CN105132434A - 一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1及其编码蛋白和应用，属于植物基因工程领域。本发明通过对紫花苜蓿CAMTA1基因的分离和功能鉴定，确定了MsCAMTA1基因在改良植物抗寒性方面的应用。本发明公开了MsCAMTA1基因核苷酸序列及编码的蛋白质氨基酸序列，MsCAMTA1基因全长3123bp，编码1040个氨基酸残基的蛋白。实验发现该基因能够提高烟草抗寒性。该基因为基因工程改良植物抗寒能力提供了新的基因资源，具有广泛的应用前景。

Description

一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1及其编码蛋白和应用。

背景技术

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是我国重要的栽培饲用牧草资源，其蛋白质含量高、营养价值丰富，适口性好，产草量高，抗逆性强，被誉为“牧草之王”。紫花苜蓿是理想的饲用植物，同时也是良好的绿肥植物，具有很强的固氮、蓄水和保护生态平衡的能力，在农牧业发展中占重要地位。我国北方地区，由于冬季气候干燥寒冷，许多引进的紫花苜蓿品种普遍存在越冬率低、容易发生冻害和死亡的现象。低温已成为限制北方紫花苜蓿产业发展的重要影响因素。紫花苜蓿越冬问题，即紫花苜蓿的抗寒性问题，一直是紫花苜蓿研究人员亟待解决的难题。

低温是植物在生长发育过程中常见的一种非生物逆境胁迫。低温能够引起植物膜损伤、光合降低、呼吸增强、有害化学物质积累、生长抑制以及代谢失调等现象。低温环境不仅影响植物的生长、发育、代谢，还影响植物的产量，质量，同时还决定植物的地域分布。大多数源于温带地区的植物可以通过低温驯化提高植物的抗寒能力，如小麦、大麦、油菜等。Thomashow将冰点以上的低温激活了转录和新陈代谢的重编，进而增加了植物对冰冻的耐性过程定义为“冷适应”。该过程涉及植物生理生化的多个过程，如：细胞渗透性的增强、质膜合成物的改变、抗氧化物增强、初级代谢产物的活跃等，也是植物为了安全度过冬季所要经历的必须阶段。

近年来，植物冷驯化和抗寒分子机理的研究取得了显著进展，紫花苜蓿抗寒基因工程也取得了较大进步。低温胁迫下，植物细胞中会产生大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其他细胞组分的严重损伤，而植物体内的各种酶促和非酶促抗氧化系统可有效清除活性氧。因此，通过将编码抗氧化酶的基因导入紫花苜蓿，可能会为提高紫花苜蓿抗逆性开辟一条新的途径。Ca²⁺信号途径在植物抵抗冷胁迫中起到重要作用，大量研究表明，细胞内钙离子浓度的瞬时升高是触发植物防御反应的早期信号，这种浓度变化需要通过Ca²⁺受体传递给相应的靶蛋白而起作用。CAMTA(calmodulin-bindingtranscriptionactivator)基因，又称SR(singaling-responsiveprotein)基因是一类能与钙调素结合并具有转录激活作用的蛋白。Doherty等发现AtSR1/CAMTA3和AtSR2/CAMTA1在植物耐低温中起着重要作用。突变体camta1中冷诱导的CBF1、CBF2、ZAT12和GOLS3的表达水平远低于野生型；双突变体camta1/camta3对低温的耐受性显著低于野生型。CAMTA基因在植物响应低温胁迫的钙信号通过中起着重要作用，虽然拟南芥、小麦、番茄都有报道，但是紫花苜蓿中CAMTA基因及相关应用至今尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1及其编码蛋白和应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1，该紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，序列长度为3123bp，核苷酸序列的碱基组成为916A869T748G590C。

本发明还公开了由上述的紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，序列长度为1040个氨基酸残基。

本发明还公开了含有上述的紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1的表达载体，所述表达载体为pCBM-35S-CATMTA1，含有草甘膦筛选标记基因PPT和组成型启动子35S。

本发明还公开了上述紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1在提高紫花苜蓿对环境抗寒性能中的应用。

进一步地，构建含有上述基因MsCAMTA1的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体转化到烟草(Nicotianatabacumcv.SR-1)中，筛选获得抗寒性增强的烟草。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明首次公开了一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1，并获得了该基因编码的蛋白氨基酸序列，同时运用分子生物学及基因工程技术证实了紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1可以提高植物抗寒性。通过Real-timePCR方法对MsCAMTA1在过表达转基因烟草中的表达量进行了检测。结果显示，所获得的转基因植株中MsCAMTA1的表达量显著提高。对获得的转基因烟草进行抗寒性分析，经分析表明，转基因植株与野生型相比较，存活率升高，膜透性增加缓慢，抗零下低温能力提高。本发明获得的MsCAMTA1是一个钙调素结合蛋白转录因子，不仅在提高植物抗寒性方面起到重要作用，对改良牧草品质具有重要的应用和经济价值。基于此研究结果，为通过基因工程或分子育种提高作物抗寒性和改良牧草品质提供必要的理论依据和技术支持，具有较大应用前景。

附图说明

图1为MsCAMTA1氨基酸序列同源性比对分析结果；

图2为MsCAMTA1系统进化树分析结果；

图3为MsCAMTA1蛋白二级结构预测结果示意图；

图4为MsCAMTA1基因表达模式结果；

其中，(a)为室外自然降温处理MsCAMTA1表达模式结果；(b)为人工降温处理MsCAMTA1表达模式结果；

图5为MsCAMTA1载体构建图；

图6为MsCAMTA1载体构建电泳结果图；

其中，a为pMD18T-CAMTA1SalI和KpnI双酶切胶回收MsCAMTA1；

b为pMD18T-CAMTA1和pBlu载体SalI和KpnI双酶切；

c为pCBMSmaI和SacI双酶切；

d为pBlu-CAMTA1-17KpnI(平滑)和SacI酶切；

e为pCBM-CAMTA1-25SmaI和SacI双酶切鉴定；

f为pCBM-CAMTA1-25转化农杆菌EHA105菌落PCR鉴定；

g为pCBM-CAMTA1-25转化农杆菌EHA105阳性克隆SmaI和SacI双酶切鉴定。

图7为转MsCAMTA1基因抗性苗的PCR鉴定；

图8为qRT-PCR分析过表达株系的MsCAMTA1表达量结果；

图9为转基因烟草与野生型烟草低温胁迫下的表型结果分析；

图9-1为转基因植株电导率；

图9-2为转基因植株叶绿素含量；

其中，WT，烟草野生型，TR2，过表达株系2。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1全长cDNA克隆

从NCBI数据库中((http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索蒺藜苜蓿的蛋白质序列和CDS序列并保存，用数据库中已知的拟南芥AtCAMTA1序列在BioEdit软件中对保存的蛋白质序列和CDS序列文本文件进行LocalBlast，这样就获得了蒺藜苜蓿中CAMTA1基因CDS序列。利用该序列设计引物，引物为：

MsCAMTA1-F：5'-AGAAGACGAAGAACATTTCG-3'；

MsCAMTA1-R：5'-GACATATATTAACAGCGGGG-3'。

具体流程如下：

1)RNA的提取：利用TRIZOL试剂盒提取，反转录为cDNA，并以此cDNA为模板RT-PCR扩增MsCAMTA1全长序列；

利用RNApreppurePlantKit试剂盒(TianGen)提取经低温4℃处理5小时的紫花苜蓿(MedicagosativaL.)叶片RNA，应用RevertraAce随机引物(Toyobo)反转录为cDNA。

以合成的紫花苜蓿cDNA为模板进行PCR扩增MsCAMTA1全长序列。

2)用TaKaRaExTaqDNA聚合酶进行PCR反应，反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30sec；54℃退火30sec；72℃延伸3min25sec；30个循环；72℃延伸10min。PCR反应结束后，将反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，得到约3310bp的片段，采用Takara公司的MiniBESTAgaroseGelDNAExtractKit回收目的片段。

将回收的PCR产物片段连接到克隆载体pMD^TM18-T(Takara)中的EcoRV位点。重组质粒转化到大肠杆菌TOP10中，然后对插入的核苷酸序列进行测序。

连接反应体系：在10μl反应体系中，SolutionI5μl，PCR回收产物4μl，pMD^TM18-T1μl。混匀后16℃反应16h。重组载体的转化：参考《分子克隆实验指南》；

4)最终鉴定得到MsCAMTA1基因ORF的全长序列。MsCAMTA1基因开放读码框全长为3123bp，其编码的蛋白的氨基酸序列具有1040个氨基酸残基，蛋白分子量为116.9kDa，理论等电点(PI)为5.61。将其氨基酸序列在GeneBank中检索，结果显示MsCAMTA1基因和MtCAMTA1基因(蒺藜苜蓿，AES63449.2)相比，氨基酸同源性为96％；与AtCAMTA1基因(拟南芥，NP_196503.1)相比，氨基酸同源性为52％。

2、MsCAMTA1基因生物信息学分析

1)MsCAMTA1基因生物信息学分析

MsCAMTA1及其他CAMTA蛋白家族成员包括Medicagotruncatula中的MtCAMTA1(AES63449.2)，Glycinemax中的GmCAMTA2(XP_003547081.1)和Glycinesoja中的GsCAMTA2(KHN39228.1)，Arabidopsisthaliana中的AtCAMTA1(NP_196503.3)和AtCAMTA2(XP_201227.3)，Cicerarietinum中的CaCAMTA2(XP_004485582.1)，Nicotianatomentosiformis中的NtCAMTA2(XP_009600618.1)的氨基酸序列通过Protein-ProteinBLAST分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，显示出较高的同源性，其中GmCAMTA2(一致性76％，相似性82％)，CaCAMTA2(一致性86％，相似性90％)，AtCAMTA1(一致性52％，相似性66％)，MtCAMTA1(一致性96％，相似性97％)同源度最高，参见图1。

2)进化树分析

从NCBI获取拟南芥(At)、野大豆(Gs)、鹰嘴豆(Ca)和蒺藜苜蓿(Mt)CAMTA蛋白质家族的氨基酸序列，应用MEGA4软件比对并构成系统发育进化树(图2)。进化关系上看，MsCAMTA1蛋白序列与MtCAMTA1和GsCAMTA2蛋白亲缘关系最近。

3)二级结构及信号肽预测

根据ProtParamtool(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)的预测分析，MsCAMTA1蛋白的分子量为116.9kDa，等电点为5.61，具有较高的Ser(10.2M％)和Asp(7.7M％)含量，不含有Pyl和Sec残基。

与此同时，再根据SOPMA的二级结构分析，结果显示(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_sopma.html)，MsCAMTA1蛋白包含37.12％α-螺旋，16.06％延展链，9.04％β-转角和37.79％不规则螺旋(图3)。信息学分析显示MsCAMTA1基因确实属于CAMTA基因家族。

3、紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1的组织特异性表达分析

1)室外自然降温处理MsCAMTA1表达模式分析

选取哈尔滨实验田苜蓿根茎作为材料，记录取样时地表温度。每个温度三个生物学重复，样品用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，最后用滤纸吸干水分，用锡纸包裹，液氮速冻，放入-80℃超低温冰柜中备用。

2)人工降温处理MsCAMTA1表达模式分析

室内培养在人工气候箱中进行。6周龄的苜蓿苗进行4℃冷驯化5d，以4℃为起始温度，以4℃为间隔设置温度梯度，降温速率不超过2℃/h，直到温度达到-8℃，然后0℃和4℃恢复培养，每个温度梯度保持1d。每个温度处理后，取出一组材料，整株植株用锡纸包裹，液氮速冻，放入-80℃超低温冰柜中备用。

从低温处理的苜蓿中提取总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测MsCAMTA1基因表达模式。采用TianGen公司试剂盒提取RNA。用DEPC处理水溶解RNA，所获得的RNA样品使用ReverTraAce-α-进行cDNA的合成。以野生型烟草为对照进行荧光定量qRT-PCR检测。qRT-PCR体系：荧光定量qRT-PCR利用7300Biosystem，根据SYBRPremixExTaq(TaKaRa)说明书进行操作。反应体系：总体积20μl包括SYBRPremixExTaqII10μl；反转录cDNA2μl；10μM的引物各0.8μl；水6.0μl；ROXReferenceDye(50x)0.4μl。利用2^-△△CT方法计算表达量。

图4结果显示，MsCAMTA1基因在室外自然降温和人工降温处理条件下表达模式存在差异。人工降温处理条件下，参见图4(a)，MsCAMTA1基因在冷适应(4℃，5d)过程中表达量逐渐升高，当受到冷胁迫(-8℃，1d)时，表达量仍然上升直到恢复培养阶段(0℃，1d)。室外自然降温过程中，参见图4(b)，MsCAMTA1基因直到11月11日(地表温度-10℃)表达量持续升高，在12月6日，温度虽然还在降低，但MsCAMTA1基因表达量下降。说明在不同低温处理条件下，MsCAMTA1基因在植物不同组织中表达模式不同。

4、植物表达载体pCBM-35S-CAMTA1的构建

构建植物表达载体pCBM-35S-CAMTA1的载体图见图5。基因克隆时分别在引物上引入限制性酶切位点KpnI和SalI。将含有MsCAMTA1基因的克隆载体pMD-MsCAMTA1质粒进行KpnI和SalI双酶切。酶切体系参考Takara公司限制性内切酶双酶切反应说明书，37℃反应12小时。回收带有粘性末端的MsCAMTA1目的片段。

将克隆载体pBlu质粒DNA进行KpnI和SalI双酶切，37℃反应12小时，回收大片段即pBlu克隆载体骨架。将目的片段与pBlu克隆载体连接。连接产物转化TOP10感受态细胞。挑取单菌落进行PCR鉴定。取菌落PCR阳性的菌落提取质粒，进行KpnI和Sal双酶切鉴定，获得约3123bp的片段，证明MsCAMTA1基因插入到了质粒载体pBlu中，参见图6a和6b。

将载体pBlu-MsCAMTA1质粒DNA进行KpnI单酶切，37℃反应12小时，酚氯仿抽提之后，用KOD平滑酶进行平滑，酚氯仿抽提，再用SacI酶切，回收大片段即带有粘性末端的MsCAMTA1目的片段(图6d)。

将双元植物表达载体pCBM质粒DNA进行SmaI和SacI双酶切，37℃反应12小时，回收大片段即pCBM载体骨架(图6c)。

将目的片段与母载体连接。连接产物转化TOP10感受态细胞。挑取单菌落进行PCR鉴定。取菌落PCR阳性的菌落提取质粒，进行SmaI和SacI双酶切鉴定，获得约3123bp的片段，证明MsCAMTA1基因插入到了质粒载体pCBM中(图6e)。

实施例5、MsCAMTA1基因转化植物及转基因植物的检测

将构建成功的植物表达载体pCBM-35S-CAMTA1，用电击法导入农杆菌EHA105中，进行菌落PCR鉴定，结果获得大约3123bp的产物(图6f)。提取PCR阳性菌落质粒，进行酶切，获得约3123bp的片段，证明转化载体已经转入农杆菌中(图6g)。

将经过菌落PCR鉴定的农杆菌单菌落分别接种于含有50mg/LKan+50mg/LStr+50mg/LRif的5mlYEB液体培养基中，于28℃，200rpm振荡培养过夜，次日，将其转入50mlYEB液体培养基中，于28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀值在0.4-0.6时，收集菌体，用MS液体培养基悬浮，待用。

将上述得到的重组过表达载体pCBM-35S-CAMTA1经农杆菌介导的叶盘法转入烟草中，具体操作步骤：在超净工作台内，将重悬后的农杆菌菌液倒入无菌培养皿中，将叶片切成1cm×1cm小块置于菌液中浸泡8min中，期间不断震荡。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着菌液，接种于诱导不定芽的培养基MS1，在25±2℃条件下暗培养48h。然后接种到MS2培养基上进行筛选培养，每20天更换一次诱导培养基。经过侵染的叶片长出不定芽时，转入生根培养基MS3中。使用培养基如下：

MS1：MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA

MS2：MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.1mg/LPPT+500mg/LCef

MS3：1/2MS+1.3mg/LPPT+500mg/LCef

根系发育好后，移入盛有无菌土的花盆中，温室常规管理。

为了确认产生的转基因植株确实含有MsCAMTA1基因，用PCR方法对筛选的转基因植株进行进一步的鉴定。

首先采用CTAB法提取植物基因组：称取植物叶片100mg左右置于1.5ml离心管中，加入液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入700μl预热的2×CTAB缓冲液(100mMTris-HclpH8.0，20mMEDTApH8.0，1.4MNacl，2％CTAB)，65℃水浴加热45分钟后取出冷却；离心取上清加入等体积的酚和氯仿，颠倒混匀，4℃离心10min(12000rpm)后转移上清至1.5ml离心管中；再次加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(24：1)颠倒混匀，4℃离心10min(12000rpm)后转移上清至新的1.5ml离心管中，加入1/10体积3MpH5.2醋酸钠和等体积异丙醇，混匀后至于-20℃冰箱中20min；4℃离心10min(12000rpm)后弃上清，加入70％乙醇500μl，4℃离心10min(12000rpm)后，干燥，用纯水溶解。

以植物基因组DNA为模板，用MsCAMTA1基因内部特异引物作PCR检测，成功转入MsCAMTA1基因的植株均能扩增出600bp的条带，参见图7。为了考察目的基因在转基因株系中的转录情况，从转基因植物中提取总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测MsCAMTA1基因在转基因植物中的转录水平。结果证明转基因植株均有目的基因的转录物，而野生型植株则没有。结果如图8所示，筛选出MsCAMTA1表达量较高的阳性植株4个株系分别是TR2、TR3、TR8和TR9，以TR2为例作后续实验。

6、转MsCAMTA1烟草的抗寒性分析

将生根两个月的转基因烟草苗，同时期栽培生长状况类似的野生型烟草苗，置于-4℃处理4h，-8℃处理0.5h，处理之后的表型参见图9，结果显示转基因植株较野生型烟草受低温胁迫损伤小，说明转基因植株抗寒能力提高。同时测定质膜透性叶绿素含量。实验设置三组重复，通过t-检验评价转基因组与对照组的显著性差异。

1)质膜透性的测定

用打孔器在转基因阳性烟草叶片上取10个小圆片(避开主脉)于20mL专用刻度试管中，加入超纯水至刻度处，然后置于干燥器中用真空泵分两次共抽气30min，以抽出细胞间隙中的空气，将抽过气的试管取出静置20min，然后用玻璃棒轻轻搅动时片，在20-25℃恒温下，用电导仪测定其电导率，然后置于100℃沸水浴中15min，以杀死植株组织，自然冷却后加超纯水至刻度处，在20-25℃恒温下，用电导仪测定其煮沸电导率，用细胞膜伤害率＝处理电导率/煮沸电导率×100％，表示细胞质膜透性的大小。结果参见图9-1，相对非转基因的对照植株，MsCAMTA1转基因烟草叶片在冷胁迫下质膜透性增加明显较缓慢，且幅度较小，说明细胞质膜受损程度较轻。t-检验显示p<0.05，转基因组与对照组的差异显著。

2)叶绿素含量测定

MsCAMTA1过表达植株和WT烟草植株的叶绿素含量检测是利用叶绿素分析仪在植株第三片完整平展的叶片上进行检测分析(SPAD-501，Japan，Minota)。结果参见图9-2，与野生型对照植株相比，MsCAMTA1转基因烟草叶片在冷胁迫下叶绿素降低较缓慢，且幅度较小，说明转基因植株受损程度较轻。t-检验显示p<0.05，转基因组与对照组的差异显著。

综上所述，本发明通过对紫花苜蓿CAMTA1基因的分离和功能鉴定，确定了MsCAMTA1基因在改良植物抗寒性方面的应用。本发明公开了MsCAMTA1基因核苷酸序列及编码的蛋白质氨基酸序列，MsCAMTA1基因全长3123bp，编码1040个氨基酸残基的蛋白。实验发现该基因能够提高烟草抗寒性。该基因为基因工程改良植物抗寒能力提供了新的基因资源，具有广泛的应用前景。

Claims (5)

1.一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1，其特征在于，该抗寒基因MsCAMTA1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.由权利要求1所述的紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pCBM-35S-CATMTA1，含有草甘膦筛选标记基因PPT和组成型启动子35S。

4.权利要求1所述紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1在提高紫花苜蓿对环境抗寒性能中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，构建含有权利要求1所述基因MsCAMTA1的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体转化到对冷敏感的植物中，筛选获得抗寒性增强的植物。