经济性状GWAS分析的重要工具，目前已有的研究结果大都使用该芯片获得。

GWAS在羊的相关性状基因的研究中主要分为两类：(1)无关个体基础上的联系。(2)家系基础上的联系剖析。病例-对照分析的方法主要用来分析病例组和对照组的全基因组中基因型的分布特点和差异性。随机群体基础上的分析法在动物的应用中主要用来分析数量性状。目前各国研究者已经对复杂疾病和经济性状开展了许多的GWAS研究分析，发现了许多与疾病或经济性状相关联的SNPs，已经证实的相关基因或位点就超过一千余个，而且近年来公开报道GWAS研究成果的数量呈逐年递增态势^[30]。

虽然GWAS分析在相关的研究中取得了优异的成绩和效果，也有学者对其持质疑的态度^[31]，有关研究和分析也在不断的修缮过程中^[32-34]。目前对于GWAS研究和分析我们还需要从多方面入手，将科研转化到实际中去。

随着生活水平的提高，人们对羊肉的消费需求也越来越多，国内一些地方肉用绵羊品种如湖羊、小尾寒羊等，因繁殖力强，肉质鲜美等优点深受消费者的喜爱，但与肉用品种相比，这些品种具有产肉量较低，生产周期长等，不能满足消费者的需求，湖羊为我国特有的宝贵绵羊品种，集繁殖力强，早期生长快，肉品质好等优点于一体，但也存在产肉性能不高，肉用体型不理想的缺陷。因此，进行湖羊肉用系选育，提高湖羊的生产性能，是湖羊选育工作中亟待解决的重要问题。

申请人申请的中国发明专利申请(申请号:CN201811241349.9、CN201811241417.1、CN201811243344.X等)公开了与湖羊体重性状相关的多个SNP分子标记及其在湖羊分子标记辅助育种中的应用。其中公开了7个SNPs在基因组水平上与体高达到极显著相关，分别为位于1号染色体的OAR1_164254640.1、2号染色体的s10476.11、6号染色体的OAR6_95218086.1、9号染色体的s10347.1、15号染色体的OAR15_18440393.1、27号染色体的OARX_76354330.1和OARX_120998827.1；同时，位于27号染色体的OARX_76354330.1在基因组水平上还与胸围极显著相关。并未涉及OARX_76354330.1与体重直接相关。

发明内容

为了解决现有技术中的技术欠缺和生活中的现实需求，本发明通过GWAS筛选出的少量与体重关注性状相关的SNPs位点，在后续的大群体中针对这些位点再进行单独的验证与基因分型，可大大提高GWAS结果的可信度与意义，进一步将候选功能基因转化为功能基因，在育种指导中发挥更大的作用。

为了解决上述的技术问题，本申请采用了以下的技术方案：

一种与湖羊体重性状相关的SNPs分子标记，该SNPs分子标记选自以下的分子标记中一种或多种：

1)包括位点位于SEQ ID NO:1的第200bp位点的SNP，其为T或A，与湖羊雌性的初生体重显着相关；

2)包括位点位于SEQ ID NO:1的第228bp位点的SNP，其为G或A，与湖羊雌性的初生体重显着相关；

3)包括位点位于SEQ ID NO:2的第203bp位点的SNP，其为G或A,与湖羊雌性的周岁体重显着相关。

优选，该SNPs分子标记包括以下的分子标记中一种或多种：

1)分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示，定位为OARX_76354330.1，所述SNP为T或A，与湖羊雌性的初生体重显着相关；

2)分子标记的序列SEQ ID NO:1所示，定位为OARX_76354330.1下游28bp，所述SNP为G或A，与湖羊雌性的初生体重显着相关；

3)所述分子标记的序列如SEQ ID NO:2所示，定位为s64890.1下游364k bp，所述SNP为G或A,与湖羊雌性的周岁体重显着相关。

进一步，本申请还提供了用于检测所述的SNPs分子标记的引物对。

优选，该引物对包括针对SEQ ID NO:1的第一引物对和针对SEQ ID NO:2的第二引物对中的一种或两种：

第一引物对：上游序列为CAACCACCAGCTGACCCAAGGGA，下游引物为CAACTAATACGTGTGACAAAGCAA；

第二引物对：上游序列为CCAGGTCCCTATTATCTGTG，下游引物为TCTGCTGCTAATCACTTCCT。

进一步，本申请还提供了一种包含所述引物对的试剂盒。

进一步，本申请还提供了所述的SNPs分子标记、所述的引物对或所述的试剂盒在筛选湖羊体重性状或湖羊分子标记辅助育种中的应用。

进一步，本申请还提供了一种筛选湖羊体重性状的方法，包括如下步骤：提取湖羊基因组DNA，利用所述的引物对进行PCR扩增，对扩增产物中的SNPs进行检测，从而筛选湖羊体重性状。

优选，所述引物对为针对SEQ ID NO:1的第一引物对和针对SEQ ID NO:2的第二引物对中的一种或两种：

优选，其中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；PCR扩增的反应体系如下：

进一步，本申请还提供了所述的方法在湖羊分子标记辅助育种中的应用。

本发明的有益效果在于：所述分子标记、引物对及相关试剂盒可以用于筛选湖羊体重性状或湖羊分子标记辅助育种，用于湖羊肉用系核心群个体的早期选育。

附图说明

图1为获得可用于分子育种的SNP位点的技术路线。

图2为湖羊基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果(Marker：DL2000plus)。

图3为湖羊研究群体结构分析图。

图4为湖羊的初生体重，六个月体重和周岁体重全基因组关联分析的曼哈顿图(Manhattan plots)。

图5为湖羊体重性状相关SNPs检测引物的PCR扩增结果。M：DL2000plus；分别对应针对s37755.1，s39389.1，OARX_76354330.1，s64890.1设计的扩增产物。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1湖羊体重性状GWAS分析

1材料与方法

1.1试验动物和伦理

本试验选用的240只湖羊均来自湖州太湖湖羊养殖专业合作社湖羊肉用系核心群亲代和子代个体，饲养管理方式依据肉羊标准的饲养管理方法进行饲养。试验羊的处理和操作遵循浙江省农业科学院和南京农业大学动物福利委员会的规则和规程。

1.2样品采集和处理

每只试验羊采集颈静脉血10mL，在含EDTA抗凝剂的采血管中暂存，并置于-20℃长期保存。

1.3主要试剂

蛋白酶K：美国Amresco公司；

NaCl、无水乙醇、琼脂糖、冰乙酸、硼酸、NaOH：北京化学试剂公司；

DNA Marker 15000：杭州擎科梓熙生物有限公司；

DNA芯片杂交试剂盒：Illumina公司；

1.4主要溶液

以萨姆布鲁克所著的《分子克隆实验指南》第三版为参考，配制所需溶液，溶剂为超纯水，蒸汽高温高压灭菌40min。

(1)1M的Tris-HCl(pH＝8.0，1L)：121.1g Tris-base溶于800mL超纯水后，以浓盐酸将溶液pH值调至8.0，定容至1L，高压灭菌。

(2)5×TBE(Tris硼酸缓冲液)：Tris-base 54g，硼酸27.5g，Na₂EDTA·2H₂O 3.72g，加超纯水定容至1L，混匀。

(3)0.5M EDTA(pH＝8.0)：将186.1g Na₂EDTA·2H₂O溶解于800mL双蒸水中，将pH调至8.0，定容至1000mL，高温高压灭菌。

(4)0.5M NaCl：5.844g NaCI溶于超纯水，并定容至200mL，高温高压灭菌。

(5)10％SDS：将10g SDS溶于65℃的超纯水，定容至100mL，用0.2nm的滤膜滤菌后保存。

(6)TE缓冲液(pH＝8.0)含20mM Tris·HCl(pH＝8.0)，1mM EDTA(pH＝8.0)：2mL1M Tris·HCl(pH＝8.0)，0.2mL 0.5M EDTA(pH＝8.0)，定容至100mL，高压灭菌。

(7)蛋白酶K(20mg/mL)：将100mg蛋白酶K溶解于5mL的超纯水中，并按照每管400μL分装后-20℃冻存。

(8)3M NaAc(pH＝5.2)：取12.305g无水NaAc加双蒸水溶解，定容至50mL，加冰乙酸调节pH至5.2，高压灭菌。

(9)PBS：8.0g NaCl，0.2g KCl，3.48g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，定容至200mL，高压灭菌。

(10)STE：5mL 1M Tris·HCl(pH＝8.0)，20mL的0.5M EDTA(pH＝8.0)，20mL的0.5MNaCl，10mL的10％SDS，加入ddH₂O双蒸水至100mL，混匀。

1.5主要仪器设备

恒温水浴锅：江苏太仓实验设备公司；

Thermo Fisher-80℃超低温冰箱：美国；

海尔4℃/-20℃冰箱：山东；

Centrifuge 58108高速低温冷冻离心机：德国Eppendorf公司；

F100 Icematic制冰机：意大利；

Bio-Rad CHEMI DOC凝胶成像分析系统：美国；

TOMY ES-315型高压蒸汽灭菌锅：日本；

Sartorius电子天平：德国；

DYY-7C型电泳仪：北京六一；

DYY-III32型电泳槽：北京六一；

QL-901涡旋振荡器：江苏；

DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器:江苏太仓实验设备厂；

AstraGene AstraNet紫外分光光度计：英国；

10μL、100μL、200μL、1000μL移液器：德国Eppendorf公司；

Infinium全基因组SNP分析系统：Illumina公司；

1.6数据分析软件及在线软件

1.6.1数据分析处理软件

1.Tassel 5.0

2.admixture v1.3

3.Plink 1.90p

4.Mutation Surveyor version 5.02

5.beagle 5.1

1.6.2在线网站及数据库

(1)UCSC：http://genome.ucsc.edu/。

(2)NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

(3)DAVID：http://david.abcc.ncifcrf.gov。

1.7.1体重性状的测定

湖羊肉用系核心群个体的体重测量包括初生重、断奶重、六月龄重、和周岁体重。为保证结果准确性，对每只羊采取两次测量并取平均值。

1.7.2技术路线

如图1所示。

1.7.3外周血基因组DNA的提取

-20℃冻存的外周血解冻后，吸取0.5mL到一个新的1.5mL EP管中，以Tris饱和酚法进行血液基因组DNA的提取。

利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。

并进行分光光度计的检测OD值260/280处于1.8～2.2。

1.7.4湖羊肉用系核心群G1代和G2代个体基因分型与质量控制

使用Ovine SNP50BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA，USA)对单个SNP进行基因分型。随后，将数据输入Bead Studio软件进行相关分析，将分型成功率小于99％的染色体位点进行剔除，等位基因频率等于0.05的染色体位点剔除以及不符合哈代温伯格检验的染色体位点。在对软件输出的基因型进行分类和校对后，进行统计分析，并通过软件消除或纠正不准确的SNP位点，以获得全基因组数据的特征。使用全基因组基因分型系统对核酸进行分型，并使用Genome Studio软件将数据可视化为基因分型结果，以.txt格式保存并导出。1.7.5湖羊肉用系核心群G1代和G2代个体群体结构与数据处理

使用admixture v1.3做群体结构分析，同时创建亲属关系矩阵图，使用TASSEL5.0分析研究群体中亲缘关系。PLINK 1.90p用于预过滤SNP数据。保留最大基因型缺失率为0.2，最小次要等位基因频率(MAF)为0.05的双等位基因位点。使用beagle 5.1(version:24Mar20.5f5)估算缺少的基因型。然后使用在PLINK 1.90p筛选基于LD的连锁分析和单倍域分析估算数据，筛选窗口大小为50kb，步长为10，成对r²阈值为0.2。

1.7.6GWAS处理

基因型数据经质控处理后，使用TASSEL5.0软件混合线性模型(MLM)进行SNP的GWAS分析，挖掘与湖羊肉用系核心群体重性状表型相关的SNPs。MLM模型校正了性别、群体结构和亲缘关系3个混杂因素。

具体模型为：Y＝Xβ+Sα+Qv+Zu+e

其中：

Y：湖羊肉用系核心群体尺性状表型值向量；

β：除SNP和群体结构之外的固定效应向量；

α：SNP效应向量；

v：群体结构效应向量；

u：多基因背景效应向量；

e：残差效应向量；

X、S、Q、Z分别为β、α、v、u的关联矩阵。

同时对P值进行处理分析和校正。通过一般线性模型与混合线性模型计算出P值，然后进行检验，具体公式如下：

α：显著性水平；

N：独立SNPs位点数。

1.7.7候选基因的注释及挖掘

全基因组关联分析获得显著性SNPs位点后，通过UCSC检索显著关联SNP位点上、下游各500bp的序列并在NCBI中进行序列比对，确定SNPs所处基因或者相近的基因。

2结果与分析

2.1基因组DNA检测

所有个体提取和纯化的血液基因组DNA进行了分光光度计的检测，确保其OD260/280在1.8-2.2之内，并进行凝胶电泳观测完整度。图2为湖羊基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果。2.2SNP分型及质量管理

通过基于全基因组的检测平台检测基因组DNA，并使用Plink1.90软件对240个单独的样品和54241个SNP位点进行质量控制管理。我们排除了以下因素：(1)3577个SNP分型成功率<99％；(2)20个SNP不符合Hardy-Weinberg平衡；(3)4435个SNP，次要等位基因频率<0.05。另外，由于分型成功率<99％。在质量控制后，将226只绵羊和35363个独立的SNP用于最终分析。

通过连锁不平衡修正的Bonferroni校正对全基因组关联分析结果P值进行校正，因此Bonferroni校正的达5％基因组水平显著的P值阈值为1.41×10^-6(0.05/35363)，即P值低于此阈值的SNPs则认为与表型显著关联；达到基因组水平潜在关联的P值阈值为2.82×10^-5(0.01/35161)。

2.4体重性的GWAS结果

使用admixture v1.3对研究群体进行结构分析，最佳K为2(图3A)。所有个体的亲属关系估计表明抽样的有效性(图3B和图3C)。GWAS确定了四个SNP，它们显着影响湖羊的出生体重，六个月体重和周岁体重。s37755.1(p＝3.01×10^-7)位于1号染色体上，s39389.1(p＝9.31×10^-6)位于7号染色体上；而在27号染色体上为OARX_76354330.1(p＝1.45×10^-5)。一个SNP与六个月体重显着相关。最显着的SNP是位于27号染色体上的OARX_76354330.1(p＝1.56×10^-5)。此外，一个SNP与周岁体重s64890.1(p＝2.31×10^-5)相关联，它接近阈值，因此我们也将它视为全基因组的潜在关联性SNP。

从GWAS分析获得的三个SNP属于基因内另一个处于基因间隔区：s37755.1位于SCMH1；OARX_76354330.1位于CAPN6；s39389.1位于ITGA11。此外，s64890.1位于CAMTA1下游364kbp的(表1)。

表1

实施例2湖羊体重性状相关SNPs的群体验证

GWAS可以应用基因组中数以百万计的SNPs，可在全基因组上与相关性状进行相关性分析，发现影响与复杂性状相关的基因变异。但其结果也需要通过后续的大群体进行验证以确保结果的可信度，排除假阳性。通过GWAS筛选出的少量与关注性状相关的SNPs位点，在后续的大群体中针对这些位点再进行单独的验证与基因分型，可大大提高GWAS结果的可信度与意义，进一步将候选功能基因转化为功能基因，在育种指导中发挥更大的作用。

目前尚未有湖羊体重性状GWAS的报道，我们中利用OvineSNP50 GenotypingBeadChip芯片，通过对比分析本课题组建的湖羊肉用新类群核心群的G1代和G2代群体，发现了4个在基因组水平极显著影响湖羊体重和胸围的SNPs。我们将前期已经筛选到的4个在基因组水平极显著影响湖羊体重和胸围的SNPs位点为后续验证位点，以本课题在杭州庞大农业开发有限公司构建的湖羊肉用系核心群G3代个体为研究对象，进行湖羊肉用系核心群G3代202个雌性个体4个SNPs的基因分型和群体遗传学分析，以及SNPs与湖羊肉用系核心群体体重性状的关联分析，这些位点的群体验证结果可为后续功能基因验证，解释性状变异的分子遗传机制，并为湖羊肉用性状分子标记辅助育种奠定重要基础。

1.材料与方法

1.1动物群体的选择

试验动物均来自杭州庞大农业开发有限公司构建的湖羊肉用系核心群G3代雌性个体。202头湖羊雌性个体进行不同位点的SNP基因型分析，并进行对应位点的群体遗传学分析。

1.2血样采集及保存

每只试验羊采集颈静脉血10mL，于含EDTA抗凝剂的采血管中暂存，并置于-20℃长期保存。

1.4PCR扩增及检测

1.4.1引物设计

以第二章中筛选出的4个与湖羊体重和胸围性状显著相关的SNPs位点为中心，11个SNP上、下游各500bp的序列下载自UCSC数据库，用于SNP PCR扩增及直接测序的引物设计。各位点引物序列详见表2。

表2

1.4.2湖羊候选功能性SNPs的核酸扩增体系

PCR反应体系为30μL，程序为：98℃预变性10min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，反应结束后4℃保存。具体反应试剂的使用量见表3。

表3湖羊体重性状相关SNPs检测的PCR扩增体系

1.4.3扩增片段的测序

取5μL的PCR产物与1μL的6×Orange Loading Buffer均匀混合后点样于1.5％的琼脂糖凝胶，使用DL2000plus做为分子量标记，200V电泳15min后取出凝胶，浸泡于EB染色10min，观测有无特异产物生成，将其进行直接测序。

1.5测序结果的分析

使用Mutation Surveyor 5.02软件对每个个体候选功能性SNP扩增产物正、反向测序峰图进行分析，确定各样本不同位点扩增产物测序结果的突变位点和突变方式。测序结果异常、无峰图或峰图异常时进行二次测序，直至双向测序结果完全吻合。

1.5.1统计分析

基因频率和基因型频率

使用PopGen32软件计算各SNPs的基因频率和基因型频率。

①群体中某基因型频率＝基因型个体数/该群体个体数×100％；

②体中某基因频率＝该性状纯合基因型频率+1/2×杂合基因型频率。

多态信息含量(PIC)

其中：Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因频率；n为等位基因数。

位点杂合度

其中：Pi为基因频率；m为等位基因数；r为位点数；H为平均杂合度。

Shannon信息含量

SIC＝-ClogPi

其中：Pi为第i个等位基因在群体中的频率，C为常数。

位点关联分析

使用SPSS20软件，基于一般线性模型(GLM)挖掘与湖羊肉用系核心群体重性状相关的SNPs。

由于分析的所有个体均为来自同一饲养场相同饲养环境和管理条件的羊只，且均为雌性个体，因此数据建模时不包括场效应及性别效应。

具体模型为：Y＝Xβ+e

其中，

Y：湖羊肉用系核心群体尺性状、体重性状表型值向量；

β：表型均值、SNP等固定效应向量；

e：残差效应向量；

X为β的关联矩阵。

当Y为湖羊肉用系核心群初生重表型值向量时，按照以下模型分析：

Y＝Xβ+Sα+e；

其中：

Y：湖羊肉用系核心群体重性状表型值向量；

α：同胞数的固定效应向量；

β：SNP效应向量；

e：残差效应向量；

X、S分别为β、α的关联矩阵。

2.结果与分析

2.1湖羊体重性状候选功能性SNPs检测引物的PCR扩增

各引物PCR产物亮度较高，条带单一，无非特异性扩增(图5，实际PCR产物与预计PCR扩增产物大小一致，可进行后续PCR-产物直接测序试验。

2.2湖羊体重性状候选功能性SNPs位点扩增产物突变分析

11个湖羊体重性状相关SNPs位点扩增产物突变分析结果如表4所示。

总共检测到13个SNP。除了检测到GWAS预测的SNP，还在扩增产物的目标SNP位点附近鉴定了一些其他突变(表4)。OARX_76354330.1的扩增产物检测到两个突变，而s39389.1的扩增产物包含三个突变。此外，s64890.1和s37755.1的扩增产物分别检测到四个突变。此外，五个SNP具有较低的多态性(PIC<0.25)，而其他八个SNP具有中等的多态性(0.25<PIC<0.5)(表5，表6)。

两个SNP与湖羊雌性的初生体重显着相关：OARX_76354330.1处的T>A突变和OARX_76354330.1下游28bp处的A>G突变(表7)。一个SNP与湖羊的断奶体重显着相关：s39389.1处的T>C突变(表8)。一个SNP与湖羊雌性的周岁体重显着相关：在s64890.1处G>A突变(表9)。

表4湖羊体重性状候选功能性SNPs位点及突变类型、方式

表5湖羊体重性状候选功能性SNPs位点的遗传参数

表6湖羊体重性状候选功能性SNPs位点的群体遗传学分析

表7湖羊初生重性状相关SNPs位点的关联分析

表8湖羊断奶重性状相关SNPs位点的关联分析

表9湖羊周岁体重性状相关SNPs位点的关联分析

注：相同一列数据字母相同表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。参考文献

[1]魏彩虹,杜立新.我国肉用绵羊育种现状与未来发展方向[J].中国草食动物科学,2012,s1):454-457.

[2]文伟,陶格素,图亚.巴彦淖尔成功培育具有知识产权肉羊品种[J].北京农业,2008,15):70-70.

[3]魏景钰,胡大君,隔日勒图雅.昭乌达肉羊新品种简介[J].中国畜牧兽医文摘,2013,8):39-40.

[4]内蒙古晨报.肉羊新品种被农业部命名为“察哈尔羊”[J].湖北畜牧兽医,2014,3):15-15.

[5]Zhao Fu Ping,Wei Cai Hong,Zhang Li,et al.A genome scan of recentpositive selection signatures in three sheep populations[J].Journal ofIntegrative Agriculture,2016,15(1):162-174.

[6]Almamun Hawlader A.,Kwan Paul,Clark Samuel A.,et al.Genome-wideassociation study of body weight in Australian Merino sheep reveals anorthologous region on OAR6 to human and bovine genomic regions affectingheight and weight[J].Genetics Selection Evolution,2015,47(1):66.

[7]Ma X.,Guan L.,Xuan J.,et al.Effect of polymorphisms in the CAMKMTgene on growth traits in Ujumqin sheep[J].Animal Genetics,2016,47(5):618-622.

[8]Li Zhang,Liu Jiasen,Zhao Fuping,et al.Genome-Wide AssociationStudies for Growth and Meat Production Traits in Sheep[J].Plos One,2013,8(6):e66569.

[9]Matika Oswald,Riggio Valentina,Anselme-Moizan Marie,et al.Genome-wide association reveals QTL for growth,bone and in vivo carcass traits asassessed by computed tomography in Scottish Blackface lambs[J].GeneticsSelection Evolution Gse,2016,48(1):11.

[10]Demars Julie,Fabre Stéphane,Sarry Julien,et al.Genome-WideAssociation Studies Identify Two Novel BMP15Mutations Responsible for anAtypical Hyperprolificacy Phenotype in Sheep[J].Plos Genetics,2013,9(4):e1003482.

[11]储明星,桑林华,王金玉,et al.小尾寒羊高繁殖力候选基因BMP15和GDF9的研究[J].Journal of Genetics\s&\sgenomics,2005,32(1):38-45.

[12]Gholizadeh M,Rahimimianji G,Nejatijavaremi A,et al.Genomewideassociation study to detect QTL for twinning rate in Baluchi sheep[J].Journalof Genetics,2014,93(2):489-493.

[13]Garcíagámez Elsa,Gutiérrezgil Beatriz,Sahana Goutam,et al.GWAAnalysis for Milk Production Traits in Dairy Sheep and Genetic Support for aQTN Influencing Milk Protein Percentage in the LALBA Gene[J].2012,7(10):e47782.

[14]Mousel M.R.,Reynolds J.O.,White S.N.Genome-Wide AssociationIdentifies SLC2A9 and NLN Gene Regions as Associated with Entropion inDomestic Sheep[J].Plos One,2015,10(6):e0128909.

[15]Jawasreh K,Boettcher P.J.,Stella A.Genome-wide association scansuggests basis for microtia in Awassi sheep[J].Animal Genetics,2016,47(4):504-506.

[16]Niggeler A.,Tetens J.,

A.,et al.A genome-wide significantassociation on chromosome 2for footrot resistance/susceptibility in SwissWhite Alpine sheep[J].Animal Genetics,2017,48(6).

[17]Ebrahimi F,Gholizadeh M,Rahimi-Mianji G,et al.Detection of QTLfor greasy fleece weight in sheep using a

K single nucleotide polymorphismchip[J].Tropical Animal Health&Production,2017,49(8):1657-1662.

[18]Bolormaa S,Swan A.A.,Brown D.J.,et al.Multiple-trait QTL mappingand genomic prediction for wool traits in sheep[J].Genetics SelectionEvolution,2017,49(1):62.

[19]Li M.H.,Tiirikka T.,Kantanen J.A genome-wide scan studyidentifies a single nucleotide substitution in ASIP associated with whiteversus non-white coat-colour variation in sheep(Ovis aries)[J].Heredity,2014,112(2):122-131.

[20]高中元,林婄婄,袁亚男,et al.PLIN基因多态性及其与绵羊尾形和屠宰性状的关联研究[J].山西农业大学学报(自然科学版),2012,32(2):158-164.

[21]刘真.肥尾和瘦尾羊全基因组选择信号检测.中国农业科学院,2015.

[22]Zhu Caiye,Fan Hongying,Yuan Zehu,et al.Genome-wide detection ofCNVs in Chinese indigenous sheep with different types of tails using ovinehigh-density600K SNP arrays[J].Sci Rep,2016,6(27822.

[23]Xu S.S.,Ren X.,Yang G.L.,et al.Genome-wide association analysisidentifies the genetic basis of fat deposition in the tails of sheep(Ovisaries)[J].Animal Genetics,2017,48(5).

[24]Martin P,Palhière I,Tosser-Klopp G,et al.Heritability and genome-wide association mapping for supernumerary teats in French Alpine and Saanendairy goats[J].Journal of Dairy Science,2016,99(11):8891-8900.

[25]兰蓉,朱兰,姚新荣,et al.山羊产羔数全基因组关联分析[J].畜牧兽医学报,2015,46(4):549-554.

[26]Martin P,Palhière I,Maroteau C,et al.A genome scan for milkproduction traits in dairy goats reveals two new mutations in Dgat1reducingmilk fat content[J].Scientific Reports,2017,7(1):1872.

[27]Davenport C.B.The Origin of Black Sheep in the Flock[J].Science,1905,22(569):674-675.

[28]Marie Martin Pauline,Isabelle Palhière,Anne Ricard,et al.GenomeWide Association Study Identifies New Loci Associated with Undesired CoatColor Phenotypes in Saanen Goats[J].Plos One,2016,11(3):e0152426.

[29]Becker D,Otto M,Ammann P,et al.The brown coat colour ofCoppernecked goats is associated with a non-synonymous variant at theTYRP1locus on chromosome8[J].Animal Genetics,2015,46(1):50-54.

[30]潘东东,李正帮,张维,et al.全基因组关联研究综述[J].应用概率统计,2014,30(1):84-103.

[31]凃欣,石立松,汪樊,et al.全基因组关联分析的进展与反思[J].生理科学进展,2010,41(2):87-94.

[32]Yang J.,Zaitlen N.A.,Goddard M.E.,et al.Advantages and pitfallsin the application of mixed-model association methods[J].Nature Genetics,2014,46(2):100-106.

[33]Xu S.Mapping quantitative trait loci by controlling polygenicbackground effects[J].Genetics,2013,195(4):1209-1222.

[34]张统雨,朱才业,杜立新,et al.羊重要性状全基因组关联分析研究进展[J].遗传,2017,39(6):491-500.

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 体重性状相关的SNPs分子标记及其在湖羊辅助育种中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 370

<212> DNA

<213> Ovine

<220>

<221> allele

<222> (200)..(200)

<223> y is "t" or "a"

<220>

<221> allele

<222> (228)..(228)

<223> y is "g" or "a"

<400> 1

gatgaccctc gtctgattgt gggcaacatc agcaaccacc agctgaccca agggagactg 60

gggcacaagc caatggtctc tgcattttcc tgtttggctg ttcaggagtg tcactggaca 120

aaggtattct cttttctgca ggacctcact tgacttctac cttcttgtct tctttagtaa 180

ctttaggaaa agtcagctcy taactttctt agtttgttta attcttgyag tcagaagtat 240

tcacgattgg aggtgacttt cctccactta gtttcacaaa tacagaaagt tgaatgattt 300

ttacagtcaa catccattta ctcacctgcg ttctgccagt aacgtttggc tccatttgct 360

ttgtcacacg 370

<210> 2

<211> 404

<212> DNA

<213> Ovine

<220>

<221> allele

<222> (203)..(203)

<223> y is "g" or "a"

<400> 2

ccaggtccct attatctgtg tctctttctt ctcaaactag aataaaactg gaaacatttc 60

agttaactga caacttgacg attacacttg gttggattcc ggtaccttga agttctccat 120

ggagcaggca gtcattctgt gccctcgtgg gcgtcctaac ctccaccacg tgcctgcaac 180

actcctggcc ctcccaggag gtyaggagga ggtgtgcact tggtaccact gcaccatcct 240

gctgttggat caaaggtgga cgcacaaccc tgtgatatcc agttgcccag ctggccaggg 300

tggggtcacc ttgcagagca gaaaagatga gtgcagccaa taggacttcc ccgcttagga 360

atcagagtgg gaaaaggtag aaggaggaag tgattagcag caga 404

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaccaccag ctgacccaag gga 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caactaatac gtgtgacaaa gcaa 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaggtccct attatctgtg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctgctgcta atcacttcct 20

Claims

1.一种检测与湖羊体重性状相关的SNPs分子标记的试剂在筛选湖羊体重性状中的应用，其特征在于，该SNPs分子标记包括以下的分子标记中一种或多种：

1）包括位点位于SEQ ID NO:1的第200bp位点的SNP，其为T或A，与湖羊雌性的初生体重显着相关；

2）包括位点位于SEQ ID NO:1的第228bp位点的SNP，其为G或A，与湖羊雌性的初生体重显着相关；

3）包括位点位于SEQ ID NO:2的第203bp位点的SNP，其为G或A, 与湖羊雌性的周岁体重显着相关。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂包括用于检测权利要求1中所述的SNPs分子标记的引物对；该引物对包括针对SEQ ID NO:1的第一引物对和针对SEQ ID NO:2的第二引物对中的一种或两种：

第一引物对：上游引物的序列为CAACCACCAGCTGACCCAAGGGA，下游引物的序列为CAACTAATACGTGTGACAAAGCAA；

第二引物对：上游引物的序列为CCAGGTCCCTATTATCTGTG，下游引物的序列为TCTGCTGCTAATCACTTCCT。

3.一种筛选湖羊体重性状的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：提取湖羊基因组DNA，利用引物对进行PCR扩增，对扩增产物中的SNPs分子标记进行检测，从而筛选湖羊体重性状；

所述的引物对包括针对SEQ ID NO:1的第一引物对和针对SEQ ID NO:2的第二引物对中的一种或两种：

第二引物对：上游引物的序列为CCAGGTCCCTATTATCTGTG，下游引物的序列为TCTGCTGCTAATCACTTCCT；

SNPs分子标记包括以下的分子标记中一种或多种：

4.根据权利要求3的一种筛选湖羊体重性状的方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min； PCR扩增的反应体系如下：

10×Dream Taq Green 缓冲液 3.0µL；

dNTP 1.5µL；

上游引物 0.15µL；

下游引物 0.15µL；

Dream Taq DNA 聚合酶 0.20µL；

DNA模板 2.0µL；

ddH2O 23.0µL；

总体系 30.0µL。