CN103382476B - 赋予植物耐寒性的一个棉花P型ATP酶基因Gbpatp的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个赋予植物耐寒性的P型ATP酶基因 Gbpatp 的应用，属于生物技术领域。 Gbpatp 基因是从海岛棉品种H7124（Gossypium barbadense）中获得的一个P4-ATPase,该基因含有跨膜区、ATPase区以及水解酶区。该基因受低温诱导后表达量显著增加，沉默该基因可以显著降低受体植株的耐低温能力。 Gbpatp 转基因植株可以显著提高受体植物对低温的耐受力。Gbpatp基因的分离可以进一步丰富抗性基因资源，有助于更好地了解耐低温基因的作用机制，可将该基因应用于抗寒育种。

Description

赋予植物耐寒性的一个棉花P型ATP酶基因Gbpatp的应用

一、技术领域

本发明提供了一个赋予植物耐寒性的P型ATP酶基因Gbpatp的应用，涉及植物基因的功能分析及其应用，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗寒性及其他有益生产性状。

二、背景技术

随着全球气候异常，极端天气发生频繁生，对植物的生长带来很大的挑战，其中，冷/冻害给农业生产带来极大的影响，为此，科研工作者不断寻找各种途径解决这一问题。其中克隆耐寒基因成为一条主要途径。

ATP酶，又称为三磷酸腺苷酶，能将三磷酸腺苷（ATP）催化水解为二磷酸腺苷（ADP）和磷酸根离子，并释放能量。该酶是使离子逆电化学势梯度进行跨膜运输的膜载体蛋白。P-type ATPases是ATP酶中的一种，因其在催化过程中形成一个磷酸化的中间体，所以称为P-type ATPases。它广泛参与植物的离子运输、细胞信号转导、细胞膜形态建成等（彭陈，2010）, 与植物的离子养分吸收运输、生长发育和逆境抗性等密切相关。因此，对P-type ATPases的深入了解不仅有助于分析其与植物生长发育及逆境抗性的关系，进而解决实际生产中存在的问题，而且也可以从分子基础上发掘具有重要利用价值的植物新资源。

1957年Jens C. Skou等发现了第一个P-type ATPases。他们在研究蟹爪神经的阳离子传导时，发现了由K+驱动的ATPase产生的跨膜电势，这是一种Na+/K+-ATPase，能利用ATP跨轴突膜来传输Na+和K+离子。40年后，1997年Jens C. Skou同Paul D. Boyer, John E. Walker一起因此获得诺贝尔化学奖（Werner Kühlbrandt, 2004）。

迄今，P-type ATPases的发现已经有50多年的时间，目前对 P-type ATPases的研究仍然方兴未艾。 Gomés等(2000)研究发现P4-ATPase与植物抗冷胁迫有关，但是参与抗冷胁迫的相关机制还未知。Baxter 等(2003)对水稻和拟南芥的P-type ATPases进行了聚类分析, 按照运输的离子不同, 将这些P-type ATPases大致分为5个大的进化上相对接近的家族, 这5个家族又进一步衍生成10个亚家族。Martin等(2006)用稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) P-type ATPases基因突变体（MgATP2）来研究 P-type ATPases对稻瘟病菌致病性的作用，接种发现稻瘟病菌突变体ΔMgATP2对水稻品种CO-39的致病力显著降低，水稻5cm 叶片的损伤密度只有2.23±1.5，并且突变体的致病时间也延后了，侵染72-96h才产生致病性状；相比之下，野生型菌株Guy11对水稻5cm叶片的损伤密度有34.33±3.6，在侵染48h内即产生致病性状。近年来，拟南芥P-type ATPase的研究有了较新的进展，例如：ALA1, ALA2 和 ALA3。 AlA1定位在细胞质膜上，且具有一定的耐低温能力 (Rosa L. Lo' pez-Marque′ s, 2012)。Lisbeth等(2008)通过T-DNA插入使拟南芥P4-ATPase基因ALA3发生突变研究其功能，发现拟南芥突变体生长矮小，根系不发达，ALA3基因突变影响了拟南芥根的生长和嫩苗的组织发育(Lisbeth Rosager Poulsen,2008)。在酵母中，DRS2的缺失会引起其对冷害及金属敏感的表型，而ALA2 恰好能弥补这一表型，由此表明：ALA2在提高植物耐低温及对金属的敏感性方面有一定的应用价值(Lopez Marques and Rosa Laura 哪年的不清楚)。综上所述，P-type ATPases与植物的离子养分吸收运输、生长发育和逆境抗性等密切相关。

在离子运输方面P-type ATPases也起到了重要作用。研究表明：大多数 P-type ATPases都参与阳离子（H+, Na+/K+, H+/K+, Ca2+，重金属）的跨高浓度的摄入或（和）排出，有少数运输磷脂（ Baxter I，2003）。植物中H+-ATPases的基本功能是产生电化学质子梯度，这个质子梯度作为原动力驱动其它二级运输系统使植物吸收养分，该梯度也具有调节细胞间pH的作用。由此可以看出，H+-ATPases的作用处于中心地位(Portillo F,2000)。

不同种类生物的 P-type ATPases具有特异性。Na+因为可以产生渗透势而对大多数生物细胞具有毒害，因而需要从细胞质中及时地被排掉，动物和真菌中存在分别属于P2C的Na+-/K+-ATPases和P2D的Na+-ATPases，它们承担着排出Na+的功能(Axelsen KB,2001)。但是到现在拟南芥中还没有发现这样运输Na+的泵。目前在拟南芥的双膜系统（质膜和液泡膜）上发现了一些具有相同功能的Na+/H+反向运输体。SOS1基因编码一个这样的质膜反向运输体，而NHX1则编码了一个液泡膜的反向运输体。拟南芥大致有三个与质膜SOS1相同的反向运输体，四个与液泡膜NHX1相似的反向运输体。除此之外，在植物和其他真核生物中还不存在原核生物中广泛存在的Kdp K+-ATPase(Thever MD,2009)。

植物中P2A ATPases的功能是运输Ca2+，与动物中的肌细胞肌浆网（Sarco- and Endo- Plasmatic Reticulum, SERCA pumps）的Ca2+ ATPases和真菌及动物一些分泌途径的ATPase类似，P2A ATPases也参与了Mn+的运输。P2B ATPase也参与Ca2+的运输，它们与哺乳动物的质膜Ca2+-ATPase(PMCA 泵)和酵母的PCA1 ATPase类似(Axelsen KB,2001)。

低温胁迫严重影响农作物产量与品质，已经成为农作物生产的重要限制因子之一。发掘和推广耐低温能力强的品种一直是农业生产中的一个重要课题。传统育种方法要进行大量的杂交，再进行多代回交和定向选择等育种方法，这需要很长时间和巨大的工作量，而植物基因工程的发展则为培育抗病品种提供了一条崭新的途径。目前基因克隆的方法主要有：序列克隆、功能克隆、定位克隆、表性差异克隆、测序克隆等，每种方法都有各自的优缺点。随着多个物种全基因组序列的公布，利用跨种序列同源性进行植物基因克隆得到了广泛的应用。本发明利用同源序列克隆法，从海岛棉7124中克隆到的一个棉花P-type ATPase基因，并命名为Gbpatp。功能分析表明，该基因能够提高植物的耐低温能力，棉花P-type ATPase基因Gbpatp的分离可以进一步丰富抗性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个赋予植物耐低温的Gbpatp基因，该基因编码棉花的一个P4-ATPase。该基因受低温诱导后表达量显著增加。该基因过量表达可以显著提高受体植物对低温的耐受力。沉默该基因可以显著降低受体植株的耐低温能力。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物耐低温能力。

技术方案

本发明涉及植物基因的功能分析，提供了一个棉花抗寒基因Gbpatp，属于植物基因工程领域，该基因来源于海岛棉品种H7124（Gossypium barbadense）。

本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。

本发明棉花抗寒基因Gbpatp及其应用，该基因编码一个ATPase，该基因受低温诱导后表达量明显上升。在海岛棉品种H7124中沉默该基因，可以明显降低H7124的耐低温能力，说明Gbpatp基因可以提高植株耐低温的能力，将Gbpatp构建到植物过量表达载体，转化普通烟草，结果该基因过量表达可以明显提高烟草的耐低温能力。 Gbpatp基因的分离可以进一步丰富抗性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。

赋予植物耐寒性的一个棉花P型ATPase基因Gbpatp的应用，包括：

以测序正确的克隆质粒T-easy-Gbpatp (陈菲，杨郁文，何冰，等． 棉花P-type ATPases 基因的克隆及表达分析． 江苏农业学报， 2011， 27( 6) : 1192-1197．)为模板，经引物

P1  ATGGAGCTGCATAACAACG

P2  TTAACTGGAATCTTCATCTGGC

高保真酶Ex Taq进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火50s，72℃延伸4min，35个循环；72℃加A10min；

PCR产物按Axygen公司PCR纯化试剂盒说明书纯化后，依据TA克隆法将Gbpatp基因全长连接到PCXSN（Chen S, Songkumarn P, Liu J, Wang GL.A versatile zero background T-vector system for gene cloning and functional genomics.Plant Physiol. 2009, 150(3):1111-21）上，采用冻融法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，培养在含有卡那霉素50 mg/L的LB固体培养基上，37℃培养16h～20h，挑取单克隆菌落于含有卡那霉素50 mg/L液体LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养14h，提取质粒，用载体引物pCXFP9 CGAATCTCAAGCAATCAAG及基因的反向引物P2进行PCR扩增3669bp大小片段，阳性克隆命名为PCXSN-Gbpatp，用冻融法将PCXSN-Gbpatp转化农杆菌LBA4404，转化子经PCR验证后保存备用；

 随机挑取合适的农杆菌转化子，进行PCR验证，吸取含有阳性克隆的菌液20μl加入到含卡那霉素50 mg／L，利福平50 mg／L 的50ml液体LB培养基中，28℃、130 r／min培养过夜至OD600为0.5，采用叶盘法侵染普通烟草，将侵染过的叶片放于培养基（MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+cef500mg/L上，黑暗处共培养2天后,将叶片转移至筛选培养基MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+cef500mg/L +hyg15上，经过筛选后，对所得再生植株，用PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达；经分子鉴定后，获得Gbpatp基因过量表达的烟草T1植株；

Gbpatp基因过量表达的烟草T1植株自交后收获T2种子，T2种子在含有15mg/L hygB的1/2MS培养基上进行筛选培养，抗潮霉素烟草生长正常，非转基因植株无法正常生长。经潮霉素筛选后的T2代烟草苗，提取DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA，经引物

hygF：TCGCCTCGCTCCAGTCAATG、

hygR：AGGGGGAAGAATCTCGTGCT

扩增356bp大小片段，筛选获得Gbpatp基因过量表达的阳性转基因烟草植株。

有益效果

1. 本发明获得了一个赋予植物耐低温的Gbpatp基因的应用。本发明涉及到的Gbpatp基因来源于海岛棉品种H7124，该基因是一个P-type ATPase基因，BLAST搜索表明该基因与拟南芥ALA1基因具有较高的同源性。该基因受低温诱导后表达量明显上升，在海岛棉品种H7124中沉默该基因，和对照放于2℃低温培养箱中，观察低温处理对其表型的影响。48h后，VIGS棉花有3片叶子出现萎蔫；而对照几乎没有变化，表明沉默Gbpatp基因降低了棉花植株对低温胁迫的抗性。

将Gbpatp基因过量表达T1烟草及普通烟草K326（对照）放于2℃低温培养箱中，观察低温处理对其表型的影响(图6)。低温处理前，2个转基因烟草株系（3和4）和2棵对照（1和2）生长状况一致；低温处理48h后，两个转基因株系的烟草（3和4）仅有下部3-4个叶片出现萎蔫，特别是3号转基因烟草依然挺拔，而对照（1和2）所有叶片全部萎蔫。初步判断，Gbpatp基因过量表达提高了烟草的耐低温能力。说明该基因确实是棉花的一个抗寒基因。

 2.本发明有助于更好地了解耐低温基因的作用机制。Gbpatp基因的克隆为进一步了植物抗寒机制奠定基础。Gbpatp基因是通过怎样的信号传导途径来提高植物的抗寒性能，哪些基因参与了该信号传导过程，可以利用该基因过量表达植株进行进一步分析，从而获得抗性信号传导通路，所以Gbpatp基因的分离以及功能鉴定为研究抗寒的作用机制奠定基础。

 3.本发明应用于抗寒育种。通过过量表达及基因沉默正反两个方向证明了Gbpatp基因具有良好的抗寒作用，所以在育种中有较大的应用价值。

四、附图说明

图1  Gbpatp的结构预测和进化树分析。该蛋白含有跨膜区、ATPase区以及水解酶区；进化树分析表明Gbpatp与ALA1亲缘关系最近。

图2 低温诱导对棉花中Gbpatp的影响。

图3 Gbpatp基因沉默效果检测。CK：对照；1-6：6株VIGS棉花，每个样品进行3次技术重复,；以P7和P8为内参引物，采用Duncan新复极差法进行数据分析。

图4低温处理对VIGS棉花表型影响。1：低温处理前对照；2：低温处理前VIGS棉花；3：低温处理后对照；4：低温处理后VIGS棉花。

图5 T2代转基因烟草的分子检测。M：标准分子量Trans2K；CK：野生型烟草；左侧为DNA检测结果，右侧为RNA检测结果；1-3：转基因株系1中的3株苗；4-6：转基因株系2中的3株苗；7-9：转基因株系3中的3株苗。

图6 低温处理对转基因烟草表型影响。A和B：分别为低温处理前、后各材料表型，1和2：对照，3和4：转基因植株。

图7 抗寒相关生理指标的测定。A, 低温处理后转基因烟草中MDA含量变化,CK：对照；M+P-1、M+P-2：2个不同的转基因株系。B, 低温处理后转基因烟草中CAT活力变化, CK：对照；M+P-1、M+P-2：2个不同的转基因株系。

五、具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验中基因来源于海岛棉品种H7124（Gossypium barbadense）。烟草品种为K326。定量PCR为德国耶拿公司qTOWER2.2六通道荧光定量PCR仪。

棉花Gbpatp基因是本研究组利用黄萎病菌（VerticilliumdahliaeKleb.）的P-type ATPases基因序列，在GeneBank中搜索棉花EST序列，根据已知片段设计3’RACE和5’RACE引物，按GenomeWalkerTMKits User Manual（Clontech）进行操作，并将扩增得到的5’和3’末端序列与原序列进行拼接，获得基因的全长（陈菲，杨郁文，何冰，等．棉花P-typeATPases基因的克隆及表达分析．江苏农业学报，2011，27(6):1192-1197．）。该基因全长3570bp，编码1189个氨基酸，在Phytozome上与雷蒙地棉（Gossypium raimondii）全基因组进行氨基酸比对，结果表明，该基因与雷蒙地棉Gorai.005G003800.4位点氨基酸序列同源性达到98.4%，且该位点含有典型E1-E2ATPase（P-type ATPase）结构域。从进化树中我们可以看到，在进化上，Gbpatp基因与拟南芥ALA1基因具有较高同源性，且为P4-ATPase亚家族成员。

（二）低温诱导对棉花Gbpatp基因表达量的影响

在H7124同一棉花植株上，分别取低温处里前，及0℃低温处理后4h、12h及24h的叶片，用CTAB法提取总RNA（骆萍，王国栋，陈晓亚. 亚洲棉C4H同源cDNA 的分离和表达特征分析. 植物学报, 2001, 43(1): 77-81.）。用RQ1 DNnase（Promega公司）处理棉花各器官的总RNA。根据Primer Premier 5设计相对定量PCR引物P5和P6，

P5  TCACCCACCTATTGGCTCAC

P6  TGGAATCTTCATCTGGCTCT

以棉花ubiquitin (UBI1)基因 (EU604080.1)为内参设计引物P7和P8，

P7 CAACGCTCCATCTTGTCCTT

P8 TGATCGTCTTTCCCGTAAGC

进行定量PCR反应，在15ul的反应体系中，cDNA加1ul，引物各加入0.5ul，SYBR Premix Ex Taq加7.5ul，ddH2O为5.5ul，反应条件为：95℃ 1min， 95℃ 10s，59℃ 20s，72℃ 20s，总计40个循环。相对定量PCR结果表明：（图 2）以低温处理前样品中Gbpatp基因的表达量为1（对照），其它时间点与其比较，从图中可知，低温处理后Gbpatp基因的表达量呈上升趋势，但上调水平不尽相同，低温处理2h后，Gbpatp基因的相对表达量达到最高值，为3.3261其它时间点分别为：2.2078、1.4433、1.1412和1.2612。低温处理后，Gbpatp基因的表达量显著高于低温诱导前（P＜0.05）。

（三） Gbpatp 基因VIGS载体构建及其对棉花抗寒性的影响

根据已经得到的Gbpatp基因的序列，设计基因片段引物P3和P4扩增，

P3 TCCACTAGT AGGACTTGGGTCAAATACGA

P4 ACGTTAATTAA TCTCCCCATGAGTCACTACTT

以质粒T-easy-Gbpatp（陈菲，杨郁文，何冰，等． 棉花P-type ATPases 基因的克隆及表达分析． 江苏农业学报， 2011， 27( 6) : 1192-1197．）为模板, 高保真酶Ex Taq进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火50s，72℃延伸4min，35个循环。将获得Gbpatp 基因片段（355bp）通过Spe/Pac 酶切，将其与pTRV1 (Gao X, Wheeler T, Li Z, Kenerley CM, He P, Shan L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromises cotton resistance to Verticillium wilt.Plant J. 2011, 66(2):293-305) 的Spe/Pac 酶切酶切产物连接，转化大肠杆菌JM109，通过筛选阳性克隆测序，验证载体构建的正确性。将构建好的质粒转化到农杆菌中，通过VIGS技术（Gao X, Wheeler T, Li Z, Kenerley CM, He P, Shan L.Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromises cotton resistance to Verticillium wilt.Plant J. 2011, 66(2):293-305）将Gbpatp基因在棉花中沉默，通过RT-PCR验证沉默效率。

为了验证VIGS植株的沉默效率，设计了3次技术重复，以非VIGS棉花为对照，设定其Gbpatp基因的表达量为1，其它VIGS棉花中Gbpatp基因的表达量与其进行比较，结果表明：6株VIGS棉花中Gbpatp基因的相对表达量分别为0.2765、0.2791、0.3542、0.3121、0.2734和0.2217，与对照相比表达量下降了60%以上，VIGS棉花中Gbpatp基因的表达量显著低于对照（P＜0.05，图3）。

将沉默掉Gbpatp同源基因的陆地棉鲁21和对照放于2℃低温培养箱中，观察低温处理对其表型的影响。48h后，VIGS棉花有3片叶子出现萎蔫；而对照几乎没有变化（图4），表明沉默Gbpatp基因降低了棉花植株对低温胁迫的抗性。

（四） Gbpatp 基因过量表达载体的构建以及烟草转化

以测序正确的克隆质粒T-easy-Gbpatp（陈菲，杨郁文，何冰，等． 棉花P-type ATPases 基因的克隆及表达分析． 江苏农业学报， 2011， 27( 6) : 1192-1197．）为模板，经引物

P1  ATGGAGCTGCATAACAACG

P2  TTAACTGGAATCTTCATCTGGC

高保真酶Ex Taq（可以直接加A）进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火50s，72℃延伸4min，35个循环；72℃加A10min。PCR产物按Axygen公司PCR纯化试剂盒说明书纯化后，依据TA克隆法将Gbpatp基因全长连接到PCXSN（Chen S, Songkumarn P, Liu J, Wang GL.A versatile zero background T-vector system for gene cloning and functional genomics.Plant Physiol. 2009, 150(3):1111-21）上，采用冻融法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，培养在含有卡那霉素（50 mg/L）的LB固体培养基上，37℃培养16h～20h，挑取单克隆菌落于含有卡那霉素（50 mg/L）液体LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养14h，提取质粒，用载体引物pCXFP9 CGAATCTCAAGCAATCAAG及基因的反向引物P2进行PCR扩增3669bp大小片段，获得阳性克隆命名为PCXSN-Gbpatp，用冻融法将PCXSN-Gbpatp转化农杆菌LBA4404，转化子经PCR验证后保存备用。

随机挑取合适的农杆菌转化子，进行PCR验证，吸取含有阳性克隆的菌液20μl加入到50ml的液体LB (含卡那霉素50 mg／L，利福平50 mg／L)培养基中，28℃、130 r／min培养过夜至OD600为0.5左右，采用叶盘法 (Horsch R B,Fry J E,Hoffmann N L,et al.A simple and general method for transferring genes into plants.Science,1985,227:1129-1131.)。侵染普通烟草，将侵染过的叶片放于培养基上（MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+cef500mg/L），黑暗处共培养2天后,将叶片转移至筛选培养（MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+cef500mg/L+hyg15）上。经过筛选后，对所得再生植株，用PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达。Gbpatp基因过量表达的烟草T1植株经分子鉴定后，转基因阳性植株自交收获T2种子。T2种子在含有15mg/L hygB的1/2MS培养基上进行筛选培养，抗潮霉素烟草生长正常，非转基因植株无法正常生长。经潮霉素筛选后的T2代烟草苗，提取DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA，经引物

hygF：TCGCCTCGCTCCAGTCAATG、

hygR：AGGGGGAAGAATCTCGTGCT

扩增356bp片段，电泳结果显示（图5），所检测的9株烟草苗在DNA和RNA水平均能扩增出特异条带，表明该基因已转入烟草，并且成功表达。

（四）T1代转化株的抗寒性鉴定及生化指标检测

将Gbpatp基因过量表达T1烟草及普通烟草K326（对照）放于2℃低温培养箱中，观察低温处理对其表型的影响。低温处理前，2个转基因烟草株系（3和4）和2棵对照（1和2）生长状况一致；低温处理48h后，两个转基因株系的烟草（3和4）仅有下部3-4个叶片出现萎蔫，特别是3号转基因烟草依然挺拔，而对照（1和2）所有叶片全部萎蔫。初步判断，Gbpatp基因过量表达提高了烟草的耐低温能力（图6）。

MDA是膜脂过氧化的终产物之一，在一定条件下，其含量与植物抵抗逆境胁迫的能力呈负相关。低温处理前， 转基因烟草与对照MDA含量均在2nmol/g左右，无显著差异（P＞0.05）。48h后，2个转基因株系和对照MDA含量分别上升为17.66162nmol/g、18.18292nmol/g和26.37982nmol/g，转基因植株中MDA含量显著低于对照（P＜0.05，图7A）。

CAT活力与植物抵抗逆境胁迫的能力呈正相关。由图7B所示，低温处理前，转基因植株和对照的CAT活力均在65U/(g·min)左右，无显著差异（P＞0.05）；低温胁迫48h后，2个转基因株系和对照分别降低至：45.3927 U/(g·min)、43.7821 U/(g·min)和15.731 U/(g·min)，转基因植株的CAT活力显著高于对照（P＜0.05, 图7B）。

综合以上两项指标，初步判断Gbpatp基因过量表达可以提高植物对低温胁迫的抵抗能力。

SEQUENCE LISTING<110>  江苏省农业科学院<120>  赋予植物耐寒性的一个棉花P型ATP酶基因Gbpatp及其应用<130>  0<160>  8     <170>  PatentIn version 3.1<210>  1<211>  19<212>  DNA<213>  人工<220><221>  Gbpatp基因全长引物P1<222>  (1)..(19)<223> 

 

<400>  1

atggagctgc ataacaacg                                                  19

 

 

<210>  2<211>  22<212>  DNA<213>  人工<220><221>  Gbpatp基因全长引物P2<222>  (1)..(22)<223> 

 

<400>  2

ttaactggaa tcttcatctg gc                                              22

 

 

<210>  3<211>  29<212>  DNA<213>  人工<220><221>  Gbpatp基因VIGS引物P3<222>  (1)..(29)<223> 

 

<400>  3

tccactagta ggacttgggt caaatacga                                       29

 

 

<210>  4<211>  32<212>  DNA<213>  人工<220><221>  Gbpatp基因VIGS引物P4<222>  (1)..(32)<223> 

 

<400>  4

acgttaatta atctccccat gagtcactac tt                                   32

 

 

<210>  5<211>  20<212>  DNA<213>  人工<220><221>  Gbpatp基因定量PCR引物P5<222>  (1)..(20)<223> 

 

<400>  5

tcacccacct attggctcac                                                 20

 

 

<210>  6<211>  20<212>  DNA<213>  人工<220><221>  Gbpatp基因定量PCR引物P6<222>  (1)..(20)<223> 

 

<400>  6

tggaatcttc atctggctct                                                 20

 

 

<210>  7<211>  20<212>  DNA<213>  人工<220><221>  棉花ubiquitin (UBI1)基因引物P7<222>  (1)..(20)<223> 

 

<400>  7

caacgctcca tcttgtcctt                                                 20

 

 

<210>  8<211>  20<212>  DNA<213>  人工<220><221>  棉花ubiquitin (UBI1)基因引物P8<222>  (1)..(20)<223> 

 

<400>  8

tgatcgtctt tcccgtaagc                                                 20

 

 

<210>  9<211>  19<212>  DNA<213>  人工<220><221>  pCXSN载体引物pCXFP9<222>  (1)..(19)<223> 

 

<400>  1

cgaatctcaa gcaatcaag                                                   19

Claims (3)

1.棉花P型ATPase基因Gbpatp在植物耐寒性育种中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，是指棉花P型ATPase基因Gbpatp过量表达在烟草耐寒性育种中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，是指棉花P型ATPase基因Gbpatp在棉花耐寒性育种中的应用。