CN102899296B

CN102899296B - 水稻耐逆性相关受体类蛋白OsSIK3及其编码基因与应用

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Publication number: CN102899296B
Application number: CN201110214133.5A
Authority: CN
Inventors: 张劲松; 陈受宜; 陈丽娟; 张万科; 马彪; 林晴; 何锶洁
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2031-07-28
Also published as: CN102899296A

Abstract

本发明公开了水稻耐逆性相关受体类蛋白OsSIK3及其编码基因与应用。本发明所提供的水稻耐逆性相关受体类蛋白OsSIK3是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明所提供的OsSIK3基因能够显著提高植物的耐盐、耐旱性。本发明对于培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对提高农作物产量具有重要意义。

Description

水稻耐逆性相关受体类蛋白OsSIK3及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及来源于水稻的耐逆性相关受体类蛋白OsSIK3及其编码基因与应用。

背景技术

环境中物理化学因素的变化，如干旱、盐碱、冷害、冻害、水涝等胁迫因素以及病虫害等生物因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。提高作物的耐逆性，可以利用传统的育种方法和分子遗传育种方法。目前，分子遗传育种已经成为科技工作者所关注的领域之一。在非生物或生物逆境的胁迫下，高等植物细胞有多种途径感受和应答外界环境中物化参数的变化，将胞外信号变为胞内信号，经过一系列磷酸化级联反应将信号传递到细胞核，经转录因子调控相关的功能基因，可以启动逆境应答基因的表达，提高植物的耐逆性。

植物耐非生物胁迫相关的基因已有很多报道，包括效应分子基因和调控基因。水稻中与耐非生物胁迫相关的调控基因方面，包括转录因子如本实验室克隆的OsbHLH(专利号ZL 03 1 23913.7)、OsDREBL(专利号ZL 02 1 29517.4)等和受体类激酶，如OsSIK1(专利申请号200710176995.7)及其它调控蛋白。上述基因转化模式植物拟南芥或水稻后，其高表达均提高了转基因植株耐非生物胁迫的能力。

水稻作为最重要的粮食作物之一，改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。转基因水稻植株的成功和水稻基因组测序工作的完成为研究发现新的耐逆境基因提供了有利条件。

发明内容

本发明的一个目的是提供与植物耐逆性相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物耐逆性相关的蛋白，名称为OsSIK3，来源于水稻(Oryzasativa)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。

序列表中的序列2由683个氨基酸残基组成。

所述与植物耐逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述与植物耐逆性相关蛋白的编码基因是如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)所述的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列1由2052个脱氧核糖核苷酸组成，自5’末端的第1至2049位脱氧核糖核苷酸为OsSIK3的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第1至3位脱氧核糖核苷酸为OsSIK3的起始密码子ATG，自5’端的第2050至2052位脱氧核糖核苷酸为OsSIK3的终止密码子TAG。

含有所述与植物耐逆性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体是在pBin438载体的多克隆位点间插入所述与植物耐逆性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

扩增所述与植物耐逆性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述与植物耐逆性相关蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性增强的转基因植物。

所述与植物耐逆性相关蛋白的编码基因是通过所述的重组表达载体导入目的植物中的。

所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。

本发明的实验证明，将OsSIK3基因导入水稻，获得了过量表达OsSIK3基因的转基因植株，在盐胁迫后，转OsSIK3基因植株的存活率和生长状态都要明显好于对照植株，而OsSIK3的突变体水稻表现出对盐和旱胁迫的超敏感，说明OsSIK3基因能够显著提高植物的耐盐、耐旱性。本发明对于培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对提高农作物产量具有重要意义。

附图说明

图1为OsSIK3在各种胁迫处理下的转录特征。

图2为植物表达载体pBin438-OsSIK3的示意图。

图3为转OsSIK3基因植株的Northern分析。

图4为转OsSIK3基因株系及对照植株耐旱性比较。

图5为转OsSIK3基因株系及对照植株在干旱处理时的水分损失率。

图6为转OsSIK3基因株系在盐池中的表现。

图7为转OsSIK3基因植株在盐胁迫下的相对离子渗透率。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、水稻耐逆性相关蛋白OsSIK3编码基因OsSIK3的筛选及其cDNA的克隆

1、OsSIK3的克隆

对数据库中的水稻全基因组序列进行BLAST检索，得到受体类激酶(RLK)相关序列片段，经过拼接，得到了267个受体类蛋白基因，经RT-PCR测定，其中一些基因受非生物胁迫诱导，从中选取一个基因作进一步研究。

将水稻(Oryza sativa var.TP309)(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Shou-Qiang Ouyang，Yun-Feng Liu，Peng Liu，Gang Lei，Si-Jie He，Biao Ma，Wan-Ke Zhang，Jin-Song Zhang and Shou-Yi Chen，Receptor-like kinase OsSIK1 improves drought and salt stress tolerance in rice(Oryzasativa)plants，The Plant Journal，2010，62(2)：316-29)幼苗培养至两周，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提方法从冷冻的水稻苗中提取RNA。取5μg总RNA用MMLV逆转录酶进行逆转录，获得cDNA一链。

以上述cDNA作为模板，所用引物如下，进行PCR扩增：

正向5’-gtgagatctatggacacgccattgctgct-3’(序列表中序列3)，

反向5’-gttggtacc tcacgctgtgcttcccggtg-3’(序列表中序列4)。

PCR反应体系为25μl，包含：PCR缓冲液、0.2mmol/L dNTPs、两个引物各0.8mmol/L、5μl稀释的cDNA混合液及1单位LA Taq DNA聚合酶(Takara)，PCR的条件为：94℃，30s；58℃，1min；72℃，3min；35个循环。

将获得的PCR产物与pGEM-T-easy载体(购自Promega)连接，得到的连接产物命名为PT-SIK3，测序，结果表明该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，该PCR产物的基因命名为OsSIK3，该基因的编码区为序列表中序列1自5’末端第1-2052位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为OsSIK3，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2所示。序列表中序列1由2052个核苷酸组成，序列表中序列2由683个氨基酸残基组成。

2、非生物胁迫和激素处理下水稻OsSIK3基因的表达模式

由于OsSIK3基因在水稻幼苗中的丰度很低，因此选用Real Time PCR的方法研究了OsSIK3在各种处理时的转录特征。

将水稻(Oryza sativa TP309)种子种在含MS培养基的培养皿中，在培养室中生长至两叶一心期时(2周)进行如下胁迫处理：1)低温处理：将水稻苗置于4℃中；2)盐处理：将水稻苗移入200mM NaCl水溶液中；3)干旱处理：将水稻苗置于20％聚乙二醇600中；4)ABA处理：将水稻苗移入100μm脱落酸(ABA)水溶液中；分别在上述各种处理后0小时、1小时、3小时、6小时和12小时分别收集新鲜叶片1g提取总RNA，将每个样品的总RNA(5μg)用MMLV逆转录酶(Gibco)在42℃下逆转录50min，取1/20的cDNA混合物用于Real Time PCR分析，引物同上，以检测OsSIK3的转录丰度。实验重复三次，得到相似的结果。

结果具体如图1所示，从图中可见，OsSIK3基因的表达明显受低温、盐、干旱和ABA诱导。

实施例2、培育耐盐和耐干旱胁迫的水稻

一、OsSIK3超表达水稻植株的获得和鉴定

1、OsSIK3超表达水稻植株的获得

1)OsSIK3超表达载体pBin438-OsSIK3的构建

以水稻(Oryza sativa TP309)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，以正向BglII：5’-agatct atggacacgccattgctgct-3’，反向KpnI：5’-gttggtacctcacgctgtgcttcccggtg-3’为引物，得到PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列1的自5′末端第1-2052位脱氧核糖核苷酸，即为OsSIK3全长cDNA；将该PCR产物经过BglII和KpnI双酶切，回收酶切后片段与经过同样酶切的pBin438载体(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：李太元，田颖川，秦晓峰，等.高效抗虫转基因烟草的研究，中国科学(B辑)，1994，24(3)：276-282.)片段连接，得到连接产物，转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在pBin438载体的BamHI和KpnI酶切位点之间正向插入序列表中序列1所示的OsSIK3基因片段，证明质粒构建正确，将得到的重组载体命名为pBin438-OsSIK3，该重组表达载体的结构示意图如图2所示。

2)OsSIK3超表达载体pBin438-OsSIK3的转化和转OsSIK3基因的水稻植株的获得

<1>转化农杆菌

a、感受态细胞的制备

参照Sambrook等(A Laboratory Manual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press)的方法：挑取根癌农杆菌AGL1(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：He Y，Jones HD，Chen S，Chen XM，Wang DW，Li KX，Wang DS，Xia LQ，Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat(Triticumturgidum L.var.durum cv Stewart)with improved efficiency，J Exp Bot.2010，61(6)：1567-81)单菌落于10mlLB(10g/L NaCl，5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨)中，28℃振荡培养至对数晚期；取0.5ml菌液加入50ml新鲜LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600≈0.5；转移至50ml离心管中，冰浴20分钟；4℃，4000rpm离心10分钟，收集菌体；沉淀用20ml预冷的10％甘油重悬；4℃，4000rpm离心10分钟，迅速倒出上清液；用甘油重悬，即为感受细胞，按每管50μl体积分装至1.5ml的离心管中，分装后于-70℃保存待用。

b、根癌农杆菌电击转化

取50μl感受态细胞，加入0.5μg重组质粒pBin438-OsSIK3，轻轻混匀，冰上放置；2 500V电击5秒，立刻加入800μl LB培养基；28℃，150rpm，恢复培养45分钟；涂布细胞于筛选培养基平板上，超净台吹干表层液体；28℃培养两天。从转化后的平板挑取单菌落接种至2ml LB YEB液体培养基(含抗生素：终浓度为50μg/ml的卡那霉素和25μg/ml的利福平)中，28℃振荡过夜，碱裂解法抽提质粒，分别进行PCR和酶切鉴定。

PCR鉴定的引物同上，得到2052bp的片段为阳性质粒。

将上述PCR鉴定的阳性质粒送去测序，结果为该质粒为pBin438-OsSIK3，将含有该质粒的菌株命名为AGL1/pBin438-OsSIK3。

<2>农杆菌介导的水稻转化

A、幼胚愈伤组织的诱导

取水稻(Oryza sativa TP309)种子，70％乙醇水溶液消毒1分钟，无菌水冲洗2-3遍；再用2％有效氯的次氯酸钠溶液振荡消毒60分钟以上，无菌水冲洗4-5遍，然后在无菌条件下分离出幼胚，接在N₆D₂培养基(N6盐分和维生素，500g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，2.5g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)上，于28℃暗培养4天，得到水稻TP309幼胚的愈伤组织。

B、农杆菌的培养

从LB固体培养基上挑取AGL1/pBin438-OsSIK3接种至20ml含终浓度为50μg/ml的卡那霉素和25μg/ml的利福平的LB液体培养基中，28℃摇菌培养至对数生长晚期；再从中取0.5ml转接至50ml同样的LB培养基中，同样条件下培养至OD₆₀₀为0.5左右。

C、共培养及转化、筛选、分化

将OD₆₀₀为0.5的AGL1/pBin438-OsSIK3于4 000g离心10分钟后，沉淀用等体积的AAM-AS(AA盐分和氨基酸，MS维生素，100mM乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，pH5.2)培养基重悬，得到AAM-AS菌液；将预培养4天的来源于水稻TP309幼胚的愈伤组织浸入此AAM-AS菌液中侵染20分钟，用无菌滤纸吸干后转移到N₆D₂C培养基(N₆D₂，10g/L葡萄糖，100mM乙酰丁香酮，pH5.2)上(在培养基表面铺一张无菌滤纸)，25℃暗培养3天。

将愈伤组织用含300mg/L的头孢霉素(cef)的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N₆D₂S₁培养基(N₆D₂，25mg/L潮霉素(Hygromycine)，600mg/L头孢霉素(cefotaxime)，pH5.8)上，筛选一代；两周后，转移至N₆D₂S₂(N₆D₂，50mg/L潮霉素，300mg/L头孢霉素，pH5.8)培养基上筛第二代(2周/代)。

取出经过两次筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基(MS盐分和维生素，300g/L水解酪蛋白，50mg/L潮霉素，3g/L 6-BA，2.5mg/L KT，0.2mg/L ZT，2.5g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)上，在分化培养箱(12小时光照/12小时黑暗，白天28℃，夜晚25℃)中培养7天；然后移至分化培养基上，在分化培养箱中培养至产生再生苗；再生的植株在生根壮苗培养基(1/4MS盐分，MS维生素，1mg/L多效唑，0.5mg/LNAA，6.5g/L琼脂粉，pH5.8)上生根壮苗；待小苗长至10cm左右时打开容器封口膜，炼苗2-3天，将阳性小苗移至人工气候室栽培，共得到了541株筛选阳性T₀代转OsSIK3水稻，筛选抗生素为：终浓度为50μg/ml的卡那酶素和25μg/ml的利福平。

按照获得转OsSIK3基因水稻的方法，用空载体pBin438转化水稻植株，得到转空载体对照水稻T0代植株。同时，设水稻(Oryza sativa TP309)为野生型对照。

T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株。

2、转OsSIK3水稻植株的鉴定

分别提取水稻(Oryza sativa TP309)植株(野生型对照)、T0代转OsSIK3水稻的总RNA进行Northern鉴定分析，所用探针为全长OsSIK3。

结果如图3所示，从图中可见，T0代转OsSIK3水稻中，OsSIK3基因表达量远高于野生型对照水稻(CK)，野生型对照水稻在正常生长条件下难以经Northern分析检测到OsSIK3的转录。挑选出18-3、18-4、20-1、15-2和15-4五个株系进一步繁殖，获得F1代种子。T0代转空载体对照水稻中OsSIK3基因表达量与野生型对照水稻中一致。

三、转OsSIK3基因水稻耐逆性检测

1、耐旱性试验

将过量表达OsSIK3的转基因水稻株系18-4、20-1和15-4株系的T₁代2周龄苗、野生型对照水稻2周龄苗及转空载体对照水稻2周龄苗停止浇水14天后，复水10天，观察并照相并统计存活率。实验重复三次，每次重复中，所有被测试株系均为30株。结果取平均值±标准差。

图4中A为未处理苗，转OsSIK3基因苗较对照苗矮，停止浇水14天后，对照明显萎蔫，而三个转OsSIK3基因株系生长受到抑制，但萎蔫不明显(图4中B)。复水10天后，野生型对照和转OsSIK3基因苗的生长差异更趋明显，对照基本枯死，转基因苗开始复壮(图4中C)。

干旱处理14天恢复10天后的存活率如表1所示，野生型对照(对照TP309)、转OsSIK3基因水稻株系18-4、20-1和15-4T₁代植株的存活率分别为0、90±11％、88±19％和73±27％。此结果说明OsSIK3的过量表达提高了转基因植株的耐旱性。

T1代转空载体对照水稻耐旱性结果与野生型对照水稻一致。

表1转OsSIK3基因及野生型对照植株经干旱处理恢复后的存活率

此外还测定了干旱处理转基因植株和对照叶片失水率比较。取各株系10棵2周龄苗的叶片，用滤纸吸干水分，置于空气中0、60、80、100、120和140分钟，并于上述时间称重，计算水分损失率，作图。结果如图5所示，从图中可见，在干旱处理下，对照的水分失水率明显高于转基因植株。

2、耐盐性试验

OsSIK3过量表达转基因株系的耐盐性鉴定在0.5％NaCl水溶液的盐池中在自然温度和光照下进行，在抽穗前完成，具体如下：

将T₁代18-3、18-4、20-1、15-2和15-4五个株系的单株在北京6月的自然温度和光照育秧一个月，后移至清水池中。在北京7月自然条件下缓秧7天之后灌盐水至0.5％(质量百分含量)NaCl，67天后复水42天，以水稻(Oryza sativa TP309)为野生型对照，计算存活率。实验重复2年。2007年测试的各转基因株系含65棵单株，对照为91棵单株，野生型对照及18-3、18-4、15-2、20-1和15-4的存活率分别为11％、26％、32％、83％、43％和43％(表2)。2008年野生型对照TP309及各转基因株系的单株数分别为18-3、18-4、15-2、20-1和15-4的测试单株数分别为29、12、13、14、14和40，其存活率分别为28％、58％、77％、71％、50％和80％(表3)。结果如图6所示，在盐池中受盐胁迫67天后，野生型对照和转基因植株均严重萎蔫，但是转基因植株好于对照。两年实验存活率的统计数显示，转基因各株系的存活率明显高于野生型对照，说明OsSIK3的过量表达提高了转基因植株的耐盐性。

表2 2007年测试的转OsSIK3基因株系与对照在0.5％NaCl盐池中的存活率比较

2007年	TP309	18-3	18-4	15-2	20-1	15-4
							单株数	91	65	65	65	65	65
存活数	10	17	21	54	28	28
							存活率％	11	26	32	83	43	43

表3 2008年测试的转OsSIK3基因株系与对照在0.5％NaCl盐池中的存活率比较

2008年	TP309	18-3	18-4	15-2	20-1	15-4
							单株数	29	12	13	14	14	40
存活数	8	7	10	10	7	32
							存活率％	28	58	77	71	50	80

相对离子渗透率是检测植物在受到逆境胁迫的时候释放出的相对离子量。一般来说，如果逆境对植物影响很大时，测定出的相对电导率较大，而如果植物具有一定抗逆性，则会较大限度的保存自身的离子，因而释放出的离子较少，相对电导率较小。因此相对离子渗透率与植物的耐盐性呈现一定的相关性。

测定了OsSIK3过量表达转基因株系T₁代和野生型对照T₁代在200mM NaCl盐胁迫3天2周龄苗的相对离子渗透率。取野生型对照和转OsSIK3基因水稻的盐胁迫处理苗和未经盐胁迫处理的苗，用水清洗4-6次，充分洗净植物表皮的离子，将植物置于15ml玻璃管中，加入12ml去离子水，0.1Mpa抽真空20-30分钟，室温放置2-3h，测定此时溶液中的电导率。将玻璃管置于沸水中煮20-30分钟，待叶片完全变黄，取出，温度降到室温后再次测定电导率值。相对电导渗透率即为前一次电导率与后一次电导率的比值。

结果如图7所示，从图中可见，转OsSIK3基因各株系在未经盐胁迫时，其相对离子渗透率无明显差异，而经过200mM NaCl处理3天后，所有株系的离子渗透率均有所升高，野生型对照(CK)的离子渗透率上升幅度很大，而转OsSIK3基因各株系的离子渗透率上升幅度明显低于对照，表明转OsSIK3基因株系在盐胁迫下膜的损伤小于对照。

T₁代转空载体对照水稻与野生型对照水稻的耐旱性结果一致。

上述实验结果表明OsSIK3基因过表达水稻植株的耐旱性和耐盐性均明显高于对照植株。OsSIK3参与植物对逆境的应答，与植物的耐逆性相关。OsSIK3基因可作为提高植物，特别是单子叶植物耐逆性基因工程的目的基因。

Claims

1.一种培育转基因水稻的方法，是将由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的水稻中，得到耐盐性和/或耐旱性增强的转基因水稻。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过如下重组表达载体导入所述目的水稻中的；

所述重组表达载体是在pBin438载体的多克隆位点间插入所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因得到的重组表达载体。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是序列表中序列1所示的DNA分子。