BR102013006244A2 - "mêtodo para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle, ácido nucléico isolado, polipepíideo isolado, construção de super-expressão, planta transgênica, cêlula hospedeira, uso, método para a produção de uma planta transgênica, parte colheitável de uma planta, produto derivado, dna cromossômico recombinante, construção de expressão, grão de pólen transgênico e composição" - Google Patents

Abstract

“metodo para aprimorar uma ou mais caracteristlcas relacionadas a0 rendimento em plantas em relaqao a plantas de controle, acido nucleico isolado, pollpeptideo isolado, construqao de super-expressao, planta transgenica, celula hospedeira, uso, metodo para a produqao de uma planta transgenica, parte colheitavel de uma planta, produto derivado, dna cromossomico recombinante, construqao de expressao, grao de pdlen transgenico e composicao” a presente invengao refere-se, em geral, ao campo da biologia molecular e se refere a um método para aprimorar varias caracteristicas relacionadas ao rendimento economicamente importantes em plantas. de modo mais especifico, a presente invengao se refere a um método para aprimorar uma ou mais caracteristicas relacionadas ao rendimento em plantas modulando-se a expressao em uma planta de um acido nucléico que codifica um polipeptideo pmp (proteina de lnteresse). a presente invengao também se refere a plantas tendo uma expressao modulada de um acido nucléico que codifica um polipeptideo pmp, sendo que tais plantas tém uma ou mais caracteristicas aprimoradas relacionadas ao rendimento comparadas a plantas de controle. a invengéo também proporciona acidos nucléicos de codificagéo de pmp desconhecidos, e construgées que compreende estes, ?teis na realizagao dos métodos da mesma.

Description

“MÉTODO PARA APRIMORAR UMA OU MAIS CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS AO RENDIMENTO EM PLANTAS EM RELAÇÃO A PLANTAS DE CONTROLE, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, CONSTRUÇÃO DE SUPER-EXPRESSÃO, PLANTA TRANSGÊNICA, CÉLULA HOSPEDEIRA, USO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, PARTE COLHEITÁVEL DE UMA PLANTA, PRODUTO DERIVADO, DNA CROMOSSÔMICO RECOMBINANTE, CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO, GRÃO DE PÓLEN TRANSGÊNICO E COMPOSIÇÃO” O presente pedido reivindica prioridade dos pedidos a seguir: EP 12 166 838.8 depositado em 4 de maio de 2012, US 61/642481 depositado em 4 de maio de 2012, estando estes aqui incorporados a título de referência em relação a todo o conteúdo da descrição.

Antecedentes A presente invenção refere-se, em geral, ao campo da biologia molecular e se refere a um método para aperfeiçoar as características relacionadas ao rendimento em plantas modulando-se a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo POI (Proteína de Interesse). A presente invenção também se refere a plantas tendo uma expressão modulada de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo POI, sendo que essas plantas têm uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação às plantas tipo selvagem correspondentes ou a outras plantas de controle. A invenção também proporciona construções úteis nos métodos, plantas, partes cofheitáveís e produtos da invenção. A população mundial em constante crescimento e o suprimento reduzido de terras cultiváveís disponíveis para agricultura de pesquisa de combustíveis voltada ao aumento da eficiência de agricultura. Meios convencionais para aperfeiçoamentos de colheitas e horticultura utilizam técnicas de procriação seletivas para identificar as plantas tendo características desejáveis. No entanto, tais técnicas de procriação seletivas apresentam várias desvantagens, isto é, estas técnicas tipicamente requerem muita mão-de-obra e resultam em plantas que geralmente contêm componentes genéticos heterogêneos que podem nem sempre resultar na característica desejada sendo transmitida a partir de plantas pais. Avanços na biologia molecular permitiram que a espécie humana modificasse o germopiasma de animais e plantas. A engenharia genética de plantas confere o isolamento e a manipulação de material genético (tipicamente sob a forma de DNA ou RNA) e a introdução subsequente deste material genético em uma planta. Essa tecnologia tem a capacidade de distribuir colheitas ou plantas tendo várias características aperfeiçoadas econômicas, agronômicas ou horticultura!.

Uma característica de interesse econômico particular é o aumento no rendimento. O rendimento é normalmente definido como a produção calculável de valor econômico de uma colheita. Isto pode ser definido em termos de quantidade e/ou qualidade. O rendimento ê diretamente dependente de vários fatores, por exemplo, o número e o tamanho dos órgãos, a arquitetura vegetai (por exemplo, o número de ramificações), a produção de sementes, a senescência de folhas e outros. O desenvolvimento da raiz, a ingestão de nutrientes, a tolerância ao estresse e vigor precoce também podem ser fatores importantes na determinação do rendimento. Portanto, a otimização dos fatos supramencíonados pode contribuir para o aumento do rendimento de colheitas. O rendimento de sementes é uma característica importante, visto que as sementes de muitas plantas são importantes para nutrição de humanos e animais. Colheitas, como milho, arroz, trigo, canola e soja representam mais da metade da ingestão calôrica de humanos, seja através de consumo direto das próprias sementes ou através do consumo de produtos de carne à base de sementes processadas. Estas também consistem em uma fonte de açúcares» óleos e muitos tipos de metabólitos usados em processos industriais. As sementes contêm um embrião (a fonte de novos ramos e raizes) e um endosperma (a fonte de nutrientes para o crescimento embrionário durante a germinação e durante o crescimento precoce de mudas). O desenvolvimento de uma semente envolve muitos genes, e requer a transferência de metabólitos a partir das raízes, folhas e caules até a semente em crescimento, Em particular, o endosperma assimila os precursores metabólicos de carboidratos, óleos e proteínas e os sintetiza em macromoléculas de armazenamento para preencher o grão, Outra característica importante para muitas colheitas é o vigor precoce. O aperfeiçoamento do vigor precoce é um objetivo importante de programas modernos de produção de arroz tanto em cultivares de arroz temperados como tropicais. Raízes longas são importantes para uma ancoragem apropriada ao solo no arroz plantado em água. Quando o arroz for semeado díretamente em campos alagados, e quando os vegetais precisarem emergir rapidamente através da água, ramos mais iongos são associados ao vigor. Quando semeação por perfuração for praticada, mesocótilo e coleóptilos mais longos são importantes para uma boa emersão de mudas. A capacidade de modificar por engenharia genética o vigor precoce em vegetais teria uma grande importância na agricultura, Por exemplo, um vigor precoce fraco tem sido uma limitação à introdução de híbridos de milho (Zea mays L.) com base no germopfasma do Cinturão de Milho no Atlântico Europeu, Outra característica importante se refere à tolerância aperfeiçoada ao estresse abióíico. O estresse abiótico é uma causa primária de perda de colheitas ao redor do mundo» reduzindo os rendimentos médios dos vegetais de colheita mais importantes em mais de 50% {Wang et al., Planta 218, 1-14, 2003). Os estresses abióticos podem ser causados por aridez, salinidade, deficiência de nutrientes, extremos de temperatura, toxicidade química e estresse oxidatívo. A capacidade de aperfeiçoar a tolerância vegetal ao estresse abiótico seria de grande importância econômica aos fazendeiros em todo o mundo e permitiría o cultivo de colheitas durante condições adversas e em territórios onde o cultivo de colheitas pode não ser possível de outra forma.

Portanto, o rendimento de colheitas pode ser aumentado otimizando-se um desses fatores supramencionados.

Dependendo do uso, a modificação de determinadas características de rendimento pode ser favorecida em relação a outras. Por exemplo, para aplicações como a produção de feno ou madeira, ou recurso biocombustível, um aumento nas partes vegetativas de um vegetal pode ser desejável, e para aplicações como a produção de farelo, amido ou óleo, um aumento nos parâmetros de semente pode ser particuíarmente desejável. Mesmo dentre os parâmetros de semente, alguns podem ser favorecidos em relação a outros, dependendo da aplicação. Vários mecanismos podem contribuir para o aumento no rendimento de sementes, seja sob a forma de um tamanho de semente aumento ou de um número aumento de sementes.

As células vegetais contêm dentre suas organelas píastídeos, e estes não são fixados em sua distribuição intracelular. Durante muitos anos, a distribuição desigual de píastídeos dentro de uma célula em resposta a estímulos externos é conhecida e descreveu-se um papel do movimento de plastídeo em uma reação de luz azul e em intensidades de luz diferentes. Os mutantes nocaute com capacidade de movimento de plastídeo alterado foram descritos em algumas plantas. A área do movimento de plastídeo é resumida na publicação de uma tese de doutorado por Serena Schmidt von Braun („Chup1 - a chloroplast movement protein and its interactions." Tese de PhD, Serena Schmidt von Braun (2008) Fakuftât für Biologie der Ludwig-Maximilians- Uníversitãt München, Munich, Alemanha; http://edoc.ub.uni-muenchen.de/8745/1/SchmÍdt von Braun Serena.pdf) Descobriu-se que várias características relacionadas ao rendimento podem ser aprimoradas em plantas modulando-se a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo FOI (Protein Of Interest) em uma planta.

Breve Descrição da Invenção A presente invenção refere-se a um método para aprimorar uma ou mais características reiacionadas ao rendimento em plantas aumentando-se a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo POI. A presente invenção também se refere a plantas tendo uma expressão aumentada de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo POI, sendo que tais plantas têm uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento comparadas a plantas de controle. A invenção também fornece polipeptídeos POI desconhecidos, ácidos nuciétcos POI e construções que compreendem ácidos nucléicos codificadores de POI, úteis na realização dos métodos da invenção.

Uma realização preferencial consiste em um método para aprimorar uma ou mais características reiacionadas ao rendimento em uma planta em relação a plantas de controle, que compreende as etapas de aumentar a expressão, de preferência, por métodos recombinantes, em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende um domínio PFAM PF10358 e desenvolve a(s) planta(s), em que o domínio PFAM PF10358 é detectável na sequência de polipeptídeo utilizando-se uma varredura InterPro (vide Zdobnov E.M. and Apweiler R,; “InterProScan - an integration platform for the signature-recognition methods in InterPro.”; Bioinformatics, 2001, 17(9): 847-8; banco de dados InterPro, lançamento 37.0, 30 de abril de 2012) e, de preferência, sendo que o ácido nucléico é exógeno à píanta e/ou a expressão se encontra, de preferência, sob o controle de uma sequência promotora operacíonatmente ligada ao ácido nucléico que codifica o polipeptídeo, e desenvolver a planta. Estes métodos inventivos compreendem aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo POI e, desse modo, aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento da dita planta comparada à planta de controle. O termo “desse modo, aprimorar" deve ser compreendido por incluir efeitos diretos de aumentar a expressão do polipeptídeo POI, bem como efeitos indiretos, desde que a expressão aumentada do ácido nucléico codificador de polipeptídeo POI resulte em um aprimoramento de pelo menos uma das características relacionadas ao rendimento. Por exemplo, a superexpressão de um fator de transcrição A pode aumentar a transcrição de outro fator de transcrição B que controle, sucessivamente, a expressão de uma série de genes de um dado caminho que leva à biomassa ou ao rendimento de sementes aprimorados. Embora o fator de transcrição A não aprimore diretamente a expressão dos genes do caminho que leva às características aprimoradas relacionadas ao rendimento, uma expressão aumentada de A é a causa pelo efeito de característica(s) aprtmorada(s) relacionada(s) ao rendimento.

Logo, um objetivo da invenção consiste em proporcionar um cassete de expressão e uma construção de vetor que compreendam um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo POI, operacionalmente ligado a uma sequência promotora benéfica. Proporciona-se o uso de tais construções genéticas para produzir uma planta transgênica tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento, de preferência, biomassa aumentada, em relação a plantas de controle.

Uma realização preferenciaf também consiste em plantas transgênicas transformadas por um ou mais cassetes de expressão da invenção, e, portanto, expressar de forma particular os ácidos nucléicos que codificam uma proteína POl, sendo que as plantas têm uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento. As partes coíheitáveis das piantas transgênicas da presente invenção e os produtos derivados das plantas transgênicas e suas partes coíheitáveis também fazem parte da presente invenção.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção mostra que aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucféico que codifica um poiipeptídeo POf proporciona plantas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em reiação a plantas de controle.

De acordo com uma primeira realização, a presente invenção proporciona um método para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um poiipeptídeo POl e, opcionalmente, selecionar as plantas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento. De acordo com outra realização, a presente invenção proporciona um método para produzir plantas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle, sendo que o dito método compreende as etapas de aumentar a expressão na dita planta de um ácido nucléico que codifica um poiipeptídeo PO! conforme descrito no presente documento e, opcionalmente, selecionar as piantas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento. üm método preferenciai para aumentar a expressão de um ácido nucléico que codifica um poiipeptídeo POl consiste em introduzir e expressar em uma planta um ácido nucléico que codifica um poiipeptídeo POl.

Qualquer referência nas partes que se seguem do presente documento a uma “proteína útil nos métodos da invenção” é adotada para significar um polipeptídeo POI conforme definido no presente documento. Qualquer referência nas partes que se seguem do presente documento a um “ácido nucléico útil nos métodos da invenção” é adotada para significar um ácido nucléico capaz de codificar tal polipeptídeo POI. Em uma realização, qualquer referência a uma proteína ou ácido nucléico “úteis nos métodos da invenção" deve ser compreendida por significar proteínas ou ácidos nucléicos “úteis nos métodos, construções, plantas, partes colheitáveis e produtos da invenção”. O ácido nucléico a ser introduzido em uma planta (e, portanto, útil na realização dos métodos da invenção) consiste em qualquer ácido nucléico que codifique o tipo de proteína que será descrito agora, a seguir também denominado como "ácido nucléico POI" ou “gene POI”.

No decorrer deste pedido, os termos “proteína de interesse” (abreviação: “POI”) e “proteína de movimento de plastídeo” (abreviação: “PMP”) são usados de modo intercambiável.

Em uma realização, um "polipeptídeo ΡΟΓ conforme definido no presente documento se refere a qualquer polipeptídeo envolvido e/ou responsável pelo movimento de plastídeo. Em uma realização preferencial, a proteína de movimento de plastídeo (PMP) é uma proteína que - quando a presença ou atividade da proteína PMP for reduzida ou interrompida - leva a um movimento de plastídeo alterado ou em mau funcionamento em resposta a estímulos comuns que normalmente causam o movimento de plastídeo dentro da célula vegetal, por exemplo, uma célula vegetal na qual a presença ou a atividade da proteína PMP permanecem inalteradas.

Em uma realização, o polipeptídeo PMP compreende 1) todos os motivos a seguir: Motivo 1 (SEQ ID NO; 34): [MA//l][P/A/G/S][L/i/M/T][D/E3[E/DJ[L/MA/][L/l/V/M3GKT[A/G]E[Q/H][l/ V)AFEG[!/M][A/V][S/T/N]A[i/V]l[Q/S/L][G/A}R[N/S][K/A|[E/D/A][G/RA//L][G/V]A[S rr/N][S/T][S/T]AA[R/Q/E][T/t/S/Alfl/V][AST];

Motivo 2 (SEG ID NO: 36): jy/N/f/C][Y/F){L/IA/3[S/P][E/D]LGKG[L/i][G/SJ[C/P][V/L/S3[V/l][G/R]T[R/ K][D/N]GG[Y/F]L[AA//T][A/S][T/M/L]NP[L/F][D/N][T/)A//N][l/AA//L/P][V/M][S/AFr/ M/G/E][R/K][K/NHD/E]fT/A/L]PKL[A/V3MQ[L/f/M3S[K/R3EP/A/Q3[L/FW!/MA^[V/I/L 3ÍL/V/F];

Motivo 3 (SEQ ID NO: 37): [S/K/E/L/V][K/E/S/A][G/D/E/SJQG[K/Q/P/E/H/N][D/E][IJV/M/1/F/Q]LW S[I/L/M]SSR[I/V][M/V]ADMWL[K/R][P/T/S/H][M/I/L]RNPD[V/I][K/N/I];

Motivo 4(SEQ ID NO: 40); M[A/G/S][T/N/S7Y]ÍA/I/G3[M/T/L/I][S/N/T][T/S/D/Y][G/S]R[K/Q/N][E/D] R[S/T/A/M/D][T/S]G[I/L]WN[V/M/I/A3ÍN/D/E/S/H/GKE/DHN/T/E/D/S3PILA//F)TS[A

A//G/SJ[E/D|fE/K/N]iV/l/L]L[A/S3[F/V/C/13[S/T/A3[L/M7T]QK[l/V/L/M3E[VyA/S/F/T3M

[AA//T3[I/V3[E/K3[A/G3LK[I/V]Q[AA/][E/D/G][!/MA/)[A/V/S/T][E/D/K][E/D];

Motivo 5 (SEG ID NO; 42): [V/L/A/F3[V/T)[V/i/A3Q[L/M3RDP[)/L/M/T3R[R/QJ[Y/F]E[A/S/ElVG[G/A3( P/T] IV/M/L/S3CV/M/1 ]f AA/][ V/L/I][V/L/I3[H/G3 A[T/V/E];

Motivo A (SEG ID NO: 43): M[Q/H/N)[K/R}[L/M][S/G)CLFSVEW[A/T/I][V/A}[Q/E][G/N/D]LP[A/SJS MNGLRL{S/A/G]V[C/A/S]VRKKET[K/R][D/E3G(A/S)[V/M][N/Q/H/K3TMP[S/C3RV[ S/D/A/H]|G/UH)G{A/S/G3[G/A3DFEET[UM3F[I/V/L)[K/RKC/S][H/N][V/L/A]Y: e Motivo B (SEG ID NO; 44): [K/R^T3FE[G/P/A/S3RtP/V/L3F[F/W/M/S/LJ[l/L/V/F3[Y/Sl{V/L/A3[F/V3[A/ S3V[D/E3A[E/D/K/G/P3[A/E]L[D/E/S3[F/L3GR[T/S/H/N3[Smi/L/A3VDLSÍE/Q/L/R3L[ IA/l[Q/K/RlES[IAy/M/T/S3[E/D/G3[K/R3M[S/N][Q/AA'][E/Q3[G/D3[T/L/A/M/E]R[V/L] RQWD[T/M/R][S/N/A3[F/W/L][S/N/G/P/K]L[S/A]GKAKGGEL[V/A/I][L/V]KL[G/S/A ]FQIM[E/D][K/D][E/D/G|G[G/V][I/V/A/G]; ou 2) quaisquer 6 dos motivos listados abaixo 1); ou 3) quaisquer 5 dos motivos listados abaixo 1); ou 4) quaisquer 4 dos motivos listados abaixo 1); ou 5) quaisquer 3 dos motivos listados abaixo 1); ou 6) Motivos 1, 2. 3, 4 e 5 conforme descrito no presente documento acima; ou 7} Motivos A e B conforme descrito no presente documento acima; ou 8) quaisquer 4 dos motivos 1, 2, 3, 4 e 5 conforme descrito no presente documento acima; ou 9) Motivos 1, 2 e 3 conforme descrito no presente documento acima; ou 10) Motivos 4 e 5 conforme descrito no presente documento acima; ou 11) Uma combinação de 7) e 8) ou 7) e 9) ou 7) e 10) acima.

Em uma realização, a ordem dos motivos dentro da sequência de aminoácidos do polipeptídeo PMP ao se olhar a partir da terminação N para a terminação C ê o Motivo 2, 1, 4, 5 e por último 3, em que o Motivo 2 não precisa estar na posição N-terminal, mas tipicamente é encontrado dentro da proteína a alguma distância da terminação N.

Em uma realização, a ordem dos motivos dentro da sequência de aminoácidos do polipeptídeo PMP ao se olhar a partir da terminação N para a terminação C é o Motivo A, B, 2, 1, 4, 5 e por último 3, em que o Motivo A não precisa estar na posição N-terminal, mas tipicamente é encontrado dentro da proteína a alguma distância da terminação N.

Em uma realização, a extremidade do Motivo 3 é encontrada nas posições de aminoácido 20, 15, 10 ou 5 a partir da extremidade C-termínai, ou a extremidade do Motivo 3 também é a extremidade C-terminal.

Em uma realização preferencial, os Motivos 2, 1, 4, 5 e 3, preferencialmente nesta ordem, com mais preferência, pelo menos os motivos 2, 1 e 3, com ainda mais preferência nesta ordem, são encontrados na metade C-terminal da proteína PMP. Em outra realização preferencial, os motivos A e B são encontrados na metade N-termina! da proteína PMP, preferencialmente nesta ordem (A antes de B), Em uma realização preferencial, em qualquer uma das realizações descritas no presente documento, o Motivo 1 pode ser substituído pelo Motivo 1a (SEQ ID NO: 35), em que o Motivo 1a é idêntico ao Motivo 1 com a exceção de que a posição 32 do motivo 1 (isto é, [G/V]) é excluída (e, logo, a posição 32 no Motivo 1a tem Alanína e continua como o Motivo 1 a partir da posição 34 em diante) e o Motivo 1a tem apenas 41 posições, ou pelo Motivo 1* conforme descrito em SEG ID NO: 46, de preferência, pelo Motivo 1* (SEG ID NO: 46): [MA//l][P/A][L/l/M/T}[D/E][E/D]{UMA/3ÍL/IA//M]GKT[A/G]EQ[l/V]AFEG

[l][A/V][S/T]A[IA/]l[G/S][G/A]RNK[E/D]GA[S/T3[S/T3[S/T]AAR[T/l/S]tf/V]tA/S/T] Em uma realização preferencial, em qualquer uma das realizações descritas no presente documento, o Motivo 2 pode ser substituído pelo Motivo 2* conforme descrito em SEG ID NO; 47: [V/N][Y/F][t/íA/][S/P][E/D]LGKG[L/I]GCV[V/i]GT[R/K]DGGYL(A/V/T][ A/S][T/M]NP[L/F}[D/N3[T/IA//N][I/A/V/UP3ÍV/MJ[S/A/T]RK[D/E]TPKLAMG[L/S/M]S

[K/R]P[L/F/Y]V[L/V].

Em uma realização preferencial, em qualquer uma das realizações descritas no presente documento, o Motivo 3 pode ser substituído pelo Motivo 3a (SEQ ID NO: 38), sendo que o Motivo 3a é idêntico ao Motivo 3 com a exceção de que a posição 5 do motivo 3 (isto é, G) é excluída (e, logo, a posição 5 no Motivo 3a é qualquer aminoácido de K, Q, P, E, H ou N e continua como o Motivo 3 a partir da posição 7 em diante) e o Motivo 3a tem apenas 30 posições, ou pelo Motivo 3b (SEQ ID NO: 39), sendo que o Motivo 3b é idêntico ao Motivo 3 com a exceção de que as posições 4 e 5 do motivo 3 (isto é, QQ) são excluídas (e, logo, a posição no Motivo 3b é de K/Q/P/E/H/N e continua como o Motivo 3 a partir da posição 7 em diante) e o Motivo 3b tem apenas 29 posições, ou pelo Motivo 3* conforme descrito em SEQ ID NO: 48, de preferência, pelo Motivo 3*(SEQ ID NO: 48): [S/K/E/LA/]K[G/D/E/S][K/Q/P/E/H/N][D/E][L/V/M/f]LWS[l/L/M]SSR[!A/] [MA/]ADMWLK[P/T/S][M/I]RNPD[V/I][K/Nj.

Em uma realização preferencial, em qualquer uma das realizações descritas no presente documento, o Motivo 4 pode ser substituído pelo Motivo 4a (SEQ ID NO: 41), sendo que o Motivo 4a é idêntico ao Motivo 4 com a exceção de que a posição 27 do motivo 4 (isto é, S) é excluída (e, logo, a posição 27 no Motivo 4a tem qualquer A,V,G ou S como aminoácido e continua como o Motivo 4 a partir da posição 29 em diante) e o Motivo 4a tem apenas 55 posições, ou pelo Motivo 4* conforme descrito em SEQ ID NO: 49, de preferência, pelo Motivo 4* (SEQ ID NO: 49): M[A/G/S][T/N/S]AM[S/N/T][T/S][G/S]R[K/Q][E/D]RI[S/T/A][T/S]G[I/L] WNV[N/D/E][E/D][Nrr/E/D]P[LA/]T[A/Vl[E/D][E/K]iy/l/L]LAF[S/T/A][L/M]QK[l/V/L /M]E[V/A/S/F/T]M[AA//T][IA/]E[A/G]LK[I/V]Q[A/VJ[E/D][I/M][A/V}[E/D][E/D].

Em uma realização preferencial, em qualquer uma das realizações descritas no presente documento, o Motivo 5 pode ser substituído pelo Motivo 5* conforme descrito em SEQ ID NO: 50: [V/L/A][V/T]VQ[L/M]RDP[l/L/M]R[R/Q][Y/F]EAVGGP[V/M/L/S][V/M/tj[ A/V](V/L/I][V/L/I][H/Q]A[TA//E].

Em uma realização preferencial, em qualquer uma das realizações descritas no presente documento, o Motivo A pode ser substituído pelo Motivo A* conforme descrito em SEQ 1D NO: 51: M[G/HjKL[S/G]CLFSVEW[A/T][V/A3QGLP[A/S3SMNGLRL[S/A]VCV

RKKET[K/R3[D/E]G[A/S][V/M][N/Q/H/KJTMP[S/C]RV[S/D]QG[A/S][G/A]DFEETL F[lA//L][K/R]CH[V/L]Y.

Em uma realização preferencial, em qualquer uma das realizações descritas no presente documento, o Motivo B pode ser substituído pelo Motivo Ba (SEG ID NO: 45), sendo que o Motivo Ba é idêntico ao Motivo B com a exceção de que a posição 39 do Motivo B {isto é, M) é excluída (e, logo, a posição 39 no Motivo Ba tem SouNe continua como o Motivo B a partir da posição 41 em diante) e o Motivo Ba tem apenas 78 posições, ou pelo Motivo B* conforme descrito em SEQ ID NO: 52, de preferência, pelo Motivo B* (SEQ ID NO: 52): KFE[G/P)RPF{FAA//M/S/L][Í/LA/)Y[V/L3[FA/JAV[D/E]A{E/D/K/G/P3[A/E] L[D/E/S)[F/L3GR[T/S/H/N][S/Y/J/L/A3VDLS[E/Q/L)L[IA/][Q/K/RJESjW)[E/D}[K/R3S G[E/G)G[T/IOA/M/E}R[V/L3RQWD[T/M3S[F/W3[S/N/G/P)LtS/A)GKAKGGELV[LA/] KLGFGlM[E/D3K[E/D)G[GA/][IA/], Em uma realização mais preferencial, a sequência de aminoãcidos de qualquer um ou todos os Motivos 1, 2, 3, 4, 5, A ou B é exatamente a sequência de aminoãcidos da extensão correspondente de SEG ID NO: 2.

Em uma realização, a proteína PMP da invenção (isto é, o polipeptídeo PG!) é uma proteína ácida, isto é, tem um valor de ponto isoelétrico (pl) abaixo de 7,0, de preferência, igual ou menor que 6,0, com mais preferência, igual ou menor que 5,5 e, com a máxima preferência, igual ou menor que 5,2. Em uma realização adicionai, o valor pl do polipeptídeo PMP está acima de 5,0. Várias técnicas e ferramentas estão disponíveis na técnica para determinar o valor pl de uma determinada proteína. Em uma realização, o valor pi é determinado utilizando-se o Sequence Manipulation Suite (Stothard P (2000) The Sequence Manipulation Suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. Bíotechniques 28:1102-1104).

Em uma realização preferenciai, o polipeptídeo PMP útil nos métodos da invenção tem um teor de aminoácidos contendo enxofre igual ou menor que 5 %, em número, isto é, por 100 aminoácidos do polipeptídeo PMP, o número de resíduos de Metionina e Cisteina e quaisquer outros resíduos de amínoácido contendo enxofre como selenocisteína somando até 5 ou menos. De preferência, os resíduos de amínoácido contendo enxofre constituem menos de 4%. De preferência, podem ser determinados utilizando-se o Sequence Manipulation Suite {Stothard P (2000) The Sequence Manipulation Suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. Bíotechniques 28:1102-1104).

Em uma realização preferencial adicionai, o polipeptídeo PMP útil nos métodos da invenção compreende pelo menos 30%, em número, de aminoácidos com cadeia lateral alifática, de preferência, igual ou maior que 31%, 32% ou até mesmo 33%. De preferência, podem ser determinados utilizando-se o Sequence Manipulation Suite {Stothard P (2000) The Sequence Manipulation Suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. Bíotechniques 28:1102-1104).

De acordo com uma realização, proporciona-se um método para aperfeiçoar as características relacionadas ao rendimento conforme proporcionado no presente documento em plantas em relação a plantas de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido no presente documento. De preferência, a dita uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento compreendem um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e, de preferência, compreendem uma biomassa aumentada e/ou um rendimento de sementes aumentado em relação a plantas de controle, e, de preferência, compreendem uma bíomassa acima do solo aumentada, uma bíomassa abaixo do solo aumentada, um rendimento de sementes aumentado e/ou um rendimento de açúcar aumentado (seja como açúcar colheitáveí por planta, por peso fresco, por peso seco ou por área) em relação a plantas de controle.

Em uma realização, as sequências de ácido nucléico empregadas nos métodos, construções, plantas, partes colheitáveis e produtos da invenção são moléculas de ácido nucléico selecionadas a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucléico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO: 1; (ii) o complemento de um ácido nucléico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO: 1; (iii) um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e adicional ou alternativamente compreendendo um ou mais motivos tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência a qualquer um ou mais dos motivos dados em SEQ ID NO: 34 to SEG fD NO: 52, de preferência, a qualquer um ou mais dos motivos dados em SEG ID NO: 46 a SEQ ID NO: 52, e, com mais preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle: e (iv) uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com uma molécula de ácido nucléico de (i) a (iií) sob condições de hibridização de alta estringência e, de preferência, confere uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; ou codificar um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ÍD NO: 2; (ti) uma sequência de aminoácidos tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e adicional ou alternativamente, compreendendo um ou mais motivos tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência a qualquer um ou mais dos motivos dados em SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 52, de preferência a qualquer um ou mais dos motivos dados em SEQ ID NO: 46 a SEQ ID NO: 52, e, com mais preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; e (iii) derivados de qualquer uma das sequências de aminoácídos dadas em (í) ou (Π) acima.

Em uma realização, o PMP útil nos métodos da invenção compreende um domínio PFAM PF10358 (N-terminal C2 em proteínas EEIG1 e EHBP1) quando analisado com o software de InterProscan (vide Zdobnov E M. e Apweiler R.; “InterProScan - an integration platform for the signature-recognition methods ín InterPro."; Bioinformatics, 2001, 17(9): 847-8; InterPro database, versão 37.0, 30 de abril de 2012) (Bateman et al„ Nucleic Acids Research 30(1); 276-280 (2002)) & The Pfam protein famiiies database: R.D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J.E. Pollington, O.L. Gavín, P. Gunesekaran, G. Certc, K. Forslund, L. Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:211-222).

De preferência, o polipeptídeo compreende um ou mais motivos ou domínios conforme definido no presente documento.

Em uma realização, o PMP útil nos métodos da invenção contém um peptídeo de trânsito para direcionamento de plastídeo e é direcionado a cloroplasto quando expresso em células vegetais.

Os Motivos 1 a 3 foram derivados em um processo de duas etapas usando o algoritmo MEME (Bailey and Elkan, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAA! Press, Menlo Park, Califórnia, 1994). Em cada posição em um motivo MEME, mostram-se os resíduos que estão presentes no conjunto de sequências de busca com uma frequência maior que 0,2. Posteriormente, a sequência de motivo foi editada manualmente.

Os Motivos 4, 5, A, B, 1a, 3a, 3b, 4a, Ba, 1*. 2*, 3*, 4*. 5*, A* e B* foram criados manualmente a partir dos alinhamentos de sequência.

Os resíduos entre colchetes representam alternativas.

Em uma realização, o polípeptídeo PMP conforme o uso em questão compreende pelo menos um dos motivos 1, 2, 3, 4 ou 5 conforme definido anteriormente.

Em uma realização adicional, o polípeptídeo PMP conforme o uso em questão compreende pelo menos um dos motivos representados pelo Grupo A : QmmOÂ Motivo A, Motivo B ou Motivo Ba, ou, alternativamente, os motivos A* e B* mais limitados Em outra realização, o polípeptídeo PMP compreende pelo menos um dos motivos representados pelo Grupo B: Grupo B

Motivo 1, 2 ,3,4 ou 5, ou, altemativamente, os motivos 1a, 2, 3a ou 3b, 4a, 5 mais limitados, ou os motivos 1*, 2*, 3*. 4* ou 5* ainda mais limitados.

Ainda em outra realização, o polípeptídeo PMP conforme o uso em questão compreende pelo menos um motivo de Grupo A e pelo menos um motivo de Grupo B conforme definido no presente documento.

Ainda em outra realização, o polípeptídeo PMP compreende em ordem crescente de preferência, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, peto menos 13 ou todos os 14 motivos selecionados a partir do grupo que consiste nos motivos 1a, 2, 3b, 4a, 5, A, Ba, 1*, 2*, 3*, 4*, 5*, A* e B* conforme definido anteriormente.

Em uma realização preferencial, o polipeptídeo PMP compreende um ou mais motivos selecionados a partir do Motivo 1*, Motivo 2*. Motivo 3*, Motivo 4* e Motivo 5*. De preferência, o polipeptídeo PMP compreende os Motivos 1 * e 2*, ou os Motivos 2* e 3*, ou os Motivos 1* e 3*, ou is Motivos 1*, 2* e 3*. Em outra realização preferenciai, o polipeptídeo PMP compreende o Motivo 3* e o motivo 4*, ou o motivo 3* e o motivo 5*, ou todos os motivos 3*, 4* e 5*. Em uma realização ainda mais preferencial, o polipeptídeo PMP compreende os Motivos 1*, 2*. 4* e 5* e, de preferência, também o Motivo 3*. Em uma realização, o polipeptídeo PMP compreende os Motivos 1*. 2*, 3*, 4*, 5*, A* e B* e além do domínio PFAM PF10358 (o último detectado utilizando-se o software interproScan conforme descrito no exemplo 4).

Adicional ou aitemativamente, a proteína PMP tem, em ordem crescente de preferência, pelo menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%. 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência geral à sequência de aminoácidos representada por SEQ JD NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64. 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, desde que a proteína homóloga compreenda qualquer um ou mais dos motivos conservados conforme descrito anteriormente. A identidade de sequência geral é determinada utilizando-se um algoritmo de alinhamento global, tal como o algoritmo Needieman Wunsch no programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), de preferência, com parâmetros padrão e, de preferência, com sequências de proteínas maduras (isto é, sem levar em consideração os sinais de secreção ou os peptídeos de transito). Em uma realização, o nível de identidade de sequência é determinado por comparação das sequências de polipeptídeo ao longo de todo o comprimento da sequência de SEQ !D NO; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO; 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2. Alternativamente, a identidade de sequência é determinada por comparação de uma sequência de ácido nucléico à sequência que codifica a proteína madura em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO: 1. Em outra realização, o nível de identidade de sequência de uma sequência de ácido nucléico é determinado por comparação da sequência de ácido nucléico ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação da sequência de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21,23, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ID NO; 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO; 1.

Em outra realização, o nível de identidade de sequência é determinado por comparação de um ou mais domínios ou motivos conservados em SEQ ID NO: 2 com domínios ou motivos conservados correspondentes em outros polipeptídeos PMP. Comparada à identidade de sequência geral, a identidade de sequência genericamente será maior quando apenas domínios ou motivos conservados forem considerados. De preferência, os motivos em um polipeptídeo PMP têm, em ordem crescente de preferência, pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a qualquer um dos domínios ου motivos conservados representados por SEQ 1D NO: 34 a SEQ ID NO; 52, de preferência, qualquer um ou mais dos motivos dados em SEQ ID NO: 46 a SEQ ID NO: 52), Em outras palavras, em outra realização, proporciona-se um método para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas, sendo que o dito polipeptídeo PMP compreende um domínio (ou motivo) conservado com pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência aos motivos iniciando-se com o aminoácido de SEQ ID NO:2 conforme mostrado na figura 1 e até o aminoácido mostrado na figura 1 , Qs termos “domínio”, “assinatura” e “motivo” são definidos na seção das '‘definições” no presente documento.

Em uma realização, o polipeptídeo PMP tem uma Valina na posição 20 do Motivo 1, 1a ou 1*, ou na posição 601 na sequência de aminoácidos ou como o primeiro aminoácido seguindo a sequência de aminoácidos Aianina, Fenilalanina, ácido Gíutâmico, Gücina e Isoleucina, ou a contraparte à posição 601 de SEQ ID NO: 2 em um alinhamento global do polipeptídeo PMP com SEQ ID NO: 2.

Em uma realização, o polipeptídeo PMP tem uma Aianina na posição 18 do Motivo B, Ba ou B*, ou na posição 219 na sequência de aminoácidos ou como o primeiro aminoácido seguindo a sequência de aminoácidos Fenilalanina, Aianina, Valina, ácido Aspârtico, Aianina e ácido Gíutâmico, ou a contraparte à posição 219 de SEQ ID NO: 2 em um alinhamento global do polipeptídeo PMP com SEQ ID NO: 2 Em uma realização, o polipeptídeo PMP tem uma Glicina na posição 392 na sequência de aminoácidos ou como o primeiro aminoácido seguindo a sequência de aminoácidos Glu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly, ou a ccntraparte à posição 392 de SEQ !D NO: 2 em um alinhamento global do polipeptídeo PMP com SEQ ID NO: 2.

Em uma realização, o polipeptídeo PMP tem uma Arginina na posição 781 na sequência de aminoácidos ou como o primeiro aminoácido seguindo a sequência de aminoácidos E-E-K-K-F-K-V-T-S-L, ou a contraparte á posição 781 de SEQ ID NO: 2 em um alinhamento global do polipeptídeo PMP com SEQ ID NO; 2.

Em uma realização preferencial, o polipeptídeo PMP compreende extensões de aminoácido de SEQ ID NO: 2 selecionado a partir do grupo que consiste em: 1. posições 127 a 192 de SEQ ID NO: 2; 2. posições 202 a 279 de SEQ ID NO: 2; 3. posições 502 a 551 de SEQ ID NO: 2; 4. posições 582 a 622 de SEQ ID NO: 2; 5. posições 627 a 681 de SEQ ID NO: 2; 6. posições 737 a 762 de SEQ ID NO: 2; 7. posições 826 a 854 de SEQ ID NO: 2; e 8. Todas as extensões listadas em 1 a 7 acima; sendo que a ordem das extensões de aminoácido no polipeptídeo PMP podem ou não ser as mesmas que sua ordem em SEQ ID NO: 2. De preferência, as extensões mostradas em 1 e 2. Acima, são encontradas na metade N-terminal do polipeptídeo PMP, e as extensões mostradas em 3 a 7 acima são encontradas na metade C-terminal do polipeptídeo PMP.

De preferência, a sequência de polipeptídeo que quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela descrita na Figura 3, se agrupa ao grupo de polipeptídeos PMP que compreende a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ao invés de por qualquer outro grupo.

Em outra realização, os polipeptídeos da invenção quando usados na construção de uma árvore filogenética, taf como aquela descrita na Figura 3 agrupam não mais que 4, 3, ou 2 pontos de ramificação hierárquica afastando-se da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, Adicionafmente, os polipeptídeos PMP (pelo menos sob sua forma nativa) tipicamente são envolvidos no movimento de plastídeo dentro de uma célula vegetal, incluindo o movimento de plastídeo e estrômutos, Os métodos para medir tais movimentos são conhecidos na técnica, por exemplo, a partir da obra de Kwok e Hanson (“Microfilaments and microtubules control the morphology and movement of non-green plastids and stromules ín Nicotiana tabacurrf; Kwok EY & Hanson MR; Piant Journal (2003) Volume: 35, Edição: 1, Páginas: 16-26).

Além disso, os ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos PMP, quando expressos em arroz de acordo com os métodos da presente invenção conforme descrito nos Exemplos 7 e 10, fornecem plantas tendo características aprimoradas relacionadas ao rendimento, em particular, rendimento de biomassa e rendimento de sementes, tal como biomassa acima do solo, biomassa abaixo do solo, número de sementes e/ou tamanho das sementes. Outra função das sequências de ácido nucléico que codificam polipeptídeos PMP consiste em conferir informações para síntese da proteína PMP que aumenta o rendimento ou as características relacionadas ao rendimento conforme descrito no presente documento, quando tal sequência de ácido nucléico da invenção for transcrita e translacionada em uma célula vegetal viva. A presente invenção é ilustrada transformando-se plantas com a sequência de ácido nucléico representada por SEQ ID NO: 1, codificando a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. No entanto, o desempenho da invenção não se restringe àquelas sequências; os métodos da invenção podem ser vantajosamente realizados utilizando-se qualquer ácido nucléico codificador de PMP ou polipeptídeo PMP conforme definido no presente documento. O termo “PMP” ou “polipeptídeo PMP” conforme o uso em questão também se destina a incluir homólogos de SEQ ID NO: 2 conforme definido abaixo.

Exemplos de ácidos nuciéicos que codificam polipeptídeos PMP são dados na Tabela A da seção de Exemplos. Esses ácidos nuciéicos são úteis na realização dos métodos da invenção. As sequências de amínoácidos dadas na Tabela A da seção de Exemplos são sequências exemplificadoras de ortólogos e parólogos do polipeptídeo PMP representado por SEQ ID NO: 2, sendo que os termos “ortólogos" e “parólogos” são conforme definidos no presente documento. Ortólogos e parólogos adicionais podem ser prontamente identificados realizando-se uma autodenominada busca por sequências semelhantes recíprocas conforme descrito na seção das Definições; onde a sequências de busca é SEQ ID NO: 1,3, 5, 7, 9. 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ID NO: 1; ou SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2; o segundo BLAST (back-BLAST) seria contra sequências de planta, de preferência, sequências de planta superiores, com mais preferência, sequências Saticeae, e, com ainda mais preferência, sequências de choupo. A invenção também proporciona ácidos nuciéicos codificadores de PMP e polipeptídeos PMP úteis nos métodos, construções, plantas, partes colheitáveis e produtos da invenção daquelas sequências. De acordo com uma realização adicional da presente invenção, proporciona-se, portanto, uma molécula isolada de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucléico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ÍD NO; 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO; 1; (ii) o complemento de um ácido nucléico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ID NO; 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO; 1; (iii) um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP tendo, em ordem crescente de preferência, peio menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e adicional ou alternativamente, compreendendo um ou mais motivos tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência a qualquer um ou mais dos motivos dados em SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 52, de preferência, a qualquer um ou mais dos motivos dados em SEQ ID NO: 46 a SEQ íD NO: 52, e, com mais preferência, compreendendo o domínio PFAM PF10358 e, com ainda mais preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; e (iv) uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com uma molécula de ácido nucléico de (i) a (iii) sob condições de híbridização de alta estringência e, de preferência, confere uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle.

De acordo com uma realização adicional da presente invenção, proporciona-se, também, um polipeptídeo isolado selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2; <ii) uma sequência de aminoácidos tendo, em ordem crescente de preferência, pefo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência â sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 58, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e adicional ou alternatívamente, compreendendo um ou mais motivos tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência a qualquer um ou mais dos motivos dados em SEQ ID NO: 34 to SEQ ID NO: 52, de preferência, a qualquer um ou mais dos motivos dados em SEQ ID NO: 46 a SEQ ÍD NO: 52, e, com mais preferência, compreendendo o domínio PFAM PF10358 e, com ainda mais preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; e (Ui) derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos dadas em (i) ou (ii) acima.

De acordo com uma realização adicional da presente invenção, proporciona-se, portanto, uma molécula isolada de ácido nuciéico selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nuciéico representado por SEQ ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, de preferência, SEQ ID NO: 1; (ti) o complemento de um ácido nuciéico representado por SEQ ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69 ou 71, de preferência, SEQ ID NO: 1; (üi) um ácido nuciéico que codifica o polipeptídeo conforme representado, de preferência, por SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, de preferência, como resultado da degeneração do código genético, o dito ácido nuciéico isolado pode ser derivado a partir de uma sequência de polipeptídeo conforme representado, de preferência, por (qualquer um entre) SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2 e, com mais preferência, confere uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; (iv) um ácido nuciéico tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 30 %, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%. 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%. ou 99% de identidade de sequência à sequência de ácido nuciéico de SEQ ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, de preferência, SEQ ÍD NO; 1, e, com mais preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; e (v) um ácido nuciéico que codifica um polípeptideo PMP tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada por (qualquer um entre) SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2 e, de preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle.

De acordo uma realização adicional da presente invenção, proporciona-se, também, um polipeptídeo isolado selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos representada por (qualquer um entre) SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2: (ii) uma sequência de aminoácidos tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada por (qualquer um entre) SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO; 2, e, de preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle.

As variantes de ácido nuciéico também podem ser úteis na prática os métodos da invenção. Exemplos de tais variantes incluem ácidos nuciéicos que codificam homólogos e derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos dados na Tabela A da seção de Exemplos, sendo que os termos "homólogo” e “derivado" são conforme definidos no presente documento, Também úteis nos métodos, construções, plantas, partes colheitáveis e produtos da invenção são ácidos nucléicos que codificam homólogos e derivados de ortólogos ou parólogos de qualquer uma das sequências de aminoácidos dadas na Tabela A da seção de Exemplos. Os homólogos e derivados úteis nos métodos da presente invenção têm substanciatmente a mesma atividade biológica e funciona! da proteína não-modificada a partir da qual eles são derivados. Outras variantes úteis na prática dos métodos da invenção são as variantes onde a utilização de códon é otimizada ou onde os sítios alvo de miRNA são removidos.

As variantes de ácido nucléico adicionais úteis na prática dos métodos da invenção incluem porções de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos PMP, ácidos nucléicos que se hibridizam em ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos PMP, variantes de splícing de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos PMP, variantes aléiicas de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos PMP e variantes de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos PMP obtidos por embaralhamento genético. Os termos sequência de hibridização, variante de splícing, variante aiéfica e embaralhamento genético são conforme descritos no presente documento.

Os ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos PMP não precisam ser ácidos nucléicos de comprimento completo, visto que o desempenho dos métodos da invenção não depende do uso de sequências de ácido nucléico de comprimento completo. De acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas, que compreende introduzir, de preferência, por métodos recombinantes, e expressar em uma planta uma porção de qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A da seção de Exemplos, ou uma porção de um ácido nucléico que codifica um ortólogo, parólogo ou homólogo de qualquer uma das sequências de aminoácido dadas na Tabela A da seção de Exemplos.

Uma porção de um ácido nucléico pode ser preparada, por exemplo, realizando-se uma ou mais deleções ao ácido nucléico. As porções podem ser usadas em forma isolada ou podem ser fundidas a outras sequências de codificação (ou não-codificação) com a finalidade de, por exemplo, produzir uma proteína que combine várias atividades. Quando fundido a outras sequências de codificação, o polipeptídeo resultante produzido mediante translação pode ser maior que aquele previsto para a porção de proteína.

As porções úteis nos métodos, construções, plantas, partes colheítãveís e produtos da invenção, codificam um polipeptídeo PMP conforme definido no presente documento ou pelo menos parte deste, e têm substancia Imente a mesma atividade biológica das sequências de aminoácido dadas na Tabela A da seção de Exemplos. De preferência, a porção é uma porção de qualquer um dos ácidos nucléicos dados na Tabela A da seção de Exemplos, ou é uma porção de um ácido nucléico que codifica um ortólogo ou parólogo de qualquer uma das sequências de aminoácido dadas na Tabela A da seção de Exemplos. De preferência, a porção tem pelo menos 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600 ou 2604 nucleotídeos consecutivos de comprimento, sendo que os nucleotídeos consecutivos são de qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A da seção de Exemplos, ou de um ácido nucléico que codifica um ortólogo ou parólogo de qualquer uma das sequências de aminoácido dadas na Tabela A da seção de Exemplos. Com a máxima preferência, a porção é uma porção do ácido nucléico de SEQ ID NO: 1. De preferência, a porção codifica um fragmento de uma sequência de aminoácido que compreende um domínio PFAM FF10358 e/ou motivos 1a, 2, 3b, 4a, 5, A e/ou Ba, com mais preferência, os motivos 1*. 2*. 3*. 4*, 5*, A* e/ou B*. e/ou tem uma atividade biológica como uma proteína envolvida na proteína de movimento de plastídeo, e/ou tem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 2.

Outra variante de ácido nucléico útil nos métodos, construções, plantas, partes colheitáveís e produtos da invenção consiste em um ácido nucléico capaz de se híbridizar, sob condições de estringência reduzida, de preferência, sob condições estringentes, com um ácido nucléico que codifica um poiipeptídeo PMP conforme definido no presente documento, ou com uma porção conforme definido no presente documento. De acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas, que compreende introduzir, de preferência, por métodos recombinantes, e expressar em uma planta um ácido nucléico capaz de se híbridizar ao complemento de um ácido nucléico que codifica qualquer uma das proteínas dadas na Tabela A da seção de Exemplos, ou ao complemento de um ácido nucléico que codifica um ortóiogo, parólogo ou homólogo de qualquer uma das proteínas dadas na Tabela A.

As sequências de hibridtzação úteis nos métodos, construções, plantas, partes colheitáveís e produtos da invenção codificam um poiipeptídeo PMP conforme definido no presente documento, tendo substancialmente a mesma atividade biológica que as sequências de aminoácidos dadas na Tabela A da seção de Exemplos. De preferência, a sequência de hibridização é capaz de se hibridizar ao complemento de um ácido nucléico que codifica qualquer uma das proteínas dadas na Tabela A da seção de Exemplos, ou a uma proteína de qualquer uma dessas sequências, sendo que uma porção é conforme definido no presente documento, ou a sequência de hibridização é capaz de se hibridizar ao complemento de um ácido nucléíco que codifica um ortólogo ou parólogo de qualquer uma das sequências de aminoácidos dadas na Tabela A da seção de Exemplos. Com mais preferência, a sequência de hibridização é capaz de se hibridizar ao complemento de um ácido nucléico que codifica o polípeptídeo as representado por SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2 ou a uma porção desta. Em uma realização, as condições de hibridização são de estringência média, de preferência, de alta estringência, conforme definido no presente documento.

De preferência, a sequência de hibridização codifica um polípeptídeo com uma sequência de aminoácidos que compreende um domínio PFAM PF10358 e/ou motivos 1a, 2, 3b, 4a, 5, A e/ou Ba, com mais preferência, os motivos 1*. 2*, 3*, 4*, 5*, A* e/ou B*. e/ou tem uma atividade biológica como uma proteína envolvida na proteína de movimento de ptastídeo, e/ou tem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a SEQ ÍD NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66. 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2.

Em outra realização, proporciona-se um método para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas, que compreende introduzir, de preferência, por métodos recombinantes, e expressar em uma píanta a variante de splicing de um ácido nucléico que codifica qualquer uma das proteínas dadas na Tabela A da seção de Exemplos, ou uma variante de splicing de um ácido nucléico que codifica um ortóiogo, parólogo ou homóíogo de qualquer uma das sequências de aminoácidos dadas na Tabela A da seção de Exemplos.

As variantes de splicing preferenciais são variantes de splicing de um ácido nucléico representado por SEG ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, de preferência, SEG ID NO; 1, ou uma variante de spiicíng de um ácido nucléico que codifica um ortóiogo ou parólogo de SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2. De preferência, a sequência de aminoácidos codificada pela variante de splicing compreende um domínio PFAM PF1Q358 e/ou motivos 1a, 2, 3b, 4a, 5, A e/ou Ba, com mais preferência, os motivos 1*, 2*, 3*. 4*, 5*. A* e/ou B\ e/ou tem uma atividade biológica como uma proteína envolvida na proteína de movimento de plastídeo, e/ou tem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2.

Ainda em outra realização, proporciona-se um método para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas, que compreende introduzir, de preferência, por métodos recombínantes, e expressar em uma planta uma variante alélica de um ácido nucléico que codifica qualquer uma das proteínas dadas na Tabela A da seção de Exemplos, ou que compreende introduzir, de preferência, por métodos recombínantes, e expressar em uma planta uma variante alélica de um ácido nucléico que codifica um ortóiogo, parólogo ou homólogo de qualquer uma das sequências de aminoácidos dadas na Tabela A da seção de Exemplos.

Os poiipepíídeos codificados por variantes alélícas úteis nos métodos da presente invenção têm substanciaimente a mesma atividade biológica que o poiípeptídeo PMP de SEQ ID NO: 2 e qualquer uma das sequências de aminoácídos descritas na Tabela A da seção de Exemplos. As variantes alèlicas existem na natureza, e abrange-se o uso desses alelos naturais nos métodos da presente invenção. De preferência, a variante aléiica é uma variante aléiica de SEQ 1D NO; 1 ou uma variante aléiica de um ácido nucléico que codifica um ortólogo ou parólogo de SEQ ID NO: 2. De preferência, a sequência de aminoácídos codificada pela variante aléiica compreende um domínio PFAM PF1G358 e/ou motivos 1a, 2, 3b, 4a, 5, A e/ou Ba, com mais preferência, os motivos 1*. 2*, 3*. 4*, 5*. A* e/ou B*. e/ou tem uma atividade biológica como uma proteína envolvida na proteína de movimento de plasíídeo, e/ou tem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%. 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%. 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2. Em outra realização, as sequências de poiípeptídeo úteis nos métodos, construções, plantas, partes colheitáveis e produtos da invenção têm substituições, deleções e/ou inserções comparadas à sequência de SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, sendo que as substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido podem variar de 1 a 10 aminoácídos cada.

Ainda em outra realização, proporciona-se um método para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas, que compreende introduzir, de preferência, por métodos recombinantes, e expressar em uma planta uma variante de um ácido nucléico que codifica qualquer uma das proteínas dadas na Tabela A da seção de Exemplos, ou que compreende introduzir, de preferência, por métodos recombinantes, e expressar em uma planta uma variante de um ácido nucléico que codifica um ortóiogo, parólogo ou homólogo de qualquer uma das sequências de aminoácidos dadas na Tabela A da seção de Exemplos, sendo que tal ácido nucléico variante é obtido por embaralhamento genético.

De preferência, a sequência de aminoácidos codifica da pelo ácido nucléico variante obtido por embaralhamento genético compreende um domínio PFAM PF10358 e/ou motivos 1a, 2, 3b, 4a, 5, A e/ou Ba, com mais preferência, os motivos 1*. 2*. 3*. 4*, 5*, A* e/ou B\ e/ou tem uma atividade biológica como uma proteína envolvida na proteína de movimento de plastídeo, e/ou tem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2.

Adicionalmente, as variantes de ácido nucléico também podem ser obtidas por mutagênese sítio-direcionada. Vários métodos encontram-se disponíveis para alcançar uma mutagênese sítio-direcionada, sendo que o mais comum consiste em métodos à base de PCR (Current Protocols ín Molecular Biology. Wiley Eds,). Os polipeptídeos PMPs diferentes da sequência de SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2 por uma ou por várias (substituição(ões), inserçâo(ões) e/ou deleção(ões) de aminoácidos conforme definido no presente documento) podem ser igualmente úteis para aumentar o rendimento de plantas nos métodos e construções e plantas da invenção.

Os ácidos nucíéicos que codificam polipeptídeos PMP podem ser derivados a partir de qualquer fonte natural ou artificial. O ácido nucléico pode ser modificado a partir de sua forma nativa em composição e/ou ambiente genômico através de manipulação humana deliberada. De preferência, o ácido nucléico codificador de polipeptídeo PMP é proveniente de uma planta, com mais preferência, de uma planta dicotiledõnea, com mais preferência, a partir de uma árvore, com a máxima preferência, o ácido nucléico é proveniente de Popufus trichocarpa.

Os métodos inventivos para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas, conforme descrito no presente documento, compreendem introduzir, de preferência, por métodos recombinantes, e expressar em uma planta o(s) ácido(s) nuclêico(s) conforme definido no presente documento, e, de preferência, a etapa adicional de desenvolver as plantas e, opcionalmente, a etapa de colher as plantas ou parte(s) destas.

Em outra realização, a presente invenção se estende ao DNA cromossômico recombinante que compreende uma sequência de ácido nucléico útil nos métodos da invenção, sendo que o dito ácido nucléico está presente no DNA cromossômico como resultado de métodos recombinantes, mas não em seu ambiente genético natural. Em uma realização adicional, o DNA cromossômico recombinante da invenção é compreendido em uma célula vegetal. O DNA compreendido em uma célula, particularmente, uma célula com paredes celulares como uma célula vegetal, é mais bem protegido contra degradação, danos e/ou colapso do que uma sequência de ácido nucléico exposta. O mesmo se mantém verdadeiro para uma construção de DNA compreendida em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula vegetal.

Em uma realização preferencial, a invenção se refere a composições que compreendem o DNA cromossômico recombinante da invenção e/ou a construção da invenção, e uma célula hospedeira, de preferência, uma célula vegetal, sendo que o DMA cromossômico recombinante e/ou a construção são compreendidos na céluia hospedeira, de preferência, em uma célula vegetal ou em uma célula hospedeira com uma parede celular. Em uma realização adicional, a dita composição compreende células hospedeiras mortas, células hospedeiras vivas ou uma mistura de células hospedeiras mortas e vivas, sendo que o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção da invenção podem estar localizados em células hospedeiras mortas e/ou em células hospedeiras vivas. Opcionalmente, a composição pode compreender outras células hospedeiras que não compreendam o DNA cromossômico recombinante da invenção ou a construção da invenção. As composições da invenção podem ser usadas em processos de multiplicar ou distribuir o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção da invenção, e/ou alternativamente proteger o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção da invenção contra colapso e/ou degradação, conforme explicado anteriormente, o DNA cromossômico recombinante da invenção e/ou a construção da invenção podem ser usados como um marcador de qualidade das composições da invenção, como um indicador de origem e/ou como uma indicação do produtor.

Em particular, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de não-estresse. Em um exemplo, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de não-estresse, tal como aridez branda para fornecer plantas tendo um rendimento aumentado em relação a plantas de controle.

Em outra realização, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de estresse, de preferência, sob condições de estresse abiótico.

Em um exemplo, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de estresse, tal como aridez para fornecer plantas tendo um rendimento aumentado em relação a plantas de controle.

Em outro exemplo, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de estresse, tal como deficiência de nutrientes para fornecer plantas tendo um rendimento aumentado em relação a plantas de controle. A deficiência de nutrientes pode resultar a partir de uma carência de nutrientes, tais corno nitrogênio, fosfatos e outros compostos contendo fósforo, potássio, cálcio, magnésio, manganês, ferro e boro, dentre outros.

Ainda em outro exemplo, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de estresse, tai como estresse salino para fornecer plantas tendo um rendimento aumentado em relação a plantas de controle. O termo "estresse salino" não se restringe a sai comum (NaCI), mas pode ser qualquer um ou mais entre: NaCI, KCI, LiCl, MgC12, CaCI2, dentre outros, Ainda em outro exemplo, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de estresse, tal como estresse ao frio ou estresse ao congelamento para fornecer plantas tendo um rendimento aumentado em relação a plantas de controle.

Em uma realização preferencial, os métodos da invenção são realizados utilizando-se plantas em necessidade de uma tolerância aumentada ao estresse abiótico, por exemplo, tolerância à aridez, salinidade e/ou a temperaturas frias ou quentes e/ou uso de nutrientes devido a uma ou mais deficiências de nutrientes, tal como deficiência de nitrogênio. O desempenho dos métodos da invenção fornece plantas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento. Em particular, o desempenho dos métodos da invenção fornece plantas tendo um rendimento aumentado, especialmente, uma biomassa aumentada e/ou um rendimento de sementes aumentado em relação a plantas de controle e, de preferência, um rendimento aumentado compreende ou consiste em uma biomassa acima do soío aumentada, uma biomassa abaixo do soio aumentada, um rendimento de sementes aumentado e/ou um rendimento de açúcar aumentado em relação a plantas de controle. Os termos “rendimento", biomassa e “rendimento de sementes" são descritos em maiores detalhes na seção das “definições".

Portanto, a presente invenção fornece um método para aumentar as características relacionadas ao rendimento, especíalmente a biomassa e rendimento de sementes de plantas, em relação a plantas de controle, sendo que o método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido no presente documento.

De acordo com um recurso preferenciai da presente invenção, o desempenho dos métodos da invenção fornece plantas tendo uma taxa de crescimento aumentada em relação a plantas de controle. Portanto, de acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para aumentar a taxa de crescimento de plantas, sendo que o método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido no presente documento. O desempenho dos métodos da invenção resulta em plantas tendo * um rendimento de sementes aumentado em relação ao rendimento de sementes de plantas de controle, e/ou * uma biomassa acima do soio aumentada, em particular, uma biomassa de caule em relação à biomassa acima do solo, e, em particular, uma biomassa de caule de plantas de controle, e/ou * uma biomassa de raiz aumentada em relação à biomassa de raiz de plantas de controle e/ou uma biomassa de beterraba aumentada em relação à biomassa de beterraba de plantas de controle.

Ademais, contempla-se partícula rmente que o teor de açúcar (em particular, o teor de sacarose) nas partes acima do solo, particularmente o caule (em particular, de plantas de cana-de-açúcar) e/ou nas partes abaixo do solo, em particular, em raízes incluindo raízes principais e túberos, e/ou em beterrabas (em particular, em beterrabas sacarina) é aumentado em relação ao teor de açúcar (em particular, o teor de sacarose) na(s) parte(s) correspondente(s) da planta de controle. O desempenho dos métodos da invenção fornece plantas desenvolvidas sob condições de não-estresse ou sob condições de aridez branda tendo características aumentadas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle desenvolvidas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para aumentar as características relacionadas ao rendimento em plantas desenvolvidas sob condições de não-estresse ou sob condições de aridez branda, sendo que o método compreende aumentar uma expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP. O desempenho dos métodos da invenção fornece plantas desenvolvidas sob condições de deficiência de nutrientes, particuiarmente, sob condições de deficiência de nitrogênio, características aumentadas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle desenvolvidas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para aumentar as características relacionadas ao rendimento em plantas desenvolvidas sob condições de deficiência de nutrientes, sendo que o método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP. O desempenho dos métodos da invenção fornece plantas desenvolvidas sob condições de estresse salino, características aumentadas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle desenvolvidas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para aumentar as características relacionadas ao rendimento em plantas desenvolvidas sob condições de estresse salino, sendo que o método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP.

Em uma realização da invenção, a biomassa de raiz é aumentada, de preferência biomassa de beterraba e/ou raiz principal, com mais preferência, em beterrabas sacarina, e, opcionalmente, o rendimento de sementes e/ou biomassa acima do solo não são aumentados.

Em outra realização da invenção, a biomassa acima do solo é aumentada, de preferência, a biomassa do caule, talo e/ou muda, com mais preferência, em Poaceae, com ainda mais preferência, em uma espécie Saccharum, com a máxima preferência, em cana-de-açúcar, e, opcionalmente, o rendimento de sementes, a biomassa abaixo do solo e/ou o crescimento da raiz não são aumentados.

Em uma realização adicional, o açúcar colheitável total, de preferência, glicose, frutose e/ou sacarose, é aumentado, de preferência, além de aumentar outras características relacionadas ao rendimento conforme definido no presente documento, por exemplo, biomassa, e, com mais preferência, também além de um aumento no teor de açúcar, de preferência, teor de glicose, frutose e/ou sacarose. A invenção também proporcionar construções genéticas e vetores para facilitar a introdução e/ou a expressão em plantas de ácidos nuclélcos que codificam polipeptídeos PMP, As construções genéticas podem ser inseridas em vetores, que podem estar comercialmente disponíveis, adequadas para transformar em plantas ou células hospedeiras e adequadas para expressão do gene de interesse nas células transformadas. A invenção também proporciona o uso de uma construção genética conforme definido no presente documento nos métodos da invenção.

De modo mais específico, a presente invenção proporciona uma construção que compreendei (a) um ácido nuciéico que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido anteríormente; (b) uma ou mais sequências de controle capazes de conduzir a expressão da sequência de ácido nuciéico de (a); e, opcionalmente, (c) uma sequência de terminação de transcrição.

De preferência, o ácido nuciéico que codifica um polipeptídeo PMP é conforme definido anteriormente. O termo "sequência de controle” e “sequência de terminação" são conforme definidos no presente documento.

Em particular, a construção genética da invenção consiste em uma construção de expressão vegetal, isto é, uma construção genética que permite a expressão do ácido nuciéico que codifica um PMP em uma planta, célula vegetal ou tecido vegetal após a construção ter sido introduzida nesta planta, célula vegetal ou tecido vegetal, de preferência, através de meios recombinantes, A construção de expressão vegetal pode, por exemplo, compreender o dito ácido nuciéico que codifica um PtMYB12L em ligação funcional a um promotor e, opcionalmente, a outras sequências de controle que controlam a expressão do dito ácido nuciéico em uma ou mais células vegetais, sendo que o promotor e, opcionalmente, as outras sequências de controle não são encontrados de forma natural em ligação funcional ao dito ácido nuciéico. Em uma realização preferencial, a(s} sequência(s) de controle incluindo o promotor resulta(m) em uma superexpressão do dito ácido nuciéico quando a construção da invenção tiver sido introduzida em uma planta, célula vegetal ou tecido vegetal. A construção genética da invenção pode ser compreendida em uma céluía hospedeira - por exemplo, uma célula vegetal - semente, produto agrícola ou planta. As plantas ou cétuias hospedeiras são transformadas com uma construção genética, tal como um vetor ou um cassete de expressão que compreende qualquer um dos ácidos nucléicos descritos anteriormente. Logo, a invenção proporciona adicionatmente plantas ou células hospedeiras transformadas com uma construção conforme descrito anteriormente. Em particular, a invenção proporciona plantas transformadas com uma construção conforme descrito anteriormente, sendo que tais plantas aumentaram as características relacionadas ao rendimento conforme descrito no presente documento.

Em uma realização, a construção genética da invenção confere um rendimento aumentado ou caracterisiíca(s) relacionada(s) ao rendimento a uma planta quando a mesma tiver sido introduzida na dita planta, sendo que tal planta expressa o ácido nucléíco que codifica o polipeptídeo PMPPM compreendido na construção genética e, de preferência, resultando em uma abundância aumentada do polipeptídeo PMP. Em outra realização, a construção genética da invenção confere um rendimento aumentado ou característica(s) relacionada(s) ao rendimento a uma planta que compreende células vegetais nas quais a construção foi introduzida, sendo que tais células vegetais expressam o ácido nucléico que codifica o PMP compreendido na construção genética. O promotor em tal construção genética pode ser um promotor não-nativo ao ácido nucléico descrito anteriormente, isto é, um promotor diferente do promotor que regula a expressão do dito ácido nucléico em seus arredores nativos.

Em uma realização preferencial, o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo PMP úti! nos métodos, construções, plantas, partes coíheitáveis e produtos da invenção consiste em uma ligação funcional a um promotor resultante da expressão do dito ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP em - biomassa acima do soio, de preferência, folhas e brotos, com mais preferência, o caule, de plantas monocotiledôneas, de preferência, plantas Poaceae, com mais preferência, plantas da espécie Saccharum, e/ou - folhas, biomassa abaixo do solo e/ou biomassa de raiz, de preferência, túberos, raízes principais e/ou órgãos de beterraba, com mais preferência, raiz principal e órgãos de beterraba de plantas dicotiledôneas, com mais preferência, plantas da espécie Solanaceae e/ou Beta.

Os cassetes de expressão ou a construção genética da invenção podem ser compreendidos em uma célula hospedeira, célula vegetai, semente, produto agrícola ou planta. O artesão versado tem ciência dos elementos genéticos que devem estar presentes na construção genética com a finalidade de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras contendo a sequência de interesse. A sequência de interesse é operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle (pelo menos a um promotor).

De modo vantajoso, qualquer tipo de promotor, seja natural ou sintético, pode ser usado para conduzir a expressão da sequência de ácido nucléico, porém, de preferência, o promotor é de origem vegetal. Um promotor constitutivo é particularmente útil nos métodos. Vide a seção das “Definições" no presente documento para definições dos vários tipos de promotor. O promotor constitutivo é, de preferência, um promotor constitutivo ubíquo de resistência média. Com mais preferência, é um promotor derivado de vegetal, por exemplo, um promotor de origem cromossômica vegetal, tal como um promotor GOS2 ou um promotor com substancialmente a mesma resistência e tendo substancialmente o mesmo padrão de expressão (um promotor funcionalmente equivalente), com mais preferência, o promotor é o promotor GOS2 proveniente do arroz. Com mais preferência, o promotor constitutivo é representado por uma sequência de ácido nuciéico substancialmente similar a um SEQ ID NO: 31, com a máxima preferência, o promotor constitutivo é conforme representado por SEQ ID NO: 31. Vide a seção das “Definições” no presente documento para exemplos adicionais de promotores constitutivos.

Deve ficar claro que a aplicabilidade da presente invenção não se restringe ao ácido nuciéico codificador de polipeptídeo PMP representado por SEQ ID NO: 1, nem a aplicabilidade da invenção se restringe ao promotor GOS2 de arroz quando a expressão de um ácido nuciéico codificador de polipeptídeo PMP for conduzida por um promotor constitutivo.

Ainda outra realização se refere a construções genéticas úteis nos métodos, construções vetoriais, plantas, partes colheitáveis e produtos da invenção, sendo que a construção genética compreende o ácido nuciéico PMP da invenção funcionalmente ligado a um promotor conforme descrito anteriormente e funcionalmente ligado, ainda, a um ou mais entre 1) ácidos nuciéicos acentuadores da expressão de ácido nuciéico (NEENAs): a) conforme descrito no pedido de patente internacional publicado como WQ2011/023537 na Tabela 1, página 27 à página 28 e/ou SEQ ID NO: 1 a 19 e/ou conforme definido nos itens i) a vi) da reivindicação 1 do dito pedido internacional quais NEENAs se encontram aqui incorporados a título de referência: e/ou b) conforme descrito no pedido de patente internacional publicado como W02Q11/023539 na Tabela 1, página 27 e/ou SEQ ID NO: 1 a 19 e/ou conforme definido nos itens i) a vi) da reivindicação 1 do dito pedido internacional quais NEENAs se encontram aqui incorporados a título de referência; e/ou c) conforme contido ou descrito no: 1) pedido de prioridade europeu depositado em 5 de julho de 2011 como EP 11172672.5 na Tabela 1» página 27 e/ou SEQ ID NO; 1 a 14937, de preferência, SEQ ID NO; 1 a 5, 14936 ou 14937, e/ou conforme definido nos itens í) a v) da reivindicação 1 do dito pedido de prioridade europeu quais NEENAs se encontram aqui incorporados a título de referência; e/ou ii) pedido de prioridade europeu depositado em 6 de julho de 2011 como EP 11172825.9 na Tabela 1, página 27 e/ou SEQ ID NO; 1 a 65560, de preferência, SEQ ID NO; 1 a 3, e/ou conforme definido nos itens i) a v) da reivindicação 1 do dito pedido de prioridade europeu quais NEENAs se encontram aqui incorporados a título de referência; e / ou d) equivalentes tendo substancialmente o mesmo efeito de aprimoramento; e/ou 2) funcionalmente ligado a uma ou mais moléculas de Ácido Nucléico Acentuador de Confiabilidade (RENA) a) conforme contido ou descrito no pedido de prioridade europeu depositado em 15 de setembro de 2011 como EP 11181420.8 na Tabela 1, página 26 e/ou SEQ ID NO: 1 a 16 ou 94 a 116666, de preferência, SEQ ID NO; 1 a 16, e/ou conforme definido no ponto i) a v) do item a) da reivindicação 1 do dito pedido de prioridade europeu quais moléculas de RENA se encontram aqui incorporadas a título de referência; ou b) equivalentes tendo substancialmente o mesmo efeito de aprimoramento.

Uma realização preferencial da invenção se refere a uma molécula de ácido nucléico útil nos métodos, construções, plantas, partes colheitáveís e produtos da invenção e que codifica um polipeptídeo PMP da invenção sob o controle de um promotor conforme descrito no presente documento acima, sendo que o NEENA, RENA e/ou o promotor é heteróiogo à dita molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP da invenção.

Em relação às sequências da invenção ou úteis nos métodos, construções, plantas, partes colheitáveís e produtos da invenção, em uma realização, um ácido nucléico ou uma sequência de polipeptídeo não-originários de plantas superiores são usados nos métodos da invenção ou na construção de expressão útil nos métodos da invenção. Em outra realização, um ácido nucléico ou uma sequência de polipeptídeo de origem vegetal são usados nos métodos, construções, plantas, partes colheitáveís e produtos da invenção, porque o dito ácido nucléico e poiípeptídeos têm a característica de uma utilização de códon otimizada para expressão em plantas, e do uso de aminoácidos e sítios regulatórios comuns em plantas, respectivamente. A planta de origem pode ser qualquer planta, mas, de preferência, aquelas plantas conforme descrito no presente documento. Ainda em outra realização, uma sequência de ácido nucléico não-originária de plantas superiores, mas artificialmente alterada para que tenha a utilização de códon de plantas superiores é usada na construção de expressão útil nos métodos da invenção.

Opcíonalmente, uma ou mais sequências terminadoras podem ser usadas na construção introduzida em uma planta. Os indivíduos versados na técnica estão cientes das sequências terminadoras que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. De preferência, a construção compreende um cassete de expressão que compreende um promotor GOS2, substancialmente similar a SEQ 1D NO: 31, operacionalmente ligado ao ácido nucléico que codifica o polipeptídeo PMP. Adicionalmente, uma ou mais sequências que codificam marcadores selecionáveis podem estar presentes na construção introduzida em uma planta.

De acordo com um recurso preferencial da invenção, a expressão modulada é uma expressão aumentada. Os métodos para aumentar a expressão de ácidos nuclêicos ou genes, ou produtos genéticos, são bem documentados na técnica e exemplos serão fornecidos na seção das definições.

Conforme mencionado anteriormente, um método preferencial para aumentar a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP consiste em introduzir, de preferência, através de métodos recombinantes, e expressar em uma planta um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP; no entanto, os efeitos de realizar o método, isto é, aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento também podem ser alcançados utilizando-se outras técnicas bem conhecidas, que incluem, mas não se limitam a, direcionamento por ativação de T-DNA, TILLING, recombínaçáo homóloga. Uma descrição dessas técnicas é fornecida na seção das definições. A invenção também proporciona um método para a produção de plantas transgênicas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle, que compreende a introdução e a expressão em uma planta de qualquer ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido no presente documento.

De modo mais específico, a presente invenção proporciona um método para a produção de plantas transgênicas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento, particularmente, rendimento e/ou biomassa de sementes aumentado, sendo que o método compreende: (i) introduzir, de preferência, por métodos recombinantes, e expressar em uma planta ou célula vegetal um ácido nucléico codificador de polipeptídeo PMP ou uma construção genética que compreende um ácido nucléico codificador de polípeptideo PMP; e (ii) cultivar a célula vegetal sob condições que promovam o crescimento e o desenvolvimento de plantas; de preferência, que promovam o crescimento e o desenvolvimento de plantas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controfe. O ácido nucléico de (i) pode ser qualquer um dos ácidos nucléicos capazes de codificar um polípeptideo PMP conforme definido no presente documento, O cultivo de uma célula vegetal sob condições que promovam o crescimento e o desenvolvimento de plantas, pode incluir ou não regeneração e/ou um crescimento até a maturidade. Consequentemente, em uma realização particular da invenção, a célula vegetai transformada pelo método de acordo com a invenção é regenerável em uma planta transformada. Em outra realização particular, a célula vegeta! transformada pelo método de acordo com a invenção não é regenerável em uma planta transformada, isto é, as células que não são capazes de se regenerarem em uma planta utilizando-se técnicas de cultura celular conhecidas na técnica. Embora as células vegetais tenham genericamente a característica de totipotência, algumas células vegetais não podem ser usadas para regenerar ou propagar plantas completas a partir das ditas células. Em uma realização da invenção, as células vegetais da invenção são estas células. Em outra realização, as células vegetais da invenção são células vegetais que não se sustentam de modo autotrófico. Um exemplo consiste em células vegetais que não se sustentam através de fotossíntese sintetizando-se carboidratos e proteínas a partir dessas substâncias inorgânicas como água, dióxido de carbono e sal mineral. O ácido nucléico pode ser introduzido diretamente em uma célula vegetal ou na própria planta {incluindo a introdução em um tecido, órgão ou qualquer outra parte de uma planta). De acordo com um recurso preferencial da presente invenção, o ácido nucléico é preferencialmente introduzido em uma planta ou célula vegetal por transformação. O termo “transformação” será descrito em maiores detalhes na seção das “definições'’ no presente documento.

Em uma realização, os métodos da invenção são métodos para a produção de uma planta Poaceae transgênica, de preferência, uma planta da espécie Saccharum, uma parte de planta transgênica ou uma célula vegetal transgênica tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle, que compreendem a etapa de colher mudas da planta transgênica e plantar as mudas e desenvolver as mudas em plantas, sendo que as mudas compreendem o ácido nucléico exógeno que codifica o polipeptídeo PMP e a sequência promotora operacionalmente ligada a ele.

Em uma realização, a presente invenção se estende a qualquer célula vegetal ou planta produzida por qualquer um dos métodos descritos no presente documento, e a todas as parles da planta e propáguios desta. A presente invenção abrange plantas ou partes destas (incluindo sementes) obteníveis pelos métodos de acordo com a presente invenção. As plantas ou partes de planta ou células vegetais compreendem um transgene de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido anteriormente, de preferência, em uma construção genética, tal como um cassete de expressão. A presente invenção se estende, ainda, a abranger a progenitura de uma célula primária transformada ou transfectada, tecido, órgão ou a planta toda que foi produzida através de qualquer um dos métodos supramencíonados, sendo que a única exigência é que a progenitura exiba as mesmas características genotípicas e/ou fenotípicas daquelas produzidas peíos pais nos métodos de acordo com a invenção.

Em uma realização adicional, a invenção se estende a sementes que compreendem de modo recombinante os cassetes de expressão da invenção, as construções genéticas da invenção, ou os ácidos nucféicos que codificam o PMP e/ou os polipeptídeos PMP conforme descrito anteriormente. Tipicamente, uma planta desenvolvida a partir da semente da invenção também apresenta características aprimoradas relacionadas ao rendimento. A invenção também inclui células hospedeiras contendo um ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido anteriormente. Em uma realização, as células hospedeiras de acordo com a invenção são células vegetais, leveduras, bactérias ou fungos. As plantas hospedeiras para os ácidos nucléicos, construção, cassete de expressão ou vetor usados no método de acordo com a invenção são, em princípio, vantajosamente todas as plantas que sejam capazes de sintetizar os polipeptídeos usados no método inventivo. Em uma realização particular, as células vegetais da invenção superexpressam a molécula de ácido nucléico da invenção.

Em uma realização adicional, a invenção se refere a um grão de pólen transgênico que compreende a construção da invenção e/ou um derivado haplóide da célula vegetal da invenção. Embora em uma realização particular o grão de pólen da invenção não possa ser usado para regenerar uma planta completa sem adicionar material genético adicional e/ou não seja capaz de fotossíntese, o dito grão de pólen da invenção pode ter usos em introduzir a característica aprimorada relacionada ao rendimento em outra planta fertilizando-se um óvulo de outra planta utilizando-se um grão de pólen vivo da invenção, produzindo-se uma semente a partir do óvulo fertilizado e desenvolvendo-se uma planta a partir da semente resultante. Ademais, os grãos de pólen encontram uso como um marcador de origem geográfica e/ou temporal.

Os métodos da invenção são vantajosamente aplicáveis a qualquer planta, em particular, a qualquer planta conforme definido no presente documento. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo forragem ou fegumes de forragem, plantas ornamentais, agriculturas, árvores ou arbustos. De acordo com uma realização da presente invenção, a planta é uma planta de colheita. Exempíos de plantas de colheita incluem, mas não se limitam a, chicória, cenoura, mandioca, trevo, soja, beterraba, beterraba sacarina, girassol, canola, alfalfa, semente de colza, semente de linho, algodão, tomate, batata, espécie Stevia, tal como, mas sem fimitar-se a, Stevia rebaudiana e tabaco. De acordo com outra realização da presente invenção, a planta é uma planta monocotiíedônea. Exemplos de plantas monocotiledôneas incluem cana-de-açúcar. De acordo com outra realização da presente invenção, a planta é um cereal. Exemplos de cereais incluem arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, tritícaie, sorgo, trigo emmer, espelta, secaíe, trigo tipo einkorn, teff, milo e aveia. Em uma reaiização particular, as plantas da invenção ou usadas nos métodos da invenção são selecionadas a partir do grupo que consiste em milho, trigo, arroz, soja, algodão, colza de semente oleaginosa incluindo canola, cana-de-açúcar, beterraba sacarina e alfalfa. De modo vantajoso, os métodos da invenção são mais eficientes que os métodos conhecidos, porque as plantas da invenção aumentaram o rendimento e/ou a tolerância a um estresse ambiental comparadas a plantas de controle usadas em métodos comparáveis, A invenção também se estende a partes colheitáveis de uma planta, tais como, mas sem limitar-se a, sementes, folhas, frutos, flores, mudas, caules, raízes, rizomas, túberos e bulbos, sendo que tais partes colheitáveis compreendem um ácido nuciéico recombinante que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido no presente documento. Em particular, essas partes colheitáveis são raízes, tais como raízes principais, rizomas, frutos, caules, beterrabas, túberos, bulbos, folhas, flores e/ou sementes. Em uma realização, as partes colheitáveis são cortes de caule (como mudas de cana-de-açúcar) ou beterrabas de beterraba sacarina. A invenção se refere, ainda, a produtos derivados ou produzidos, de preferência, direta mente derivados ou diretamente produzidos, a partir de uma ou mais partes colheitáveis de tal planta, tais como péletes secos, caules comprimidos, mudas, farinhas ou pós, fibras, tecido, papel ou papelão contendo fibras produzidas pelas plantas da invenção, óleo, gordura e ácidos graxos, amido, - incluindo amidos, papel ou papelão contendo carboidratos produzidos pelas plantas da invenção seiva, sumo, palha ou proteínas. Os carboid ratos preferenciais são amidos, celulose e/ou açúcares, de preferência, sacarose. As fibras secas residuais, por exemplo, do caule (como bagaço da cana-de-açúcar após a extração do caldo de cana), melaço, ou torta de filtro, de preferência, proveniente da cana-de-açúcar também são produtos preferenciais. Os ditos produtos podem ser produtos agrícolas.

Em uma realização, o produto compreende um ácido nucléico recombinante que codifica um polipeptideo PMP e/ou um polipeptídeo PMP recombinante, por exemplo, como um indicador da qualidade particular do produto. Em outra realização, a invenção se refere a sementes moldas anti-falsificação, caule moído e/ou raiz moida tendo como uma indicação de origem e/ou como uma indicação do produtor uma célula vegetal da invenção e/ou a construção da invenção, sendo que a raiz moida é, de preferência, beterraba moida, com mais preferência, beterraba sacarina moida. A invenção também inclui métodos para fabricar um produto que compreende a) desenvolver as plantas da invenção e b) produzir o dito produto a partir ou pelas plantas da invenção ou partes destas, incluindo caule, muda, raiz, beterraba e/ou sementes. Em uma realização adicional, os métodos compreendem as etapas de a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes colheitáveis conforme descrito no presente documento a partir das plantas e c) produzir o dito produto a partir, com as partes colheitáveis das plantas de acordo com a invenção.

Em uma realização, o método da invenção consiste em um método para fabricar tecidos a) desenvolvendo-se as plantas da invenção que são capazes de produzir fibras úteis na fabricação de tecidos, por exemplo, algodão, b) removendo-se as partes colheitáveis conforme descrito no presente documento a partir das plantas, e c) produzindo-se as fibras a partir da dita parte colheitável e d) produzindo-se tecido a partir das fibras de c). Outra realização da invenção se refere a um método para produzir ração para biorreatores, processos de fermentação ou usinas de biogás, que compreende a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes colheitáveis conforme descrito no presente documento a partir das plantas e c) produzir ração para biorreatores, processos de fermentação ou usinas de biogás. Em uma realização preferencial, o método da invenção consiste em um método para produzir álcool(is) a partir de material vegetal que compreende a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes colheitáveis conforme descrito no presente documento a partir das plantas e c) opcionaimente produzir ração para processos de fermentação, e d) - seguir a etapa b) ou c) - produzir um ou mais áícool(ís) a partir da dita ração ou partes colheitáveis, de preferência, utilizando-se microorganismos, tais como fungos, algas, bactérias ou leveduras, ou culturas celulares. Um exemplo típico seria a produção de etanol utifizando-se as partes colheitáveis contendo carboidratos, por exemplo, semente de milho, partes do caule da cana-de-açúcar ou partes de beterraba sacarina.

Em uma realização, o produto é produzido a partir do caule da planta transgênica.

Em outra realização, o produto é produzido a partir da raiz, de preferência, raiz principal e/ou beterraba da planta.

Em outra realização, o método da invenção consiste em um método para a produção de um ou mais polímeros que compreende a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes colheítáveis conforme descrito no presente documento a partir das plantas e c) produzir um ou mais monômeros a partir das partes colheítáveis, opcionalmente envolvendo produtos intermediários, d) produzir um ou mais polímeros reagindo-se pelo menos um dos ditos monômeros com outros monômeros ou reagindo-se os ditos monômeros entre si. Em outra realização, o método da invenção consiste em um método para a produção de um composto farmacêutico que compreende a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes coiheitáveís conforme descrito no presente documento a partir das plantas e c) produzir um ou mais monômeros a partir das partes colheítáveis, opcionafmente envolvendo produtos intermediários, d) produzir um composto farmacêutico a partir das partes colheítáveis e/ou produtos intermediários. Em outra realização, o método da invenção consiste em um método para a produção de um ou mais produtos químicos, que compreende a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes colheítáveis conforme descrito no presente documento a partir das plantas e c) produzir um ou mais blocos de construção químicos, tais como, mas sem limitar-se a, acetato, piruvato, lactato, ácidos graxas, açúcares, aminoácidos, nucleotídeos, carotenóides, terpenóides ou esteróides a partir das partes colheítáveis, opcionalmente envolvendo produtos intermediários, d) produzir um ou mais produtos químicos reagindo-se pelo menos um entre os ditos blocos de construção com outro bloco de construção ou reagindo-se o(s) dito(s) bloco(s) de construção entre si. A presente invenção também se refere a um produto obtido por um método para fabricar um produto, conforme descrito no presente documento- Em uma realização adicional, os produtos produzidos pelos métodos de fabricação da invenção são produtos vegetais, tais como, mas sem limitar-se a, um produto alimentício, ração, um suplemento alimentar, suplemento nutricional, cosmético ou farmacêutico. Em outra realização, os métodos para produção são usados para produzir produtos agrícolas, tais como, mas sem limitar-se a, fibras, extratos vegetais, farelo ou torta prensada e outros materiais residuais após um ou mais processos de extração, farinha, proteínas, aminoácidos, carboidratos, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas, e similares. Os carboidratos preferenciais são açucares, de preferência, sacarose. Em uma realização, o produto agrícola é selecionado a partir do grupo que consiste em T) fibras, 2) madeira, 3) extratos vegetais, 4) farelo ou torta prensada ou outros materiais residuais após um ou mais processos de extração, 5) farinha, 6) proteínas, 7) carboidratos, 8) gorduras, 9) óleos, 10) polímeros, por exemplo, celulose, amido, lignina, tignocelulose, e 11) combinações e/ou misturas de qualquer 1) a 10). Em uma realização preferencial, o produto ou produto agrícola não compreende genericamente células vegetais vivas, compreende o cassete de expressão, construção genética, proteína e/ou polinucleotídeo conforme descrito no presente documento.

Ainda em outra realização, os polinucleotídeos ou os pofipeptídeos ou as construções da invenção são compreendidos em um produto agrícola. Em uma realização particular, as sequências de ácido nucléico e as sequências de proteína da invenção podem ser usadas como marcadores de produto, por exemplo, onde um produto agrícola foi produzido pelos métodos da invenção. Esse marcador pode ser usado para identificar um produto que foi produzido por um processo vantajoso resultando não apenas em uma eficiência maior do processo, mas também em uma qualidade aperfeiçoada do produto devido à quafidade aumentada do material vegetal e partes colheitáveis usadas no processo. Esses marcadores podem ser detectados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, mas sem Simitar-se a, métodos â base de PCR para detecção de ácidos nuciéicos ou métodos à base de anticorpos para detecção de proteínas. A presente invenção também abrange o uso de ácidos nuciéicos que codificam polipeptídeos PMP conforme descrito no presente documento e o uso desses polipeptídeos PMP em aprimorar qualquer uma das características relacionadas ao rendimento supramencionadas em plantas. Por exemplo, os ácidos nuciéicos que codificam polípeptídeo PMP aqui descritos, ou os próprios polipeptídeos PMP, podem encontrar uso em programas de reprodução onde se identifica que um marcador de DNA pode ser geneticamente ligado a um gene codificador de polípeptídeo PMP. Os ácidos nucléicos/genes, ou os próprios polipeptídeos PMP podem ser usados para definir um marcador molecular. Este marcador de DNA ou proteína pode, então, ser usado em programas de reprodução para selecionar plantas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento conforme definido no presente documento nos métodos da invenção. Adicionalmente, as variantes aléfícas de um ácido nucléico/gene codificador de polípeptídeo PMP podem encontrar uso em programas de reprodução assistidos por marcadores. Os ácidos nuciéicos que codificam polipeptídeos PMP também podem ser usados como sondas para mapear genética e fisicamente os genes do qual esses fazem parte, e como marcadores para características ligadas a esses genes. Essas informações podem ser úteis em reprodução de plantas com a finalidade de desenvolver linhas com fenótipos desejados.

Em uma realização preferenciai, o polípeptídeo POi útil nos métodos da invenção não é 1. nenhum dos polipeptídeos descritos no pedido de patente US2007039067, publicado em 15 de fevereiro de 2007, e, com mais preferência, não consiste nas sequências descritas no dito pedido como SEQ ID NO 19887; e/ou 2. nenhum dos polipeptídeos descritos no pedido de patente US20G4031072, publicado em 12 de fevereiro de 2004, e, com mais preferência, não consiste na sequência descrita como SEQ ID NO: 281286 do dito pedido de patente e/ou como AFQ901Q9 no banco de dados Geneseq (status 19 de setembro de 2012), disponível junto a Thomson Reuters, 3 Times Square, New York, NY 10036, EUA; e/ou 3. nenhum dos polipeptídeos descritos no pedido de patente US2007011783, publicado em 11 de janeiro de 2007, e, com mais preferência, não consiste na sequência descrita como SEQ ID NO: 52853 do dito pedido de patente e/ou como AN016009 no banco de dados Geneseq (status 19 de setembro de 2012), disponível junto a Thomson Reuters, 3 Times Square, New York, NY 10036, EUA.

Em uma realização, o teor de carboídrato de armazenamento total das plantas da invenção, ou partes destas e, em particular, das partes colheitáveis da(s) pianta(s) é aumentado comparado à(s) pianta(s) de controle e às partes de planta correspondentes das plantas de controle.

Os carboidratos de armazenamento são preferencialmente açúcares, tais como, mas sem limitar-se a. sacarose, frutose e glicose, e polissacarídeos, tais como, mas sem limitar-se a, amidos, glucanos e frutanos, O teor de carboídrato de armazenamento total e o teor de grupos individuais ou espécies de carboidratos podem ser medidos em uma série de formas conhecidas na técnica. Por exemplo, o pedido internacional publicado como W02006066969 descreve nos parágrafos [79] a [117] um método para determinar o teor de carboídrato de armazenamento total de cana-de-açúcar, incluindo o teor de frutano.

Outro método para cana-de-açúcar é o seguinte: As plantas de cana-de-açúcar transgênicas são desenvolvidas durante 10 a 15 meses, seja em estufa ou em campo. Utilizam-se condições padrão para o crescimento das plantas.

Colhem-se talos de plantas de cana-de-açúcar com 10 a 15 meses de idade e com mais de 10 internódios. Após todas as folhas serem removidas, os internódios do talo são numerados de cima (= 1) para baixo (por exemplo = 38). Um disco de talo com aproximadamente 1 a 2 g é cortado do meio de cada internódio. Os discos de talo de 3 internódios são, então, combinados para fornecer uma amostra e congelados em nitrogênio líquido.

Para a extração de açúcar, os discos de talo são primeiramente esmiuçados em um misturador Waring (disponível junto a Wartng, New Hartford, Connecticut, EUA). Os açúcares são extraídos agitando-se durante uma hora a Õ5°C em um tampão de fosfato de sódio a 10 mM com pH 7,0. Posteriormente, os sólidos são removidos por fíltração através de uma peneira de 30 pm. A solução resultante é subsequentemente empregada para a determinação de açúcar (vide abaixo).

As plantas de cana-de-açúcar transgênicas são desenvolvidas durante 10 a 15 meses. Em cada caso, um talo de cana-de-açúcar da linha transgênica e uma planta de cana-de-açúcar tipo selvagem é desfolhado, o talo é dividido em segmentos de 3 internódios, e estes segmentos de internódio são congelados em nitrogênio líquido em um recipiente plástico de 50 mi vedado. O peso fresco das amostras é determinado. A extração por propósitos da determinação de açúcar é realizada conforme descrito abaixo.

Os teores de glicose, frutose e sacarose no extrato obtido de acordo com o método de extração de açúcar descrito anteriormente são determinados de modo fotométrico em um ensaio de enzima através da conversão de NAD+ (dinucleotídeo de nicotínamida e adenina) em NADH (dinucleotídeo de nicotinamida e adenina reduzido). Durante a redução, o caráter aromático no anel de nicotinamida é perdido, e, portanto, o espectro de absorção é alterado. Esta alteração no espectro de absorção pode ser detectada de modo fotométrico. A glicose e a frutose presentes no extrato são convertidas em glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato por meio da enzima hexoqutnase e trifosíato de adenosina (ATP). A glicose-6-fosfato é subsequentemente oxidada pela enzima glicose-6-fosíafo desidrogenase para fornecer 6-fosfogiuconato. Nesta reação, IMAD+ é reduzido para fornecer NADH, e a quantidade de NADH formada é determinada de modo fotométrico. A razão entre o NADH formado e a glicose presente no extrato é de 1:1, de tal modo que o teor de glicose possa ser calculado a partir do teor de NADH utifizando-se o coeficiente de absorção molar de NADH (6.3 1 por mmol e por cm lightpath). Após o término da oxidação de glicose-6-fosfato, a frutose-6-fosfato, que foi formada da mesma forma na solução, é convertida pela enzima fosfogluco isomerase para fornecer gficose-6-fosfato que, sucessivamente, é oxidado para fornecer 6-fasfogíuconato. Novamente, a razão entre a frutose e a quantidade de NADH formada é de 1:1. Posteriormente, a sacarose presente no extrato é clivada pela enzima sucrase (Megazyme) para fornecer glicose e frutose. As moléculas de glicose e frutose liberadas são, então, convertidas com as enzimas supramencionadas na reação dependente de NAD+ para fornecer 6-fosfogluconato. A conversão de uma molécula de sacarose em 6-fosfogíuconato resulta em duas moléculas de NADH. A quantidade de NADH formada é determinada da mesma forma de modo fotométrico e usada para calcular o teor de sacarose, utilizando-se o coeficiente de absorção molar de NADH.

Os talos de cana-de-açúcar são divididos em segmentos, em cada caso, de três internódios, conforme especificado anteriormente. Os internódios são numerados de cima para baixo (topo = internódio 1, base = internódio 21).

Adicionalmente, as plantas de cana-de-açúcar transgênicas podem ser analisadas utilizando-se qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, mas sem limitar-se a: • The Sampling of Sugar cane by the Fult Width Hatch Sampler; 1CUMSA (International Commisston for Uniform Methods of Sugar Analysís, http://www.icumsa.org/index.php?td=4) Method GS 5-5 (1994) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/) • The Sampling of Sugar cane by the Corer Method; SCUMSA Method GS 5-7 (1994) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/) • The Determination of Sucrose by Gas Cbromatography in Molasses and Factory Products - Official; and Cane Juíce; ICUMSA Method GS 4/7/8/5-2 (2002) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/) • The Determination of Sucrose, Glucose and Fructose by HPLC -in Cane Molasses- and Sucrose in Beet Molasses; ICUMSA Method GS 7/4/8-23 (2011) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/) • The Determination of Glucose, Fructose and Sucrose in Cane Juices, Syrups and Molasses, and of Sucrose in Beet Molasses by High Performance lon Cbromatography; ICUMSA Method GS 7/8/4-24 (2011) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/).

Para colheitas diferentes de cana-de-açúcar, métodos similares são conhecidos na técnica ou podem ser facilmente adaptados a partir de um método conhecido para outra colheita. Por exemplo, o teor de carboidrato de armazenamento de beterraba sacarina pode ser determinado por qualquer um dos métodos descritos para cana-de-açúcar acima com adaptações para beterraba sacarina.

As plantas de beterraba sacarina transgênicas adicionais podem ser analisadas para biomassa ou seu teor de açúcar ou outros parâmetros fenotípicos utilizando-se qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, mas sem limitar-se a; • The Determination of Glucose and Fructose in Beet Juices and Processing Products by an Enzymatic ÍVtethod - ICUMSA (International Commission for Untform Methods of Sugar Analysís, http://www.icumsa.org/index.php?id=4) Method GS 8/4/6-4 (2007) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Beriin (http://www.bartens.com/) • The Determination of Mannitol, Glucose, Fructose, Sucrose and Raffinose in Beet Brei and Beet Juices by HPAEC-PAD; ICUMSA Method GS8-26 (2011) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Beriin (http://www.bartens.com/) • The Determination of Sucrose, Glucose and Fructose by HPLC -ín Cane Motasses- and Sucrose in Beet Molasses; ICUMSA Method GS 7/4/8-23 (2011) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Beriin (http://www.bartens.com/) • The Determination of Glucose, Fructose and Sucrose in Cane Juices, Syrups and Molasses, and of Sucrose in Beet Molasses by High Performance lon Chromatography; ICUMSA Method GS 7/8/4-24 (2011) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Beriin (http://www.bartens.com/) • The Determination of Glucose and Fructose in Beet Juices and Processing Products by an Enzymatic Method; ICUMSA Method GS 8/4/6- 4 (2007) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/) • The Determination of the Apparent Total Sugar Content of Beet Pulp by the Luff Schoorl Procedure; ICUMSA Method GS 8-5 (1994) disponível junto a Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr, 16, 14129 Berlin (http ://www. bartens. com/). A seguir, a expressão “conforme definido na reivindicação/item X“ significa instruir o artesão a aplicar a definição conforme descrito no item/reivindicação X. Por exemplo, “um ácido nucléico conforme definido no item 1” precisa ser entendido de tal modo que a definição do ácido nucléico, de acordo com o item 1, seja aplicada ao ácido nucléico. Em consequência, o termo “conforme definido no item" ou “conforme definido na reivindicação" podem ser substituídos pela definição correspondente de tal item ou reivindicação, respectivamente. EíMJZasões^diciomis As definições e explicações dadas no presente documento se aplicam, com as mudanças necessárias, às realizações a seguir.

Ademais, a presente invenção se refere às realizações específicas a seguir: 1. Método para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP, sendo que o dito polipeptídeo PMP compreende o domínio PFAM PF10358. 2. Método, de acordo com a realização 1, em que o dito polipeptídeo PMP é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos representada por SEG ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54. 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ου 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 58, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2; e (ii) uma sequência de aminoácidos tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58. 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, ao longo de todo o comprimento das sequências representadas por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e, com mais preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle. 3. Método, de acordo com a realização 1 ou 2, em que a dita expressão aumentada é executada introduzindo-se e expressando-se em uma planta o dito ácido nuciéico que codifica o dito polipeptídeo PMP. 4, Método, de acordo com a realização 1, 2 ou 3, em que o dito ácido nuciéico é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nuciéico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61, 63. 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO: 1; (ii) o complemento de um ácido nuciéico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ JD NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO: 1; {iii) um ácido nudéico que codifica um polipeptideo PMP tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a toda a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54. 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e, com mais preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; e (ív) uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com uma molécula de ácido nucléico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta estringência e, de preferência, confere uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle. 5. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 4, em que a dita uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento compreende um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e compreende, de preferência, uma biomassa aumentada e/ou um rendimento de sementes aumentado em relação a plantas de controle, e, de preferência, compreende ou consiste em uma biomassa acima do solo aumentada, uma biomassa abaixo do solo aumentada, um rendimento de sementes aumentado e/ou um rendimento de açúcar aumentado em relação a plantas de controle. 6. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 5, em que a dita uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento são obtidas sob condições de não-estresse, 7, Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 6, em que o dito polipeptídeo PMP compreende (í) todos os motivos a seguir: Motivo 1a (SEQ ID NO 35): fM/V/lj[P/A/G/S)[L/f/M/T][D/E][E/D]{L/MA/][Uí/V/M]GKT[A/G]E[Q/H][!/ V]AFEG[l/M][A/Vj(S/T/N]A[i/VJI[Q/S/L][G/A]R(N/S][K/A][E/D/A][G/R/V/L][G/V]A[S /T/N][S/T][S/T]AA[R/Q/E][T/l/S/A]{l/V][A/S/T] ou, altematívamente, o Motivo 1 (SEQ 1D NO: 34); [MA//I][P/A/G/S][L/I/M/T][D/E][E/D][L/M/V][L/I/V/M]GKT[A/G]E[Q/H][I/ V]AFEG[l/M][AA/][S/T/N]A[IA/]l[Q/S/L][G/A]RfN/$][K/A][E/D/A][G/R/V/L][G/V]A[S /T/N][S/T][S/T]AA[R/Q/E][T/l/S/A](lA/](AST3; e Motivo 2 (SEQ ID NO: 36): [V/N/l/C][Y/F][L/i/V][S/P](E/D]LGKG(L/l][G/S][C/P][V/L/l]|y/f](Q/R]T[R/ K][D/N]GG[Y/FjL[A/V/T][A/S3[T/M/L]NP[L/F][D/N3(T/IA//N][l/A/V/L/P][V/M)[S/A/T/ M/G/E]LR/K][K/N][D/E][T/A/L]PKL[A/V]MQ[M/M]S[K/R][P/A/Q][L/F/Y/I/M/V][V/I/L ][LA/7F]; e Motivo 3b (SEQ ID NO: 39): [S/K/E/LA/][K/E/S/A][G/D/E/SJ[K/Q/P/E/H/N](D/E][L/V/M/I/F/Q]LWS[I/ L/M]SSR[l/V][MA/]ADMWL[K/R3[P/T/S/H}[M/1/L]RNPD[V/í]|K/N/í] ou, altematívamente, o Motivo 3 (SEQ ID NO: 37): [S/K/E/LA/][K/E/S/A][G/D/E/SJQQ[K/Q/P/E/H/N][D/E][LA//M/I/F/Q}LW S[l/L/M]SSR[f/V](M/V]ADMWL[K/R][P/T/S/H][M/i/L]RNPDfV/í][K/N/l] ou, alternativamente, o Motivo 3a (SEQ ID NO 38): [S/K/E/L/V][K/E/S/A][G/D/E/S][Q/NONE][K/Q/P/E/H/N][D/E][LA//M/l/F/ Q]LWS[}/L/M]SSR[!/V][M/V]ADMWLÍK/R][P/T/S/HMM/i/L]RNPD[V/í][K/N/t]; e Motivo 4a (SEQ ID NO: 41): M[A/G/S][T/N/S/V][A/l/GJ[M/T/U!lfS/N/T][T/S/D/Y][G/S]R[K/0/NJ[E/D] Rl[S/T/A/M/D][T/S]G[l/L]WN[V/M/l/A][N/D/E/S/H/Q][E/D][N/T/E/D/S]P[L/V/F]T[A/ V/G/S][E/D][E/K/NJ[V/f/L]L[A/Sl[F/V/C/i][S/T/A][L/M/T]QK[IA//L/M]E[V/A/S/F/T]M[ A/V/T][l/V3tE/K][A/G]LK[l/V]Q[A/V][E/D/G3[i/M/V3[A/V/S/T][E/D/K]tE/D] ou, alternativamente, o Motivo 4(SEG ID NO: 40): M[A/G/S][T/N/S/V][A/l/Gl[M/T/L/i]|S/N/T3tT/S/D/Y][G/S3R[K/Q/Nl[E/D] RI[S/T/A/M/D][T/S]G[!/L]WN[V/M/Í/A][N/D/E/S/H/Q][E/D]|N/T/E/D/S]P[LA//F]TS[ A/V/G/S]{E/D][E/K/N3[V/l/L]L[A/S]fF/V/C/l][S/T/A][L7MrT]QK[!/V/L/M]E[V/A/S/F/T] M{A/V/T][I/V][E/K][A/G]LK[IA/}Q[A/V][E/D/G][I/M/V][AA//S/T][E/D/K][E/D]; e Motivo 5 (SEQ ID NO: 42): [V/L/A/F3[V/T][V/l/A]Q[L/M]RDP[l/L/M/T]R[R/Q][Y/F]E[A/S/E3VG[G/A]f P/T3[V/M/L/S3[V/M/!][AA/]fV/L/l][V/L/l][H/Q3A[TA//E}; e Motivo A (SEQ ID NO: 43): M[Q/H/N][K/R][L/M][S/G]CLFSVEW[A/T/I][V/A][Q/E][G/N/D]LP[A/S]S MNGLRL{S/A/G]V[C/A/S3VRKKET[K/R][D/E]G[A/S]|V/M]ÍN/Q/H/K]TMP[S/C]RV( S/D/A/H][Q/L/H]G[A/S/G][G/A]DFEET[L/M]F[IA//L][KyR][C/S][H/N][V/L/A]Y;

E

Motivo Ba (SEQ ID NO 45): [K/R/T]FE[Q/P/A/S]R[P/V/L]F[F/W/M/S/L][i/LA//F][Y/S]fV/L/A][F/V][A/ SjV[D/EJA[E/D/K/Q/P][A/E]L[D/E/S][F/L]GR[T/S/H/N][S/Y/l/L/A]VDLS[E/Q/L/R]L[ lA/][Q/K/R]ES[fA//M/T/S][E/D/G][K/R][S/N][Q/A/Y][E/Q]IG/D][T/L/A/M/E]R[V/L]R

QWD[T/M/R][S/N/A][FA/V/L][S/N/G/P/K]L(S/A]GKAKGGEL[V/A/I][L/V]KL[G/S/A3F QIM[E/D3{K/D][E/D/G]G[GA/3(I/V/A/G] ou, atternativamente, o Motivo B (SEG ID NO: 44): [K/R/T]FE[Q/P/A/S]R[P/V/L]F[F/W/M/S/L][I/LA//F][Y/S][V/L/A]ÍF/V][A/ SMD/E]A[E/D/K/Q/P][A/E3L[D/E/S3[F/L]GR[T/S/H/NI[S/Y/i/L/A3VDLS[E/Q/L/R]L[ IA/][Q/K/R]ESflA//M/T/S][E/D/G][K/R]M[S/N][G/A/Y3[E/Q][G/D][T/L/A/M/E]R[V/L] RQWD[T/M/R][S/N/A][F/W/L][S/N/G/P/K]L[S/A3GKAKGGEL[V/A/I][LA/]KL[G/S/A 3FQIM[E/D][K/D][E/D/G]G[G/V][i/V/A/G]; ou (íi) quaisquer 6 dos motivos fistados abaixo (i) ; ou (iii) quaisquer 5 dos motivos listados abaixo (í); ou (iv) quaisquer 4 dos motivos listados abaixo (s); ou (v) quaisquer 3 dos motivos listados abaixo (i); ou (vi) Motivos 1, 2, 3, 4 e 5 conforme descrito no presente documento acima: ou (vii) Motivos A e B conforme descrito no presente documento acima; ou (viii) quaisquer 4 dos motivos 1, 2, 3, 4 e 5 conforme descrito no presente documento acima;ou (ix) Motivos 1, 2 e 3 conforme descrito no presente documento acima; ou (x) Motivos 4 e 5 conforme descrito no presente documento acima; ou (xi) Combinações de (ví) e (vii) ou (vii) e (ix) ou (vii) e (x) acima. 8. Método, de acordo com a realização 7, em que o Motivo 1 é substituído peio motivo 1*(SEQ ID NO: 46), o motivo 2 pelo motivo 2* ( SEQ ID NO: 47), o motivo 3 pelo motivo 3* ( SEQ ID NO: 48), o motivo 4 pelo motivo 4* ( SEQ ID NO: 49), o motivo 5 pelo motivo 5* ( SEQ ID NO: 50), o motivo A pelo motivo A* ( SEQ ID NO: 51) e / ou o motivo B pelo motivo B* ( SEQ ID NO: 52). 9. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 8, em que o dito ácido nucléico que codifica um PMP é de origem vegetal, de preferência, a partir de uma planta dicotiledônea, com mais preferência, a partir de uma árvore, com mais preferência, a partir do gênero Populus, com a máxima preferência, a partir de Populus trichocarpa. 10. Método, de acordo com quafquer uma das realizações 1 a 9, em que o dito ácido nucléico que codifica um PMP codifica qualquer um dos polipeptídeos listado na Tabela A ou consiste em uma porção de tal ácido nucléico, ou um ácido nucléico capaz de se hibridizar com uma sequência complementar de tal ácido nucléico. 11. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 10, em que a dita sequência de ácido nucléico codifica um ortólogo ou parófogo de qualquer um dos polipeptídeos dados na Tabela A. 12. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 11, em que o dito ácido nucléico codifica o poüpepíídeo representado por SEQ ID NO: 2. 13. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 12, em que o dito ácido nucléico é operacionalmente ligado a um promotor constitutivo de origem vegetal, de preferência, a um promotor constitutivo de resistência média de origem vegetal, com mais preferência, a um promotor GOS2, com a máxima preferência, a um promotor GOS2 proveniente do arroz. 14. Planta, ou parte deste, ou célula vegetal, obteníveis através de um método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 13, em que a dita planta, parte de planta ou célula vegetal compreende um ácido nucléico recombinante que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido em qualquer uma das realizações 1,2, 4 e 7 a 13. 15. Construção, que compreende: (í) ácido nucléico que codifica um PMP conforme definido em qualquer uma das realizações 1, 2, 4 e 7 a 13 ; (ii) uma ou mais sequências de controle capazes de conduzir uma expressão da sequência de ácido nucléico de (i); e, opcionalmente, (iii) uma sequência de terminação de transcrição. 16. Construção, de acordo com a realização 15, em que uma das ditas sequências de controle é um promotor constitutivo de origem vegetal, de preferência, a um promotor constitutivo de resistência média de origem vegetal, com mais preferência, a um promotor GOS2, com a máxima preferência, a um promotor GOS2 proveniente do arroz. 17. Célula hospedeira, de preferência, uma célula hospedeira bacteriana, com mais preferência, uma célula hospedeira da espécie Agrobacterium, que compreende a construção, de acordo com qualquer uma das realizações 15 ou 16, ou o ácido nucléico conforme definido na realização 4. 18. Uso de uma construção, de acordo com a realização 15 ou 16 em um método para produzir plantas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento, de preferência, um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e, com mais preferência, um rendimento de sementes aumentado e/ou uma biomassa aumentada em relação a plantas de controle. 19. Planta, parte de planta ou célula vegetal transformadas por uma construção, de acordo com a realização 15 ou 16. 20. Método para a produção de uma planta transgênica tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle, de preferência, um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e, com mais preferência, um rendimento de sementes aumentado e/ou uma biomassa aumentada em relação a plantas de controle, que compreende: (i) introduzir e expressar em uma céluia vegetal ou planta um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido em qualquer uma das realizações 1, 2, 4 e 7 a 13 ; e (íi) cultivar a dita célula vegetal ou planta sob condições que promovam o crescimento e o desenvolvimento de plantas, 21, Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 13 ou 20, em que o dito polipeptídeo é codificado por uma molécula de ácido nucléico que compreende uma molécula de ácido nucléico selecionado a partir do grupo que consiste em: (»} um ácido nucléico representado por (qualquer um entre) SEQ ID NO: 1 ; (ií) o complemento de um ácido nucléico representado por (qualquer um entre) SEQ ID NO: 1; (iii) um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo conforme representado por (qualquer um entre) SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, e, de preferência, confere uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; (iv) um ácido nucléico tendo, em ordem crescente de preferência pelo menos 30 %, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%. 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a (quaisquer) sequências de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1, e, com mais preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; (v) uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza ao complemento de um molécula de ácido nucléico de (i) a (iv) sob condições de hibridízação estringente e, de preferência, confere uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; (vi) um ácido nucléico que codifica o dito polipeptídeo tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 30 %, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada por (quaiquer um entre) SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2 e, de preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; ou (vii) um ácido nucléico que compreende qualquer(quaisquer) combinação(ões) de recursos de (i) a (vi) acima. 22. Planta transgênica tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle, de preferência, um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e, com mais preferência, um rendimento de sementes aumentado e/ou uma biomassa aumentada, resultando a partir da expressão aumentada de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido em qualquer uma das realizações 1, 2, 4 e 7 a 13 e 21, ou uma célula vegetal transgênica derivada a partir da dita planta transgênica. 23. Planta transgênica, de acordo com a realização 14, 19 ou 22, ou uma célula vegetal transgênica derivada a partir da mesma, em que a dita planta é uma planta de colheita, tal como beterraba, beterraba sacarina ou alfalfa; ou uma planta monocotiledônea, tal como cana-de-açúcar; ou um cereal, taf como arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, tritícale, sorgo, trigo emmer, espeita, secaie, trigo tipo einkorn, teff, milo e aveia. 24. Parte cofheitável de uma planta, de acordo com a realização 14, 19, 22 ou 23, em que as ditas partes colheitáveís compreendem a construção, de acordo com a realização 15 ou 16 e são, de preferência, a bíomassa de ramos e/ou a biomassa de raiz e/ou sementes. 25. Produto derivado a partir de uma planta, de acordo com a realização 14, 19 22 ou 23 e/ou a partir de partes colheitáveís de uma pianta, de acordo com a realização 23 e compreende a construção, de acordo com a realização 15 ou 16. 26. Uso de um ácido nucléico que codifica um pofipeptideo PMP conforme definido em qualquer uma das realizações 1, 2, 4 e 7 a 13 e 21 para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle, de preferência, para aumentar o rendimento, e, com mais preferência, para aumentar o rendimento de sementes e/ou para aumentar a biomassa em plantas em relação a plantas de controle. 27. Método para fabricação de um produto, que compreende as etapas de desenvolver as plantas, de acordo com as realizações 14, 19, 22 ou 23 e produzir o dito produto a partir ou através das ditas plantas; ou partes destas, incluindo as sementes, 28. DNA cromossômico recombinante, que compreende a construção, de acordo com a realização 15 ou 16. 29. Construção, de acordo com a realização 15 ou 16 ou DNA cromossômico recombinante, de acordo com a realização 28, compreendido em uma célula vegetal, de preferência, uma célula vegetal de colheita. 30. Qualquer uma das realizações 1 a 29, em que o polipeptídeo PMP não é a) nenhum dos poiipeptídeos descritos no pedido de patente US2007039067, publicado em 15 de fevereiro de 2007, e, com mais preferência, não consiste nas sequências descritas no dito pedido como SEQ ID NO 19887; e/ou b) nenhum dos poiipeptídeos descritos no pedido de patente US2004031072, publicado em 12 de fevereiro de 2004, e, com mais preferência, não consiste na sequência descrita como SEQ ID NO; 281286 do dito pedido de patente e/ou como AFQ90109 no banco de dados Geneseq (status 19 de setembro de 2012), disponível junto a Thomson Reuters, 3 Times Square, New York, NY 10036, EUA; e/ou c) nenhum dos poiipeptídeos descritos no pedido de patente US2007011783, publicado em 11 de janeiro de 2007, e, com mais preferência, não consiste na sequência descrita como SEQ ID NO: 52853 do dito pedido de patente e/ou como AN016009 no banco de dados Geneseq {status 19 de setembro de 2012), disponível junto a Thomson Reuters, 3 Times Square, New York, NY 10036, EUA.

Realizações adicionais; i. Método para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle, que compreende modular, de preferência, aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP, sendo que o dito polipeptídeo PMP compreende um domínio PFAM PF103S8. II. Método, de acordo com a realização í, em que o dito polipeptídeo PMP é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2; e (ü) uma sequência de aminoácidos tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, ao longo de todo o comprimento das sequências representadas por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e, com mais preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle, III, Método, de acordo com a realização l ou li, em que a dita expressão modulada é executada introduzindo-se e expressando-se em uma planta o dito ácido nucléico que codifica o dito polipeptídeo PMP, IV. Método, de acordo com a realização I, II ou III, em que o dito ácido nucléico é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucléico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, 53, 55. 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO: 1; (ii) o complemento de um ácido nucléico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO: 1; (iii) um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo POI tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a toda a sequência de aminoácídos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e, com mais preferência, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; e (iv) uma molécula de ácido nucléico que se hibrídiza com uma molécula de ácido nucléico de (i) a (iii) sob condições de bibridízação de alta estringência e, de preferência, confere uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle. V. Método, de acordo com qualquer uma das realizações I, II, III ou IV, em que a dita uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento compreende um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e, de preferência, compreende uma biomassa aumentada e/ou um rendimento de sementes aumentado em relação a plantas de controle, e, com ainda mais preferência, compreende ou consiste em uma biomassa acima do solo aumentada, uma biomassa abaixo do solo aumentada, um rendimento de sementes aumentado e/ou um rendimento de açúcar aumentado em relação a plantas de controle. VI. Método, de acordo com qualquer uma das realizações I a V, em que o dito polipeptídeo PMP compreende (i) todos os motivos a seguir: Motivo 1a (SEQ ID NO 35): [M/V/l][P/A/G/S][L/l/M/T][D/E][E/D][L/M/V][L/l/V/M]GKT[A/G]E[G/H](l/ V]AFEG[l/M][AA/3[S/T/N]A[l/V]i[Q/S/LIEG/A]R[N/S][K/A]{E/D/A][G/R/V/L][GA/]A[S /T/N][S/T][S/T]AA[R/Q/E3{T/I/S/A][I/V][A/S/T] ou, aíternativamente, o Motivo 1 (SEQ ID NO: 34): [M/V/l][P/A/G/S3[L/l/M/T][D/E][E/D][L/MA/][L/!/V/M]GKT[A/G]E[Q/H][f/ V]AFEG[I/M]EAA/3[S/T/N]A[I/V]IIQ/S/L3[G/A]R[N/S][K/A][E/D/A][G/RA//L][GA/]A[S /T/N][SFT][S/T]AA[R/Q/EMT/Í/S/A][IA/][AST]; e Motivo 2 (SEQ ID NO: 36): [V/N/l/C3fY/F3[L/IA/3[S/P]{E/D]LGKG[L/l][G/S][C/P][V/L/l}[V/l][Q/R]TÍR/ Kl[D/N}GG[Y/F]L[AA//TJ[A/S]ET/M/L]NP|L/F|[D/N][T/IA//NKi/A/V/L/P]ÍV/M3[S/A/T/ M/G/E][R/K][K/N][D/E][T/A/L]PKL[A/V]MQ[L/I/M]S[K/R][P/A/Q][L/F/Y/I/M/V][V/I/L JJL/V/F]; e Motivo 3b (SEQ ID NO: 39): [S/K/E/LA/][K/E/S/A][G/D/E/S][K/Q/P/E/H/N][D/E][LA//M/I/F/Q1LWS[I/ L/M]SSR[i/V][M/V]ADMWL[K/R3[Pnr/S/H][M/l/L]RNPD[V/l][K/N/l] ou, aíternativamente, o Motivo 3 (SEQ ID NO: 37): [S/K/E/L/V][K/E/S/A][G/D/E/S]QQ[K/Q/P/E/H/N][D/E][L/V/M/I/F/Q]LW S[l/L/M]SSR[l/V](M/V]ADIVIWL[K/R][P/T/S/H3[M/l/L]RNPD[V/l][KyN/l] ou, aíternativamente, o Motivo 3a (SEQ ID NO 38): [S/K/E/L/V][K/E/S/A3[G/D/E/S][Q/NONE][K/Q/P/E/H/N][D/E3[LA//M/l/F /Q]LWS[l/L/M]SSR[IA/][M/V]ADMWL[K/R][P/T/S/H][M/l/L]RNPD[V/t]ÍK/N/l]; e Motivo 4a (SEQ ID NO: 41); M[A/G/S][T/N/SA/][A/I/G][M/T/L/IJ[S/N/T][T/S/D/Y][G/S]R[K/Q/N}[E/D] RI[S/T/A/M/DJ[T/S]G[1/LJWN[V/M/I/A][N/D/E/S/H/Q][E/D][N/T/E/D/S]P[UV/F]T[A/ V/G/S][E/D]EE/K/N][V/1/L]L[A/S][F/V/C/I][S/T/A][L/M/T]GK[I/V/L/M)E[V/A/S/F/T]M[ A/V/T][l/V][E/K][A/G]LKÍfA/]Q[A/V][E/D/G][f/MA/][AA//SyT][E/D/K][E/D] ou, alternativamente, o Motivo 4{SEG ID NO: 40): MIA/G/S][T/N/S/V]ÍA/l/G][MmL/l][S/N/T][T/S/D/YHG/S]R{K/Q/NJ[E/D] RI[Srr/A/M/D][T/S]GEi/L]WN[V/M/l/A][N/D/E/S/H/Q]{E/D][N/T/E/D/S]P[L/V/F]TS[ A/V/G/S]EE/Dj{E/K/N]fV/f/L3L[A/S][FA//C/l][S/T/A][L/M/T]QK[l/V/L/M]EPvr/A/S/F/T] M[AA//T1[!A/][E/K][A/G]LK[!A/]Q[AA/][E/D/G][I/M/V][AA//S/T]EE/D/K][E/D]; e Motivo 5 (SEQ ID NO: 42): [V/L/A/F][V/T][V/l/A]Q[L/M]RDP[!/L/M/T]RÍR/03[Y/F3E[A/S/E]VGfG/A] [P/T}[V/M/L/S][V/M/I][AA/]|[V/L/1][V/L/I)[H/Q]A[T/V/E]; e Motivo A (SEQ ID NO: 43): M[Q/H/N][K/R]{L/M][S/G]CLFSVEW[A/T/1][V/A][Q/E][G/N/D]LP[A/3]S MNGLRL[S/A/G]V[C/A/S]VRKKET[K/R][D/E]G[A/S][V/M][N/Q/H/K]TMP[S/C]RV[ S/D/A/H][Q/L/H]G[A/S/G][G/AJDFEET[L/M]F[i/V/L]ÍK/R]EC/S][H/N][V/L/A3Y; e Motivo Ba (SEQ ID NO 45): [K/R/T]FE[Q/P/A/S3R[PA//L]FíF/W/M/S/L][i/L/V/F3[Y/S][V/L/A][FA/][A/ S]V[D/E]A[E/D/K/Q/P][A/E]L[D/E/S][F/L]GR[T/S/H/N][Smi/L/A]VDLSíE/Q/L/R]L[ l/V][Q/K/R]ES[l/V/M/T/S]{E/D/G]íK/R}[S/N][Q/A/Y][E/Q]EG/D][T/L/A/M/E]R[V/L]R

QWD[T/M/Rj[S/N/A][F/W/L][S/N/G/P/K]L[S/A]GKAKGGEL[V/A/!][LA^KL{G/S/A]F QIM[E/D][K/D][E/D/G]G[GA/][I/V/A/G] ou, alternativamente, o Motivo B (SEQ ID NO: 44): [K/R/T]FE[Q/P/A/S]R[PA//L]F[F/W/M/S/L][1/L/V/F][Y/S][V/L/A]EF/V][A/ S]V[D/E3Aj;E/D/K/Q/P]ÍA/E]L[D/E/S3[F/L3GR[T/S/H/NJESA"/l/L/A]VDLSfE/Q/L/R3LE IA/]fQ/K/R]ES[lA//M/T/S][E/D/G][K/R]M[S/N][Q/A/Y]{E/Q][G/D][T/L/A/M/E]R[V/L3 RGWD[T/M/R][S/N/A][F/W/L][S/N/G/P/K]L[S/A]GKAKGGEL[V/A/I][L/V]KL[G/S/A ]FQIM[E/D][K/D][E/D/G]G(GA/][IA//A/G]; ou (ií) quaisquer 6 dos motivos listados abaixo (i); ou (iii) quaisquer 5 dos motivos listados abaixo (i); ou (iv) quaisquer 4 dos motivos listados abaixo (i); ou (v) quaisquer 3 dos motivos listados abaixo <í); ou (vi) Motivos 1a, 2, 3b, 4a e 5 conforme descrito no presente documento acima; ou (vii) Motivos A e Ba conforme descrito no presente documento acima; ou (viii) quaisquer 4 dos motivos 1a, 2, 3b, 4a e 5 conforme descrito no presente documento acima; ou (ix) Motivos 1a, 2 e 3b conforme descrito no presente documento acima; ou (x) Motivos 4a e 5 conforme descrito no presente documento acima; ou (xi) Uma combinação de (vi) e (vii) ou (vii) e (ix) ou (vii) e (x) acima, VII. Método, de acordo com a realização VI, em que o Motivo 1 é substituído pelo motivo 1*(SEQ ID NO: 46), o motivo 2 pelo motivo 2* ( SEQ ID NO: 47), o motivo 3 pelo motivo 3* ( SEQ ID NO: 48), o motivo 4 pelo motivo 4* ( SEQ ID NO: 49), o motivo 5 pelo motivo 5* ( SEQ ID NO: 50), o motivo A pelo motivo A* { SEQ ID NO: 51) e / ou o motivo B pelo motivo B* ( SEQ ID NO: 52). VIII. Método, de acordo com qualquer uma das realizações í a VII, em que o dito ácido nucléico é operacionalmente ligado a um promotor constitutivo de origem vegetal, de preferência, a um promotor constitutivo de resistência média de origem vegetai, com mais preferência, a um promotor GOS2, com a máxima preferência, a um promotor GOS2 proveniente do arroz. IX. Construção, que compreende: (i) um ácido nucléico que codifica um PMP conforme definido em qualquer uma das realização 1, li, IV, e Vi a VIII; (ii) uma ou mais sequências de controle capazes de conduzir a expressão da sequência de ácido nucléico de (i); e, opcíonaimente (iií) uma sequência de terminação de transcrição. X. Célula hospedeira, de preferência, uma célula hospedeira bacteriana, com mais preferência, uma célula hospedeira da espécie Agrobacterium, que compreende a construção, de acordo com a realização IX ou o ácido nucléico conforme definido na realização IV. XI. Uso de uma construção, de acordo com a realização IX em um método para marcar plantas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento, de preferência, um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e, com mais preferência, um rendimento de sementes aumentado e/ou uma bíomassa aumentada em relação a plantas de controle, XII. Método para a produção de uma planta transgêníca tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle, de preferência, um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e, com mais preferência, um rendimento de sementes aumentado e/ou uma biomassa aumentada em relação a plantas de controle, que compreende: (i) introduzir e expressar em uma célula vegetal ou planta um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido em qualquer uma das realização I, II, IV, e VI a VIII; e (ii) cultivar a dita célula vegetal ou planta sob condições que promovam o crescimento e o desenvolvimento da planta.

Xlfi, Planta, ou parte desta, ou célula vegetal, obteníveis através de um método, de acordo com qualquer uma das realizações I a XII, em que a dita planta, parte de planta ou célula vegetal compreende um ácido nucléico recombinante que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido em qualquer uma das realizações I, II, IV, e VI a VIII. XIV. Planta transgêníca tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle, de preferência, um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e, com mais preferência, um rendimento de sementes aumentado e/ou uma biomassa aumentada, resuitante a partir da expressão modulada de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo PMP conforme definido em qualquer uma das realizações I, II, IV, e Vi to VII! ou uma célula vegetai transgênica derivada a partir da dita planta transgênica. XV. Parte colheitável de uma pianta, de acordo com a realização XIII ou XIV, em que as ditas partes coiheitáveis são, de preferência, biomassa de ramos e/ou biomassa de raiz e/ou sementes e compreende, de preferência, a construção da realização IX. XVI. Qualquer uma das realizações I a XV, em que o polipeptídeo PMP não é a) nenhum dos polipeptídeos descritos no pedido de patente US2007039067, publicado em 15 de fevereiro de 2007, e, com mais preferência, não consiste nas sequências descritas no dito pedido como SEQ ID NO 19887; e/ou b) nenhum dos polipeptídeos descritos no pedido de patente US2004031072, publicado em 12 de fevereiro de 2004, e, com mais preferência, não consiste na sequência descrita como SEQ ID NO: 281286 do dito pedido de patente e/ou como AFQ90109 no banco de dados Geneseq (status 19 de setembro de 2012), disponível junto a Thomson Reuters, 3 Times Square, New York, NY 10036, EUA; e/ou c) nenhum dos polipeptídeos descritos no pedido de patente US2007Q11783, publicado em 11 de janeiro de 2007, e, com mais preferência, não consiste na sequência descrita como SEQ iD NO: 52853 do dito pedido de patente e/ou como AN016009 no banco de dados Geneseq (status 19 de setembro de 2012), disponível junto a Thomson Reuters, 3 Times Square, New York, NY 10036, EUA.

Definições As definições a seguir serão usadas ao longo do presente pedido. Os títulos e cabeçalhos da seção neste pedido servem apenas para propósitos de conveniência e referência e não devem afetar de forma alguma o significado ou interpretação desse pedido. Os termos técnicos e expressões usados no escopo desse pedido servem, em geral, para fornecer o significado comumente aplicado aos mesmos na técnica pertinente de biologia vegetal, biologia molecular, bíolnformãtica e reprodução de plantas. Todas as definições de termos a seguir se aplicam ao conteúdo completo desse pedido. Deve-se compreender que conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações, “um" ou “uma" pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual são usados. Assim, por exemplo, uma referência a “uma célula” pode significar que pelo menos uma célula pode ser utilizada. O termo "essencialmente”, “cerca de”, “aproximadamente” e similares em conjunto com um atributo ou um valor, particularmente também definem exatamente o atributo ou exatamente o valor, respectívamente, O termo “cerca de’* no contexto de um determinado valor ou faixa numérica se refere em particular a um valor ou faixa que está dentro de 20%, dentro de 10%, ou dentro de 5% do valor ou faixa fornecida. Conforme o uso em questão, o termo “compreende” também abrange o termo “consiste em”. POUPEPTÍDEO(S)/PRQTEÍNAÍSy Os termos “peptídeo”, “oligopeptídeos”, "polipeptídeo" e "proteína" são usados de maneira intercambiável aqui e se referem a aminoácidos em uma forma políméríca de qualquer comprimento, figados por ligações peptídicas, exceto onde mencionado em contrário.

POUhiUCLEOTÍDEO(S}/ÁciDO(S) NUCLÉICOtSt/SEQUÊNCIAtSt DE ÁCIDO HüCLÉiCOfSEQUÊNClAÍS) DE NUCLEOTÍDEOS

Os termos "poíinucleotídeo(s)", "sequência(s) de ácido nucléicos", “sequência(s) de nucieotídeos", "ácido{s) nucléico(s)", "moíécula de ácido nuciéico" são usados de maneira intercambiável aqui e se referem a nucieotídeos, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma combinação desses, em uma forma polimérica não ramificada de qualquer comprimento. O termo “nucleotídeo” se refere a um bloco de construção de ácido nuciéico que consiste em uma nucleobase, uma pentose e pelo menos um grupo fosfato. Assim, o termo “nucleotídeo” inclui um nucleosídeo monofosfato, nucleosídeo difosfato, e nucleosídeo trifosfato. HOMOLÓGOfS) "Homólogos" de uma proteína incluem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que possuem substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido relativas à proteína não modificada em questão e que possuem substancialmente a mesma atividade biológica e funcional que a proteína não modificada da qual esses são derivados, “Homólogos" de um gene abrangem sequências de ácido nuciéico com substituições, deleções e/ou inserções de nucleotídeo em relação ao gene não modificado em questão e possuem substancialmente a mesma atividade biológica e/ou funcional que o gene não modificado a partir do qual são derivados, ou codificam polipeptídeos que possuem substancialmente a mesma atividade biológica e funcional que o polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nuciéico não modificada.

Ortóiogos e parólogos são duas formas diferentes de homólogos e abrangem conceitos evolutivos usados para descrever as relações ancestrais de genes ou proteínas. Os parólogos são genes ou proteínas dentro da mesma espécie que foram originados através da duplicação de um gene ancestral; ortóiogos são genes ou proteínas de organismos diferentes que foram originados através de especiação, e também são derivados de um gene ancestral comum.

Uma “deleção” se refere à remoção de um ou mais aminoácidos de uma proteína ou à remoção de um ou mais nucleotídeos de um ácido nuciéico.

Uma “inserção” se refere a um ou mais resíduos de aminoácido sendo introduzidos em um sítio predeterminado em uma proteína ou em um ou mais nucleotídeos introduzidos em um sítio predeterminado em uma sequência de ácido nuciéico. Com referência a uma proteína, as inserções podem compreender fusões N-terminal e/ou C-terminal assim como inserções de intra-sequência de um único aminoácido ou múltiplos aminoácidos. Em geral, as inserções na sequência de aminoácido serão menores que as fusões N- ou C~ terminal, da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos. Exemplos de proteínas ou peptídeos de fusão N- ou C-terminal incluem o domínio de ligação ou o domínio de ativação de um ativador transcricional conforme usado no sistema de levedura duplamente híbrido, proteínas de revestimento de fago, (histidina)-6-tag, glutationa S-transferase-tag, proteína A, proteína de ligação a maltose, diidrofolato redutase, Tag-100 epítopo, c-mic epítopo, FLAG®- epítopo, lacZ, CMP (peptídeo de ligação a calmodulina), HA epítopo, epítopo de proteína C e epítopo VSV.

Uma “substituição” se refere à substituição de aminoácidos da proteína por outros aminoácidos que possuem propriedades similares (como hidrofobicidade, hidrofiticidade, antigenicidade, propensão similares para formar ou quebrar estruturas α-helicoidal ou estruturas em folha-β). As substituições de aminoãcido são tipicamente de resíduos simples, porém podem ser agrupadas dependendo das restrições funcionais impostas sobre o polipeptídeo. As substituições de aminoácido são, de preferência, substituições conservadoras de aminoácido. As tabelas de substituição conservadora são bem conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman e Company (Eds) e a Tabela 1 abaixo).

Tabela 1: Exemplos de substituições conservadoras de aminoácido As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido podem ser facilmente realizadas utilizando técnicas sintéticas de peptídeo conhecidas, como síntese peptídica em fase sólida e similares, ou por manipulação de DNA recombinante. Os métodos para a manipulação de sequências de DNA para produzir variações de substituição, inserção ou deleção de uma proteína são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as técnicas para produzir mutações por substituição em locais predeterminados em DNA são bem conhecidas pelos elementos versados na técnica e incluem mutagênese M13, mutagênese T7-Gen in vitro (USB, Clevele, OH, EUA), mutagênese sítio-direcionada QuickChange (Stratagene, San Diego, CA, EUA), mutagênese sítio-direcionada mediada por PCR ou outros protocolos de mutagênese sítio-direcionada (veja Current Protocols in Molecular Bioíogy, John Wiiey & Sons, N.Y. (1989 e atualizações anuais)).

Derivados "Derivados” incluem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos que podem, comparados à sequência de aminoácido da forma de ocorrência natural da proteína, como a proteína de interesse, compreendem substituições de aminoácidos por resíduos de aminoácido de ocorrência não-natural, ou adições de resíduos de aminoácido de ocorrência não-natural. Os "derivados" de uma proteína também abrangem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos que compreendem resíduos de aminoácido de ocorrência natural alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, mínstoilados, sulfatados etc.) ou de ocorrência não-natural alterados comparados com a sequência de aminoácido de uma forma de ocorrência não-natural do polipeptídeo. Um derivado também pode compreender um ou mais substituintes ou adições sem aminoácido comparado com a sequência de aminoácido a partir da qual esse é derivado, por exemplo, uma molécula repórter e ou outro íigante, covalente ou não-covaientemente ligado à sequência de aminoácido, como uma molécula repórter que é ligada para facilitar sua detecção, e resíduos de aminoácido de ocorrência não-natural relativos à sequência de aminoácido de uma proteína de ocorrência natural. Ademais, os "derivados" também incluem fusões da forma de ocorrência natural da proteína com peptídeos de marcação como FLAG, HIS6 ou tioredoxina (para uma análise de peptídeos de marcação, veja Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523- 533, 2003).

Os "derivados” de ácidos nucléicos incluem ácidos nucléicos que podem, comparados com a sequência de nucleotídeo da forma naturalmente ocorrente do ácido nucléico compreendem deleções, alterações ou adições com nucleotídeos não naturalmente ocorrentes. Estes podem ser nucleotideos alterados naturalmente ocorrentes ou alterados não naturalmente ocorrentes como comparado com a sequência de nucleotídeo de uma forma natural mente ocorrente do ácido nucléico. Um derivado de uma proteína ou ácido nucléico ainda fornece substancialmente a mesma função, por exemplo, característica aprimorada relacionada ao rendimento, quando expressada ou reprimida em uma planta respectivamente.

Fragmentos funcionais O termo “fragmento funcional” se refere a qualquer ácido nucléico ou proteína que compreende meramente uma parte do ácido nucléico de comprimento completo ou proteína de comprimento completo, respectivamente, porém ainda fornece substancialmente a mesma função, por exemplo, característica(s) aprimorada(s) relacionada(s) ao rendimento, quando super-expressado ou reprimido em uma planta respectivamente.

Em casos onde a superexpressão de ácido nucléico é desejada, o termo ‘'substancialmente a mesma atividade funcional” ou “substancialmente a mesma função” significa que qualquer homólogo e/ou fragmento fornece característica(s) aprimorada(s) relacionada(s) ao rendimento quando expresso em uma planta. De preferência, substancialmente a mesma atividade funcional ou substancialmente a mesma função significa pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% ou mais característica(s) aumentada(s)/aprimorada(s) relacionada(s) ao rendimento comparada(s) à atividade funcional fornecida pela expressão exógena da sequência de nucleoíídeo codificadora de PMP de comprimento completo ou a sequência de aminoácído PMP, Domínio. Motivo/Seqüéncia de consenso/Assinatura O termo "domínio" se refere a um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de sequências de proteínas evolutivamente relacionadas. Enquanto os aminoácidos em outras posições podem variar entre homólogos, os aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que são provavelmente essenciais na estrutura, estabilidade ou função de uma proteína. Identificados por seu alto grau de conservação em sequências alinhadas de uma família de homólogos de proteína, esses podem ser usados como identificadores para determinar se qualquer poiipeptídeo em questão pertence a uma família de poiipeptídeo anteriormente identificada. O termo "motivo" ou "sequência de consenso" ou "assinatura" se refere a uma região conservada curta na sequência de aminoácidos ou sequências de ácidos nucléicos evolutívamente relacionadas. Para as sequências de aminoácidos, os motivos geralmente são partes altamente conservadas de domínios, porém também podem incluir apenas parte do domínio, ou podem ser localizadas fora do domínio conservado (se todos os aminoácidos do motivo estiverem fora de um domínio definido).

Existem bancos de dados especialistas para a identificação de domínios, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Ácido nucléicos Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al, (2003) Nucl. Acids. Res, 31 , 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motivos and its function ín automatíc sequência interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P.» Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61 , AAAI Press, Menlo Park; Hulo et aí., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)), ou Pfam (Bateman et al. , Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)) & The Pfam protein families database (R.D. Ftnn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J.E. Poflington, O.L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:211-222). Um conjunto de ferramentas para análise in silíco de sequências protéicas está disponível no servidor proteômico ExPASy (Swiss institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., Ex- PASy; the proíeomics server for in-depth protein knowtedge and analysis, Nucléico Acids Res, 31 :3784-3788(2003)). Os domínios ou motivos também podem ser identificados utilizando técnicas rotineiras, como por alinhamento de sequência.

Os métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, esses métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Bioi 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (ou seja, estendendo as sequências completas) de duas sequências que maximiza o número de pareamentos e minimiza o número de lacunas. O algoritmo BLAST (Altschui et ai. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula a porcentagem de identidade de sequência e realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para realizar a análise BLAST está publicamente disponível através do National Centre for Biotechnology Information (NCBl). Os homólogos podem ser facilmente identificados utilizando, por exemplo, o algoritmo de sequência múltipla ClustatW (versão 1 .83), com os parâmetros de alinhamento em pares padrão, e um método de pontuação em porcentagem. As porcentagens globais de similaridade e identidade também podem ser determinadas utilizando um dos métodos disponíveis no pacote de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29, MatGAT: um aplicativo que gera matrizes de simílaridade/identidade utilizando sequências protéícas ou de ONA.). A edição menor de manual pode ser realizada para otimizar o alinhamento entre os motivos conservados, como podería ser óbvio para um elemento versado na técnica. Ademais, em vez de utilizar sequências de comprimento completo para a identificação de homólogos, domínios específicos também poderíam ser usados. Os valores de identidade de sequência podem ser determinados através de toda a sequência de ácido nucléico ou aminoácido ou através de domínios ou motivo(s) conservado(s) selecionados, utilizando os programas mencionados acima que utilizam os parâmetros padrão, Para alinhamentos locais, o algoritmo de Smith-Waterman é particularmente útil (Smíth TF, Waterman MS (1981 ) J. Mol. Biol 147(1 ); 195-7). BLAST Recíproco Tipicamente, envolve um primeiro BLAST que envolve aplicar um BLAST (ou seja, executar o software de BLAST com a sequência de interesse como a sequência de busca) a uma sequência de busca (por exemplo, utilizando qualquer uma das sequências listadas na Tabela A da seção de Exemplos em relação a qualquer banco de dados de sequência, como o banco de dados NCBt publicamente disponível. BLASTIM ou TBLASTX (que utiliza valores padrão) é geralmente usado quando parte-se de uma sequência de nucleotídeo, e BLASTP ou TBLASTN (que utiliza valores padrão) quando parte-se de uma sequência de proteína. Os resultados de BLAST podem ser opcionatmente filtrados. As sequências longas de cada resultado filtrado ou resultado não-filtrado são então colocadas novamente em BLAST (segundo BLAST) contra as sequências do organismo a partir do qual a sequência de busca é derivada. Os resultados dos primeiro e segundo BLASTs são então comparados. Um parólogo é identificado se um acerto de classificação alta do primeiro blast for da mesma espécie a partir da qual a sequência de busca é derivada, um novo BLAST então resulta idealmente na sequência de busca entre os maiores acertos; um ortólogo é identificado se um acerto de classificação alta no primeiro BLAST não for da mesma espécie a partir da qual a sequência de busca é derivada, e, de preferência, resulta em novo BLAST na sequência de busca que está entre os maiores acertos.

Os acertos de classificação alta são aqueles que possuem um valor E baixo. Quanto menor for o valor E, mais significativa será a classificação (ou em outras palavras, menor será a chance de o acerto ao acaso). A comparação do valor E é bem conhecido na técnica, Além dos valores E, as comparações também são classificadas por porcentagem de identidade. A porcentagem de identidade se refere ao número de nucieotídeos (ou aminoácidos) idênticos entre as duas sequências de ácido nuciéico (ou potipeptídeo) comparadas em um comprimento particular. No caso de famílias grandes, CiustalW pode ser usado, seguido por uma árvore de similaridade, para ajudar a visualizar o agrupamento de genes relacionados e a identificar os ortólogos e parólogos.

PEPTÍDEO PE TRÀNSjTO

Um “peptídeo de trânsito” (ou sinal de trânsito, peptídeo de sinal, sequência de sinal) é uma cadeia de peptídeo curta (3 a 80 aminoácidos de comprimento) que dirige o transporte de uma proteína, de preferência, a organeias dentro da célula ou a determinados locais subcetulares ou para a secreção de uma proteína. Os peptídeos de trânsito também podem ser denominados sinal de trânsito, peptídeo de sinai, sequência de sinal, sinais de marcação ou sinais de localização (subcetulares).

Hibridizacão O termo “hibridização" conforme definido no presente documento é um processo onde sequências nucleotídicas complementares substancialmente homólogas se enrijecem entre si. O processo de hibridização pode ocorrer totalmente em solução, isto é, ambos os ácidos nucléicos complementadas estão em solução. O processo de hibridização também pode ocorrer com um dos ácidos nucléicos complementares imobilizado a uma matriz, tais como mícroesferas magnéticas, microesferas de Sepharose ou qualquer outra resina. Ademais, o processo de hibridização pode ocorrer com um dos ácidos nucíéicos complementares imobilizados a um suporte sólido, tal como uma membrana de nitro-celuiose ou náilon ou imobilizados, por exemplo, através de fotolitografia, por exemplo, a um suporte de vidro silicioso (o último sendo conhecido como matrizes ou micromatrízes de ácido nuciéico ou como chips de ácido nucléico). Com a finalidade e permitir que a hibridização ocorra, as moléculas de ácido nucléico são térmica ou quimicamente desnaturadas para fundir um filamento duplo em dois filamentos únicos e/ou remover estruturas tipo “hairpin” ou outros motivos dos ácidos nucléicos de filamento único. O termo "estringência" se refere a condições sob as quais uma hibridização ocorre. A estringência de hibridização é influenciada por condições como temperatura, concentração de sal, resistência iônica e composição de tampão de hibridização. Em geral, as condições de baixa estringência são selecionadas como sendo cerca de 30°C menores que o ponto de fusão térmica (Tm) para uma sequência específica em uma resistência iônica definida e pH. As condições de estringência média ocorrem quando a temperatura estiver 20°C abaixo de Tm, e as condições de estringência alta ocorrem quando a temperatura estiver 10°C abaixo de Tm. As condições de hibridização de estringência baixa são tipicamente usadas para isolar as sequências de hibridização que têm uma alta similaridade de sequência à sequência alvo de ácido nucléico. No entanto, os ácidos nucléicos podem desviar em sequência e ainda codificar um polípeptídeo substancialmente idêntico, devido à degeneração do código genético. Portanto, as condições de hibridização de estringência média podem algumas vezes ser necessárias para identificar tais moléculas de ácido nucléico. A Tm é a temperatura sob resistência iônica definida e pH, onde 50% da sequência alvo se hibridiza em uma sonda perfeítamente compatível. A Tm depende das condições de solução e da composição de base, e do comprimento da sonda. Por exemplo, maiores sequências se hibridizam especifica mente em temperaturas maiores. A taxa máxima de hibridização é obtida a partir de cerca de 16°C até 32°C abaixo da Tm. A presença de cáíions monovalentes na sofução de hibridização reduz a repulsão eletrostátíca entre os dois filamento de ácido nucléico promovendo, assim, uma formação híbrida; este efeito é visível para concentrações de sódio de até Q,4M (para maiores concentrações, este efeito pode ser ignorado). A formamida reduz a temperatura de fusão de duplexes de DNA-DNA e DNA-RNA com 0,6 a 0,7°C para cada formamida percentual, e além de 50% de formamida permite que a hibridízação seja realizada em 30 a 45°C, de qualquer forma, a taxa de hibridização irá ser reduzida. As incompatibilidades em pares de base reduzem a taxa de hibridização e a estabilidade térmica dos duplexes. Em média e para sondas maiores, a Tm diminui cerca de 1°C por % de incompatibilidade de base. A Tm pode ser calculada utilizando-se as equações a seguir, dependendo dos tipos de híbridos; 1) híbridos de DNA-DNA (Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem., 138; 267-284, 1984);

Tm= 81,5CC + 16,6xlog10fNa+]a + 0,41x%[G/Cb] - 50Gx[Lc]“1 -0.61 x% de formamida 2) híbridos de DNA-RNA ou RNA-RNA: Tm= 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 - 820/Lc 3) híbridos de oligo-DNA ou oligo-RNAd: Para <20 nucleotideos: Tm= 2 (ln) Para de 20 a 35 nucleotideos; Tm= 22 + 1,46 (ín) 3 ou para outro cátion monovaiente, mas apenas preciso na faixa de 0,01-0,4 M. D apenas preciso para %GC na faixa de 30% a 75%. c L = comprimento de duplex em pares de base. d oligo, oligonucleotídeo; Sn» = comprimento efetivo de iniciador = 2*(no. de G/C)+(no. de ATT). A ligação não-específica pode ser controlada utiiízando-se qualquer uma entre uma série de técnicas conhecidas, como, por exemplo, bloqueio da membrana com soluções contendo proteína, adições de RNA, DNA, e SDS heteróiogos ao tampão de híbridização, e tratamento com Rnase. Para sondas não-homólogas, pode-se realizar uma série de hibridizações variando-se um entre (i) reduzir progressivamente a temperatura de têmpera (por exemplo, de 68°C a 42°C) ou <ii) reduzir progressivamente a concentração de formamida (por exemplo, de 50% a 0%). O artesão versado está ciente dos vários parâmetros que podem ser alterados durante a híbridização e quais manterão ou alterarão as condições de estríngência.

Além das condições de híbridização, a especificidade de híbridização tipicamente também depende da função de lavagens pós-híbridização. Com a finalidade de remover o background resultante da híbridização não-espeeífica, as amostras foram lavadas com soluções salinas diluídas. Os fatores críticos dessas lavagens incluem a resistência tônica e a temperatura da solução de lavagem final: quanto menor a concentração salina e maior a temperatura de lavagem, maior a estríngência da lavagem. As condições de lavagem são tipicamente realizadas em ou abaixo de uma estríngência de híbridização. Uma híbridização positiva fornece um sinal que esta é pelo menos o dobro daquela do background. Em geral, as condições estringentes adequadas para ensaios de híbridização de ácido nucléico ou procedimentos de detecção de amplificação de gene são conforme apresentado anteriormente. Podem-se selecionar mais ou menos condições estringentes. O artesão versado está ciente dos vários parâmetros que podem ser alterados durante a lavagem e quais manterão ou alterarão as condições de estríngência.

Por exemplo, as condições típicas de híbridização de estríngência para híbridos de DNA maiores que 50 nucleotideos abrangem a híbridização a 65°C em 1x SSC ou a 42X em 1x SSC e 50% de formamida, seguida pela lavagem a 65°C em 0,3x SSC, Exemplos de condições médias de hibridização de estringência para híbridos de DNA maiores que 50 de nucíeotídeos abrangem a hibridização a 50°C em 4x SSC ou a 40°C em 6x SSC e 50% de formamtda, seguida pefa lavagem a 50°C em 2x SSC. O comprimento do híbrido é o comprimento antecipado para hibridização do ácido nucléico. Quando os ácidos nucléicos de sequência conhecida forem hibridizados, o comprimento híbrido pode ser determinado alinhando-se as sequências e identificando-se as regiões conservadas aqui descritas. 1*SSC é 0,15M a NaCI e citrato de sódio a 15mM; a solução de hibridização e as soluções de lavagem podem incluir, ainda, reagente de Denhardt 5x, 0,5-1,0% de SOS, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado e desnaturado, 0,5% de pírofosfato de sódio. Em uma realização preferencial, as condições de alta estringência significam uma hibridiação a 65°C em 0,1x SSC que compreende 0,1 SDS e, opcionalmente, um reagente 5x Denhardt, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado e desnaturado, 0,5% de pirofosfato de sódio, seguido pela lavagem a 65°C em 0,3x SSC.

Para os propósitos de definir o nível de estringência, pode-se fazer referência a Sambrook et al, (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York ou Current Protocols ín Molecular Bioiogy, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 e atualizações anuais).

Variante de splicing O termo “variante de splicing” conforme o uso em questão abrange variantes de uma sequência de ácido nucléico onde os introns e/ou exons selecionados foram excisados, substituídos, deslocados ou adicionados, ou onde os introns foram encurtados ou alongados, Essas variantes serão aquelas onde a atividade biológica da proteína é substancialmente retida; isto pode ser alcançado retendo-se sefetivamente os segmentos funcionais da proteína. Essas variantes de splicing podem ser encontradas na natureza ou podem ser fabricadas pelo homem. Os métodos de prever e isolar tais variantes de splicing são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Foissac and Schiex (2005} BMC Bioinformatics 6: 25).

VARtANTE ALÉLiCA

Os “alelos” ou “variantes alélicas” são formas alternativas de um determinado gene, focalizado na mesma posição cromossômica. As variantes alélicas abrangem Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs), assim como Pequenos Polimorfismos de Inserção/Exclusão (INDELs). O tamanho dos INDELs é geralmente menor que 100 bp. Os SNPs e INDELs formam o maior conjunto de variantes de sequência em cepas polimórfícas de ocorrência natural da maioria dos organismos, Endógeho A referência no presente documento a um ácido nucléico e/ou proteína “endógenos" se refere ao ácido nucléico e/ou proteína em questão conforme encontrado em uma planta sob sua forma natural (isto é, sem qualquer intervenção humana, como a tecnologia de DNA recombinante), mas também se refere ao mesmo gene (ou um ácido nucléico/gene substancialmente homólogo) sob uma forma isolada subsequentemente (re)introduzído em um vegetal (um transgene). Por exemplo, um vegetal transgênico contendo tal transgene pode encontrar uma redução substancial da expressão de transgene e/ou redução substancia! de expressão do gene endógeno. O gene isolado pode ser isolado a partir de um organismo ou pode ser fabricado pelo homem, por exemplo, através de síntese química.

Exógeno O termo ácido nucléico ou gene “exógeno” (ao contrário de “endógeno”) se refere a um ácido nucléico que foi introduzido em uma planta por meio de tecnologia de D NA recombinante, Um ácido nuciéico “exógeno” não pode ocorrer em uma planta em sua forma natural» pode ser diferente do ácido nuciéico em questão como encontrado em uma planta em sua forma natural, ou pode ser idêntico a um ácido nuciéico encontrado em uma planta em sua forma natural, porém não integrado dentro de seu ambiente genético natural. O significado correspondente de “exógeno” é aplicado no contexto de expressão de proteína. Por exemplo, uma planta transgênica que contém um transgene, ou seja, um ácido nuciéico exógeno, pode, quando comparado com a expressão do gene endógeno, encontrar um aumento substancial da expressão do respectivo gene ou proteína no total. Uma planta transgênica de acordo com a presente invenção incluí um ácido nuciéico PMP exógeno integrado a qualquer loca) genético e, opcionalmente, a planta também pode incluir o gene endógeno dentro do contexto genético natural.

Embaralhamento genético/evolucão direcionada O “embaralhamento genético” ou "evolução direcionada” consiste em iterações de embaralhamento de DNA seguidas por triagem e/ou seleção apropriadas para gerar variantes de ácidos nucléicos ou porções destes que codificam proteínas tendo uma atividade biológica modificada (Castle et a!., (2004) Science 304(5674): 1151-4; patentes US 5.811.238 e 6,395.547).

Cassete de expressão “Cassete de expressão" como usado aqui é um DNA capaz de ser expresso em uma célula hospedeira ou em um sistema de expressão ín-vitro. De preferência, o DNA, parte do DNA ou a disposição dos elementos genéticos que formam o cassete de expressão é artificial. Os elementos versados na técnica estão cientes dos elementos genéticos que devem estar presentes no cassete de expressão com a finalidade que sejam expressos com sucesso. O cassete de expressão compreende uma sequência de interesse a ser expressa operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle (pelo menos a um promotor) conforme descrito no presente documento. Os elementos regulatórios adicionais podem incluir acentuadores transcricionais e translacionais, um ou mais NEENA conforme descrito no presente documento, e/ou um ou mais RENA conforme descrito no presente documento. Os indivíduos versados na técnica estão cientes das sequências terminadoras e intensificadoras que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região 5' não-translacionada (UTR) ou à sequência de codificação para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol, conforme descrito na seção de definições para expressão/superexpressâo aumentada. Outras sequências de controle (além das sequências promotoras, intensificadoras, silenciadoras, íntron, regiões 3'UTR e/ou 5’UTR) podem ser elementos estabilizadores de proteína e/ou RNA. Essas sequências poderíam ser conhecidas ou podem ser facilmente obtida por um elemento versado na técnica. O cassete de expressão pode ser integrado ao genoma de uma célula hospedeira e replicado juntamente com o genoma da dita célula hospedeira.

CONSTRUÇÂO/CONSTRUÇÃO GENÉTICA É o D NA - artificial em parte ou total ou artificial na disposição dos elementos genéticos contidos - capaz de aumentar ou reduzir a expressão de DNA e/ou proteína de interesse tipicamente por replicação em uma célula hospedeira e usada para a introdução de uma sequência de interesse de DNA em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro. A replicação pode ocorrer após a integração no genoma da célula hospedeira ou através da presença da construção como parte de um vetor ou um cromossomo artificial dentro da célula hospedeira.

As células hospedeiras da invenção podem ser qualquer célula selecionada a partir de células bacterianas, como células da espécie Escherichia coli ou Agrobacterium, células de levedura, células de fungos, algas ou cianobactérias ou células vegetais. O elemento versado na técnica está ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes na construção genética para transformar, selecionar e propagar de forma bem sucedida as células hospedeiras que contêm a sequência de interesse.

Tipicamente, a construção/ construção genética é uma construção de expressão e compreende um ou mais cassetes de expressão que podem resultar em superexpressão (construção de superexpressão) ou expressão reduzida de um gene de interesse. Uma construção pode consistir em um cassete de expressão. A(s) sequência(s) de interesse é/são ligadas de modo operacional a uma ou mais sequências de controle (pelo menos um promotor) conforme descrito no presente documento. Os elementos reguladores adicionais podem incluir intensifícadores transcricionaís bem como translacionais, um ou mais NEENA conforme descrito no presente documento, e/ou um ou mais RENA conforme descrito no presente documento. Os elementos versados na técnica estarão cientes de sequências terminadoras e intensificadoras que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não traduzida 5' (UTR) ou na sequência de codificação para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol, com descrito na seção de definições para expressão aumentada/superexpressio. Outras sequências de controle (além de sequências promotoras, intensificadoras, siienciadoras, de íntrons, regiões 3'UTR e/ou 5'UTR) podem ser elementos estabilizadores de proteína e/ou RNA. Essas sequências poderíam ser conhecidas ou podem ser facilmente obtidas por um elemento versado na técnica.

As construções genéticas da invenção podem incluir adicionalmente uma origem de sequência de replicação que é exigida para a manutenção e/ou repiicação em um tipo de célula específico, Um exemplo é quanto exige-se que uma construção genética seja mantida em uma célula bacteriana como um elemento genético epissomal (por exemplo, molécula de plasmídeo o cosmídeo). As origens preferidas de repiicação incluem, porém sem caráter limitativo, f1-ori e colE1.

Para a detecção da transferência bem sucedida das sequências de ácido nucléico como usadas nos métodos da invenção e/ou seleção de plantas transgênicas que compreendem esses ácidos nucléicos, é vantajoso utilizar genes marcadores (ou genes-repórter). Portanto, a construção genética pode compreender opcionalmente um gene marcador selecionávei. Os marcadores selecionáveis são descritos em mais detalhes na seção "definições" no presente documento. Os genes marcadores podem ser removidos ou excisados da célula transgêníca uma vez que esses não são mais necessários. As técnicas de remoção de marcador são conhecidas, as técnicas úteis são descritas acima na seção definições.

Construção oe vetor/vetqr É o DNA (como, porém sem caráter limitativo, plasmídeo ou DNA viral) - artificiai em parte ou total ou artificial na disposição dos elementos genéticos contidos - capaz de repiicação em uma célula hospedeira e usados para a introdução de uma sequência de DNA de interesse em célula hospedeira ou organismo hospedeiro. Um vetor pode ser uma construção ou pode compreender pelo menos uma construção. Um vetor pode se replicar sem se integrar no genoma de uma célula hospedeira, por exemplo, um vetor piasmidial em uma célula hospedeira bacteriana, ou pode integrar parte ou todo seu DNA no genoma da célula hospedeira e, assim, resultar na repiicação e expressão de seu DNA. As células hospedeiras da invenção podem ser qualquer célula selecionada a partir de células bacterianas, como células das espécies Escherichia coli ou Agrobacterium, células de levedura, fungos, algas ou cianobactérias ou células vegetais. O elemento versado na técnica está ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes na construção genética para transformar, selecionar e propagar de forma bem sucedida as células hospedeiras que contêm a sequência de interesse. Tipicamente o vetor compreende pelo menos um cassete de expressão. Uma ou mais sequências de interesse são ligadas de modo operacional a uma ou mais sequências de controle (pelo menos a um promotor) conforme descrito no presente documento. Os elementos reguladores adicionais podem incluir intensificadores transcricionais bem como translacionais, um ou mais NEENA conforme descrito no presente documento, e/ou um ou mais RENA conforme descrito no presente documento. Os elementos versados na técnica estarão cientes de sequências terminadoras e intensíficadoras que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não traduzida 5' (UTR) ou na sequência de codificação para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol, com descrito na seção de definições. Outras sequências de controle (além de sequências promotoras, intensíficadoras, silenciadoras, de íntrons, regiões 3'UTR e/ou 5'UTR) podem ser elementos estabilizadores de proteína e/ou RNA. Essas sequências poderíam ser conhecidas ou podem ser facilmente obtidas por um elemento versado na técnica.

Elemento regulador/Sequência de controle/Promotor Os termos “elemento regulador”, “sequência de controle” e “promotor” são todos usados de maneira intercambíávet no presente documento e devem ser adotados em um contexto amplo para se referir a sequências reguladoras de ácido nucféico capazes de realizar uma expressão das sequências às quais elas se associam. O termo “promotor” ou “sequência promotora" tipicamente se refere a uma sequência de controle de ácido nucléico localizada a montante a partir do início transcricional de um gene e que esteja envolvida no reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas, direcionando, assim, a transcrição de um ácido nucléico operacionatmente ligado. Abrangidos pelos termos anteriormente mencionados estão as sequências reguladoras transcricionais derivadas de um gene genômico eucariòtico clássico (inclusive TATA box que é exigido para a iniciação de transcrição precisa, com ou sem uma sequência CCAAT box) e elementos reguladores adicionais (ou seja, sequências, intensificadores e silenciadores de ativação a montante) que alteram a expressão genética em resposta aos estímulos de desenvolvimento e/ou externos, ou de maneira tecido-específica. Também incluído dentro do termo está uma sequência reguladora transcricional de um gene procariótico clássico, nesse caso esse pode incluir uma sequência 35 box e/ou sequências reguladoras transcricionais -10 box. O termo "elemento regulador" também inclui uma molécula de fusão sintética ou derivado que confere, ativa ou aumenta a expressão de uma molécula de ácido nucléico em uma célula, tecido ou órgão.

Um "promotor vegetal’1 compreende elementos reguladores, que mediam a expressão de um segmento de sequência de codificação em células vegetais. Consequentemente, um promotor vegetal não precisa ser de origem vegetal, porém pode se originar de vírus ou microrganismos, por exemplo, de vírus que atacam as células vegetais. O "promotor vegetal” também pode se originar de uma célula vegetal, por exemplo, da planta que é transformada com a sequência de ácido nucléico que será expressa no processo inventivo e descrita aqui. Isso também se aplica a outros sinais reguladores "vegetais", como terminadores "vegetais". Os promotores a montante das sequências de nucleotídeo úteis nos métodos da presente invenção podem ser modificados por uma ou mais substituição(ões), inserção(ões) e/ou deleção(ões) de nucleotídeo sem interferir na funcionalidade ou atividade dos promotores, do quadro aberto de leitura (GRF) ou da região reguladora 3' como terminadores ou outras regiões reguladoras 3’ que ficam localizadas distante do ORF. Ademais, é possível que a atividade dos promotores seja aumentada pela modificação de sua sequência, ou que esses sejam substituídos por promotores mais ativos, mesmo promotores de organismos heterólogos. Para expressão em plantas, a molécula de ácido nucléico deve, como descrito aqui, ser ligada de maneira funcional ou compreender um promotor adequado que expressa o gene no momento certo e com o padrão de expressão espacial exigido.

Para a identificação de promotores funcionalmente equivalentes, a resistência de promotor e/ou padrão de expressão de um promotor candidato podem ser analisados, por exemplo, ao ligar de maneira funcional o promotor a um gene repórter e analisar o nível de expressão e padrão do gene repórter em vários tecidos da planta. Os genes repórter bem conhecidos adequados incluem, por exemplo, beta-glucuronídase ou beta-galactosidase. A atividade de promotor é analisada ao medir a atividade enzimática da beta-glucuronidase ou beta-galactosidase, A resistência de promotor e/ou padrão de expressão podem ser então comparados com aqueles de um promotor de referência (como aquele usado nos métodos da presente invenção), Alternativamente, a resistência de promotor pode ser analisada ao quantificar os níveis de mRNA ou ao comparar os níveis de mRNA do ácido nucléico usado nos métodos da presente invenção, com os níveis de mRNA de genes de manutenção como 18S rRNA, utilizando métodos conhecidos na técnica, como Northern blotting com análise densitométrica de autorradiogramas, PCR em tempo real quantitativa ou RT- PCR (Heid et a!., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Geralmente, por "promotor fraco" entende-se um promotor que conduz a expressão de uma sequência codificadora em um baixo nível. Por "baixo nível" entende-se em níveis de cerca de 1/10.000 transcrições a cerca de 1/100.000 transcrições, a cerca de 1/500.0000 transcrições por célula. Em contrapartida, um "promotor forte" conduz a expressão de uma sequência codifícadora em alto nfvei, ou em cerca de 1/10 transcrições a cerca de 1/100 transcrições a cerca de 1/1000 transcrições por célula. Geralmente, por "promotor de resistência média" entende-se um promotor que conduz a expressão de uma sequência codifícadora em um nível menor do que um promotor forte, em particular em um nível que está em todos os casos abaixo daquele obtido quando estiver sob o controle de um promotor 35S CaMV.

OPERACtQNALMENTE LIGADO O termo "operacionalmente ligado" ou “funcionalmente ligado” é usado de maneira intercambiável e, conforme o uso em questão, se refere a uma ligação funcional entre a sequência promotora e o gene de interesse, de tal modo que a sequência promotora seja capaz de direcionar a transcrição do gene de interesse. O termo "ligação funcional" ou "funcíonaimente ligado" em relação a elementos reguladores, será entendido como, por exemplo, a disposição sequencial de um elemento regulador (por exemplo, um promotor) com uma sequência de ácido nuclêico que será expressa e, se apropriado, elementos reguladores adicionais (como, por exemplo, um terminador, NEENA como descrito aqui ou um RENA como descrito aqui) de modo que cada elemento regulador possa executar sua função pretendida para permitir, modificar, facilitar ou, de outro modo, influenciar a expressão da dita sequência de ácido nuclêico. Como um sinônimo, a palavra “ligação operável” ou “operacíonalmente ligado” pode ser usada. A expressão pode resultar, dependendo da disposição das sequências de ácido nuclêico, em RNA senso ou anti-senso. Para isso, a ligação direta no sentido químico não é necessariamente exigida. As sequências de controle genéticas como, por exemplo, sequências intensificadoras, também podem exercer sua função sobre a sequência alvo a partir de posições que estão distantes, ou de fato a partir de outras moiécuias de DNA, As disposições preferidas são aquelas em que a sequência de ácido nucléico a ser expressa de forma recombínante é posicionada atrás da sequência que atua como promotor, de modo que as duas sequências sejam covalentemente ligadas uma à outra. A distância entre a sequência promotora e a sequência de ácido nucléico a ser expressa de modo recombínante ê, de preferência, menor que 200 pares de base, especialmente, de preferência, menor que 100 pares de base, muito especialmente, de preferência, menor que 50 pares de base. Em uma realização preferida, a sequência de ácido nucléico que será transcrita fica localizada atrás do promotor de modo que o início da transcrição seja idêntico com o começo desejado do RNA da invenção. A ligação funcional e uma construção de expressão podem ser geradas por meio de recombinação convencional e técnicas de clonagem como descrito (por exemplo, em Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloníng: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubeí et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, and Wiíey Interscience; Geivin et al. (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, Holanda). Entretanto, sequências adicionais, que, por exemplo, atuam como um ügante com sítios de divagem específicos para enzimas de restrição, ou como um peptídeo de sinal, também podem ser posicionados entre as duas sequências. A inserção de sequências também pode resultar na expressão de proteínas de fusão. De preferência, a construção de expressão, que consiste em uma ligação de uma região reguladora, por exemplo, um promotor e sequência de ácido nucléico que será expressa, pode se apresentar em uma forma integrada com vetor e pode ser inserida em um genoma da planta, por exemplo, por transformação.

Promotor Constítütivo Um “promotor constitutivo” se refere a um promotor que seja transcricionalmente ativo durante a maioria das, mas não necessariamente todas, fases de crescimento e desenvolvimento e sob condições ambientais, em pelo menos uma célula, tecido ou órgão. A Tabela 2a abaixo fornece exemplos de promotores constitutivos.

Tabela 2a: Exemplos de promotores constitutivos Promotor ubíquo Um promotor ubíquo é ativo substancialmente em todos os tecidos ou células de um organismo.

Promotor desenvolvídamente regulado Um promotor desenvolvídamente regulado é ativo durante determinados estágios de desenvolvimento ou em partes do vegetal que são submetidas a alterações de desenvolvimento.

Produtor induzível Um promotor induzível induziu ou aumentou uma iniciação de transcrição em resposta a um produto químico (para uma revisão, vide Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physioi. Plant Mot, Bioi., 48:89-108), estímulo ambiental ou físico, ou pode ser “induzível por estresse", isto é, ativado quando um vegetal for exposto a várias condições de estresse, ou “induzível por patógeno” isto é, ativado quando um vegetal for exposto a vários patógenos.

Promotor òrgão-específíco/tecido-específico Um promotor órgão-específico ou tecído-específico é aquele capaz de iniciar preferencialmente uma transcrição em determinados órgãos ou tecidos, tais como folhas, raízes, tecido de sementes etc. Por exemplo, um “promotor raiz-específico" é um promotor transcricíonalmente ativo predominantemente em raízes vegetais, substancialmente à exclusão de quaisquer outras partes de um vegetal, enquanto ainda permite qualquer expressão basal nessas outras partes de vegetal. Os promotores capazes de iniciar uma transcrição em determinadas células são referidos no presente documento apenas como “célula-específicos”.

Exemplos de promotores raiz-específicos são listados na Tabela 2b abaixo: Tabela 2b: Exemplos de promotores raiz-específicos___________ Um promotor semente-específico é transcricionalmente ativo predominantemente em tecido de sementes, mas não necessariamente exclusivamente em tecidos de sementes {em casos de expressão basal). O promotor semente-específico pode ser ativo durante o desenvolvimento de sementes e/ou durante a germinação. O promotor semente-específico pode ser endosperma/aleurona/embrio específico. Exemplos de promotores sementes-específicos (endosperma/aleurona/embrio específicos) são mostrados na Tabela 2c a Tabela 2f abaixo. Outros exemplos de promotores semente-específicos são dados em Qing Qu e Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004), estando a descrição deste aqui incorporada a título de referência ainda que estejam completamente apresentados.

Tabela 2c: Exemplos de promotores semente-esfecíficos Tabela 2o: Exemplos de promotores enposperma-específicqs Tabela 2e: Exemplos de promotores embrio-especIficos Tabela 2f : Exemplos oe promotores aleurona-específicos Um promotor tecido-específico verde conforme definido no presente documento é um promotor transcricioalmente ativo predominantemente em tecido verde, substancialmente à exclusão de quaisquer outras partes de um vegetal, enquanto ainda permite qualquer expressão basal nessas partes vegetais.

Exemplos de promotores tecido-específicos verde que podem ser usados para realizar os métodos da invenção são mostrados na Tabela 2g abaixo.

Tabela 2g: Exemplos de promotores tecído-específícos verde Outro exemplo de um promotor tecido-específico é um promotor meristema-especifico, que é transcricionalmente ativo predominantemente em tecido meristemátíco, substancialmente à exclusão de quaisquer outras partes de um vegetal, enquanto ainda permite qualquer expressão basal nessas outras partes vegetais. Exemplos de promotores meristema-específicos verde que podem ser usados para realizar os métodos da invenção são mostrados na Tabela 2h abaixo. _ _____ Tabela 2h: Exemplos de promotores meristema-específícos Terminador O termo “terminador” abrange uma sequência de controle que consiste em uma sequência de DNA na extremidade de uma unidade transcricional que sinaliza o processamento e poiiadenilação 3 de uma transcrição primária e terminação de transcrição, O terminador pode ser derivado do gene natural, a partir de uma variedade de outros genes de vegetal, ou a partir de T-DNA. O terminador a ser adicionado pode ser derivado, por exemplo, a partir de genes de sintase nopalina ou síntase octopina, ou, alternativamente, a partir de outro gene de vegetal, ou, com menos preferência, a partir de qualquer outro gene eucariótico.

Marcador selecionavel (gene)/Gene repórter O “marcador sefecionável”, “gene marcador seiecionáve!” ou “gene repórter” inclui qualquer gene que confira um fenótipo em uma célula na qual este é expresso de modo a facilitar a identificação e/ou a seleção de células que sejam transfectadas ou transformadas com uma construção de ácido nucléico da invenção. Estes genes marcadores permitem a identificação de uma transferência bem sucedida de moléculas de ácido nucléico através de uma série de diferentes princípios. Os marcadores adequados podem ser selecionados a partir de marcadores que conferem resistência antibiótica ou herbicida, que introduzem uma nova característica metabólica ou que permitem uma seleção visual. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem genes eu conferem resistência a antibióticos (como nptll que fosforila neomicina e canamicina, ou hpt, que fosforila higromicina, ou genes que confere resistência, por exemplo, a bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenícol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicína ou blasticidina), a herbicidas (por exemplo, bar que proporciona resistência a Basta®; aroA ou gox que proporcionam resistência contra glifosato, ou os genes que conferem resistência, por exemplo, a ímídazolinona, fosfinotricina ou suífonilurea), ou genes que proporcionam uma característica metabólica (tal como manA que permite que os vegetais usem manose como a única fonte de carbono ou xilose ísomerase para a utilização de xiiose, ou marcadores antinutritivos, como a resistência a 2-deoxiglicose). A expressão de genes marcadores visuais resulta na formação de cor (por exemplo, β-glucuronidase, GUS ou β-galactosidase com seus substratos coloridos, por exemplo, X-Gal), luminescência (como o sistema de luciferína/luceferase) ou fluorescência (Proteína Fluorescente Verde, GFP, e derivados desta). Esta lista representa apenas um pequeno número de marcadores possíveis. Os indivíduos versados estão familiarizados com tais marcadores. Diferentes marcadores são preferenciais, dependendo do organismo e do método de seleção.

Sabe-se que mediante uma integração estável ou transiente de ácidos nudéicos em células vegetais, apenas uma minoria das células recolhem o DNA externo e, se desejado, o integram em seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada. Com o intuito de identificar e selecionar tais integrantes, uma codificação genética para um marcador selecionável (como aqueles descritos anteriormente) é geralmente introduzida nas células hospedeiras junto ao gene de interesse. Estes marcadores podem, por exemplo, ser usados em mutantes onde estes genes não são funcionais, por exemplo, através de exclusão por métodos convencionais. Ademais, as moléculas de ácido nucléico que codificam um marcador setecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor que compreende a sequência que codifica os polipeptídeos da invenção ou usadas nos métodos da invenção, ou, até mesmo em um vetor separado. As células que foram estavelmente transfectadas com o ácido nucléico introduzido podem ser identificadas, por exemplo, através de seleção (por exemplo, as células que têm integradas o marcador setecionável sobrevivem enquanto as outras células morrem).

Visto que os genes marcadores, particularmente genes para resistência a antibióticos e herbicidas, não são mais necessários ou indesejados na célula hospedeira transgênica uma vez que os ácidos nucléícos tiverem sido introduzidos com sucesso, o processo de acordo com a invenção para introduzir os ácidos nucléícos emprega, de modo vantajoso, técnicas que permitem a remoção ou a excisão desses genes marcadores. Um desses métodos é conhecido como co-transformação. O método de co-transformação emprega dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor que suporta o ácido nucléico de acordo com a invenção e um segundo vetor que suporta g{s) gene(s) marcador(es). Uma grande proporção de transformantes recebe ou, no caso de vegetais, compreende (até 40% ou mais dos transformantes), ambos os vetores. No caso de transformação com Agrobacteria, os transformantes geralmente recebem apenas uma parte do vetor, isto é, a sequência ffanqueada pelo T-DNA, que geratmente representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem ser subsequentemente removidos do vegetal transformado realizando-se cruzamentos. Em outro método, os genes marcadores integrados em uma transposâo são usados para a transformação junto ao ácido nucléico desejado (conhecido como a tecnologia Ac/Ds), Os transformantes podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com uma construção de ácido nucléico que confere a expressão de uma transposase, de modo transiente ou estável. Em alguns casos (aprox. 10%), a transposão sai do genoma da célula hospedeira uma vez que a transformação tiver ocorrido com sucesso e é perdido. Em uma série de outros casos, o transposão salta para um loca! diferente. Nestes casos, o gene marcador deve ser eliminado realizando-se cruzamentos. Em microbiologia, desenvolveram-se técnicas que tornam possível, ou facilitam, a detecção desses eventos. Um método vantajoso adicional se refere ao que é conhecido como sistemas de recombinação; cuja vantagem é que a eliminação por cruzamento pode ser dispensada. O sistema melhor conhecido deste tipo é aquele conhecido como o sistema Cre/lox. Cre1 é uma recombinase que remove as sequências localizadas entre as sequências loxP. Se o gene marcador for integrado entre as sequências loxP, o mesmo é removido uma vez que a transformação tiver ocorrido com sucesso, através de expressão da recombinase. Os sistemas de recombinação adicional são os sistemas HIN/HiX, FLP/FRT e REP/STB (Tríbble et al„ J. Biol. Ghem., 275, 2000; 22255-22267; Velmurugan et ai., J. Ceil Biol., 149, 2000: 553-566). Uma integração sifio-especifica no genoma vegetal da sequência de ácidos nucléicos de acordo com a invenção é possível. Naturalmente, estes métodos também podem ser aplicados a microorganismos como levedura, fungos ou bactérias. iBANSGÉNjcon·. mmGÃmJMsiQmmmM.

Para os propósitos da invenção, “transgênico”, “transgene” ou “recombinante” significa em relação, por exemplo, a uma sequência de ácido nucléico, um cassete de expressão, uma construção genética ou um vetor que compreende a sequência de ácido nucléico ou um organismo transformado pela sequência de ácidos nucléicos, cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, todas essas construções foram produzidas através de métodos recombinantes onde (a) a sequência de ácidos nucléicos que codifica proteínas úteis nos métodos da invenção, ou (b) sequência de controle genético que é operacionalmente ligada à sequência de ácido nuciéico de acordo com a invenção, por exemplo, um promotor, ou (c) a) e b) não ficam localizadas em seu ambiente genético natural ou foram modificadas por métodos recombinantes, sendo que é possível que a modificação assuma a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, exclusão, inversão ou inserção de um ou mais resíduos nucleotídícos, O ambiente genético natural é compreendido como um local genômico ou cromossômico natural no vegetal original ou a presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nuciéico é, de preferência, retido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nuciéico pelo menos em um lado e tem um comprimento de sequência de pelo menos 50 bp, de preferência, peio menos 500 bp, com preferência especial, pelo menos 1000 bp, com a máxima preferência, pelo menos 5000 bp. Um cassete de expressão de ocorrência natural - por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nuciéico com a sequência de ácido nuciéico correspondente que codifica um polipeptídeo útil nos métodos da presente invenção, conforme definido anteriormente - se torna um cassete de expressão transgênico quando o cassete de expressão for modificado por um método sintético não-natural (“artificial”} como, por exemplo, tratamento mutagênico. Os métodos adequados são descritos, por exemplo, nos documentos US 5,565,350 ou WO 00/15815. Adicíonalmente, um cassete de expressão de ocorrência natural - por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nuctéico com a sequência de ácido nucléico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, conforme definido anteríormente - se torna um cassete de expressão recombinante quando este cassete de expressão não for integrado no ambiente genético natural, mas em um ambiente genético diferente como resultado de um isolamento do dito cassete de expressão a partir de seu ambiente genético natural e re-inserção em um ambiente genético diferente.

Deve-se notar, ainda, que no contexto da presente invenção, o termo “ácido nucléico isolado” ou “polipeptídeo isolado” pode, em alguns casos, ser considerado como um sinônimo para um "ácido nucléico recombinante” ou um “polipeptídeo recombinante”, respectivamente, e se refere a um ácido nucléico ou polipeptídeo que não esteja localizado em seu ambiente genético natural ambiente celular, respectivamente, e/ou que tenha sido modificado por métodos recombinantes. Uma sequência de ácido nucléico isolada ou uma molécula de ácido nucléico isolada é aquela que não está em seus arredores nativos ou adjacências de ácido nucléico nativo, ainda é física e funcionalmente conectada a outras sequências de ácido nucléico ou moléculas de ácido nucléico e é encontrada como parte de um ácido nucléico construção, sequência de vetor ou cromossomo.

Portanto, uma planta transgênica para os propósitos da invenção é entendida significando, conforme anteríormente, que os ácidos nucléicos usados no método da invenção não estão presentes, ou originários a partir, do genoma da dita planta, ou estão presentes no genoma da dita planta, mas não em seu local natural no genoma da dita planta, sendo que é possível que os ácidos nucléicos sejam expressos de modo homogêneo ou heterogêneo. No entanto, conforme mencionado, transgênico também significa que, enquanto os ácidos nucléicos de acordo com a invenção ou usados no método inventivo estão em sua posição natural no genoma de uma planta, a sequência foi modificada em relação à sequência natural, e/ou que as sequências regulatórias das sequências naturais foram modificadas. O transgênico é, de preferência, entendido como significando que ocorre a expressão dos ácidos nucléicos de acordo com a invenção em um local não-naturat no genoma, isto é, expressão homologa ou, de preferência, heteróloga dos ácidos nucléicos. As plantas transgênicas preferenciais são mencionadas no presente documento.

Conforme o uso em questão, o termo “transgênico" referente a um organismo, por exemplo, uma planta transgênica se refere a um organismo, por exemplo, uma planta, célula vegetal, calo, tecido vegetal, ou parte de planta que contenha de modo exógeno o ácido nuciéico, construção, vetor ou cassete de expressão descritos no presente documento ou uma parte destes que seja preferencialmente introduzida por processos que não sejam essencialmente biológicos, de preferência, através de uma transformação mediada por bombardeio de partículas de Agrobacteria. Uma planta transgênica para os propósitos da invenção é, portanto, entendida como significando, conforme anteriormente, que os ácidos nucléicos aqui descritos não estão presentes, ou não se originam a partir do genoma da dita planta, ou estão presentes no genoma da dita planta, mas não em seu ambiente genético natural no genoma da dita planta, sendo possível que os ácidos nucléicos sejam expressos de modo homogêneo ou heterogêneo.

Modulação O termo “modulação" significa em relação à expressão ou expressão genética, um processo em que o nível de expressão é alterado pela dita expressão genética em comparação com a planta de controle, o nível de expressão pode ser aumentado ou reduzido. A expressão original, não modulada pode ser qualquer tipo de expressão de um RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com tradução subsequente. Para os propósitos dessa invenção, a expressão não modulada original também pode ser ausência de qualquer expressão. O termo “modular a atividade” ou o termo “modular a expressão” em relação às proteínas ou ácidos nucléicos usados nos métodos, construções, cassetes de expressão, vetores, plantas, sementes, células hospedeiras e usos da invenção deve significar qualquer alteração da expressão das sequências de ácido nucléico inventivas ou proteínas codificadas, que resulta em característica(s) aumentada(s) ou reduzida(s) relacionada(s) ao rendimento. A expressão pode aumentar de zero (ausência de, ou expressão imensurável) para uma determinada quantidade, ou pode diminuir de uma determinada quantidade para pequenas quantidades imensuráveis ou zero.

Expressão O termo “expressão” ou "expressão genética" significa a transcrição de um gene específico ou genes específicos ou construção genética específica. O termo “expressão” ou “expressão genética” em particular significa a transcrição de um gene ou genes ou construção genética em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com ou sem tradução subsequente do último em uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA e o processamento do produto de mRNA resultante. O termo “expressão” ou “expressão genética” também pode incluir a tradução do mRNA e com isso a síntese da proteína codificada, ou seja, expressão protéica.

Expressão aumentapa/superexpressào O termo “expressão aumentada”, “expressão acentuada” ou “superexpressão” conforme o uso em questão significa qualquer forma de expressão que seja adicional ao nível de expressão de ocorrência natural original. Para os propósitos dessa invenção, o nível de expressão de ocorrência natural original também deve ser zero, ou seja, ausência de expressão ou expressão imensurável. Referência aqui à “expressão aumentada”, “expressão acentuada” ou “superexpressão” é considerada para significar um aumento na expressão do gene e/ou, se refere a polipeptídeos, níveis de polipeptídeo aumentados e/ou atividade de polipeptideo aumentada, em relação a plantas de controle. O aumento na expressão, os níveis de polipeptideo ou atividade de polipeptídeo está na ordem crescente de preferência pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 100% ou ainda mais comparado com aqueles de plantas de controle. O aumento na expressão pode estar na ordem crescente de preferência pelo menos 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000% ou 5000% ou ainda mais comparado com aquele de plantas de controle. Em casos onde as plantas de controle possuem apenas muito pouca expressão, os níveis de polipeptídeo ou atividade de polipeptídeo da sequência em questão e/ou o gene recombínante está sob o controle de elemento(s) regulador(es) forte(s) aumentam em expressão, os níveis de polipeptídeo ou atividade de polipeptídeo podem ser pelo menos 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes, 2000 vezes, 3000 vezes, 5000 vezes, 10 000 vezes, 20 000 vezes, 50 000 vezes, 100 000 vezes ou ainda mais comparado com aqueles de plantas de controle.

Os métodos para aumentar a expressão de genes ou produtos genéticos são bem c documentados na técnica e incluem, por exemplo, a superexpressão conduzida por promotores adequados, o uso de intensificadores de transcrição ou intensificadores de tradução, Os ácidos nuciéicos isolados que servem como elementos promotores ou intensificadores de podem ser introduzidos em uma posição adequada (tipicamente a montante) de uma forma não-heteróloga de um polinucleotídeo para super-regular a expressão de um ácido nudéico que codifica o polipeptídeo de interesse. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo por mutação, deleção, e/ou substituição (veja, Kmiec, US 5,585.350; Zaríing et al., W09322443), ou os promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula vegetal na orientação e distância adequadas de um gene da presente invenção para controlar a expressão do gene.

Se a expressão de polipeptídeo for desejada, geralmente deseja-se incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3' de uma região de codificação de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes vegetais, ou de T-DNA. A sequência de extremidade 3' que será adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes da nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene vegetal, ou com menos preferência, de outro gene eucariótico.

Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não traduzida 5' (UTR) ou à sequência codificadora da sequência codificadora parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. A inclusão de um íntron na unidade de transcrição nas construções de expressão vegetais e animais foi mostrada para aumentar a expressão genética nos níveis de mRNA e proteína para até 1000 vezes {Buchman and Berg (1988) Mal. Celf biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1 183-1200). Tal aumento de íntron de expressão genética é tipicamente maior quando colocado próximo à extremidade 5' da unidade de transcrição. O uso dos íntrons de milho Adh1 -S íntron 1 , 2, e 6, o íntron Bronze-1 é conhecido na técnica. Para informações gerais, veja: The Maize Hebook, capítulo 116, Freeling and Walbot, Eds,, Sprínger, N.Y. (1994).

Para obter a expressão aumentada ou superexpressão de um polipeptídeo mais comumente o ácido nucléico que codifica esse polipeptídeo é superexpresso na orientação senso com um sinal de poliadenilação. íntrons ou outros elementos intensificadores podem ser usados além de um promotor adequado para conduzir a expressão com o padrão de expressão pretendido. Em contrapartida, a superexpressão da mesma sequência de ácido nucléico que a construção anti-senso não irá resultar em expressão aumentada da proteína» porém expressão reduzida da proteína.

Expressão reduzida No presente documento, a referência ã “expressão reduzida" ou “redução ou eliminação substanciai" de expressão deve significar uma redução em expressão genética endógena e/ou de níveis de poiipeptídeo e/ou atividade de poiipeptídeo em relação a plantas de controle. A redução ou eliminação substanciai está em ordem crescente de preferência pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior comparada àquela de plantas de controle.

Para a redução ou eliminação substancia! de expressão de um gene endógeno em uma planta, requer-se um comprimento suficiente de nucleotídeos substancíalmente contíguos de uma sequência de ácido nucléico. Com a finalidade de realizar o silenciamento de genes, este pode ser tão pequeno quanto 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ou menos nucleotídeos, alternativamente, pode ser tão grande quanto todo o gene (incluindo o 5’ e/ou 3’ UTR, em parte ou como um todo). O alcance de nucleotídeos substancíalmente contíguos pode ser derivado a partir do ácido nucléico que codifica a proteína de interesse (gene alvo), ou a partir de qualquer ácido nucléico capaz de codificação de um ortóiogo, parólogo ou homólogo da proteína de interesse. De preferência, o alcance de nucleotídeos substancíalmente contíguos é capaz de formar ligações de hidrogênio com o gene alvo (seja um filamento sentido ou anti-sentido), com mais preferência, o alcance de nucleotídeos substancialmente contíguos tem, em ordem crescente de preferência, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidade de sequência ao gene alvo seja um filamento sentido ou anti-sentido). Uma sequência de ácido nucíéico que codifica um polipeptídeo (funcional) não é uma exigência para os vários métodos aqui discutidos para a redução ou eliminação substancial de expressão de um gene endógeno.

Esta redução ou eliminação substancial de expressão pode ser alcançada utilizando-se ferramentas e técnicas de rotina. Um método preferencial para a redução ou eliminação substancial de expressão genética endógena ocorre introduzindo-se, de preferência por métodos recombinantes, e expressando-se em uma planta uma construção genética na quat o ácido nucíéico (neste caso, um alcance de nucíeotídeos substancialmente contíguos derivados a partir do gene de interesse, ou a partir de qualquer ácido nucíéico capaz de codificar um ortólogo, parólogo ou homólogo de qualquer uma das proteínas de interesse) é clonado como uma repetição invertida (em parte ou compietamente), separado por um espaçador (DNA de não-codificação).

Neste método preferencial, a expressão do gene endógeno é reduzida ou substancialmente eliminada através de silenciamento mediado por RNA que utiliza uma repetição invertida de um ácido nucíéico ou uma parte do mesmo (neste caso, um alcance de nucíeotídeos substancialmente contíguos derivados a partir do gene de interesse, ou a partir de qualquer ácido nucíéico capaz de codificar um ortólogo, parólogo ou homólogo da proteína de interesse), de preferência, capaz de formar uma estrutura tipo hairpin. A repetição invertida é clonada em um vetor de expressão que compreende sequências de controle. A sequência de ácido nucíéico de DNA de não-codificação (um espaçador, por exemplo, um fragmento de região de fixação de matriz (MAR), um intron, um politigador, etc.) fica localizada entre dois ácidos nucléicos invertidos que formam a repetição invertida. Após a transcrição da repetição invertida, um RNA quimérico com uma estrutura auto-complementar é formado (parcial ou totalmente). A estrutura de RNA de filamento duplo é referida como RNA tipo hairpin (hpRNA). O hpRNA é processado pela planta em siRNAs que são incorporados em um complexo de siíenciamento induzido por RNA (RISC). O RISC diva, ainda, as transcrições de mRNA, reduzindo, assim, substanciaimente o número de transcrições de mRNA a serem transladadas em polipeptídeos, Para detalhes gerais adicionais vide, por exemplo, Grierson et al. (1998) WO 98/53083; Waterhouse et ai. (1999) WO 99/53050). O desempenho dos métodos da invenção não se refere à introdução e à expressão em uma planta de uma construção genética na qual o ácido nuciéico é clonado como uma repetição invertida, mas qualquer um ou mais métodos de “siíenciamento de genes” bem conhecido pode ser usados para se obter os mesmos efeitos.

Um desses métodos para a redução de expressão genética endógena é o siíenciamento mediato por RNA de expressão genética (regulação descendente). Neste caso, o siíenciamento é acionado em uma planta por uma sequência de RNA de filamento duplo (dsRNA) que é substancialmente similar ao gene endógeno alvo. Este dsRNA é adicionalmente processado pela planta em cerca de 20 a cerca de 26 nucleotídeos denominados RN As de curta interferência (siRNAs). Os siRNAs são incorporados em um complexo de siíenciamento induzido por RNA (RISC) que clíva a transcrição de mRNA do gene endógeno alvo, reduzindo, assim, substancialmente o número de transcrições de mRNA a serem transladadas em um peptídeo. De preferência, a sequência de RNA de filamento duplo corresponde a um gene alvo.

Outro exemplo de um método de siíenciamento de RNA envolve a introdução de sequências de ácido nuciéico ou partes destas (neste caso, um alcance de nucleotídeos substancialmente contíguos derivados a partir do gene de interesse, ou a partir de qualquer ácido nuciéico capaz de codificar um ortólogo, paróiogo ou homólogo da proteína de interesse) em uma orientação de sentido em uma planta. A “orientação de sentido” se refere a uma sequência de DNA que é homóloga a uma transcrição de mRNA. Portanto, em uma planta deve-se introduzir pelo menos uma cópia da sequência de ácido nucléico. A sequência de ácido nucléico adicional reduzirá a expressão do gene endógeno, causando um fenômeno conhecido como co-supressão. A redução da expressão genética será mais pronunciada se várias cópias adicionais de uma sequência de ácido nucléico forem introduzidas na planta, assim como se existisse uma correlação positiva entre altos níveis de transcrição e o acionamento de co-supressão.

Outro exemplo de um método de silenciamento de RNA envolve o uso de uma sequência de ácidos nucléicos anti-sentido. Uma sequência de ácido nucléico “anti-sentido" compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de ácido nucléico de “sentido" que codifica uma proteína, isto é, complementar ao filamento de codificação de uma molécula de cDNA de filamento duplo ou complementar a uma sequência de transcrição de mRNA. A sequência de ácido nucléico anti-sentido é, de preferência, complementar ao gene endógeno a ser silenciado. A complementaridade pode estar localizada na “região de codificação" e/ou na “região de não-codificação” de um gene. O termo "região de codificação” se refere a uma região da sequência de nucleotídeo que compreende códons que são transladados em resíduos de aminoácido. O termo “região de não-codificação" se refere às sequências 5* e 3* que flanqueia a região de codificação que são transcritas, mas não transladadas em aminoácidos (também com referência às regiões não-transladadas 5' e 3*).

As sequências de ácido nucléico anti-sentido podem ser projetadas de acordo com as regras de pareamento em base de Watson e Crick. A sequência de ácido nucléico anti-sentido pode ser complementar a toda a sequência de ácido nucléíco {neste caso, um alcance de nucleotídeos substancialmente contíguos derivado do gene de interesse, ou a partir de qualquer ácido nucféico capaz de codificar um ortólogo, parólogo ou homólogo da proteína de interesse), mas também pode ser um oligonucleotídeo que é anti-sentido a apenas uma parte da sequência de ácido nucléíco (incluindo o mRNA 5’ e 3* UTR), Por exemplo, a sequência de oligonucleotídeo anti-sentido pode ser complementar à região que circunda o sítio de início de translação de uma transcrição de mRNA que codifica um polipeptideo. O comprimento de uma sequência de oligonucleotídeo anti-sentido adequada é conhecido na técnica e pode iniciar a partir de cerca de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 ou 10 nucleotídeos em comprimento ou menor, Uma sequência de ácido nucléíco anti-sentido de acordo com a invenção pode ser construída utiiizando-se síntese química e reações de iigação enzimática que utilizam métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma sequência de ácido nucléíco anti-sentido (por exemplo, uma sequência de oligonucleotídeo anti-sentido) pode ser quimicamente sintetizada utilizando-se nucleotídeos de ocorrência natural ou nucleotídeos modificados de diversas maneiras projetados para aumentar a estabilidade biológica das moléculas ou aumentar a estabilidade física do duplex formado entre as sequências de ácido nucléíco anti-sentido e sentido, por exemplo, derivados de fosforotioato e nucleotídeos acridina substituídos podem ser usados. Exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser usados para gerar as sequências de ácido nucléíco anti-sentido são bem conhecidos na técnica. As modificações nucieotídicas conhecidas incluem metílação, cíclização e 'caps' e substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, como inosina. Outras modificações de nucleotídeos são bem conhecidas na técnica. A sequência de ácido nucléíco anti-sentido pode ser produzida biologicamente utilizando-se um vetor de expressão no qual uma sequência de ácido nuclêíco foi selecionada em uma orientação anti-sentido (isto é, o RNA transcrito a partir do ácido nucíéico inserido terá uma orientação anti-sentido a um ácido nucíéico alvo de interesse). De preferência, a produção de sequências de ácido nucíéico anti-sentido em plantas ocorre por meio de uma construção de ácido nucíéico estavelmente integrada que compreende um promotor, um olígonucíeotldeo anti-sentido operacionalmente ligado, e um terminador.

As moléculas de ácido nucíéico usadas para silenciamento nos métodos da invenção (sejam introduzidas em uma planta ou geradas In situ) se hibridizam ou se ligam a transcrições de mRNA e/ou DNA genômíco que codifica um polipeptídeo para, desse modo, inibir a expressão da proteína, por exemplo, inibindo-se a transcrição e/ou translação. A hibridização pode ocorrer por nucleotídeo convencional complementar para formar um duplex estável, ou, por exemplo, no caso de uma sequência de ácido nucíéico anti-sentido que se liga a duplexes de DNA, através de interações especificas na ranhura principal da hélice dupla. As sequências de ácido nucíéico anti-sentido podem ser introduzidas em uma planta por transformação ou injeção direta em um sítio tecido-específico. Alternativamente, as sequências de ácido nucíéico anti-sentido podem ser modificadas em células alvo selecionadas e, então, sístemícamente administradas. Por exemplo, para uma administração sistêmica, as sequências de ácido nucíéico anti-sentido podem ser modificadas de tal modo que se liguem especificamente a receptores ou antígenos expressos em uma superfície celular selecionada, por exemplo, Itgando-se a sequência de ácido nucíéico anti-sentido aos peptídeos ou anticorpos que se ligam aos receptores ou antígenos de superfície celular. As sequências de ácido nucíéico anti-sentido também podem ser distribuídas a células utilizando-se os vetores descritos no presente documento.

De acordo com um aspecto adicional, a sequência de ácido nucléico aníí-sentido é uma sequência de ácido nucléico a-anomérica. Uma sequência de ácido nucféíco a-anomérica forma híbridos específicos de filamento dupfo com RNA complementar onde, ao contrário das b-unidades usuais, os filamentos se estendem em paralelo entre si (Gaultier et al. (1987) Nuci Ac Res 15: 6625-6641). A sequência de ácido nucléico anti-sentido também pode compreender um 2'-o-metil ribonucleotídeo (Inoue et al, (1987) Nuci Ac Res 15, 6131-6148) ou um análogo RNA-DNA quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330). A redução ou eliminação substancia! de expressão genética endógena também pode ser realizada utilizando-se ribozimas. As ribozimas são moléculas de RNA catalíticas com atividade de rtbonuclease que são capazes de clivar uma sequência de ácido nucléico de filamento único, tal como um mRNA, ao qual eles têm uma região complementar. Portanto, as ribozimas (por exemplo, ribozimas cabeça de martelo (descritas em Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) podem ser usadas para cíivar catalíticamente as transcrições de mRNA que codificam um potipeptideo, reduzindo, assim, substancialmente o número de transcrições de mRNA a serem transladadas em um polipeptídeo. Uma ribozima tendo especificidade para uma sequência de ácido nucléico pode ser projetada (vide, por exemplo: Cech et al. Patente U.S. No. 4.987,071; e Cech et al. Patente U.S. No. 5.116.742). Alternativamente, as transcrições de mRNA correspondentes a uma sequência de ácido nucléico podem ser usadas para selecionar um RNA catalítico tendo uma atividade de ribonuctease especifica a partir de um pool de moléculas de RNA (Bartel and Szostak (1993) Science 261, 1411-1418). G uso de ribozimas para siiencíamento genético em plantas é conhecido na técnica (por exemplo, Atkins et al. (1994) WO 94/00012; Lenne et al. (1995) WO 95/03404; Lutziger et al, (2000) WO 00/00619; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 e Scott et al. (1997) WO 97/38116). O silencíamento genético também pode ser aícançado por mutagênese de inserção (por exemplo, inserção de T-DNA ou inserção de transposão) ou por estratégias conforme descrito, dentre outros, por Angell e Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Ampiicon VIGS WO 98/36083), ou Baulcombe (WO 99/15682). O silencíamento genético também pode ocorrer se existir uma mutação em um gene endógeno e/ou uma mutação em um gene/ãcido nucléico isolado subsequentemente introduzido em uma planta. A redução ou eliminação substancial pode ser causada por um polipeptideo não-funcional. Por exemplo, o polipeptideo pode se ligar a várias proteínas de interação; uma ou mais mutações e/ou truncações podem, portanto, proporcionar um polipeptideo que ainda seja capaz de se ligar a proteínas de interação (como proteínas receptoras), porém, não podem exibir sua função normal (como um ligante de sinalização).

Uma abordagem adicional ao silencíamento genético ocorre direcionando-se as sequências de ácido nucléico complementares â região regulatória do gene (por exemplo, o promotor e/ou acentuadores) de modo a formar estruturas helicoidais triplas que evitam a transcrição do gene em células alvo. Vide Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene et ai., Ann. N.Y. Acad, Sei. 660, 27-36 1992; e Maher, LJ, Bioassays 14, 807-15, 1992.

Outros métodos, como o uso de anticorpos direcionados a um polipeptideo endógeno para inibir sua função em plantas, ou interferência no caminho de sinalização onde um polipeptideo está envolvido, serão bem conhecidos pelos indivíduos versados. Em particular, pode-se contemplar que moléculas produzidas pelo homem podem ser úteis para inibir a função biológica de um polipeptideo alvo, ou interferir o caminho de sinalização onde o polipeptideo alvo está envolvido.

Alternativamente, um programa de triagem pode ser configurado para identificar, em uma população vegetal, variantes naturais de um gene, sendo que essas variantes codificam polipeptídeos com atividade reduzida. Essas variantes naturais também podem ser usadas, por exemplo, para realizar uma recombinação homóloga.

Os mícroRMAs artificiais e/ou naturais (miRNAs) podem ser usados para neutralizar a expressão genética e/ou a translação de mRNA. Os miRNAs endógenos são pequenos RNAs de filamento único tendo , tipicamente, de 19 a 24 nucleotídeos de comprimento. Estes funcionam primariamente para regular a expressão genética e/ou a translação de mRNA. A maioria dos microRNAs (miRNAs) vegetais tem uma complementaridade perfeita ou quase perfeita com sua sequências alvo. No entanto, existem alvos naturais tendo até cinco incompatibilidades, Eles são processados a partir de RNAs de não-codificação longos com estruturas dobradas características por RNases específicas de filamento duplo da família Dicer. Mediante o processamento, estes são incorporados no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) ligando-se a seu componente principal, uma proteína Argonaute. Os MiRNAs servem como os componentes específicos de RISC, visto que são pareados em base aos ácidos nuciéícos alvo, principalmente mRNAs, no citoplasma. Os eventos regulatóríos subsequentes incluem divagem de mRNA alvo e destruição e/ou inibição translacionat. Os efeitos de super-expressão de míRNA são, portanto, geralmente refletidos em níveis reduzidos de mRNA de genes alvo.

Os microRNAs artificiais (amiRNAs), que têm tipicamente 21 nucleotídeos de comprimento, podem ser geneticamente modificados de modo específico para regular negativamente a expressão genética de um ou de múltiplos genes de interesse. Os determinantes de seleção alvo de micro RNA vegetal são bem conhecidos na técnica. Os parâmetros empíricos para reconhecimento alvo foram definidos e podem ser usados para auxiliar no projeto de amiRNAs específicos, (Schwab et ai., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). As ferramentas convenientes para projeto e geração de amiRNAs e seus precursores também se encontram disponíveis ao público (Schwab et a!., Plant Cell 18, 1121-1133, 2006).

Para um desempenho ótimo, as técnicas de silenciamento genético usadas para reduzir a expressão em uma planta de um gene endógeno requerem o uso de sequências de ácido nucléico provenientes de plantas monocotiledôneas para transformação de plantas monocotiiedôneas, e provenientes de plantas dicotííedôneas para transformação de plantas dicotiledôneas. De preferência, uma sequência de ácido nucléico proveniente de qualquer espécie vegetai determinada é introduzida na mesma espécie. Por exemplo, uma sequência de ácido nucléico proveniente do arroz é transformada em uma planta de arroz. No entanto, não é uma exigência absoluta que a sequência de ácido nucléico a ser introduzida se origine da mesma espécie vegetal da planta na qual a mesma será introduzida. É suficiente que exista uma homotogia substancial entre o gene alvo endógeno e o ácido nucléico a ser introduzido.

Acima, descreveram-se exemplos de vários métodos para a redução ou eliminação substancial de expressão em uma planta de um gene endógeno. üm indivíduo versado na técnica é prontamente capaz de adaptar os métodos supramencionados para silenciamento de modo a obter uma redução de expressão de um gene endógeno em uma planta completa ou em partes da mesma através do uso de um promotor apropriado, por exemplo.

Transformação O termo “introdução" ou “transformação” conforme referido no presente documento abrange a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método usado para transferir. O tecido vegetal capaz de propagação clonal subsequente, seja por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com uma construção genética da presente invenção e uma planta completa regenerada a partir do mesmo. O tecido particular escolhido irá variar dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis, e mais bem adequado, para as espécies particulares sendo transformadas. Exemplos de alvos de tecido incluem discos de folha, pólen, embriões, cotiíédons, hipocótilos, megagametófitos, tecido do caule, tecido meristemático existente (por exemplo, meristema aptcal, botões auxiliares, e meristemas de raiz), e o tecido meristema induzido (por exemplo, meristema de cotitédon e meristema de hipocótilos). O polinucleotídeo pode ser introduzido de modo transiente ou estável em uma célula hospedeira de pode ser mantido não-íntegrado, por exemplo. como um plasmídeo. Alternativamente, pode ser integrado no genoma hospedeiro. A célula vegetal transformada resultante pode, então, ser usada para regenerar uma planta transformada de maneira conhecida pelos indivíduos versados na técnica. Alternativamente, uma célula vegetal que não podería ser regenerada em uma planta pode ser escolhida como célula hospedeira, isto é, a célula vegetal transformada resultante não tem a capacidade de se regenerar em uma planta (completa), A transferência de genes estranhos no genoma de uma planta é denominada como transformação. A transformação de uma espécie vegetal consiste agora em uma técnica cfaramente de rotina. De modo vantajoso, qualquer entre vários métodos de transformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em uma célula ancestral adequada. Os métodos descritos para a transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais podem ser utilizados para transformação transiente ou estável. Os métodos de transformação incluem o uso de li posso m os, eletroporação, produtos químicos que aumentam livre absorção de DMA, injeção do DMA diretamente na pianta, bombardeamento de partículas, transformação utilizando-se vírus ou pólen e microprojeção. Os métodos podem ser selecionados a partir do método de cálcio/polietileno glicol para protoplastos (Krens, F.A. et al,, (1982) Nature 296, 72-74; Negrutíu I et ai. (1987) Plant Mal Biol 8: 363-373); eletroporação de protoplastos (Shiliito R.D, et aí. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinjeção em material vegetal (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeamento de partículas revestidas por DNA ou RNA (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infecção com vírus (não-integrativos) e similares. As plantas transgênicas, que incluem vegetais de colheita transgênico, são preferencialmente produzidas através de uma transformação mediada por Agrobacteríum. Um método de transformação vantajoso é a transformação em planta. Neste sentido, é possível, por exemplo, permitir que a agrobactéria atue sobre as sementes ou inoculem o meristema vegetal com a agrobactéria. De modo partícularmente adequado, de acordo com a invenção, provou-se permitir que uma suspensão de agrobactérias transformadas atue sobre a planta intacta ou peio menos no primórdio da flor. A planta é subsequentemente desenvolvida até que as sementes da planta tratada sejam obtidas (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Os métodos para transformação mediada por Agrobacteríum de arroz incluem métodos bem conhecidos para transformação de arroz, tal como aqueles descritos em qualquer um dos seguintes: pedido de patente europeu EP 1198985 A1, Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), estando estas descrições aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência. No caso de transformação de milho, o método preferencial é conforme descrito em Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) ou Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), estando estas descrições aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência. Os ditos métodos são adicionaimente descritos a título de exemplos em B. Jenes et a!., Techniques for Gene Transfer, in; Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and ütílization, eds. S.D, Kung and R. Wu, Academtc Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu, Rev. Ptant Physiol. Plant Moiec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucléicos ou a construção a ser expressa são preferencialmente clonados em um vetor, que seja adequado para transformação de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo, pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). A agrobactéria transformada por tal vetor pode, então, ser usada de maneira conhecida para a transformação de plantas, tais como as plantas usadas como um modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaüana se encontra no escopo da presente invenção não considerada como uma planta de colheita), ou plantas de colheita como, a título de exemplos, plantas de tabaco, por exemplo, imergindo-se folhas machucadas ou folhas cortadas em uma solução agrobacteriana e os submetendo à cultura em um meio adequado. A transformação de plantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hôfgen and Willmítzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecido entre outros a partir de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Hígher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Uíiiizatíon, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academíc Press, 1993, pp. 15-38.

Além da transformação de células somáticas, que, então, precisam ser regeneradas em plantas intactas, também é possível transformar as células de meristemas vegetais e, em particular, aquelas células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados seguem o desenvolvimento vegetal natural, produzindo plantas transgênicas. Portanto, por exemplo, as sementes de Arabidopsis são tratadas com agrobactérias e as sementes são obtidas a partir de plantas em desenvolvimento nas quais uma determinada proporção é transformada e, portanto, transgênica [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:1-9; Feldmann K (1992). in: C

Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientlfic, Singapura, pp. 274-289], Os métodos alternativos se baseiam na remoção repetida de inflorescências e incubação do sítio de exctsâo no centro da roseta com agrobactérias transformadas, deste modo, as sementes transformadas podem ser obtidas em um ponto de tempo posterior (Chang (1994). Ptant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). No entanto, um método especial mente efetivo é o método de infiltração a vácuo com suas modificações, como o método de “mergulho floral”. No caso de infiltração a vácuo de Arabidopsis, as plantas intactas sob pressão reduzida são tratadas com uma suspensão agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sei Paris Life Sei, 316: 1194-1199], enquanto no caso do método de “mergulho floral”, o tecido floral em desenvolvimento é brevemente incubado com uma suspensão agrobacteriana tratada com tensoativos [Clough, SJ and Bent AF (1998) The Piant J. 16, 735-743], Uma determinada proporção de sementes transgênicas é colhida em ambos os casos, e estas sementes podem ser distinguidas das sementes não-transgênicas desenvolvendo-se sob as condições seletivas descritas anteriormente. Além da transformação estável de ptastídeos apresentar vantagens pelo fato de os plasíídeos serem maternalmente herdados, os mesmo reduzem ou eliminam os riscos em colheitas de fluxo transgenético através de pólen. A transformação do genoma de clcroplasto é genericamente alcançada por um processo que foi esquematicamente exibido em Kiaus et al., 2004 fNature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Brevemente, as sequências a serem transformadas são clonadas junto a um gene marcador selecionãvel entre as sequências de fianqueamento homólogas ao genoma de cioroplasto. Estas sequências de fianqueamento homólogas direcionam a integração sítio-específica no plastoma. A transformação plastidal foi descrita em relação a muitas espécies vegetais diferentes e uma visão geral é dada em Bock (2001) Transgenic plastids ín basic research and plant biotechnology. J Mol Biol, 21 de setembro de 2001; 312 (3):425-38 ou Maliga, P (2003) Progress towards commercialízation of ptastid transformation technoiogy, Trends Biotechnol. 21, 20-28. Um progresso biotecnológico adicional foi recentemente reportado sob a forma de transformantes de pfastídeos isentos de marcadores, que podem ser produzidos por um gene marcador co-integrado transiente (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

As células vegetais geneticamente modificadas podem ser regeneradas através de todos os métodos com os quais os indivíduos versados estão familiarizados. Os métodos adequados podem ser encontrados nas publicações supra mencionadas por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hõfgen e Willmitzer. Alternativamente, as células vegetais geneticamente modificadas são não-regeneráveis em uma planta completa.

Em geral, após a transformação, as células vegetais ou grupamentos celulares são selecionados pela presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes expressíveis em plantas co-transferidos com o gene de interesse, depois disso o material transformado é regenerado em uma planta completa. Com o intuito de selecionar as plantas transformadas, o material vegetal obtido na transformação é, em via de regra, submetido a condições seletivas de tal modo que as plantas transformadas possam ser distinguidas das plantas nâo-transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas da maneira descrita anteriormente podem ser plantadas e, após um período de crescimento inicial, submetidas a uma seleção adequada por aspersão. Uma possibilidade adicional consiste no crescimento das sementes, se apropriado após a esterilização, em placas de agar utilizando-se um agente de seleção adequado de tal modo que apenas as sementes transformadas possam se desenvolver em plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são submetidas à triagem para determinação da presença de um marcador selecionável, tais como aqueles descritos no presente documento.

Após a transferência e regeneração de DNA, as plantas presumidamente transformadas também podem ser avaliadas, por exemplo, utilizando-se uma análise Southern, para determinação da presença do gene de interesse, número de cópia e/ou organização genômica. Alternativa ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recentemente introduzido podem ser monitorados utilizando-se análises Northern e/ou Western, sendo que ambas as técnicas são conhecidas pelos indivíduos versados na técnica.

As plantas transformadas geradas podem ser propagadas através de uma variedade de meios, tal como propagação clonal ou técnicas de procriação clássicas. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou T1) pode se auto-reproduzir e os transformantes homozigotos de segunda geração (ou T2) selecionados, e as plantas T2 podem, então, ser propagadas através de técnicas de procriação clássicas. Os organismos transformados gerados podem assumir uma variedade de formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e células não-transformadas; transformantes clonaís (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não-transformados (por exemplo, em plantas, um rizoma transformado enxertado em um descendente não-transformado).

Ao longo deste pedido, uma planta, parte de planta, semente ou célula vegetal transformada com - ou transformada de modo intercambiável por - uma construção ou transformada com ou através de um ácido nucléico deve ser compreendida como significando uma planta, parte de planta, semente ou célula vegetal que carrega a dita construção ou ácido nucléico como um transgene devido ao resultado de uma introdução desta constrição ou deste ácido nucléico por meios biotecnológicos. A planta, parte de planta, semente ou célula vegetal compreendem, portanto, esta construção recombinante ou este ácido nucléico recombínante.

Direcionamento por ativação de T-DNA O direcionamento por ativação de T-DNA (Hayashí et aí. Science (1992) 1350-1353), envolve a inserção de T-DNA, geralmente contendo um promotor (também pode ser um acentuador de transíação ou um intron), na região genômica do gene de interesse de 10 kb em diante - ou a jusante da região de codificação de um gene em uma configuração de tal modo que o promotor direcione a expressão do gene direcionado. Tipicamente, a regulação da expressão do gene direcionado por seu promotor natural é interrompida e o gene fica sob controle do promotor recentemente introduzido. O promotor é tipicamente embutido em um T-DNA. Este T-DNA é aleatoriamente inserido no genoma vegetal, por exemplo, através de infecção de Agrobacterium e leva â expressão modificada de genes próximos ao T-DNA inserido. As plantas transgênicas resultantes mostram fenótipos dominantes devido á expressão modificada de genes próximos ao promotor introduzido.

TILLING O termo “TILLING” é uma abreviação de “Segmentação Induzida por Lesões Locais em Genomas” e se refere a uma tecnologia de mutagênese útil para gerar e/ou identificar os ácidos nucléicos que codificam proteínas com expressão e/ou atividade modificada. A TILLING também permite a seleção de plantas que realizam tais variantes mutantes. Estas variantes mutantes podem exibir uma expressão modificada, seja em resistência, em local, ou em temporização (se as mutações afetarem o promotor, por exemplo). Estas variantes mutantes podem exibir uma atividade maior que aquela exibida pelo gene em sua forma natural. A TILLING combina a mutagênese de alta densidade com métodos de triagem de alto rendimento. As etapas tipicamente seguidas em TILLING são: (a) mutagênese EMS (Redei GP e Koncz C (1992) In Methods ίη Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schelt J, eds. Singapore, World Scientifíc Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) In J Maríinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) preparação de DNA e combinação de indivíduos; (c) amplificação de PCR de uma região de interesse; (d) desnaturação e têmpera para permitir a formação de heteroduplexes; (e) DHPLC, onde a presença de um heteroduplex em um pool é detectada como um pico extra no cromatograma; (f) identificação do mutante individual; e (g) seqüenciamento do produto de PCR mutante. Os métodos para TILLING são bem conhecidos na técnica (McCalIum et ai., (2000) Nat Biotechno! 18: 455-457; revisado por Stempie (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA A recombinação homóloga permite a introdução em um genoma de um ácido nucléico selecionado em uma posição selecionada definida. A recombinação homóloga é uma tecnologia padrão usada rotineiramente em ciências biológicas para organismos inferiores, como levedura ou o musgo Physcomitrella, Os métodos para realização de uma recombinação homóloga em plantas foram descritos não apenas para modelos vegetais (Offrínga et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) mas também para plantas de colheita, por exemplo, arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8), e existem abordagens que são genericamente aplicáveis independentemente do organismo alvo (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

CARACTERÍSTICA(S) RELAClONADAfS) AO RENDIMENTO

Uma “característica relacionada ao rendimento" é uma característica ou recurso que seja relacionado ao rendimento vegetai. As características relacionadas ao rendimento podem compreender um ou mais da seguinte lista não limitativa de recursos: período de florescimento precoce, rendimento, biomassa, rendimento de sementes, vigor precoce, índice de verdor, taxa de crescimento, características agronômicas como, por exemplo, tolerância à submersão (que resulta em rendimento aumentado em arroz), Eficiência de Uso da Água (WUE), Eficiência de Uso de Nitrogênio (NUE), etc.

Deve-se compreender que o termo "uma ou mais características relacionadas ao rendimento” se refere a uma característica relacionada ao rendimento, ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis ou sete ou oito ou nove ou dez, ou mais de dez características relacionadas ao rendimento de uma planta comparada a uma planta de controle. A referência aqui a uma “característica aprimorada relacionada ao rendimento” pretende significar um aumento em relação a plantas de controle em uma característica relacionada ao rendimento, por exemplo, em vigor precoce e/ou em biomassa, de uma planta inteira ou de uma ou mais partes de uma planta, que pode incluir (i) partes acima do solo, de preferência, partes coiheitáveís acima do solo, e/ou (ii) partes abaixo do solo, de preferência, partes coiheitáveís abaixo do soio.

Em particular, essas partes coiheitáveís são raízes, tais como raízes principais, caules, beterrabas, túberos, folhas, flores ou sementes.

Ao longo do presente pedido, a tolerância e/ou resistência a um ou mais agroquímicos por uma planta, por exemplo, tolerância a herbicida, não é considerada uma característica relacionada ao rendimento dentro do significado desse termo do presente pedido. Uma tolerância e ou resistência alterada a um ou mais agroquímicos por uma planta, por exemplo, tolerância a herbicida aprimorada, não é uma “característica aprimorada relacionada ao rendimento" como usado ao longo desse pedido.

Em uma reafização particular da presente invenção, qualquer referência a uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento se destina a excluir a restauração da expressão e/ou atividade do polipeptídeo FOI em uma planta em que a expressão e/ou a atividade do polipeptídeo ΡΟΙ foi reduzida ou desabilítada quando comparado com a planta de ocorrência natural original ou variedade original Por exemplo, a superexpressão do polipeptídeo POI em uma variedade mutante inativa de uma planta, em que o dito polipeptídeo POI ou um ortólogo ou paróiogo foi inativado não é considerado com acentuando uma ou mais características relacionadas ao rendimento dentro do significado da presente invenção.

Rendimento O termo “rendimento” significa, em geral, um produto mensurável de valor econômico, tipicamente relacionado a uma colheita específica, a uma área, e a um período de tempo. As partes de plantas individuais contribuem diretamente para o rendimento com base em seu número, tamanho e/ou peso, ou o rendimento real é o rendimento por metro quadrado para uma colheita ao ano, que é determinada dividindo-se a produção total (incluo tanto a produção colhida como a produção avaliada) por metros quadrados plantados.

Os termos “rendimento de uma planta” e “rendimento de planta” são usados aqui de forma íntercambiávei e se referem à biomassa vegetativa como biomassa de raízes e/ou galhos, aos órgãos reprodutores, e/ou a propágulos como sementes de tal planta.

As flores no milho são uníssexuais; inflorescências macho (franjas) se originam do caule apical e as inflorescências femininas (espigas) surgem a partir de ápices de broto auxiliar. A infiorescência feminina produz pares de espiguetas sobre a superfície de um eixo central (sabugo). Cada espigueta feminina encerra dois flósculos férteis, um desses geralmente será desenvolvido em um grão de milho uma vez fertilizado. Então, um aumento do rendimento pode ser manifestado como um dos seguintes: aumento no número de plantas estabelecidas por metro quadrado, um aumento no número de espigas por planta, um aumento no número de fileiras, número de grãos por fileira, peso dos grãos, peso de mil grãos, comprimento/diâmetro da espiga, aumento na taxa de preenchimento de sementes que é o número de sementes preenchidas pelo número total de sementes e multiplicado por 100, dentre outros.

As inflorescências em plantas de arroz são denominadas panículas. A panícuta contém espiguetas, que são as unidades básicas das panículas, e que consistem em um pediceto e um flósculo. O flósculo é sustentado sobre o pedicelo e inclui uma flor que é coberta por duas glumas protetoras: uma gluma grande (a lema) e uma gluma mais curta (a pálea). Então, adotando-se o arroz como exemplo, um aumento do rendimento pode se manifestar como um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por metro quadrado, número de panículas por planta, comprimento de panícula, número de espículas por panícula, número de flores (floretes) por panícula, aumento na taxa de preenchimento de sementes que é o número de floretes preenchidos e multiplicados por 100, um aumento em peso de mil grãos, dentre outros.

Tempo de florescimento precoce As plantas com um “tempo de florescimento precoce” como usado aqui são plantas que começam a florescer antes das plantas de controle. Então, esse termo se refere a plantas que mostram um início precoce de florescimento. O tempo de florescimento de plantas pode ser avaliado ao contar o número de dias (“tempo para florescer”) entre a semeação e a emergência de uma primeira inflorescência. O “tempo de florescimento” de uma planta pode ser determinado, por exemplo, utilizando o método como descrito em WO 2007/093444.

Vigor precoce O termo “vigor precoce” refere-se ao crescimento bem equilibrado saudável ativo especialmente durante os estágios precoces do crescimento da planta, e pode resultar da adaptação aumentada da planta devido, por exemplo, às plantas estarem mais bem adaptadas a seu ambiente (isto é, otimizar o uso de recursos de energia e o particionamento entre os galhos e as raizes). As plantas que têm um vigor precoce também mostram uma sobrevivência aumentada de mudas e um melhor estabelecimento da colheita, que geralmente resulta em campos altamente uniformes (com o crescimento da colheita de maneira uniforme, isto é, com a maioria das plantas alcançando os vários estágios de desenvolvimento substancialmente ao mesmo tempo), e um rendimento ainda melhor e maior. Portanto, um vigor aumentado pode ser determinado medindo-se vários fatores, tal como peso em mil grãos, germinação percentual, emergência percentual, crescimento das mudas, altura das mudas, comprimento das raízes, biomassa das raizes e galhos e muitos outros.

Taxa de crescimento aumentada A taxa de crescimento aumentada pode ser específica a uma ou mais partes de uma planta (incluindo sementes) ou pode ser por substancialmente toda a planta. As plantas que têm uma taxa de crescimento aumentada podem ter um ciclo de vida mais curto, O ciclo de vida de uma planta pode ser tomado para significar o tempo necessário para crescer de uma semente madura até o estágio em que a planta tenha produzido sementes maduras similares ao material iniciai. Esse ciclo de vida pode ser influenciado por fatores tais como a velocidade de germinação, vigor precoce, taxa de crescimento, índice de verdor, tempo de floração e velocidade de maturação de semente. O aumento na taxa de crescimento pode ocorrer em um ou mais estágios no ciclo de vida de uma planta ou durante substancialmente o ciclo de vida de planta inteiro. A taxa de crescimento aumentada durante os estágios iniciais no cicio de vida de uma planta pode refletir o vigor elevado. O aumento na taxa de crescimento pode alterar o ciclo de colheita de uma planta permitindo que as plantas sejam semeadas mais tarde e/ou colhidas mais cedo do que seria possível de outra forma (um efeito similar pode ser obtido com o tempo de floração mais cedo). Se a taxa de crescimento for suficientemente aumentada, a mesma pode permitir a semeadura adicional de sementes da mesma espécie de planta (por exemplo, semeadura e colheita de plantas de arroz seguidas pela semeadura e colheita de plantas de arroz adicionais tudo dentro de um período de crescimento convencional). Similarmente, se a taxa de crescimento for suficientemente aumentada, a mesma pode permitir a semeadura adicional de sementes de diferentes espécies de plantas (por exemplo, semeadura e colheita de plantas de milho seguidas, por exemplo, pela semeadura e colheita opcional de soja, batata ou qualquer outra planta adequada). Os tempos adicionais de colheita do mesmo talo de raiz no caso das mesmas plantas de cultura podem também ser possíveis. Alterar o ciclo de colheita de uma planta pode levar a um aumento na produção de biomassa por metro quadrado (devido a um aumento no número de vezes (diga-se em um ano) que qualquer planta em particular pode ser crescida e colhida). Um aumento da taxa de crescimento pode também permitir a cultivação de plantas transgênicas em uma área geográfica maior que suas contrapartes do tipo selvagem, como as limitações territoriais para crescer uma colheita são determinadas por condições ambientais contrarias ou no momento da plantação (início de temporada) ou no momento da colheita (final de temporada). Tais condições adversas podem ser evitadas se o ciclo de colheita for encurtado. A taxa de crescimento pode ser determinada derivando-se vários parâmetros das curvas de crescimento, tais parâmetros podem ser: T-Mid (o tempo tomado para que as plantas alcancem 50% de seu tamanho máximo) e T-90 (tempo tomado para que as plantas alcancem 90% de seu tamanho máximo), dentre outros.

Resistência ao estresse Um aumento na taxa de rendimento e/ou crescimento ocorre se a planta estiver sob condições de não estresse ou se a planta for exposta a diversos estresses comparado ás plantas de controle. As plantas respondem tipicamente à exposição ao estresse ao crescer mais lentamente. Em condições de estresse severo, a planta ainda pode interromper totalmente o crescimento. O estresse moderado, por outro lado, é definido, no presente documento, como qualquer estresse ao qual uma planta é exposta que não resulte na cessação total do crescimento da planta sem a capacidade de retomar o crescimento. O estresse moderado, no sentido da invenção, leva a uma redução no crescimento das plantas estressadas menor que 40%, 35%, 30% ou 25%, mais preferencialmente, menor que 20% ou 15%, em comparação à planta de controie sob condições de não estresse. Devido aos avanços nas práticas agrícolas (irrigação, fertilização, tratamentos com pesticida) estresses severos não são muitas vezes encontrados nas plantas de cultivo cultivadas. Como uma consequência, o crescimento comprometido induzido pelo estresse moderado muitas vezes é um recurso indesejável para a agricultura. “Estresse abiótico” é entendido como um impacto negativo feito a plantas por outros organismos vivos, tais como bactérias, vírus, fungos, nematódeos, insetos, outros animais ou plantas. "Estresses abióticos" são tipicamente aqueles estresses causados por patógenos, tais como bactérias, vírus, fungos, plantas, nematódeos e insertos, ou outros animais, que podem resultar em efeitos negativos sobre o crescimento e/ou rendimento das plantas. “Estresse abiótico” é entendido como um impacto negativo de fatores não-vivos sobre a planta viva em um ambiente específico. Os estresses abíóticos ou estresses ambientais podem ocorrer devido à seca ou água em excesso, estresse anaeròbico, estresse salino, toxicidade química, estresse oxidativo e temperaturas quentes, frias ou de congelamento. O "estresse abiótico" pode ser um estresse osmótico causado por um estresse de água, por exemplo, devido à aridez, estresse salino, ou estresse por congelamento. O estresse abiótico também pode ser um estresse oxidativo ou um estresse ao frio. O “estresse ao congelamento” é destinado a se referir ao estresse devido a temperaturas congelantes, isto é, temperaturas nas quais as moléculas de água disponíveis congelam e se transformam em gelo. O “estresse ao frio" também denominado como "estresse de resfriamento", é destinado a se referir a temperaturas frias, por exemplo, temperaturas abaixo de 10°, ou, de preferência, abaixo de 5°C, porém, na qual as moléculas de água não congelam. Conforme relatado em Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14), o estresse abiótico leva a uma série de alterações morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e moleculares que afetam adversamente o crescimento e produtividade da planta. A seca, salinidade, temperaturas extremas e o estresse são conhecidos por serem interconectados e poder induzir o crescimento de dano celular através de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) descreve um grau particularmente alto de “linha cruzada" entre o estresse hídrico e o estresse de alta salinidade. Por exemplo, seca e/ou safínização se manifestam primeiramente como estresse osmótico, resultando- na interrupção da homeostase e a distribuição de íon na célula. O estresse oxidativo, que frequentemente acompanha a alta ou baixa temperatura, salinidade ou estresse hídrico, pode causar a desnaturação de proteínas funcionais e estruturais. Como uma consequência, estes estresses ambientais diversos, muitas vezes, ativam vias de sinalização de célula similares e respostas celulares, tal como, a produção de proteínas de estresse, regulação ascendente de antioxid antes, acúmulo de soiutos compatíveis e parada de crescimento. O termo condições de “não estresse”, conforme o uso em questão, são aquelas condições ambientais que permitem o crescimento ótimo das plantas. As pessoas versadas na técnica estão cientes das condições de solo e condições climáticas normais para um determinado iocal. As plantas com condições de crescimento ótimo, (crescimento sob condições de não estresse) produzem, tipicamente, em ordem crescente de preferência, ao menos 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% ou 75% da produção média de tal planta em um determinado ambiente. A produção média pode ser calculada com base na colheita e/ou estação. As pessoas versadas na técnica estão cientes das produções de rendimento médio de uma colheita.

Aumento/Aprimoramento/Acentuacão Os termos "aumentar”, “aprimorar” ou "acentuar" no contexto de uma característica relacionada ao rendimento são intercambiáveis e devem significar, no sentido do pedido, ao menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%, de preferência, ao menos 15% ou 20%, mais preferencialmente 25%, 30%, 35% ou 40% de aumento na(s) característíca(s) reiacionada(s) ao rendimento (tais como, mas sem limitar-se a, mais rendimento e/ou crescimento) em comparação às plantas de controle, conforme definido no presente documento.

Rendimento de Sementes O rendimento de semente aumento pode se manifestar como um ou mais entre o seguinte: a) um aumento na biomassa da semente (peso de semente total) que pode ser em uma base de semente individual e/ou por planta e/ou por metro quadrado; b) número aumentado de flores por planta; c) número aumentado de sementes; d) taxa de preenchimento de semente aumentada (que é expressa como a razão entre o número de fioretes preenchidos dividido pelo número total de floretes); e) índice de colheita aumentado, que é expresso como uma razão do rendimento das partes colheitáveis, tais como sementes, dividido pela biomassa de partes vegetais acima do solo; e f) peso de mil grãos aumentado (TKW), que é extrapolado do número de sementes contado e seu peso total, Um TKW aumentado pode resultar de um tamanho de semente e/ou peso de semente aumentado, e também pode resultar de um aumento no tamanho do embrião e/ou endosperma, Os termos “floretes preenchidos” e “sementes preenchidas” podem ser considerados sinônimos.

Um aumento no rendimento de semente também pode se manifestar como um aumento no tamanho de semente e/ou volume de semente. Além disso, um aumento no rendimento de semente também pode se manifestar como um aumento na área de semente e/ou comprimento de semente e/ou largura de semente e/ou perímetro de semente.

iNOrçimViRDOR O “índice de verdor”, conforme o uso em questão, é calculado a partir de imagens digitais de plantas. Para cada pixel que pertence ao objeto da planta na imagem, a razão do valor verde versus o valor vermelho (no modelo RGB para codificar a cor) é calculada. O índice de vegetação é expresso como a porcentagem de pixels na qual a razão entre verde e vermelho excede um determinado fimite. Sob condições de crescimento normais, sob condições de crescimento de estresse salino, e sob condições de crescimento de disponibilidade de nutriente reduzida, o índice de vegetação das plantas é medido na última formação de imagem antes da fioração. Em contrapartida, sob condições de crescimento de estresse hídrico, o índice de vegetação de plantas é medido na primeira formação de imagem após a seca.

Biomassa O termo “biomassa” como usado aqui pretende se referir ao peso total de uma planta ou parte da planta. O peso total pode ser medido como peso seco, peso fresco ou peso úmido. Dentro da definição de biomassa, uma distinção pode ser feita entre a biomassa de uma ou mais partes de uma planta, que podem incluir qualquer um ou mais dos seguintes: - partes acima do solo como, porém sem caráter limitativo, biomassa de brotos, biomassa de sementes, biomassa de folhas, etc.; - partes acima do solo coiheitáveís como, porém sem caráter limitativo, biomassa de brotos, biomassa de sementes, biomassa de folhas, biomassa de caule, mudas etc.; - partes abaixo do solo como, porém sem caráter limitativo, biomassa de raiz, tubérculos, bulbos, etc.; - partes abaixo do solo coiheitáveís como, porém sem caráter limitativo, biomassa de raiz, tubérculos, bulbos, etc - partes coiheitáveís parcialmente subterrâneas como, porém sem caráter limitativo, beterrabas e outras áreas de hipocótilo, rizomas, estolhos ou rizomas rastejantes; - biomassa vegetativa como biomassa de raiz, biomassa de broto, etc.; - órgãos reprodutivos; e - propágulos como semente.

Em uma realização preferencial ao longo desse pedido, qualquer referência à “raíz“ como biomassa ou partes coiheitáveís ou como órgão, por exemplo, de teor de açúcar aumentado, será entendida como uma referência a partes coiheitáveís parcialmente inseridas ou em contato físico com o solo, tal como, mas sem limitar-se a, beterrabas e outras áreas de hipocótilo de uma planta, rizomas, estolhos ou rizomas rastejantes, mas não incluindo folhas, bem como partes colheitáveis abaixo do solo, tal como, mas sem limitar-se a, raiz principal, tubérculos ou bulbos.

Em outra realização, as partes acima do solo ou as partes colheitáveis acima do solo ou biomassa acima do solo devem ser compreendidas como uma biomassa vegetativa acima do solo não incluindo sementes e/ou frutos.

Reprodução assistida por marcadores Tais programas de reprodução, algumas vezes, requerem a introdução de variação aléfica através do tratamento mutagênico das plantas, que usam, por exemplo, mutagênese EMS; de maneira alternativa, o programa pode começar com uma coleta de variantes aléücas de autodenominada origem “natural” causadas de maneira não intencional. A identificação de variantes alélicas, então, ocorre, por exemplo, através de PCR. Esta é seguida por uma etapa para seleção de variantes alélicas superiores da sequência em questão e que fornece rendimento aumentado. A seleção é tipicamente realizada monitorando-se o desempenho de crescimento de plantas que contêm variantes alélicas diferentes da sequência em questão. O desempenho de crescimento pode ser monitorado em uma estufa ou no campo. As etapas opcionais adicionais incluem cruzar as plantas em que a variante alélica superior foi identificada em outra planta. Isto pode ser usado, por exemplo, para efetuar uma combinação de características fenotípicas interessantes.

Uso COMO SONDAS EM (MAPEAMENTO PE GENE) O uso de ácidos nucléicos que codifica a proteína de interesse para mapear genética e fisicamente os genes requer apenas uma sequência de ácido nucléico de ao menos 15 nucleotídeos de comprimento. Estes ácidos nucléicos podem ser usados como marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP). Southern blots (Sambrook J, Fritsch EF e Maniafis T (1989) Molecular Ciontng, A Laboratory Manual) de DMA genômico de planta de digestão de restrição podem ser sondados com os ácidos nucléicos que codificam a proteína de interesse. Os padrões de união resultantes podem, então, ser submetidos à análise genética que usa programas de computador, tal como, MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181), a fim de construir um mapa genético. Além disso, os ácidos nucléicos podem ser usados para sondar Southern blots que contêm DNAs genõmicos tratados por endonuclease de restrição de um conjunto de indivíduos que representam pais e descendentes de um cruzamento genético definido. A segregação dos polímorfismos de DNA é notada e usada para calcular a posição do ácido nucféico que codifica a proteína de interesse no mapa genético previamente obtido usando esta população (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331). A produção e o uso de sondas derivadas de gene de planta para uso no mapeamento genético são descritos em Bernatzky and Tanksley (1988) Plant Mol. Biol. Repórter 4: 37-41. Inúmeras publicações descrevem o mapeamento genético de clones de cDNA específicos que usam a metodologia delineada acima ou variações desta. Por exemplo, F2 populações cruzadas, populações retrocruzadas, populações aleatoriamente casadas, linhas isogênicas próximas, e outros conjuntos de indivíduos podem ser usados para o mapeamento. Tais metodologias são bem conhecidas para aqueles versados na técnica.

As sondas de ácido nucléico também podem ser usadas para o mapeamento físico (isto é, colocação de sequências nos mapas físicos; vide Hoheisef et aí. Em: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-348, e referências citadas neste).

Em outra realização, as sondas de ácido nucléico podem ser usadas no mapeamento de hibridlzação in sítu por fluorescência direta (FiSH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Embora os métodos atuais de mapeamento FISH favoreçam o uso de clones grandes (alguns kbs a algumas centenas de kb; vide Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), os aprimoramentos na sensibilidade podem permitir o desempenho de mapeamento FISH usando sondas mais curtas.

Uma variedade de métodos baseados em amplificação de ácido nucléico para mapeamento genético e físico pode ser realizada usando os ácidos nucléicos. Os exemplos incluem amplificação aielo-específica (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligação aleio-específica (Landegren et ai. (1988) Science 241:1077-1080), reações de extensão de nucleotídeo (Sokolov (1990) Ácido nucléico Res. 18:3671), Mapeamento de Híbridos por Radiação (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) e Happy Mapping (Dear and Cook (1989) Nucleic Acids Res. 17:6795-6807). Para estes métodos, a sequência de um ácido nucléico é usada projetar e produzir pares íniciadores para uso na reação de amplificação ou em reações de extensão iníciadoras. O projeto de tais íniciadores é bem conhecido por aqueles versados na técnica. Nos métodos que empregam mapeamento genético baseado em PCR, pode ser necessário identificar as diferenças de sequência de DNA entre os pais do cruzamento de mapeamento na região que corresponde à sequência de ácido nucléico instantânea. Entretanto, isto geralmente não é necessário para os métodos de mapeamento.

Planta O termo “planta" conforme o uso em questão abrange plantas completas, ancestrais e descendentes das plantas e partes de plantas, incluindo sementes, falhos, caules, folhas, raízes (incluindo túberos), flores, e tecidos e órgãos, sendo que cada um desses mencionados acima compreendem o gene/ácido nucléíco de interesse. O termo “planta” também abrange as células vegetais, as culturas de suspensão, o tecido caloso, os embriões, as regiões meristemáticas, os gametófitos, os esporófitos, o pólen e os micrósporos, sendo que cada um desses mencionados acima compreendem o gene/ácido nucléíco de interesse.

As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todos as plantas que pertencem à superfamíiia Virídiplantae, em particular, plantas monocotiiedôneas e dicotiledôneas que incluem forragem ou legumes de forragem, plantas ornamentais, agriculturas, árvores ou arbustos selecionados a partir da lista que compreende Acer spp., Actinidia spp., Abeimoschus spp., Agave sisaiana, Agropyron spp., Agrostís stolonifera, Aliium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, A veria spp. (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrída), Averrhoa carambola, Bambusa spBenincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vuigaris, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza de semente oleaginosa, nabo]), Cadaba farínosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctoríus, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichoríum endivia, Cinnamomum spp., Citruilus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia escuienta, Coia spp,, Corchorus sp,, Coriandrum sativum, Coryíus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus iongan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochioa spp., Elaeis (por exemplo, Elaeis guineensis, Eiaeis oleifera), Efeusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia unifiora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus caríca, Fortune Ha spp., Fragaria spp., Ginkgo bifoba, Glycine spp. (por exemplo, G/ycine max, Soja hispida ou Soja max) Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por exemplo, Helianthus annuus). Hemerocailis fu Iva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Línum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangufa, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon escufentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Maipighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Meliiotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza iatifolia), Panicum mihaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroseiinum crispum, Ph a Ia ris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites austrafis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psídium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Saiix sp,, Sambucus spp., Secale cereaie, Sesamum spp., Sínapis sp., Soianum spp. (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum ou Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp.. Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp . dentre outros.

EkMlMslmcoMROLE A escolha de plantas de controle adequadas é uma parte de rotina de uma configuração experimental e pode incluir plantas de tipo selvagem correspondentes ou plantas correspondentes sem o gene de interesse. A planta de controle é tipicamente da mesma espécie de planta ou até mesmo da mesma variedade que a planta a ser avaliada. A planta de controle pode também se um nulizigoto da planta a ser avaliada. Os nulízigotos (ou plantas de controle nulo) são indivíduos que não têm o transgene por segregação. Ademais, as plantas de controle se desenvolvem sob condições de crescimento iguais às condições de crescimento das plantas da invenção, ou seja, nos arredores de, e simultaneamente com, as plantas da invenção. Uma “planta de controle" conforme o uso em questão refere-se não só a plantas inteiras, mas também a partes de plantas, incluindo sementes e partes de sementes.

Material de propagacão/Propágulo O “material de propagação” ou “propáguto” é qualquer tipo de órgão, tecido, ou célula de uma planta capaz de se desenvolver em uma planta completa. O “material de propagação" pode se basear na reprodução vegetativa {também conhecida como propagação vegetativa, multiplicação vegetatíva, ou clonagem vegetativa) ou reprodução sexual. Portanto, o material de propagação pode ser sementes ou partes dos órgãos não-reprodutores, como caule ou folha. Em particular, em relação a Poaceae, o material de propagação adequado também pode ser seções do caule, ou seja, incisões de caule (como mudas).

Talo Um “talo” é o caule de uma planta pertencente à família das Poaceae, e também é conhecido como “colmos industriaiizáveís”. No contexto de Poaceae, o “talo”, “caule”, “broto", ou “rebento” são usados de modo intercambiável.

Mmà Uma “muda” é uma seção do caule de uma planta da família das Poaceae, que seja adequada para uso como um material de propagação. As expressões sinônimas a “muda” são "semente de cana”, “Incisão de caule", “seção do talo”, e “pedaço de semente”, PESCRtcÃo das Figuras A presente invenção será descrita agora com referência às figuras a seguir, onde: A Figura 1 representa a estrutura de domínio de SEQ IO NO: 2 com motivos conservados. Os motivos 1 a 4 são indicados por linhas tracejadas abaixo da sequência (números arábicos denotam o número de motivo). A Figura 2 representa um alinhamento múltiplo de vários polipeptídeos PMP conforme fornecido na Tabela A utilizando-se ClustafW (versão 2.0.11). Os asteriscos indicam os aminoácidos idênticos selecionados dentre as várias sequências de proteína. Esses alinhamentos podem ser usados para definir outros motivos ou sequências de assinatura, ao usar aminoácidos conservados. A Figura 3 mostra uma árvore filogenética de polipeptídeos PMP conforme fornecido na Tabela A. As proteínas foram alinhadas utilizando-se MAFFT (Katoh K, Toh H (2008) Recent developments in the MAFFT muitipie sequence alignment program. Briefings in Bioinformatics 9: 286-298). Uma árvore NJ de bootstrap foi calculada por GuíckTree (100 repetições, não-corrigidas) (# QuickTree: Howe et aí. (2002), Bioinformatics 18(11): 1546-7). Um cladograma foi desenhado utilizando-se Dendroscope2.G.1 (Huson DH, Ríchter DC, Rausch C, Dezulian T, Franz M, Rupp R (2007) Dendroscope: An Interactive viewer for large phylogenetic trees. BMC Bioinformatics 8; Article No,: 460), A Figura 4 mostra a tabefa MATGAT do Exemplo 3. A Figura 5 representa o vetor binário usado para uma expressão aumentada em Oryza sativa de um ácido nucléico codificador de PMP sob o controle de um promotor GOS2 de arroz (pGOS2). A Figura 6 mostra um alinhamento de SEG ID NO: 2 e SEQ íD NO: 8 usando Clustaf (versão 2.1; vide Larkin MA, Biackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWiliiam H, Valentin F, Wafface IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. (2007). Clustal W e Glustal X versão 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948). Os asteriscos indicam os aminoácidos idênticos selcionados dentre as duas sequências de proteína. Este alinhamento pode ser usado para definir outros motivos ou sequências de assinatura, ao usar aminoácidos conservados.

Exemplos Agora, a presente invenção será descrita com referência aos exemplos a seguir, que servem apenas para propósitos ilustrativos. Os exemplos a seguir não são destinados a limitarem o escopo da invenção.

Em particular, as plantas usadas nos experimentos descritos são usadas devido à Arabidopsís, plantas de tabaco, arroz e milho serem plantas modelo para o teste de transgenes. Essas são amplamente usadas na técnica devido à facilidade relativa de teste visto que possuem uma capacidade de transferência satisfatória dos resultados para outras plantas usadas na agricultura, como, porém sem caráter limitativo milho, trigo, arroz, soja, algodão, colza de semente oleaginosa inclusive canola, cana-de-açúcar, beterraba sacarina e alfafa, ou outras culturas dicotiledôneas ou monocotiledôneas.

Exceto onde indicado em contrário, a presente invenção emprega técnicas e métodos convencionais de biologia vegetal, biologia molecular, bioinformática e reprodução de plantas.

Manipulação de DNA; a não ser que de outra forma determinado, as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com o descrito em (Sambrook (2001) Molecular Cíoning: a laboratory manual, 3a Edição Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nova Iorque) ou nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et ai. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Materiais e métodos padrão para trabalho molecular em planta são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackweü Scientífic Publications (UK), Exemplo 1: Identificação de sequêncías relacionadas à SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 Sequências (cDNA, ESTs ou genômicas de comprimento completo) relacionadas a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 foram identificadas dentre aquelas mantidas no banco de dados Entrez Nucleotides no Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (NCBI) com uso de ferramentas de pesquisa de sequência de banco de dados, ta! como a Ferramenta Básica de Alinhamento Local (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Bio!. 215:403 a 410; e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 a 3402). O programa é usado para encontrar regiões de similaridade local entre sequências por comparação de ácido nucléico ou sequências de polipeptídeo com bancos de dados de sequência e por cálculo da significância estatística das correlações. Por exemplo, o polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico da SEQ ID NO: 1 foi usado para o algoritmo TBLASTN, com definições padrão e o filtro para ignorar sequências de baixa complexidade acionado. O resultado da análise foi visto por comparação por pares e classificado de acordo com a pontuação de probabilidade (valor E), em que a pontuação reflete a probabilidade de que um alinhamento particular ocorra por acaso (quanto menor o valor E, mais sígnificante o acerto). Adicionalmente aos vaiores E, comparações também foram pontuadas por porcentagem de identidade. A porcentagem de identidade refere-se ao número de nucleotídeos idênticos (ou aminoácidos) entre duas sequências de ácidos nucléicos comparadas (ou polipeptídeo) por um comprimento particular. Em algumas ocorrências, os parâmetros padrão podem ser ajustados para modificar o rigor da pesquisa. Por exemplo, o valor E pode ser aumentado para mostrar correlações menos rigorosas. Dessa forma, correlações exatas quase curtas podem ser identificadas. A Tabela A fornece uma lista de sequências de ácido nucléico relacionadas a SEQ 1D NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

Tabela A: Exemplos pe ácidos nucléicos e poupeptípeos FMP

As sequências de poiipeptídeo de SEQ ID NO: 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 e 72 foram artificialmente projetadas utilizando-se SEQ 1D NO: 2 como um ponto de partida. Elas compartilham aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 96, 97 e 98 por cento de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 2, respectivamente. SEQ ID NO: 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69 e 71 são exemplos de sequências de ácido nucléico que codificam os polipeptídeos de SEQ ID NO: 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 e 72, respectivamente.

As sequências foram temporariamente coletadas e publicamente descritas por instituições de pesquisa, tal como The Institute for Genomic Research (TIGR; começando com TA). Por exemplo, o banco de dados Eukaryoitc Gene Orthologs (EGO) pode ser usado para identificar tais sequências relacionadas, seja por uma busca por palavra-chave ou utilizando-se o algoritmo BLAST com a sequência de ácido nucléico ou sequência polipeptídica de interesse. Os bancos de dados especiais de sequência de ácido nucléico foram criados por organismos particulares, tal como pelo Joint Genome Institute. Ademais, o acesso aos bancos de dados prioritários permitiu a identificação de novas sequências de ácidos nucléicos e sequências de polipeptídeos.

Exemplo 2: Alinhamento de sequências de pqlifeptIdeq PMP O alinhamento das sequências de poiípeptfdeo foi realizado utilizando-se o algoritmo ClustalW versão 2.0.11 de alinhamento progressivo (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et aí. (2003). Nucieic Acids Res 31:3497-3500 & Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. (2007). Clustal W e Ciustal X versão 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948)) com ajuste padrão (alinhamento lento, matriz de similaridade: Gonnet, penalidade de abertura de vão 10, penalidade de extensão de vão: 0.2). Realizou-se uma edição manual mínima para otimizar adicionalmente o alinhamento.. Os polipeptídeos PMP são alinhados na Figura 2.

Uma árvore filogenética de polipeptídeos PMPs (Figure 3) foi construída alinhando-se as sequências PMP através do uso de MAFFT (Katoh and Toh (2008) - Bríefings in Bioinformatics 9:286-298) com ajustes padrão. Uma árvore de similaridade foi calculada utilizando-se Quick-Tree (Howe etal. (2002), Bioinformatics 18(11): 1546-7), 100 repetições de bootstrap. A árvore filogenética foí desenhada utilizando-se Dendroscope (Huson et al. (2007), BMC Bioinformatics 8(1):460). Os níveis de confiança para as 100 repetições de bootstrap são indicados para ramificações maiores.

Exemplo 3: Cálculo da identidade de porcentagem global entre as SEQUÊNCIAS DE POLIPEPTÍDEO

As porcentagens globais de similaridade e identidade entre as sequências polipeptídicas de comprimento completo úteis na realização dos métodos da invenção foram determinadas utilizando-se o software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an apptication that generates simüarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software hosted by Ledion Biíincka). O MatGAT gera matrizes de similaridade/identidade para sequências de DNA ou proteína sem a necessidade de um pré-alinhamento dos dados. O programa realiza uma série de alinhamentos por pares utilizando-se o algoritmo de alinhamento global Myers and Miller, calcula a similaridade e a identidade, e, então, coloca os resultados em uma matriz de distância.

Os resultados da analise MatGAT são mostrados na Figura 4 com porcentagens globais de similaridade e identidade em relação ao comprimento completo das sequências de poiipeptídeo. A similaridade de sequência é mostrada na metade inferior da linha divisória e a identidade de sequência é mostrada na metade superior da linha diagonal divisória. Os parâmetros usados na análise foram: Matriz de classificação: B!osum62, Primeiro vão: 12, Vão de extensão: 2. A identidade de sequência (in%) entre as sequências de poiipeptídeo PMP úteis na realização dos métodos da invenção pode ser tão baixa quanto 29 %, mas é genericamente maior que 49%) comparada a uma SEQ ID NO: 2.

Assim como para sequências de comprimento completo, pode-se gerar uma tabela MATGAT baseada em subsequências de um domínio específico. Com base em um alinhamento múltiplo de polipeptídeos PMP, tal como, por exemplo, aquele do Exemplo 2, um indivíduo versado pode selecionar sequências conservadas e submeter como uma entrada para uma análise MaTGAT. Esta abordagem é útil onde uma conservação de sequência gerai dentre as proteínas PMP é preferenciaimente baixa.

Exemplo 4: Identificação de domínios compreendidos em sequências de FOLIPEPTÍDEO ÚTEIS NA REALIZAÇÃO DOS MÉTODOS DA INVENÇÃO O banco de dados de Recurso Integrado de Famílias de Proteína, Domínios e Sítios (InterPro) é uma interface integrada para os bancos de dados de assinatura comumente usados para pesquisas a base de texto e de sequência. O banco de dados InterPro combina esses bancos de dados que usam diferentes metodologias e graus variáveis de informações sobre proteínas bem caracterizadas para derivar assinaturas de proteína. Os bancos de dados colaboradores incluem SWiSS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom e Pfam, Smart e TIGRFAMs. Pfam é uma coleção grande de múltiplos alinhamentos de sequência e modelos de Markov ocultos que cobrem muitos domínios e famílias de proteínas comuns. Pfam é hospedado no servidor do Instituto Sanger no Reino Unido. Interpro é hospedado no Instituto de Bioinformática Europeu no Reino Unido.

Os resultados do SnterPro scan {(vide Zdobnov E.M. and Apweiler R.; "InterProScan - an integration piatform for the signature-recognítion methods in InterPro."; Bioinformatics, 2001, 17(9): 847-8; banco de dados InterPro, versão 37,0, 30 de abril de 2012) das sequências de polipeptídeo conforme representado por SEQ ID NO: 2. 4 e 8 mostraram que o domínio PFAM PF10358 foi detectado. Uma análise repetida usando o banco de dados InterPro versão 41.0, 13 de fevereiro de 2013 produziu um domínio N-terminal EEIG1/EHBP1 (IPR019448) como um acerto. 1PR019448 compreende um domínio PFAM PF10358.

Tabela B; Resultados de InterProScan (números de acesso principais) oa SEQUÊNCtA DE POLIPEPTÍDEO CONFORME REPRESENTADO POR SEQ ID NO: 2 Em uma realização, um polipeptídeo PMP compreende um domínio conservado com pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a um domínio conservado do aminoácido 127 a 274 em SEQ ID NO:2).

Identificação de motivos conservados Os padrões conservados foram identificados pela ferramenta de software MEME versão 3.5. MEME foi desenvolvido por Timothy L. Baiiey and Charles Elkan, Dept. of Computer Science and Engineering, Universíty of Califórnia, San Diego, EUA e é descrito por Timothy L. Baiiey e Charles Elkan (Fitting a mixture model by expectation maximization to d isco ver motifs in biopolymers, Proceedings of the Second Internationa! Conference on Intelíigent Systems for Moiecular Bíology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, 1994). O código de origem para o programa autônomo é público junto a San Diego Supercomputer centercentre (http://meme.sdsc.edu). Os motivos 1 a 3 foram criados através desta ferramenta.

Para identificar os motivos comuns em todas as sequências pela ferramenta de software MEME, utiiizaram-se os ajustes a seguir: -maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0.001, -maxw 60, -distance 1e-3, -minsites número de sequências usadas para a análise. As sequências de entrada para MEME eram sequências não-aiinhadas em formato Fasta. Outros parâmetros foram usados nos ajustes padrão nesta versão de software.

Os padrões prosite para domínios conservados foram gerados pela ferramenta de software Pratt versão 2.1 ou manualmente. Pratt foi desenvolvido por inge Jonassen, Dept. of Informatics, Universíty of Bergen, Noruega e é descrito por Jonassen et ai. (I.Jonassen, J.F.Coilins e D.G.Higgins, Finding flexible patterns in unaiígned proteín sequences, Protein Science 4 (1995), pp. 1587-1595; I.Jonassen, Efficient díscovery of conserved patterns using a pattern graph, Submetido a CABIOS em fevereiro de 1997]. O código de origem (ANSI C) para o programa autônomo é público, por exemplo, em centros estabelecidos de Bioinformática como EBI (European Bioinformatics Institute).

Para gerar padrões peta ferramenta de software Pratt, utilizaram-se os seguintes ajustes: PL (Comprimento de padrão máximo): 100, PN (Nr máx de Símbolos Padrão): 100, PX (Nr máx de x concecutivo); 30, FN {Nr máx de espaçadores flexíveis): 5, FL (Flexibilidade máxima): 30, FP (Produto de flexibilidade máxima): 10, ON (padrões de número máximo): 50, As sequências de entrada para Praft eram regiões distintas das sequências de proteína que exibem alta similaridade conforme identificado a partir da ferramenta de software MEME. O número mínimo de sequências, que precisam corresponder aos padrões gerados (CM, Nr min de Seqs a corresponder) foi ajustado para peio menos 80% das sequências proporcionadas. O padrão identificado através de PROSITE e/ou MEME foram adicionalmente processados com o programa Fuzzpro, conforme implementado no “The European Molecular Bioiogy Open Software Suite” (EMBOSS), versão 6.3.1.2 (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)), para chegar nos motivos.

Utilizando-se o alinhamento conforme descrito no exemplo 3, os Motivos 4, 5, A, B, 1a, 3a, 3b, 4a, Ba, 1*, 2*. 3*, 4*, 5*. A* e B* foram identificados manualmente.

Em uma realização, um polipeptídeo POI compreende um motivo com pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a qualquer um dos motivos 1a, 2, 3b, 4a, 5, A, Ba, 1*. 2*, 3*. 4*, 5*, A* e B*, de preferência, a qualquer um dos motivos 1*, 2*, 3*, 4*, 5*. A* e B*, contidos em SEQ ID NO: 2 conforme mostrado por suas posições de início e fim na figura 1.

Exemplo 5: Topologia de predíção das sequências de pqlipeptídeo PMP

TargetP 1.1 prevê um local subceiular de proteínas eucarióticas. A atribuição de local se baseia na presença prevista de qualquer uma das pré-sequêncías N-terminais: peptídeo de trânsito de cíoroplasto (cTP), peptfdeo direcionador mitocondria! (mTP) ou peptídeo de sinal de caminho secretório (SP), As classificações nas quais se baseia a predíção final não são realmente probabilidades, e estas não adicionam necessariamente a um. No entanto, o local com a maior ciassificação é o mais provável de acordo com o TargetP, e a relação entre as classificações (a classe de confiabilidade) pode ser uma indicação de quão certa a previsão é, A ciasse de confiabilidade (RC) varia de 1 a 5, onde 1 indica a predição mais forte. TargetP é mantido no servidor da Universidade Técnica da Dinamarca (vide http.V/www.cbs.dtu.dk/services/TarqetP/ & “Locating proteins in the ceil usíng TargetP, SignaiP, and reíated too Is”, Ofof Emanuefsson, Saren Brunak, Gunnar von Heijne, Henrik Nielsen, Nature Protocols 2, 953-971 (2007)).

Deve-se selecionar uma série de parâmetros antes de analisar uma sequência, tal como o grupo de organismo (não-vegetal ou vegetal), conjuntos de corte (nenhum, conjunto predefinido de cortes, ou conjunto específico a usuário de cortes), e o cálculo de previsão dos sítios de clívagem (sim ou não). Os ajustes de TargetP eram: “vegetalcorte cTP =0; corte mTP =0; corte SP = 0; outro corte = 0. Predições de sítio de divagem incluídas.

Os resultados da análise TargetP 1.1 da sequência de poiípeptídeo conforme representado por SEQ ID NO: 2 são apresentados na Tabela C. O grupo de organismo “vegetal" foi selecionado, nenhum corte foi definido, e o comprimento previsto do peptídeo de trânsito solicitado, A localização subceiular da sequência de poiípeptídeo conforme representado por SEQ ID NO: 2 pode ser o piastídeo, por exemplo, um cíoroplasto ou o citoplasma - um peptídeo de trânsito ao cioroplasto é previsto.

Tabela C: Anáüse TargetP 1.1 dasequénoa de polipeptídeqconforme REPRESENTADO POR SEQ ID NO: 2 Muitos outros algoritmos podem ser usados para realizar tais análises, incluindo: » GhloroP 1.1 hospedado no servidor da Universidade Técnica da Dinamarca; • Protein Prowier Subcellular Localisation Predictor versão 1.2 hospedado no servidor do instituto de Biociência Molecular, Universidade de Queensland, Brisbane, Austrália; • PENCE Proteome Anafyst PA-GOSUB 2.5 hospedado no servidor da Universidade de Aiberta, Edmonton, Alberta, Canadá; • TMHMM, hospedado no servidor da Universidade Técnica da Dinamarca • PSORT (URL: psort.org) • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656-1663, 2003).

Exemplo 6: Clonagem da sequência de ácido nucléico codificador de FMP A sequência de ácido nucléico foi amplificada por PCR utilizando-se como modelo uma biblioteca cDNA Populus tríchocarpa seedlings sob medida. A biblioteca cDNA usada para clonagem foi feita sob medida a partir de diferentes tecidos (por exemplo, folhas, raízes) de Populus trichocarpa. Uma planta Jovem de P.trichocarpa usada foi coletada na Bélgica. A PCR foi realizada utilizando-se DNA polimerase Taq revisada comercialmente disponível em condições padrão, utilizando-se 200 ng de modelo em um mix de PCR de 50 μ!. Os iniciadores usados eram prm15115 (SEQ ID NO: 32; sentido, códon de partida em negrito): 5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcaacagatagaaggaat3’ e prm15116 (SEQ ID NO: 33; inverso, complementar): 5’ ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttggacaattcttgtcttacc3’, que inclui os sítios AttB para recombinação Gateway. O fragmento de PCR amplificado também foi purificado utilizando-se os métodos padrão. A primeira etapa do procedimento Gateway, a reação de BP, foi, então, realizada, durante a qual o fragmento de PCR recombinado in vivo com o plasmídeo pDONR201 para produzir, de acordo com a terminologia Gateway, um “cione de entrada”, tipo pPMP. O plasmídeo pDONR2ü1 foi adquirido junto a invitrogen (parte da Life Technologies GmbH, Frankfurter Strafie 129B, 64293 Darmstadt, Alemanha), como parte da tecnologia Gateway®. O clone de entrada que compreende SEQ ID NO: 1 foi, então, usado em uma reação LR com um vetor de destino usado para transformação de Oryza sativa. Este vetor continha como elementos funcionais nos limites de T-DNA: um marcador selecíonável vegetai; um cassete de expressão de marcador passível de triagem; e um cassete de Gateway destinado para recombinação LR in vivo com a sequência de ácido nucléico de interesse já donada no clone de entrada. Um promotor GOS2 de arroz (SEQ ID NO: 31) para expressão específica constitutiva estava localizado a montante deste cassete de Gateway.

Após a recombinação de LR, o vetor de expressão resultante pGOS2::PMP (Figura 5) foi transformado em uma cepa Agrobacteríum LBA4044 de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. .^.y.iMFJkSL?.··.Ijj.SFORMAQÃO D E _PLANTA IMNSFORMA^AO^E^RíR^ A Agrobacteríum contendo o vetor de expressão foi usada para transformar vegetais Oryza sativa. As sementes secas maduras do cultivar Nipponbare de subespécie arroz japônica foram descascadas. A esterilização foi realizada por incubação durante um minuto em etanol 70%, seguida por 30 a 60 minutos, de preferência, 30 minutos em solução de hipoclorito de sódio (dependendo do grau de contaminação), seguida por 3 a 6 lavagens, de preferência, 4 vezes com água destilada estéril. As sementes estéreis foram, então, germinadas em um meio contendo 2,4-D (meio de indução de calo). Após a incubação sob luz durante 6 dias, os calos embríogênicos derivados de escutelo foram transformados com Agrobacteríum conforme descrito mais adiante. A cepa de Agrobacteríum LBA4404 contendo o vetor de expressão foi usada para co-cultivação, A Agrobacteríum foi inoculada em um meio AB com os antibióticos apropriados e submetida à cultura durante 3 dias a 28°C. As bactérias foram, então, coletadas e suspensas em um meio liquido de co-cultivação em uma densidade (ODeoo) igual a cerca de 1. Os calos foram imersos na suspensão durante 1 a 15 minutos. Os tecidos calosos foram, então, secos em um filtro de papel e transferidos para um meio solidificado de co-cultivação e incubados durante 3 dias no escuro a 25°C. Após a lavagem de Agrobacterium, os calos foram desenvolvidos em um meto contendo 2,4-D durante 10 a 14 dias (tempo de crescimento para indica: 3 semanas) sob luz a 28°C na presença de um agente de seleção. Durante este período, o crescimento de calos resistentes foi desenvolvido. Após a transferência deste material para um meio de regeneração, o potencial embriogênicc foi liberado e ramos se desenvolveram nas quatro a seis semanas seguintes. Os ramos foram excisados dos calos e incubados durante 2 a 3 semanas em um meio contendo auxina a partir do qual eles foram transferidos para o soio. Os ramos fortificados foram desenvolvidos sob alta umidade e poucos dias em uma estufa. A transformação de cultivar indica de arroz também pode ser realizada de maneira similar conforme descrito acima de acordo com técnicas bem conhecidas por um elemento versado na técnica. 35 a 90 transformantes de arroz TO independentes foram gerados para uma construção. Os transformantes primários foram transferidos a partir de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa. Após uma análise de PCR quantitativa para verificar o número de cópia da inserção de T-DNA, apenas os vegetais transgênicos de cópia única que exibem tolerância ao agente de seleção foram mantidos para colheita de semente T1. As sementes foram, então, colhidas três a cinco meses apôs o transplante. O método produziu transformantes de local único em uma taxa superior a 50 % (Aldemita and Hodges1996, Chan et al. 1993, Hieietaf. 1994).

Como uma alternativa, as plantas de arroz podem ser geradas de acordo com o seguinte método: Agrobacteríum contendo o vetor de expressão é usada para transformar plantas Oryza sativa. As sementes secas maduras do cultivar Japonica de arroz Nipponbare são descascadas. A esterilização é realizada por incubação durante um minuto em 70% de etanoi, seguido por 30 minutos em 0,2% de HgCia, seguido por 6 lavagens durante 15 minutos com água destilada estéril. As sementes estéreis são então germinadas em um meio contendo 2,4-D (meio de indução de calo). Após a incubação no escuro durante quatro semanas, os calos embriogênicos derivados de escutelo são excisados e propagados no mesmo meio. Após duas semanas, os calos são multiplicados ou propagados por subcultura no mesmo meio por mais 2 semanas. As partes de calo embriogênico são sub-culíivadas em meio fresco 3 dias antes do co-cultivo (para estimular a atividade de divisão celular), A cepa de Agrobacterium LBA4404 contendo o vetor de expressão è usada para o co-cultivo. Agrobacterium é inoculada em meio AB com os antibióticos adequados e cultivada durante 3 dias a 28°C. As bactérias são então coletadas e suspensas em meio de co-cultivo líquido em uma densidade (ODSOo) de cerca de 1. A suspensão é então transferida para uma placa de Petri e os calos imersos na suspensão durante 15 minutos. Os tecidos de calo são então secos em um papel filtro e transferidos para o meio de co-cultivo solidificado e incubados durante 3 dias no escuro a 25°C. Os calos co-cultivados se desenvolvem em meio contendo 2,4-D durante 4 semanas no escuro a 28°C na presença de um agente de seleção. Durante esse período, ilhas de calos resistentes de crescimento rápido são desenvolvidas. Após a transferência desse material para um meio de regeneração e incubação sob luz, o potencial embriogênico é liberado e os brotos desenvolvidos nas próximas quatro a cinco semanas. Os brotos são excisados dos calos e incubados durante 2 a 3 semanas em um meio contendo auxina a partir do qual esses são transferidos para o solo. Brotos endurecidos são desenvolvidos sob alta umidade e poucos dias em uma estufa.

Aproximadamente 35 a 90 transformantes de arroz TO independentes são gerados para uma construção. Os transformantes primários foram transferidos a partir de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa. Após uma análise de PCR quantitativa para verificar o número de cópia da inserção de T-DNA, apenas as plantas transgênicas de cópia única que exibem tolerância ao agente de seleção são mantidas para colheita de semente T1. As sementes são, então, colhidas três a cinco meses apôs o transplante. O método produziu transformantes de local único em uma taxa superior a 50 % (Aldemita e Hodges1996, Ghan et al. 1993, Hiei et ai. 1994).

Exemplo 8; Transformação oe outras colheitas Transformação pe milho A transformação do milho (Zea mays) é realizada com uma modificação do método descrito por tshida et al, (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. A transformação é dependente de genótipo em milho e apenas os genótipos específicos são receptivos para transformação e regeneração. A linha natural A188 (Universidade de Minnesota) ou híbridos com A188 como um parente são boas fontes de material doador para transformação, porém, outros genótipos também podem ser usados com sucesso. As espigas são colhidas do milho aproximadamente 11 dias após a polinização (DAP) quando o comprimento do embrião imaturo for cerca de 1 a 1,2 mm. Os embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão, e os vegetais transgênícos são recuperados através de organogênese. Os embriões excisados são desenvolvidos no meio de indução de calo, então, o meio de regeneração de milho, contendo o agente de seleção (por exemplo, imidazoiinona, porém, vários marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na fuz a 25 °C durante 2 a 3 semanas, ou até que ramos se desenvolvam. Os ramos verdes são transferidos a partir de cada embrião para o meio de enraizamento de milho e incubados a 25 °C durante 2 a 3 semanas, até que as raízes se desenvolvam. Os ramos enraizados são transplantados para o solo na estufa. Produzem-se sementes T1 a partir dos vegetais que exibam tolerância ao agente de seleção e que contenham uma única cópia da inserção de T-DNA.

Transformação oe trigo A transformação do trigo é realizada com o método descrito por íshida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. O cultivar Bobwhite (disponível junto à CIMMYT, México) é comumente usado na transformação. Os embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão, e os vegetais transgênicos são recuperados através de organogênese. Após a incubação com Agrobacterium, os embriões são desenvolvidos in vítro em meio de indução de calos, então em meio de regeneração, contendo o agente de seleção (por exemplo, tmidazoiinona, porém vários marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 25 °C durante 2 a 3 semanas, ou até que ramos se desenvolvam. Os ramos verdes são transferidos a partir de cada embrião para o meio de enraizamento de milho e incubados a 25 °C durante 2 a 3 semanas, até que as raízes se desenvolvam. Os ramos enraizados são transplantados para o solo na estufa. Produzem-se sementes T1 a partir dos vegetais que exibam tolerância ao agente de seleção e que contenham uma única cópia da inserção de T-DNA

Transformação de soja A soja é transformada de acordo com uma modificação do método descrito na patente Texas A&M US 5.164.310. Diversas variedades de soja comerciais são receptivas à transformação por esse método. O cultivar Jack (disponível junto à Illinois Seed foundation) é comumente usado para a transformação. As sementes de soja são esterilizadas para semeação in vitro. O hipocótiío, a radícuia e um cotilédone são cortados de mudas jovens com sete dias. O epicótilo e o cotilédone restantes são adicionalmente cultivados para desenvolver nodos axilares. Esses nodos axilares são cortados e incubados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão. Após o tratamento de co-cultivação, os explantes são lavados e transferidos para o meto de seleção. Os ramos regenerados são cortados e colocados em um meio de alongamento de ramos. Ramos não maiores do que 1 cm são colocados no meto de enraizamento até as raízes se desenvolverem. Os ramos enraizados são transplantados para o solo na estufa. As sementes T1 são produzidas a partir de vegetais que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma única cópia da inserção de T-DNA.

Transformação de semente de colza/canola Os pecíoios cotiiedonares e hipocóíilos de mudas jovens com 5 a 6 dias são usados como expíantes para a cuitura de tecido e transformados de acordo com Babic et ai, (1998, Ptant Celi Rep 17: 183-188), O cultivar comercial Westar (Agriculture Canada) é a variedade padrão usada para a transformação, porém outras variedades também podem ser usadas. As sementes de canola são esterilizadas em superfície para semeadura in vítro. Os expíantes de pecíolo cotifedonar com o cotilédone junto são cortados das mudas in vitro, e ínoculados com Agrobacterium (contendo o vetor de expressão) ao imergir a extremidade cortada do explante de pecíolo na suspensão bacteriana. Os expíantes são então cultivados durante 2 dias em meio MSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP, 3 % de sacarose, 0,7 % de Pbytagar a 23 °C, 16 h sob a luz. Após dois dias de co-cultivação com Agrobacterium, os expíantes de pecíolo são transferidos para o meio MSBAP-3 contendo 3 mg/i de BAP, cefotaxima, carbenicilina, ou timentina (300 mg/l) durante 7 dias, e então cultivados em meio MSBAP-3 com cefotaxima, carbenicilina, ou timentina e o agente de seleção até a regeneração do ramo. Quando os ramos possuírem 5 a 10 mm de comprimento, esses são cortados e transferidos para o meio de alongamento de ramo (MSBAP-0,5, contendo 0,5 mg/í de BAP). Os ramos de cerca de 2 cm de comprimento são transferidos para o meio de enraizamento (MS0) para a indução do enraizamento. Os ramos enraizados são transplantados para o solo na estufa. As sementes T1 são produzidas a partir de vegetais que exibem tolerância ao agente de seleção e que contém uma única cópia da inserção de T-DNA, Transformação de alfafa Um clone de regeneração de alfafa (Medicago sativa) é transformado com o uso do método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119:839 a 847). A regeneração e a transformação de alfafa é dependente de genótipo e, portanto, uma planta de regeneração é exigida. Métodos para se obter plantas de plantas de regeneração foram descritos. Por exemplo, estes podem ser selecionados dentre o cultivar Rangelander (Agricuiture Canada) ou qualquer outra variedade de alfafa comercial, conforme descrito por Brown DCW and A Atanassov (1985. Plant Ceíl Tissue Organ Culture 4:111 a 112). Alternativamente, a variedade de RA3 (Universidade de Wisconsin) foi selecionada para uso na cultura de tecido (Walker et a!., 1978 Am d Bot 65:654 a 659). Explantes de Pecíolo são co-cultivados com uma cultura de um dia para outro de Agrobacterium íumefaciens C58C1 pMP9Q (McKersie et a!., 1999 Plant Physiol 119: 839 a 847) ou LBA4404 que contém o vetor de expressão. Os explantes são co-cultivados por 3 dias no escuro em meto de indução SH que contém 288 mg/t de Pro, 53 mg/l de tioprolina, 4,35 g/l de K2S04 e 100 pm de acetosiringinona. Os explantes são lavados em meio de Murashíge-Skoog de meia força (Murashige and Skoog, 1962) e plaqueados no mesmo meio de indução SH sem acetosiringinona, mas com um agente de seleção adequada e antibiótico adequado para inibir o crescimento de Agrobacterium, Após diversas semanas, os embriões somáticos são transferidos para o meio de desenvolvimento BOÍ2Y que não contém nenhum regulador de crescimento, nenhum antibiótico e 50 g/i de sacarose. Os embriões somáticos são subsequentemente germinados em meio de Murashtge-Skoog de meia força. Os brotos enraizados foram transplantados para potes e cultivados em uma estufa. As sementes T1 são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma única cópia do inserto de T~ DNA.

Transformação de algodão O algodão é transformado com o uso de Agrobacterium tumefaciens, de acordo com o método descrito no documento US 5.159.135.

As sementes de algodão são esterilizadas em superfície em 3% de hipocioriío de sódio durante 20 minutos e lavadas em água destilada com 500 g/mf de cefotaxima. As sementes são, então» transferidas para meio SH com 50 g/m! de benomiía para a germinação. Os hipocótilos de brotos de 4 a 6 dias são removidos» cortados em partes de 0,5 cm e são colocados em 0,8% de agar. Uma suspensão de Agrobacteríum (aproximadamente 108 células por ml, diluídas a partir de uma cultura de um dia para o outro transformada com o gene de interesse e marcadores de seleção adequados), se usada para inoculação de expiantes de hipocótilos. Após 3 dias à temperatura e iluminação ambientes, os tecidos são transferidos para um meio sóiido (1,6 g/i de Gelrite) com sais de Murashíge e Skoog com vitaminas B5 (Gamborg et a!., Exp. Celi Res. 50: 151 a 158 (1968)), 0,1 mg/f de 2,4-D, 0,1 mg/l de 6-furfurilaminopurina e 750 g/m! de MgCL.2, e com 50 a 100 g/ml de cefotaxima e 400 a 500 g/ml de carbenicitina para exterminar bactéria residual. Linhagens celulares individuais são isoladas após dois a três meses (com subculturas a cada quatro a seis semanas) e são adicionalmente cultivadas em meio seletivo para ampliação de tecido (30°C, 16 horas de fotoperíodo). Tecidos transformados são subsequente e adicionalmente cultivados em meio não seletivo durante 2 a 3 meses para permitir o crescimento de embriões somáticos. Embriões de aspecto saudável de pelo menos 4 mm de comprimento são transferidos aos tubos com meio SH em vermicuiita fina, suplementado com 0,1 mg/l de ácido acético de Índole, 6 furfuníamínopurina e ácido giberélico. Os embriões são cultivados a 30/C com um fotoperíodo de 16 horas, e plântufas no estágio de folha 2 a 3, são transferidos para potes com vermicuiita e nutrientes. As plantas são enrijecidas e subsequentemente movidas para a estufa para cultivo posterior.

Transformação de beterraba sacarina As sementes de beterraba sacarina (Beta vulgaris L.) são esterilizada em 70% de etanol durante um minuto seguido por 20 minutos e agitação em 20% de aivejante de Hipoclorito, por exemplo, alvejante comum Cíorox® (comercialmente disponível junto à Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, USA), As sementes são lavadas com água estéril e secas ao ar seguido por semeação em meio de germinação (meio baseado em Murashige e Skoog (MS) (Murashige, T., e Skoog, 1962. Physiol. Plant, vot. 15, 473-497) inclusive vitaminas B5 (Gamborg et ai.; Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8.) suplementado com 10 g/l de sacarose e 0,8% de ágar). O tecido de hipocótiío é usado essencialmente para a iniciação de culturas de broto de acordo com Hussey and Hepher (Hussey, G., e Hepher, A., 1978. Annaís of Botany, 42, 477-9) e são mantidas em meio baseado em MS suplementado com 30g/l de sacarose mais 0,25mg/l de benzilaminopurina e 0,75% de ãgar, pH 5,8 a 23-25°C com um fotoperíodo de 16 horas. A cepa de Agrobacterium tumefaciens que contém um piasmídeo binário dotado de um gene marcador selecionável, por exemplo, nptii, é usada em experimentos de transformação. Um dia antes da transformação, uma cultura de LB líquido que inclui antibióticos é desenvolvida em um agitador (28°C, 150 rpm) até uma densidade óptica (O.D.) em 600 nm de -0,6 ser atingida. As culturas bacterianas desenvolvidas durante a noite são centrifugadas e ressuspensas em meio de inoculaçâo baseado em MS (O.D. -1) inclusive Acetosiringona, pH 5,5. O tecido da base de broto é cortado em pedaços (1,0 cm x 1.0 cm x 2,0 mm aproximadamente). O tecido é imerso durante 30s em meio de inoculaçâo bacteriano líquido. O excesso de líquido é removido por papel filtro. O co-cultivo ocorreu durante 24-72 horas em meio baseado em MS incl, 30g/l de sacarose seguido por um período não seletivo que inclui meio baseado em MS, 30g/l de sacarose com 1 mg/l de BAP para induzir o desenvolvimento de broto e cefotaxíme para eliminar Agrobacterium, Após 3 a 10 dias, os são transferidos para o meio seletivo similar, por exemplo, contendo canamicina ou G418 (50-100 mg/l genótipo dependente). Os tecidos são transferidos para meio fresco a cada 2 a 3 semanas para manter a pressão de seleção. A iniciação muito rápida de brotos (após 3 a 4 dias) indica a regeneração de meristemas existentes em vez de organogênese de meristemas transgênícos recentemente desenvolvidos. Pequenos brotos são transferidos após várias séries de subcuftura para o meto de indução de raiz contendo 5 mg/l de NAA e canamícina ou G418. Etapas adicionais são realizadas para reduzir o potencial de gerar plantas transformas que são quiméricas (parciatmente transgênicas). Amostras de tecido de brotos regenerados são usadas para análise de DNA. Outros métodos de transformação de beterraba sacarina são conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles por Lsnsey & Gaiiois (Linsey, K., e Galíois, P., 1990. Journal of Experimentai Botany; voi. 41, No. 226; 529-36) ou os métodos publicados no pedido internacional publicado como W09623891 A.

Transformação de cana-oe-acúcar As hastes são isoladas de plantas de cana-de-açúcar de 6 meses de idade desenvolvidas em campo (Arencibia et ai., 1998. Transgentc Research, voi. 7, 213-22; Enriquez-Obregon et a!., 1998. Planta, vol, 206, 20-27). O material é esterilizado por imersão em 20% de atvejante de Hipoclorito, por exemplo, alvejante comum Clorox® (comercialmente disponível junto à Glorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, USA) durante 20 minutos. As seções transversais de cerca de 0»5cm são colocadas no meio na direção ascendente. O material vegetai é cultivado durante 4 semanas em meio baseado em MS (Murashige, T., e Skoog, 1962.. Physiol Piant, vol. 15, 473-497) incl. vitaminas B5 (Gamborg, O., et ai., 1968. Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8) suplementado com 2Gg/i de sacarose, 500 mg/l de hidrolísado de caseína, 0,8% de ágar e 5mg/l de 2,4-D a 23°C no escuro. As culturas são transferidas após 4 semanas em meio fresco idêntico. A cepa de Agrobacterium tumefaciens que contém um plasmídeo binário dotado de um gene marcador selecionáveí, por exemplo, hpt, é usada em experimentos de transformação, Um dia antes da transformação, uma cultura de LB liquido que incluí antibióticos é desenvolvida em um agitador (28°C, 150rpm) até uma densidade óptica (O.D.) em 600 nm de -0,6 ser atingida. As culturas bacteríanas desenvolvidas durante a noite são centrifugadas e ressuspensas em meio de inoculação baseado em MS (O.D. -0,4) inclusive acetosiringona, pH 5,5. As partes do caio embriogênico de cana-de-açúcar (2-4 mm) são isoladas com base nas características morfológicas como estrutura compacta e cor amarela e secas durante 20 minutos na capela de fluxo seguido por imersão em um meio de inoculação bacteriana líquido durante 10-20 minutos. O excesso de líquido é removido por papel filtro. O co-cultivo ocorreu durante 3 a 5 dias no escuro em papel filtro que é colocado na parte superior do meio baseado em MS incl. vitaminas B5 contendo 1 mg/t de 2,4-D. Após o co-cultivo, os calos são lavados com água estéril seguido por um período de cultivo não seletivo em meio similar contendo 500 mg/l de cefotaxime para eliminar as células de Agrobacterium restantes. Após 3 a 10 dias, os explantes são transferidos para o meio seletivo baseado em MS incl. vitaminas B5 contendo 1 mg/i 2,4-D durante mais 3 semanas com 25 mg/I de higromícina (genótipo dependente). Todos os tratamentos são realizados a 23°C no escuro. Os calos resistentes são ainda cultivados em meio desprovido de 2,4-D inclusive 1 mg/l de BA e 25 mg/l de higromícina durante um fotoperíodo de 16 h sob luz resultando no desenvolvimento de estruturas de brotos. Os brotos são isolados e cultivados em meio de enraizamento seletivo (baseado em MS que inclui 20g/l de sacarose, 20 mg/l de higromiciana e 500 mg/l de cefotaxime). As amostras de tecido dos brotos regenerados são usadas para análise de DNA. Outros métodos de transformação de cana-de-açúcar são conhecidos na técnica, por exemplo, do pedido internacional publicado como WQ2Q10/151634A e a patente europeia concedida EP1831378.

Para transformação por bombardeio de partículas, a indução de calo e a transformação de cana-de-açúcar pode ser realizada pelo método de Snyman et ai. (Snyman et al., 1996, S. Afr. J, Bot 62, 151-154). A construção pode ser co-transformada com o vetor pEmuKN, que expressa o gene nptll (Beck et al. Gene 19, 1982, 327-336; Gen-Bank Accession No. V00618) sob o controle do promotor pEmu (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81, 581-588). As plantas são regeneradas pelo método de Snyman et al. 2001 (Acta Horticulturae 560, (2001), 105-108).

Exemplo 9: Procedimento de avaliação fenotípica 9.1 Configuração de avaliação 35 a 90 transformantes de arroz 10 independentes foram gerados. Os transformantes primários foram transferidos de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa para o cultivo e colheita de semente T1. Seis eventos, dos quais a progênie T1 foi segregada 3: 1 para presença/ausência do transgene foram retidos. Para cada um desses eventos, aproximadamente 10 mudas T1 contendo o transgene (hetero e homozigotos) e aproximadamente 10 mudas T1 que não contêm o transgene (nulizigotos) foram selecionadas através do monitoramento de expressão de marcador visual. As plantas transgênicas e os nulizigotos correspondentes foram cultivados lado a lado em posições aleatórias. As condições de estufa são de dias curtos (12 horas de luz), 28°C na luz e 22°C no escuro, e uma umidade relativa de 76%. As plantas cultivadas sob condições de não estresse foram regadas em intervalos regulares para garantir que a água e nutrientes não sejam limitadores e para satisfazer as necessidades de planta para completar o crescimento e desenvolvimento, a não ser que essas sejam usadas em uma triagem de estresse. A partir do estágio de semeação até o estágio de maturidade, as plantas passaram várias vezes por um gabinete de formação de imagens digitais, Em cada ponto de tempo, as imagens digitais (2048x1536 pixeis, 16 milhões de cores) foram obtidas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes.

Os eventos T1 podem ser adicionalmente avaliados na geração de T2 após o mesmo procedimento de avaliação que a geração de T1, por exemplo, com menos eventos e/ou com mais indivíduos por evento.

Triagem de secura As plantas T1 ou T2 são desenvolvidas em vasos sob condições normais até que se aproximassem do estágio de espigamento. Elas são transferidas para uma seção “seca" onde a irrigação é privada. As sondas de umidade de solo são inseridas em vasos escolhidos aleatoriamente para monitorar o teor de água do solo (SWC), Quando o SWC cair abaixo de determinados limites, as plantas são automaticamente re-regadas de modo contínuo até que um nível normal seja novamente atingido. As plantas são, então, retransferidas novamente para condições normais. O resto do cultivo (maturação de planta, colheita de semente) foi o mesmo que para plantas não cultivadas sob condições de estresse abiótico. Os parâmetros de crescimento e rendimento são registrados como detalhados para o crescimento sob condições normais.

As plantas T1 ou T2 são cultivadas em vasos sob condições normais exceto pela solução de nutriente. Os vasos são regados a partir do transplante até a maturação com uma solução de nutrientes especifica que contém teor de nitrogênio N reduzido (N), normalmente entre 7 a 8 vezes menor. O resto do cultivo (maturação de planta, colheita de semente) é o mesmo que para plantas não cultivadas sob condições de estresse abiótico. Os parâmetros de crescimento e rendimento são registrados como detalhados para o crescimento sob condições normais, Triagem de estresse salino As plantas T1 ou T2 são cultivadas em um substrato feito de fibras de coco e partículas argila assada argex (razão 3 para 1). Uma solução de nutriente normal é usada durante as primeiras duas semanas após o transplante das plântulas para a estufa. Após as primeiras duas semanas, 25 mM de sal (NaCI) são acrescentados á solução de nutriente, até que as plantas sejam colhidas. Os parâmetros de crescimento e rendimento são registrados como detalhado para crescimento sob condições normais.

9.2 Análise estatística; teste F

Um ANOVA de dois fatores (análise de variantes) foi usado como um modelo estatístico para a avaliação geral de características de fenotípicas de planta. Um teste F foi realizado em todos os parâmetros medidos de todas as plantas de todos os eventos transformados com o gene da presente invenção. O teste F foi realizado para verificar um efeito do gene em todos os eventos de transformação e para verificar um efeito gerai do gene, também conhecido como efeito de gene global. O limite para significância para um efeito de global verdadeiro é configurado a um nível de probabilidade de 5% para o teste F. Um valor do teste F significante indica um efeito de gene, o que significa que não é apenas a mera presença ou posição do gene que causa as diferenças no fenótipo. 9.3 Parâmetros medidos A partir do estágio de semeadura até o estágio de maturidade, as plantas passaram diversas vezes através de um gabinete de formação de imagem digital. Em cada ponto no tempo, imagens digitais (2048x1536 pixels, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta a partir de pelo menos 6 ângulos diferentes como descrito em W02010/031780, Essas medidas foram usadas para determinar parâmetros diferentes.

Medida de parâmetro relacionado à biomassa A biomassa de partes de planta acima do solo foi determinada medindo-se a área de planta acima do solo (ou biomassa verde), que foi determinada pela contagem do número total de pixels nas imagens digitais de partes de plantas acima do solo discriminadas do fundo (“AreaMax”), Esse valor foi ponderado para as imagens obtidas no mesmo ponto de tempo a partir dos ângulos diferentes e foi convertido em um valor de superfície física expresso em mm quadrado por calibração. Os experimentos mostram que a área de planta acima do solo medida dessa forma correlaciona à biomassa de partes de planta acima do solo. A área acima do solo é a área medida no ponto no tempo no quai a planta alcançou sua biomassa verde máxima. O aumento na biomassa de raiz é expresso como um aumento na biomassa de raiz total (medida como a biomassa máxima de raízes observadas durante a expectativa de vida de uma planta, “Rootmax*’); ou como um aumento no índice de raiz/broto (“RootShlnd"), medido como a razão entre massa de raiz e massa de broto no período de crescimento ativo de raiz e broto no período de crescimento ativo de raiz e broto, Em outras palavras, o índice de raiz/broto é definido como a razão da rapidez de crescimento de raiz para a rapidez de crescimento de broto no período de crescimento ativo de raiz e broto. Este parâmetro é uma indicação ou biomassa de raiz e desenvolvimento. A biomassa de raiz pode ser determinada utilizando-se um método conforme descrito em WO 2006/029987. Da mesma forma, o diâmetro das raízes, a quantidade de raízes acima de um determinado nível de espessura e abaixo de um determinado nível de espessura pode ser medido. A altura absoluta pode ser medida ("HeíghtIVtax"). Uma indicação robusta alternativa da altura da planta é a medição do local do centro de gravidade, isto é, determinar a altura (em mm) do centro de gravidade da biomassa verde acima do solo. Isto evita a influência por uma única folha ereta, com base na asslntofa do ajuste de curva ou, se o ajuste não for satisfatório, com base no mínimo absoluto (“GravityYMax"), Parâmetros relacionados ao tempo de desenvolvimento O vigor precoce é a área vegetal acima do solo três semanas após a germinação. O vigor precoce foi determinado ao contar o número total de pixels de partes do vegetal acima do solo discriminadas daquelas abaixo do solo. Calculou-se a média desse valor para as imagens obtidas no mesmo ponto de tempo a partir dos diferentes ângulos e o mesmo foi convertido em um valor de superfície físico expresso em mm quadrados por caiibração. A taxa de crescimento relativa (RGR) como o logaritmo natural da biomassa acima do solo medida (denominada como 'TotalArea') em um segundo ponto de tempo, menos o logaritmo natural da biomassa acima do solo em um primeiro ponto de tempo, dividido pelo número de dias entre esses dois pontos de tempo ([log(TotalArea2)-log(TotalArea1)]/ndays). Os pontos de tempo são os mesmos para todas as plantas em um experimento. O primeiro ponto de tempo é escolhido como a medição mais precoce tomada entre 25 e 41 dias após o plantio. Se o número de medições (plantas) no ponto de tempo em que o experimento é menor que um terço do número máximo de medições tomadas por ponto de tempo para tal experimento, então, o próximo ponto de tempo é tomado (novamente com a mesma restrição sobre o número de medições). O segundo ponto de tempo é simplesmente o próximo ponto de tempo (com a mesma restrição sobre o número de medições).

AreaEmer é uma indicação de um desenvolvimento precoce rápido quando este valor diminuir comparado às plantas de controle. É a razão (expressa em %} entre o tempo que uma planta precisa para produzir 30% da biomassa final e o tempo necessário para produzir 90% de sua biomassa final.

O “tempo de florescer" (TTF) ou “tempo de florescimento" da planta pode ser determinado utilizando-se o método conforme descrito em WO 2007/093444.

Medidas de parâmetros relacionados à semente Os panículos primários maduros foram colhidos, contados, acondicíonados, identificados com código de barras e então secos durante três dias em um forno a 37°C. Os panículos foram então debulhados e todas as sementes foram coletadas e contadas. As sementes são geralmente revestidas por um revestimento externo seco, a casca. As cascas (no presente documento também denominadas como floretes preenchidos) foram separadas das vazias utilizando um dispositivo de sopro a ar. As cascas vazias foram descartadas e a fração restante foi contada novamente. As cascas preenchidas foram pesadas em uma balança analítica. O número tota! de sementes foi determinado ao contar o número de cascas preenchidas que permaneceram após a etapa de separação. O peso total de semente foi medido pesando-se todas as cascas preenchidas colhidas a partir de uma planta. O número total de sementes (ou floretes) por planta foi determinado contando-se o número de cascas (sejam preenchidas ou não) colhidas a partir de uma planta. O Peso de Mil Grãos (TKW) é extrapolado a partir do número de sementes contadas e de seu peso total. O Índice de Colheita (Hl) na presente invenção é definido como a razão entre o rendimento de peso de semente total e a área acima do solo (mm2), multiplicada por um fator 106. O número total de flores por panículo conforme definido na presente invenção é a razão entre o número total de sementes e o número de panículos primários maduros. A ‘taxa de enchimento de sementes" ou “taxa de preenchimento de sementes" conforme definido na presente invenção é a proporção (expressa como uma %) do número de sementes preenchidas (isto é, fforetes contendo sementes) sobre o número total de sementes (isto é, o número total de floretes). Em outras palavras, a taxa de preenchimento de sementes é a porcentagem de floretes que são preenchidos com sementes.

Exemplo 10: Resultados da avaliação fenotípica oas plantas transgénicas Os resultados da avaliação de plantas de arroz transgêníco na geração T1 e a expressão de um ácido nuctéico que codifica o polipeptídeo PMP de SEQ ID NO; 2 sob condições de não-estresse são apresentados abaixo na Tabela D. Quando desenvolvidos sob condições de não-estresse, um aumento de pelo menos 5% foi observado para biomassa acima do solo (AreaMax), biomassa de raiz (RootMax) e para o rendimento de sementes (incluindo o peso total de sementes (totalwgseeds), o número de floretes de uma planta (nrtotalseed), o número de sementes preenchidas de uma planta (nrfilledseed)) e a taxa de crescimento relativa (RGR). Um aumento em raízes finas foi observado em 50 por cento das plantas, e um aumento nas raízes grossas em pelo menos 16 por cento das plantas. De modo interessante, as plantas que mostram o aumento em raízes grossas também apresentaram um aumento em raízes finas junto ao aumento mais forte na biomassa de raiz total (18 por cento) e Np ganho mais forte de biomassa acima do solo (AreaMax; + 18 por cento).

Metade dos casos mostrou um índice modificado entre ramo e raiz, com um caso mostrando um aumento, 3 sendo neutro e 2 mostrando uma redução, e um terceiro caso mostrou um forte aumento de 15 para 20 por cento no índice de Colheita. Além disso, as plantas que expressam um ácido nucléico PMP mostraram um aumento no número médio de floretes por panículo em uma planta, no número de panículos na primeira brotação, na altura das plantas, na altura do centro de gravidade das plantas, no verdor atrasado e no verdor precoce e um desenvolvimento precoce mais rápido (AreaEmer) em peto menos 1 caso, embora outro caso mostrasse um desenvolvimento precoce mais tento.

Tabela D: Sumário ps papos para plantas de arroz transgênico: para cada PARÂMETRO, O AUMENTO PERCENTUAL TOTAL É MOSTRADO PARA PLANTAS PE GERAÇÃO T1, PARA CADA PARÂMETRO O P-VALOR t <0,05 Exemplo 11: Ensaio funcional das alterações de movimento de plastípeq Descreveram-se vários métodos para avaliar se uma proteína particular representar um papel no movimento de plastídeo em resposta a estímulos conhecidos, como, mas sem iimitar-se a, reação à luz azul e a diferentes intensidades de luz.

Por exemplo, as plantas nocaute para uma sequência de interesse podem ser geradas ou ordenadas a partir de coleções, por exemplo, coleções nocaute de T-DNA no Arabidopsis Biological Resource Center, 1060 Carmack Road, Rightmire Hall, sala 055, Columbus, OH 43210, EUA.

Outras técnicas para reduzir ou eliminar a expressão e/ou a atividade de uma proteína são conhecidas na técnica, por exemplo, uma expressão antissentido, RNAi, miRNA, captura de anticorpo de uma proteína de interesse. As plantas e as células vegetais com uma expressão e/ou atividade inalteradas da sequência em questão podem servir como controles, ou a expressão e/ou a atividade reduzidas podem ser restauradas para que tenham plantas de controle ou células vegetais. A avaliação do movimento de plasíídeo e suas alterações são conhecidas na técnica e algumas estão reduzidas na publicação de uma tese de doutorado por Serena Schmidt von Braun („Chup1 - a chloroplast movement protein and its interactlons,” Tese de PhD, Serena Schmidt von Braun (2008) Fakultãt für Bioiogie der Ludwig-Maximilians-Universitãt München, Munich, Alemanha; http://edoc.ub.uni-muenchen.de/ 8745/1/Schmidt_von_ Braun_Serena.pdf).

Reivindicações

Claims (38)

1. MÉTODO PARA APRIMORAR UMA OU MAIS CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS AO RENDIMENTO EM PLANTAS EM RELAÇÃO A PLANTAS DE CONTROLE, que compreende as etapas de aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo e desenvolver a planta, em que o dito polipeptídeo compreende todos os motivos a seguir; Motivo 1a (SEQ ÍD NO 35): M/V/l][P/A/G/S][L/l/M/T][D/E][E/D][L/MA/][L/l/V/M]GKT[A/G3E[Q/H] [IA/]AFEG[!/M][A/V][S/T/N]A[I/V]I[Q/S/L][G/A]R[N/S][K/A]{E/D/A][G/R/V/L][G/V]A [S/T/N3[S/T][S/T]AA[R/Q/E][T/I/S/A][IA/][A/S/TJ ou, alternativamente, o Motivo 1 (SEQ ID NO: 34): [M/V/l][P/A/G/S]{L/l/MjC3[D/E][E/D][L/MA/][L/lÃ//M]GKT[A/G]E[Q/H3 ÍIAf]AFEG[l/M][AA/]fS/T/N]A[IA/]l[Q/S/L][G/A]R[N/S][K/A][E/D/A][G/R/V/L][G/V]A [S/T/N][S/T]{S/T]AA[R/Q/E][T/I/S/A][ÍA/][AST]; e Motivo 2 (SEQ ID NO: 36): [V/N/I/C][Y/F][L/I/V]ÍS/P]ÍE/D]LGKG[UI3{G/S][C/P][V/L/I][V/I3[Q/R]T[R /K][D/N3GG[Y/F]L[AA//T][A/SjfT/M/L]NP[L/F]fD/N][T/!/V/Nl[l/AA//L/P3|y/M][S/A/T7 M/G/E][R/K][K/N]fD/E]fT/A/L]PKL[A/V]MQ[L/l/M]S[K/R][P/A/Ql[L/F/Y/l/M/V]fV/l/L 3ÍL/V/F]; e Motivo 3b (SEQ ID NO: 39): [S/K/E/L/V][K/E/S/A][G/D/E/S3ÍK/Q/P/E/H/N][D/E][L/V/M/I/F/Q]LWS [l/L/M]SSR[l/V][MA/]ADMWL[K/R][P/T/S/H][M/l/L3RNPD{V/l][K/N/l] ou, alternativamente, o Motivo 3 (SEQ ID NO: 37): [S/K/E/LA/]{K/E/S/A][G/D/E/S]GG[K/G/P/E/H/N][D/E][L/V/M/I/F/G] LWS[l/L/M]SSR[IA/][MA/]ADMWL[K/R][P/T/S/H][M/l/LJRNPD[V/l][K/N/!] ou, alternativamente, o Motivo 3a (SEQ ID NO 38): IS/K/E/L/V][K/E/S/A3[G/D/E/Sj[Q/NONEj[K/Q/P/E/H/N][D/E][L/V/M/l/F/ Q]LWS[l/UM]SSR[i/V][MA/3ADMWL[K/R][P/T/S/H][M/f/L}RNPD[V/l][K/N/l]; e Motivo 4a (SEQ !D NO: 41): MÍA/G/S][T/N/S/V]ÍA/l/G][Mn"/L/l3[S/N/T][T/S/DA'][G/S]R[K/Q/N][E/DI RI[S/T/A/M/D]{T/S]G[l/L]WN[V/M/l/A3[N/D/E/S/H/Q][E/D][N/T/E/D/S]P[L/V/F]T[A/ V/G/S][E/D][E/K/N][V/i/L]L[A/S3[F/V/C/l][S/T/A}[L/M/T]QK(l/V/L/M]Eiy/A/S/F/T]M[ AA//T][l/V][E/K][A/G]LKfl/V]Q[A/V3{E/D/G][l/MA/][AA//S/T][E/D/K][E/D] ou, alternativamente, o Motivo 4(SEG ID NO: 40): M[A/G/S][T/N/S/V][A/l/G]fM/T/L/l3ÍS/N/T][T/S/D/Y][G/S]R[K/Q/N][E/D] R[S/T/A/M/D][T/S]G[I/L]WN(V/M/I/A][N/D/E/S/H/Q][E/D][N/T/E/D/S3P[LA//F]TS[A /V/G/S][E/D][E/K/N][V/l/L]L[A/S][F/V/C/l][S/T/A][L/M/T]QK[!/V/L/M]E[V/A/S/F/T]M [A/V/T][I/V]{E/K3[A/G}LK[I/V]Q[A/V][E/D/G][I/M/V][A/V/S/T][E/D/K][E/D]; e Motivo 5 (SEQ ID NO: 42): [V/L/A/F][V/T]jy/í/A]Q[L/M]RDP[l/L/M/T]R[R/Q]{Y/F]E[A/S/E]VG[G/A3 [P/T][V/M/L/S][V/M/IHAA/][V/L/f3[V/L/l]IH/Q]A[TA//E]; e Motivo A (SEQ ID NO: 43): M[Q/H/N][K/R][L/M][S/G]CLFSVEVV{A/T/i][V/A][G/Ej[G/N/D]LP[A/S3 SMNGLRL[S/A/G]V[C/A/S]VRKKETfKyR][D/E]G[A/S][V/M}[N/Q/H/K]TMP[S/C]R V[S/D/A/Hj[G/L/H]G[A/S/G][G/A]DFEET[L/M]F[l/V/L][K/R](C/S][H/N]jy/L/A]Y; e Motivo Ba (SEQ ID NO 45): [K/R/T]FE[Q/P/A/S]R[PA//L]F[F/W/M/S/L][I/LA//F][Y/S][V/L/A][F/V][A/ S3V[D/E]A[E/D/K/Q/P][A/E]L[D/E/S][F/L]GR[T/S/H/N][S/Y/I/L/A]VDLS[E/Q/L/R]L[ 1A/][Q/K/R]ES[IA//M/T/S][E/D/G][K/R][S/N][Q/A/Y}[E/Q][G/D][T/L/A/M/E]R[V/L]R QWD[T/M/R][S/N/Aj[F/W/L][S/N/G/P/K]L[S/A]GKAKGGEL[V/A/l][L/V]KL[G/S/A]F QIM[E/D}[K/D][E/D/G]G[G/V][i/V/A/G] ou, alternativamente, o Motivo B (SEG ID NO: 44); [K/R/T]FE[Q/P/A/S3R[PA//L]F[FAA//M/S/L}[I/L/V/F][Y/S][V/L/A][F/V]{A/ S]V[D/E]A[Ê/D/K/Q/P][A/E]L[D/E/S]|F/L]GR[T/S/H/N][S/Y/Í/L/A]VDLS[E/Q/L/R]L[ l/V][Q/K/R]ES[l/V/M/T/S][E/D/G][K/R}M[S/N][Q/A/Y][E/Q][G/Dj[T/L/A/M/E]R[V/L] RQWD[T/M/R][S/N/A][F/W/L][S/N/G/P/K]L[S/A]GKAKGGEL[V/A/I][LA/]KL[G/S/A JFQiM[E/D][K/D][E/D/G]G[G/V][i/V/A/Gj; ou (ii) quaisquer 6 dos motivos listados sob (i) ; ou (iií) quaisquer 5 dos motivos listados sob (i); ou (iv) quaisquer 4 dos motivos listados sob (i); ou (v) quaisquer 3 dos motivos listados sob (i); ou (vi) Motivos 1a, 2, 3b, 4a e 5 conforme descrito anteriormente no presente documento; ou (vii) Motivos A e Ba conforme descrito anteriormente no presente documento; ou (viii) quaisquer 4 dos motivos 1a, 2, 3b, 4a e 5 conforme descrito anteriormente no presente documento; ou (ix) Motivos 1a, 2 e 3b conforme descrito anteriormente no presente documento; ou (x) Motivos 4a e 5 conforme descrito anteriormente no presente documento; ou (xi) Uma combinação de (vi) e (vii) ou (vii) e (ix) ou (vii) e (x) anteriores.

2. MÉTODO PARA APRIMORAR UMA OU MAIS CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS AO RENDIMENTO EM PLANTAS EM RELAÇÃO A PLANTAS DE CONTROLE, que compreende as etapas de aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléíco que codifica um polípeptídeo e desenvolver a planta, em que o dito polipeptídeo compreende o domínio PFAM PF10358,

3. MÉTODO PARA APRIMORAR UMA OU MAIS CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS AO RENDIMENTO EM PLANTAS EM RELAÇÃO A PLANTAS DE CONTROLE, que compreende as etapas de aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléíco que codifica um polipeptídeo e desenvolver a planta, em que o dito polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: (t) uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2; e (ii) um sequência de aminoácido tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NQ: 2, ao longo de todo o comprimento das sequências representadas por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e com mais preferência ainda, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle.

4. MÉTODO PARA APRIMORAR UMA OU MAtS CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS AO RENDIMENTO EM PLANTAS EM RELAÇÃO A PLANTAS DE CONTROLE, que compreende as etapas de aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídea e desenvolver a planta, em que o dito polipeptídeo compreende o domínio PFAM PF10358 e em que o dito polipeptídeo compreende (i) todos os motivos a seguir; Motivo 1a (SEQ ID NO 35); [MA//1][P/A/G/S][L/I/M/T][D/E][E/D][L/MA/][L/IA//M]GKT[A/G]E[Q/H][I/ V]AFEG[l/Ml[AA/][Sfr/N]A[ÍA/]l[Q/S/L][G/A]R[N/S][K/A][E/D/A][G/RA//L][G/V)A[S /T/N][S/T][S/T]AA[R/Q/EJ[T/l/S/A3[l/Vj[A/S/T] ou, alternaíivamente, o Motivo 1 (SEQ ID NO; 34): [M/V/I][P/A/G/S][L/I/M/T][D/E][E/D][L/MA/][L/IA//M]GKT[A/G]E[Q/H][I/ V]AFEG[l/M][AA/][S/T/N]A[lA/]í[0/S/L][G/AjR{N/S)[K/A][E/D/A][G/RA//L][GA/]A[S /T/Nl[S/T][S/T]AA[R/0/EJ[T/!/S/A][IA/][AST3; e Motivo 2 (SEQ ID NO: 36): [V/N/l/C][Y/F][L/iA/][S/P]{E/D]LGKG[L/l][G/S][C/P][V/L/l3[V/l][Q/R]TfR/ K][D/N]GG[Y/F]L[A/V/T][A/S][T/M/L]NPIL/F][D/N][T/I/V/N][I/AA//L/P][V/M][S/A/T/ M/G/E][R/K][K/N][D/E][T/A/L3PKL[AA/]MQ[L/I/M]S[K/R][P/A/Q][L/F/Y/I/MA/][V/I/L }[L/V/Fj; e Motivo 3b (SEQ ID NO: 39): ÍS/K/E/L/V][K/E/S/A][G/D/E/S][K/Q/P/E/H/N][D/E][L/V/M/I/F/Q]LWS[I/ L/M]SSRílA/][MA/]ADMWL[K/R](P/T/S/H][M/i/L]RNPD[V/l]ÍK/N/l] ou, alternaíivamente, o Motivo 3 (SEQ ID NO: 37); [S/K/E/LA/][K/E/S/A][G/D/E/S]QQ[K/Q/P/E/H/N][D/E][L/V/M/I/F/Q]LW S[l/L/M]SSR[l/V][M/V]ADMWL[K/R]{P/T/S/H][M/!/L]RNPD[V/í3[K/N/l] ou, alternativamente, o Motivo 3a (SEQ ID NO 38): [S/K/E/LA/][K/E/S/A][G/D/E/S][Q/NONE}[K/Q/P/E/H/N][D/E][LA//M/l/F/ Q]LWS[i/L/M]SSR[l/V][M/V]ADMWL[K/R][P/T/S/H]|M/l/L]RNPD[V/IJ[K/N/!]; e Motivo 4a (SEQ ID NO: 41): M{A/G/S]fT/N/SA/][A/i/G][M/T/Ui][S/N/T][T/S/D/Y]fG/S]RíK/Q/N][E/D3 RIÍS/T/A/M/D3[T/S]G[I/L]WN[V/M/I/A3£N/D/E/S/H/Q][E/D][N/T/E/D/S]P[L/V/F]T[A/ V/G/S][E/D][E/K/N][V/l/L]L[A/S][FA//C/l][S/T/A][L/M/T3QKflA//L/M]E[V/A/S/F/T]M[ AA//T][I/V][E/K][A/G]LKÍIA/]Q[AA/][E/D/G)[I/MA/][AA//S/T][E/D/K][E/D] ou, alternativamente, o Motivo 4(SEG ID NO: 40): M[A/G/S]{T/N/S/V][A/l/G][M/T/L/t][S/N/T](T/S/D/Y][G/S]R[K/Q/N][E/D] Rl[S/T/A/M/D][T/S]G[i/L3WN[y/M/i/A][N/D/E/S/H/Q][E/D}fN/T/E/D/S]P[LA//F3TS[ AA//G/S][E/D][E/K/N][V/l/L]L[A/S][FA//C/l](SFr/A][L/MyT]QK[í/V/L/M]EIV/A/S/F/T] M[A/V/T][i/V3[E/K3(A/G]LK[fA/]Q[A/V][E/D/G][l/M/V][AA//S/T]{E/D/KJfE/D]; e Motivo 5 (SEQ ID NO: 42): [V/L/A/F][V/T][V/I/A]Q[L/M]RDP[I/L/M/T]R[R/Q][Y/F]E[A/S/E]VG[G/A][ P/T][V/M/L/S][V/M/i3[A/V}[V/L/l][V/L/l3[H/Q3AITA//E3; e Motivo A (SEQ ID NO: 43): M[Q/H/N][K/R][L/M}[S/G]CLFSVEW[A/T/l][V/A][Q/E][G/N/DjLP[A/S] SMNGLRL[S/A/G]V[C/A/S]VRKKET[K/R][D/E3G[A/S3[V/M][N/Q/H/K3TMP[S/C]R V[S/D/A/H][Q/L/H]G[A/S/G](G/A3DFEET[L/M]F(i/V/t][K/R][C/S][H/N][V/L/A]Y; e Motivo Ba (SEQ ID NO 45): [K/R/T]FE(Q/P/A/SJR[PA//L]F[FAA//M/S/L][i/L/V/F][Y/S][V/L/A](FA/][A/ S]V[D/E]A[E/D/K/Q/P][A/E]L[D/E/S]ÍF/L]GR[T/S/H/N][S/Y/I/L/A]VDLS[E/Q/L/R]L[ fA/][Q/K/R]ES[IA//M/T/S]ÍE/D/G][K/R][S/N][Q/A/Y]{E/Q][G/D][T/L/A/M/E]R[V/L]R QWDET/M/R][S/N/A][F/W/L][S/N/G/P/K]L[S/A]GKAKGGEL[V/A/I3[L/V]KL[G/S/A]F QIM[E/D][K/D][E/D/G]G[GA/][IA//A/G3 ou, alternativamente, o Motivo B (SEQ 1D NO: 44): [K/R/T]FE[Q/P/A/S]R[P/V/L]F[FA/V/M/S/L1[1/LA//F]IY/S][V/L/A][F/V][A/ SMD/E]A[E/D/K/Q/P][A/E]L[D/E/S][F/L]GRET/S/H/N][S/Y/I/L/A]VDLS[E/Q/L/R3LE l/V][Q/K/R]ES[IA//M/T/S][E/D/G][K/R]M[S/N3[Q/A/Y][E/QJ[G/D][T/L/A/M/E]R[V/L] RQWD[T/M/R][S/N/A][FA/V/L][S/N/G/P/K]L[S/A]GKAKGGEL[V/A/I][L/V]KL[G/S/A ]FOIM{E/D]EK/D][E/D/G]G[GA/]|IA//A/G]; ou (ii) quaisquer 6 dos motivos listados sob (i) ; ou (iti) quaisquer 5 dos motivos listados sob (i); ou (iv) quaisquer 4 dos motivos listados sob (i); ou (v) quaisquer 3 dos motivos listados sob (i), ou (vi) Motivos 1a, 2, 3b, 4a e 5 conforme descrito anteriormente no presente documento; ou (vii) Motivos A e Ba conforme descrito anteriormente no presente documento; ou (vííi) quaisquer 4 dos motivos 1a, 2, 3b, 4a e 5 conforme descrito anteriormente no presente documento; ou (ix) Motivos 1a, 2 e 3b conforme descrito anteriormente no presente documento; ou (x) Motivos 4a e 5 conforme descrito anteriormente no presente documento; ou (xí) Uma combinação de (vi) e (vii) ou (vii) e (ix) ou (vii) e (x) anteriores,

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, em que o Motivo 1 ou 1a ê substituído pelo motivo 1*(SEQ ID NO: 46), motivo 2 pelo motivo 2* ( SEQ ID NO: 47), motivo 3 pelo motivo 3* ( SEQ ID NO: 48), motivo 4 pelo motivo 4* ( SEQ ID NO: 49), motivo 5 pelo motivo 5* ( SEQ !D NO: 50), motivo A peio motivo A* ( SEQ tD NO: 51) e/ou motivo B pelo motivo B* ( SEQ ID NO: 52), de preferência, todos os motivos 1, 1a, 2, 3, 4, 5, A e B são substituídos de modo correspondente,

6. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, em que a expressão do ácido nuciéico que codifica um polipeptídeo é aumentada por um ou mais métodos recombinantes.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o dito polipeptídeo codificado pelo dito ácido nuciéico é selecionado a partir do grupo que consiste em; (í) uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2; e (íi) uma sequência de aminoácido tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24. 26, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, ao longo de todo o comprimento das sequências representadas por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30. 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 82, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e com mais preferência ainda, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a dita expressão é efetuada introduzindo-se e expressando-se em uma planta do dito ácido nucléico que codifica do dito polipeptídeo.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o dito ácido nucléico é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um ácido nucléico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 53, 55, 57, 59,61,63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ID NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO: 1; (ii) o complemento de um ácido nucléico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71; de preferência, SEQ ÍD NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, com mais preferência, SEQ ID NO: 1; (ii!) um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo, em ordem crescente de preferência, pelo menos 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%. 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a toda a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, de preferência, SEQ ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 ou 72, com mais preferência, SEQ ID NO: 2, e com mais preferência ainda, conferindo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle; e (iv) uma molécula de ácido nucléico que se híbridiza com uma molécula de ácido nucléico de (í) a (iii) sob condições de hibridização altamente rigorosas e, de preferência, confere uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que as ditas uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento compreendem um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e de preferência, compreendem uma biomassa aumentada e/ou rendimento de sementes aumentado em relação a plantas de controle, e, de preferência, compreendem uma biomassa acima do solo aumentada, uma biomassa abaixo do solo aumentada, um rendimento de sementes aumentado e/ou um rendimento de açúcares aumentado em relação a plantas de controle.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o dito polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste m; a. Uma proteína ácida com um valor de ponto isoeiétrico (pl) menor que 7,0; b. Uma proteína com um teor de enxofre contendo aminoácidos igual ou menor que 5%, em número; c. Uma proteína que compreende ou contém pelo menos 30%, em número, de aminoácidos com uma cadeia lateral aüfática; e d. Qualquer combinação de a. a c. anteriores.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que as ditas um ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento são obtidas sob condições de não-estresse.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que as ditas uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento são obtidas sob condições de estresse ambiental, de preferência sob condições de estresse de temperatura, estresse salino, deficiência de nitrogênio e/ou aridez.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a dita molécula de ácido nuciéico ou o dito polipeptídeo, respectivamente, são de origem vegetal, de preferência, de uma planta dicotiledônea, com mais preferência ainda, da família Sahcaceae. com mais preferência, do gênero Populus, com a máxima preferência, da Populus trichocarpa.

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o dito ácido nuciéico que codifica um polipeptídeo codifica qualquer um dos polipeptídeos listados na Tabela A ou consiste em uma porção de tai ácido nuciéico, ou um ácido nuciéico capaz de se hibridizar com uma sequência complementar de tal ácido nuciéico.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a dita sequência de ácido nuciéico codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer um dos polipeptídeos dados na Tabela A.

17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o polipeptídeo é uma proteína envolvida e/ou responsável pefo movimento de plastídeo dentro de uma célula vegetal.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que o dito ácido nuciéico é operacionalmente ligado a um promotor constitutivo de origem vegetal, de preferência, a um promotor constitutivo de resistência média de origem vegetal, com mais preferência, a um promotor GOS2, com a máxima preferência, a um promotor GOS2 proveniente do arroz.

19. ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, selecionado a partir do grupo que consiste em: a. Um ácido nuciéico da sequência conforme descrito em SEQ ÍD NO: 1, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ou 71, de preferência, SEQ ID NO: 1; ou b. Um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da sequência descrita em SEG iD NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 OU 72, de preferência, SEG iD NO: 2.

20. POLIPEPTÍDEO ISOLADO, com a sequência do polipeptídeo conforme descrito em SEG ID NO: 2, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 OU 72, de preferência, SEG ÍD NO: 2.

21. CONSTRUÇÃO, que compreende: (i) um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4. 5,7, 9, 11 e 14 a 17; (ii) uma ou mais sequências de controle capazes de conduzir a expressão da sequência de ácido nucléico de (i); e, opcionalmente (iii) uma sequência de terminação de transcrição.

22. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 21, em que a construção é uma construção de super-expressão.

23. CONSTRUÇÃO DE SUPER-EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 22, em que uma das ditas sequências de controle é um promotor constitutivo, de preferência, um promotor constitutivo de resistência média, de preferência, um promotor vegetal, com mais preferência, um promotor GOS2, com a máxima preferência, um promotor GOS2 proveniente do arroz.

24. PLANTA, parte de planta ou célula vegeta! transformada com uma construção, de acordo com as reivindicações 21 a 23.

25. CÉLULA HOSPEDEIRA, de preferência, uma célula hospedeira bacteriana, com mais preferência, uma célula hospedeira de espécie Agrobacterium que compreende a construção, de acordo com qualquer reivindicação 21 a 23 ou o ácido nucléico conforme definido nas reivindicações 1, 3, 4, 5,7, 9, 11 e 14 a 17.

26. USO, de uma construção, de acordo com a reivindicação 21, 22 ou 23 em um método para produção de plantas tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento, de preferência, um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e com mais preferência, um rendimento de sementes aumentado e/ou uma biomassa aumentada em relação a plantas de controle.

27. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle, de preferência, um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e, com mais preferência, um rendimento de sementes aumentado e/ou uma biomassa aumentada em relação a plantas de controle, que compreende: (i) introduzir e expressar em uma célula vegetai ou planta um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4, 5,7, 9, 11 e 14 a 17; e (ii) cultivar a dita célula vegetal ou planta sob condições que promovam o crescimento e o desenvolvimento de vegetais.

28. PLANTA, ou parte desta, que inclui uma semente ou célula vegetal, obteníveis por um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que a dita planta, parte de planta ou célula vegetal compreendem um ácido nucléico recombinante que codifica um polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 e 14 a 17,

29. PLANTA TRANSGÊNICA, tendo uma ou mais características aprimoradas relacionadas ao rendimento em relação a plantas de controle, de preferência, um rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e, com mais preferência, um rendimento de sementes aumentado e/ou uma biomassa aumentada, resultante a partir de uma expressão aumentada de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4, 5, 7» 9» 11 e 14 a 17 ou uma célula de planta transgênica derivada a partir da dita planta transgênica.

30. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 28 ou 29, ou uma célula de planta transgênica derivada a partir da mesma, em que a dita planta é uma planta de colheita, tais como plantas dicotiledoneas tipo soja, algodão, sementes oleaginosas que incluem canola, beterraba, beterraba sacarina ou alfalfa; ou uma planta monocotiledênea, tal como cana-de-açücar; ou um cereal, tal como arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, triticafe, sorgo, trigo emmer, espelta, secale, trigo tipo einkorn, teff, milo e aveia.

31. PARTE COLHEJTAVEL DE UMA PLANTA, de acordo com a reivindicação 24, 28, 29 ou 30 e que compreende a construção, de acordo com a reivindicação 21, 22 ou 23 e/ou o ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 19 e/ou o polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 20, em que as partes colheitáveís são, de preferência, uma biomassa de ramos e/ou uma biomassa de raiz e/ou sementes.

32. PRODUTO DERIVADO, a partir de uma planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 28, 29 ou 30 e/ou a partir de partes colheitáveís de uma planta, de acordo com a reivindicação 31, que compreende a construção, de acordo com a reivindicação 21, 22 ou 23 e/ou o ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 19 e/ou o polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 20.

33. USO, do ácido nucléico que codifica um polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 19 ou conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4, 5,7, 9, 11 e 14 a 17 ou a construção, de acordo com a reivindicação 21, 22, ou 23 ou o polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 20 ou conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4, 5,7, 9, 11 e 14 a 17 para aprimorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle sob condições de estresse ambiental e/ou condições de não-estresse, de preferência, para aumentar o rendimento, e, com mais preferência, para aumentar o rendimento de sementes e/ou para aumentar a biomassa em plantas em relação a plantas de controle.

34. MÉTODO, para a produção de um produto que compreende as etapas de desenvolver as plantas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 28, 29 ou 30 e produzir o dito produto a partir ou através de a. ditas plantas; ou b. partes, incluindo sementes, das ditas plantas.

35 DNA CROMOSSÔM1CO RECOMBINANTE, que compreende a construção, de acordo com a reivindicação 21, 22 ou 23.

36. CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 21, 22 ou 23 ou DNA cromossômíco recombinante, de acordo com a reivindicação 35 compreendido em uma célula vegetal.

37. GRÃO DE PÓLEN TRANSGÊNICO, que compreende a construção, de acordo com a reivindicação 21, 22 ou 23.

38. COMPOSIÇÃO, que compreende o DNA cromossômíco recombinante, de acordo com a reivindicação 35 e/ou a construção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, e uma célula hospedeira, de preferência, uma célula vegetai, em que o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção são compreendidos dentro da célula hospedeira.