MX2012009971A - Plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento y un metodo para producirlas. - Google Patents

Abstract

Un método para mejorar, en plantas, varios rasgos relacionados con el rendimiento de importancia económica. Más específicamente, un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI (proteína de interés). También, plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, en donde dichas plantas tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control. También, provee ácidos nucleicos que codifican POI y constructos que los comprenden desconocidos hasta el momento, útiles en la realización de los métodos de la invención.

Description

PLANTAS QUE TIENEN MEJORES RASGOS RELACIONADOS CON EL RENDIMIENTO Y UN MÉTODO PARA PRODUCIRLAS Las siguientes solicitudes de prioridad se incorporan por referencia a la presente: US 61/316012 y EP 10157199.0.

La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular y se relaciona con un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa). La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa), cuyas plantas tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las correspondientes plantas de tipo silvestre u otras plantas de control. La invención también provee constructos útiles en los métodos de la invención.

Un rasgo de particular interés económico se refiere a un aumento del rendimiento.

Normalmente, el rendimiento se define como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto se puede definir en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diversos factores, por ejemplo, la cantidad y el tamaño de los órganos, la arquitectura de la planta (por ejemplo, la cantidad de ramas), la producción de semillas y la senectud de las hojas. El desarrollo de la raíz, la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés y el vigor temprano también pueden ser factores importantes para determinar el rendimiento. En consecuencia, la optimización de los factores antes mencionados puede contribuir a aumentar el rendimiento del cultivo.

En condiciones de campo, el rendimiento de las plantas, por ejemplo, en términos de crecimiento, desarrollo, acumulación de biomasa y generación de semillas, depende de la tolerancia de una planta y de su capacidad para aclimatarse a diversas condiciones ambientales, cambios y tipos de estrés.

Los biotecnólogos agrícolas usan mediciones de diversos parámetros que indican el posible impacto de un transgen en el rendimiento de los cultivos. Para los cultivos de forraje como alfalfa, maíz ensilado y heno, la biomasa de la planta se correlaciona con el rendimiento total. Sin embargo, para los cultivos de grano, se usaron otros parámetros para calcular el rendimiento, tales como el tamaño de planta, medido por el peso total fresco y seco de la planta, el peso fresco y seco aéreo y subterráneo, el área de la hoja, el volumen del tallo, la altura de la planta, la longitud de la hoja, la longitud de la raíz, la cantidad de vástagos y la cantidad de hojas. El tamaño de la planta en una etapa temprana del desarrollo normalmente se correlaciona con el tamaño de la planta en una etapa posterior del desarrollo. Una planta más grande con una mayor área de hoja normalmente puede absorber más luz y dióxido de carbono que una planta más pequeña y, por lo tanto, probablemente gane más peso durante el mismo período. Existe un fuerte componente genético que determina el tamaño y la velocidad de crecimiento de la planta y, por lo tanto, para diversos genotipos, es posible que el tamaño de la planta en una determinada condición ambiental se correlacione con el tamaño en otra. De esta manera, se puede usar un ambiente estándar que se asemeje a los diversos ambientes dinámicos que enfrentan los cultivos en el campo. Las plantas que exhiben tolerancia a un tipo de estrés abiótico en general exhiben tolerancia a otro tipo de estrés ambiental. Este fenómeno de tolerancia cruzada no se comprende al nivel mecánico. Sin embargo, es razonable esperar que las plantas que exhiben mejor tolerancia a la baja temperatura, por ejemplo, temperaturas de heladas y/o de congelación, debido a la expresión de un transgén también puedan exhibir tolerancia al estrés por sequía y/o salino y/o a otro tipo de estrés abiótico. Se caracterizaron algunos genes que participan en las respuestas al estrés, el uso de agua y/o biomasa en plantas, pero hasta el momento los intentos por desarrollar plantas de cultivos transgénicos con mejor rendimiento han sido limitados.

En consecuencia, es necesario identificar genes que confieren, cuando se sobreexpresan o regulan en forma descendente, mayor tolerancia a diversos tipos de estrés y/o mejor rendimiento en condiciones de crecimiento óptimas y/o subóptimas.

Ahora se ha descubierto que se puede aumentar el rendimiento y se pueden mejorar varios rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en la planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI (proteína de interés).

SÍNTESIS Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que modular la expresión de un ácido nucleico que codifica la fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) produce plantas que tienen mayor rendimiento y mejores rasgos relacionados con el rendimiento, en particular, mayor biomasa de brote y/o raíz, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con una forma de realización, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica la fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa).

De acuerdo con la invención, por lo tanto, los genes identificados en la presente se pueden usar para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento, en particular, mayor biomasa de brote y/o mayor biomasa de raíz, con respecto a las plantas de control. El aumento del rendimiento se puede determinar en pruebas de campo de plantas transgénicas y sus plantas de control adecuadas. Alternativamente, se puede determinar la capacidad de un transgen para aumentar el rendimiento en un modelo de planta en condiciones de crecimiento óptimas y controladas. El aumento del rendimiento se puede determinar al medir cualquiera de los siguientes fenotipos o una combinación de éstos, en comparación con las plantas de control: rendimiento de las partes secas cosechables de la planta, rendimiento de las partes secas cosechables aéreas de la planta, rendimiento de las partes secas cosechables subterráneas de la planta, rendimiento del peso fresco de las partes cosechables de la planta, rendimiento del peso fresco de las partes cosechables aéreas de la planta, rendimiento del peso fresco de las partes cosechables subterráneas de la planta, rendimiento de la fruta de la planta (fresco y seco), rendimiento de las semillas (fresco y seco), peso de los granos secos y similares. Se puede demostrar la mayor capacidad de crecimiento intrínseco de una planta mediante una mejora en su rendimiento de semillas (por ejemplo, mayor tamaño de semilla/grano, mayor cantidad de mazorcas, mayor cantidad de semillas por mazorca, mejora del llenado de semillas, mejora de la composición, y similares); una modificación de su crecimiento y desarrollo inherentes (por ejemplo, altura de planta, velocidad de crecimiento de planta, cantidad de vainas, cantidad de internodos, momento de floración, resquebrajamiento de la vaina, eficacia de la fijación de nitrógeno y nodulación, eficacia de la asimilación de carbono, mejora del vigor temprano/vigor de plántula, mejor eficacia de la germinación, mejora de la arquitectura de la planta, modificaciones del ciclo celular y/o similares).

Los rasgos relacionados con el rendimiento también se pueden mejorar para aumentar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico ambiental. Los tipos de estrés abiótico incluyen sequía, bajas temperaturas, salinidad, estrés osmótico, sombra, alta densidad de las plantas, tipos de estrés mecánico y estrés oxidativo. Los fenotipos adicionales que se pueden controlar para determinar una mayor tolerancia al estrés ambiental abiótico incluyen, pero no se limitan a, marchitamiento; amarronamiento de la hoja; presión de turgencia; curvatura y/o caída de las hojas o agujas; senectud prematura de las hojas o agujas; pérdida de clorofila en las hojas o agujas y/o color amarillento de las hojas. Cualquiera de los fenotipos relacionados con el crecimiento descritos anteriormente se pueden controlar en las plantas de cultivo en las pruebas de campo o en modelos de plantas en condiciones de crecimiento controlado para demostrar que una planta transgénica tiene mayor tolerancia a los tipos de estrés abiótico ambiental.

DEFINICIONES Polipéptido(s)/Proteína(s) Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan en forma indistinta en la presente y se refieren a los aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud, ligados por enlaces peptídicos.

Polinucleótido(sVÁcido(s) nucleico(s)/Secuencia(s) de ácidos nucleicos/Secuencia(s) de nucleótidos Los términos "polinucleótido(s)", "secuencia(s) de ácidos nucleicos", "secuencia(s) de nucleótidos", "ácido(s) nucleico(s)", "molécula de ácido nucleico" se usan en forma indistinta en la presente y se refieren a nucleótidos, sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica no ramificada de cualquier longitud.

Homóloqo(s) Los "homólogos" de una proteína abarcan los péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos con respecto a la proteína en cuestión no modificada y que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada de la cual derivan.

Una eliminación se refiere a la supresión de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una inserción se refiere a la introducción de uno o más residuos de aminoácidos en un sitio predeterminado de una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones N-terminal y/o C-terminal y también inserciones intrasecuencia de aminoácidos únicos o múltiples. Generalmente, las inserciones en la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones N- o C-terminal, en el orden de alrededor de 1 a 10 residuos. Los ejemplos de péptidos o proteínas de fusión N- o C-terminal incluyen el dominio de unión o dominio de activación de un activador de la transcripción como se usa en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de recubrimiento de fagos, (histidina)-6- tag, glutatión S-transferasa-tag, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epitopo Tag-100, epitopo c-myc, epitopo FLAG® , lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epitopo HA, epitopo de proteína C y epitopo VSV.

Una sustitución se refiere al reemplazo de aminoácidos de la proteína con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión similar a formar o romper estructuras helicoidales a o estructuras de hoja ß). Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos únicos, pero se pueden agrupar según las restricciones funcionales del polipéptido y pueden variar de 1 a 10 aminoácidos; generalmente, las inserciones serán del orden de alrededor de 1 a 10 residuos de aminoácidos. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las tablas de sustituciones conservadoras son conocidas en el arte (véase, por ejemplo. Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds) y la siguiente Tabla 1 ).

Tabla 1 : Ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos Las sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos se pueden realizar fácilmente mediante las técnicas de síntesis de péptidos conocidas en el arte, tales como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o mediante la manipulación de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir sustitución, inserción o eliminación de variantes de una proteína son muy conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados del ADN son muy conocidas por los expertos en el arte e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis de T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

Derivados Los "derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden comprender, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma natural de la proteína tal como la proteína de interés, sustituciones de aminoácidos por residuos de aminoácidos no naturales o adiciones de residuos de aminoácidos no naturales. Los "derivados" de una proteína también abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos alterados de forma natural (glucosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, etc.) o alterados de forma no natural, en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones de no aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cual deriva, por ejemplo una molécula informadora u otro ligando, unido de forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula indicadora que se liga para facilitar su detección y residuos de aminoácidos no naturales, con respecto a la secuencia de aminoácidos de una proteína natural. Además, los "derivados" también incluyen fusiones de la forma natural de la proteína con péptidos rotuladores tales como FLAG, HIS6 o tiorredoxina (para una reseña sobre péptidos rotuladores, véase Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

Ortóloqo(s)/Paráloqo(s) Los ortólogos y parálogos abarcan conceptos evolutivos que se utilizan para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que han sido originados por duplicación de un gen ancestral; los ortólogos son genes que provienen de diferentes organismos que han sido originados por especiación y también derivan de un gen ancestral común.

Dominio. Motivo/Secuencia de consenso/Característica El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de proteínas relacionadas en la evolución. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que probablemente son esenciales para la estructura, estabilidad o función de una proteína. Si se los identifica por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, se los puede utilizar como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos previamente identificada.

El término "motivo" o "secuencia de consenso" o "característica" se refiere a una región corta conservada en la secuencia de proteínas relacionadas en la evolución. Con frecuencia, los motivos son partes altamente conservadas de dominios, pero también pueden incluir sólo parte del dominio, o pueden estar ubicados fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo están fuera de un dominio definido).

Existen bases de datos especializadas para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucí. Acids. Res. 31 , 315-318), Prosite (Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61 , AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucí. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)) o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1 ): 276-280 (2002)). Un conjunto de herramientas para el análisis in silico de secuencias proteicas se encuentra disponible en el servidor proteómico ExPASy (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31 :3784-3788(2003)). También se pueden identificar dominios o motivos mediante técnicas de rutina, tales como alineamiento de secuencias.

Los métodos para el alineamiento de secuencias para la comparación son muy conocidos en el arte, dichos métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para hallar el alineamiento global (es decir, que abarca las secuencias completas) de dos secuencias que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de brechas. El algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está disponible al público mediante National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Se pueden identificar fácilmente homólogos mediante, por ejemplo, el algoritmo ClustalW de alineamiento de secuencia múltiple (versión 1.83), con los parámetros predeterminados de alineamiento de a pares y un método de calificación en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud e identidad también se pueden determinar mediante uno de los métodos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Se puede realizar edición manual menor para optimizar el alineamiento entre motivos conservados, como sería evidente para un experto en el arte. Además, en lugar de utilizar secuencias de longitud total para la identificación de homólogos, también se pueden utilizar dominios específicos. Los valores de identidad de secuencia se pueden determinar con respecto a la secuencia completa de ácidos nucleicos o aminoácidos, o con respecto a motivo(s) conservado(s) o dominios seleccionados, utilizando los programas antes mencionados con los parámetros predeterminados. Para los alineamientos locales, el algoritmo de Smith-Waterman es particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981 ) J. Mol. Biol 147(1 ); 195-7).

BLAST recíproco En general, esto incluye un primer BLAST que implica someter a BLAST una secuencia incógnita (por ejemplo, usando cualquiera de las secuencias enumeradas en la Tabla A de la sección de Ejemplos) con respecto a cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos disponible al público NCBI. Generalmente, se utiliza BLASTN o TBLASTX (con valores predeterminados estándar) cuando se comienza desde una secuencia de nucleótidos y BLASTP o TBLASTN (con valores predeterminados estándar) cuando se comienza desde una secuencia de proteínas. Los resultados de BLAST se pueden filtrar opcionalmente. Las secuencias de longitud total de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados luego se someten de nuevo a BLAST (segundo BLAST) con respecto a secuencias provenientes del organismo del cual deriva la secuencia incógnita Luego se comparan los resultados del primer y segundo BLAST. Se identifica un parálogo si una coincidencia de alto rango del primer blast proviene de la misma especie de la cual deriva la secuencia incógnita, entonces un nuevo blast idealmente daría como resultado que la secuencia incógnita se encuentre entre las mayores coincidencias; se identifica un ortólogo si una coincidencia de alto rango en el primer BLAST no proviene de la misma especie de la cual deriva la secuencia incógnita y preferentemente, daría como resultado que el nuevo BLAST en la secuencia incógnita se encuentre entre las mayores coincidencias.

Las coincidencias de alto rango son aquellas que tienen bajo valor E. Cuanto más bajo es el valor E, más importante es la calificación (o, en otras palabras, menor es la probabilidad de hallar la coincidencia por azar). El cálculo del valor E es bien conocido en el arte. Además de los valores E, las comparaciones también se calificaron por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere a la cantidad de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polípéptidos) comparadas a lo largo de una longitud particular. En el caso de grandes familias, se puede utilizar ClustalW, seguido por un árbol de unión cercana, para contribuir a visualizar la agrupación de genes relacionados e identificar ortólogos y parálogos.

Hibridación El término "hibridación", como se define en la presente, es un proceso en el cual las secuencias de nucleótidos complementarias sustancialmente homologas se aparean entre sí. El proceso de hibridación se puede producir por completo en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El proceso de hibridación también se puede producir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como esferas magnéticas, esferas de sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación también se puede producir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o nylon o inmovilizado, por ejemplo, por fotolitografía, por ejemplo, en un soporte de vidrio silíceo (este último se conoce como arreglos o microarreglos de ácido nucleico o como chips de ácido nucleico). Con el fin de permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácido nucleico generalmente se desnaturalizan en forma térmica o química para fundir una doble cadena en dos cadenas simples y/o eliminar las horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios.

El término "rigurosidad" se refiere a las condiciones en las cuales tiene lugar la hibridación. La rigurosidad de hibridación está influenciada por condiciones tales como temperatura, concentración salina, fuerza iónica y composición del buffer de hibridación. Generalmente, las condiciones de baja rigurosidad se seleccionan para que sean de alrededor de 30 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media son aquellas en que la temperatura es 20 °C por debajo de Tm y las condiciones de rigurosidad alta son aquellas en que la temperatura es 10 °C por debajo de Tm. Las condiciones de rigurosidad alta se utilizan típicamente para aislar secuencias de hibridación que tienen mucha similitud de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos blanco. Sin embargo, los ácidos nucleicos se pueden desviar en secuencia y aún así codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. En consecuencia, algunas veces las condiciones de hibridación de rigurosidad media pueden ser necesarias para identificar dichas moléculas de ácido nucleico.

La Tm es la temperatura con una fuerza iónica y pH definidos, a la cual el 50% de la secuencia blanco se híbrida a una sonda perfectamente apareada. La Tm depende de las condiciones de la solución y la composición base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. La tasa máxima de hibridación se obtiene de alrededor de 16 °C a 32 °C por debajo de Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electroestática entre las dos cadenas de ácido nucleico, promoviendo de este modo la formación de híbridos; este efecto es visible para las concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (para mayores concentraciones, este efecto se puede ignorar). La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 a 0,7°C para cada porcentaje' de formamida, y la adición de 50% de formamida permite que la hibridación se realice de 30 a 45 °C, si bien se reducirá la tasa de hibridación. Los errores de apareamiento de los pares de bases reducen la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para sondas grandes, la Tm disminuye alrededor de 1°C por % de errores de apareamiento de las bases. La Tm se puede calcular con las siguientes ecuaciones, según los tipos de híbridos: 1 ) Híbridos de ADN-ADN ( einkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984): Tm= 81,5°C + 16,6xlog10[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] - 500x[LT1 - 0,61x% de formamida 2) Híbridos de ADN-ARN o ARN -ARN: Tm= 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11 ,8 (%G/Cb)2 - 820/Lc 3) Híbridos de oligo-ADN u oligo-ARNd: Para <20 nucleótidos: Tm= 2 (ln) Para 20-35 nucleótidos: Tm= 22 + 1 ,46 (ln) a o para otro catión monovalente, pero sólo exacto en el rango 0,01-0,4 M. b sólo exacto para el % de GC en el rango de 30% a 75%. 0 L = longitud del dúplex en pares de bases. d oligo, oligonucleótidos; ln, = longitud efectiva del cebador = 2*(No. de G/C)+(No. de A/T).

La unión no específica se puede controlar mediante cualquiera de las numerosas técnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteínas, adiciones de ARN, ADN y SDS heterólogos al buffer de hibridación y tratamiento con Rnasa. Para las sondas no homologas, se puede realizar una serie de hibridaciones al variar uno de los siguientes: (i) disminuir progresivamente la temperatura de apareamiento (por ejemplo, de 68°C a 42°C) o (¡i) disminuir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo, de 50% a 0%).

El experto en el arte conoce varios parámetros que se pueden alterar durante la hibridación y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de la hibridación generalmente también depende de la función de los lavados posteriores a la hibridación. Para retirar el fondo que resulta de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de dichos lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: a menor concentración salina y mayor temperatura del lavado, mayor rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente con la rigurosidad de la hibridación o con una rigurosidad inferior a ésta. Una hibridación positiva produce una señal que es por lo menos el doble de la del fondo. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o procedimientos de detección de amplificación génica son como se indicaron anteriormente. También se pueden seleccionar condiciones más o menos rigurosas. El experto en el arte conoce varios parámetros que se pueden alterar durante el lavado y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad típicas para los híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos comprenden hibridación a 65°C en 1x SSC o a 42°C en 1x SSC y 50% de formamida, seguida de lavados a 65°C en 0,3x SSC. Los ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos comprenden hibridación a 50°C en 4x SSC o a 40°C en 6x SSC y 50% de formamida, seguida de lavados a 50°C en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud prevista para el ácido nucleico de hibridación. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, se puede determinar la longitud del híbrido mediante el alineamiento de las secuencias y la identificación de las regiones conservadas descritas en la presente. 1 *SSC es NaCI 0,15 M y citrato de sodio 15 mM; la solución de hibridación y las soluciones de lavado también pueden incluir reactivo de Denhardt 5x, 0,5-1 ,0% de SDS, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, 0,5% de pirofosfato de sodio.

A fin de definir el nivel de rigurosidad, se puede hacer referencia a Sambrook et al. (2001 ) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 y las actualizaciones anuales).

Variante de empalme Como se usa en la presente, el término "variante de empalme" abarca variantes de una secuencia de ácidos nucleicos en la cual se escindieron, reemplazaron, desplazaron o agregaron intrones y/o exones seleccionados, o en la cual se acortaron o alargaron intrones. Dichas variantes serán aquellas en las que la actividad biológica de la proteína es sustancialmente retenida; esto se puede obtener mediante la retención selectiva de segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de empalme se pueden hallar en la naturaleza o pueden ser fabricadas por el hombre. Los métodos para predecir y aislar dichas variantes de empalme son muy conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Foissac and Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alélica Los alelos o las variantes alélicas son formas alternativas de un gen determinado, ubicado en la misma posición del cromosoma. Las variantes alélicas abarcan polimorfismos de nucleótido único (SNP) y también polimorfismos de inserción/eliminación pequeña (INDEL). Usualmente, el tamaño de los INDEL es menor de 100 pb. Los SNP e INDEL forman el mayor conjunto de variantes de secuencia en las cepas polimórficas naturales de la mayoría de los organismos.

Gen endógeno La referencia en la presente a un gen "endógeno" no sólo se refiere al gen en cuestión como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin que medie intervención humana), sino que también se refiere a ese mismo gen (o a un gen/ácido nucleico sustancialmente homólogo) en forma aislada que es (re)introducido posteriormente en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene dicho transgén puede presentar una reducción sustancial de la expresión del transgén y/o una reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado se puede aislar de un organismo o puede ser preparado por el hombre, por ejemplo, mediante síntesis química.

Transposición génica/Evolución dirigida El transposición génica o la evolución dirigida consiste en iteraciones de transposición de ADN seguido del barrido y/o selección adecuada para generar variantes de ácidos nucleicos o porciones de éstos que codifican proteínas que tienen actividad biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; patentes estadounidenses 5.811.238 y 6.395.547).

Constructo Otros elementos reguladores pueden incluir mejoradores de la transcripción y de la traducción. Los expertos en el arte conocen las secuencias terminadoras y mejoradoras que pueden ser adecuadas para utilizar en la realización de la invención. También se puede agregar una secuencia intrónica a la región 5' no traducida (UTR) o en la secuencia codificante para aumentar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de definiciones. Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, mejoradoras, silenciadoras, intrónicas, regiones 3'UTR y/o 5'UTR) pueden ser elementos estabilizadores de ARN y/o proteína. El experto en el arte conoce dichas secuencias o las puede obtener fácilmente.

Los constructos genéticos de la invención también pueden incluir una secuencia de origen de replicación que es necesaria para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo de célula específica. Un ejemplo es cuando es necesario mantener un constructo genético en una célula bacteriana como elemento genético episomal (por ejemplo, una molécula de cósmido o plásmido) Los orígenes de replicación preferidos incluyen, pero no se limitan a, f 1 -ori y colE1.

Para detectar la transferencia exitosa de las secuencias de ácidos nucleicos como se usan en los métodos de la invención y/o la selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucleicos, es ventajoso usar genes marcadores (o genes indicadores). Por lo tanto, el constructo genético puede comprender, opcionalmente, un gen marcador seleccionable. Los marcadores seleccionabas se describen en mayor detalle en la sección "definiciones" de la presente. Los genes marcadores se pueden retirar o eliminar de la célula transgénica cuando dejan de ser necesarios. Las técnicas para retirar marcadores son conocidas en el arte, se describieron técnicas útiles en la sección de definiciones.

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se utilizan en forma indistinta en la presente y se deben interpretar en un contexto amplio para referirse a secuencias de ácidos nucleicos reguladoras capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las cuales están ligadas. El término "promotor" típicamente se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos de control ubicada corriente arriba del inicio de la transcripción de un gen y que participa en el reconocimiento y la unión de ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de este modo la transcripción de un ácido nucleico ligado operativamente. Los términos antes mencionados abarcan las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariótico clásico (incluso la caja TATA que es necesaria para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias de activación corriente arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a los estímulos del desarrollo y/o externos, o de manera específica de tejido. El término también incluye una secuencia reguladora transcripcional de un gen " procariótico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de la caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de la caja -10. El término "elemento regulador" también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o mejora la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, un tejido u un órgano.

Un "promotor de planta" comprende elementos reguladores que median la expresión de un segmento de una secuencia codificante en las células de las plantas. En consecuencia, un promotor de planta no necesita ser de origen vegetal, pero se puede originar a partir de virus o microorganismos, por ejemplo de virus que atacan las células de las plantas. El "promotor de planta" también se puede originar a partir de una célula de planta, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácidos nucleicos expresada en el proceso de la invención y que se describe en la presente. Esto también se aplica a otras señales reguladoras de "planta", tales como terminadores de "planta". Los promotores corriente arriba de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de la presente invención se pueden modificar mediante una o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de nucleótidos sin interferir con la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, el marco de lectura abierto (ORF) o la región reguladora 3' tal como terminadores u otras regiones reguladoras 3' que se localizan fuera del ORF. Además, es posible que la actividad de los promotores aumente mediante la modificación de su secuencia o que sean reemplazados por completo por promotores más activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico, como se describió anteriormente, debe estar ligada operativamente o comprender un promotor adecuado que exprese el gen en el punto temporal correcto y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la potencia del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato se pueden analizar, por ejemplo, mediante la unión operativa del promotor a un gen indicador y el análisis del nivel de expresión y patrón del gen indicador en varios tejidos de la planta. Los genes indicadores conocidos y adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se analiza al medir la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La potencia del promotor y/o el patrón de expresión luego se pueden comparar con los de un promotor de referencia (tal como el que se utiliza en los métodos de la presente invención). Alternativamente, la potencia del promotor se puede analizar mediante la cuantificación de los niveles de mARN o mediante la comparación de los niveles de mARN del ácido nucleico utilizado en los métodos de la presente invención, con niveles de mARN de genes housekeeping tales como rARN 18S, con los métodos conocidos en el arte, tales como Northern blotting con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativo en tiempo real o RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Generalmente, por "promotor débil" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por "nivel bajo" se entienden niveles de alrededor de 1/10.000 transcriptos a alrededor de 1/100.000 transcriptos, a alrededor de 1/500.0000 transcriptos por célula. Por el contrario, un "promotor fuerte" dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel alto o de alrededor de 1/10 transcriptos a alrededor de 1/100 transcriptos a alrededor de 1/1000 transcriptos por célula. En general, por "promotor de potencia media" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel más bajo que un promotor fuerte, en particular a un nivel que es, en todos los casos, inferior al obtenido bajo el control de un promotor 35S CaMV.

Ligado operativamente Como se usa en la presente, el término "ligado operativamente" se refiere a un enlace funcional entre la secuencia del promotor y el gen de interés, de modo que la secuencia del promotor puede iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo Un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es activo en la transcripción durante la mayoría, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en la mayoría de las condiciones ambientales, en al menos una célula, un tejido o un órgano. La siguiente Tabla 2a provee ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos Promotor ubicuo Un promotor ubicuo es activo en casi todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor regulado por el desarrollo Un promotor regulado por el desarrollo es activo durante ciertas etapas del desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios del desarrollo.

Promotor inducible Un promotor inducible ha inducido o aumentado la iniciación de la transcripción en respuesta a un estímulo químico (para una reseña, véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), ambiental o físico, o puede ser "inducible por estrés", es decir, que se activa cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o "inducible por patógeno" es decir, que se activa cuando una planta se expone a diversos patógenos.

Promotor específico de órgano/específico de tejido Un promotor específico de órgano o específico de tejido es un promotor capaz de iniciar preferentemente la transcripción en ciertos órganos o tejidos, tales como hojas, raíces, tejido de semilla, etc. Por ejemplo, un "promotor específico de raíz" es un promotor activo durante la transcripción predominantemente en las raíces de las plantas, excluyendo en gran medida cualquier otra parte de una planta, aun mientras permite cualquier expresión con pérdida en estas otras partes de la planta. Los promotores capaces de iniciar la transcripción sólo en ciertas células se denominan en la presente "específicos de célula".

Los ejemplos de promotores específicos de raíz se enumeran en la siguiente Tabla 2b: Tabla 2b: Ejemplos de promotores específicos de raíz Un promotor específico de semilla es activo durante la transcripción predominantemente en el tejido de semillas, pero no necesariamente en forma exclusiva en el tejido de las semillas (en casos de expresión con pérdida). El promotor específico de semilla puede ser activo durante el desarrollo de la semilla y/o durante la germinación. El promotor específico de semilla puede ser específico de endosperma/aleurona/embrión. Los ejemplos de promotores específicos de semilla (específicos de endosperma/aleurona/embrión) se indican en las siguientes Tabla 2c a Tabla 2f. Otros ejemplos de promotores específicos de semilla se proveen en Qing Qu and Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004), cuya descripción se incorpora a la presente por referencia como si se indicara en su totalidad.

Tabla 2c: Ejemplos de promotores específicos de semilla Tabla 2e: Ejemplos de promotores específicos de embrión: Tabla 2f: Ejemplos de promotores específicos de aleurona: Un promotor específico de tejido verde, como se define en la presente, es un promotor que es activo durante la transcripción predominantemente en el tejido verde, excluyendo en gran medida cualquier otra parte de una planta, aun mientras permite cualquier expresión con pérdida en estas otras partes de la planta.

Los ejemplos de promotores específicos de tejido verde que se pueden utilizar para llevar a cabo los métodos de la invención se indican en la siguiente Tabla 2g.

Tabla 2g: Ejemplos de promotores específicos de tejido verde Otro ejemplo de un promotor específico de tejido es un promotor específico de meristema, que es activo durante la transcripción predominantemente en tejido meristemático, excluyendo en gran medida cualquier otra parte de una planta, aun mientras permite cualquier expresión con pérdida en estas otras partes de la planta. Los ejemplos de promotores específicos de meristema verde que se pueden utilizar para llevar a cabo los métodos de la invención se indican en la siguiente Tabla 2h.

Tabla 2h: Ejemplos de promotores específicos de meristema Terminador El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad de transcripción que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de planta o de T-ADN. El terminador a agregar puede derivar, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa o, alternativamente, de otro gen de planta o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariótico.

(Gen) marcador seleccionable/ Gen indicador "Marcador seleccionable", "gen marcador seleccionable" o "gen indicador" incluyen cualquier gen que confiere un fenotipo a una célula en la cual se expresa para facilitar la identificación y/o selección de las células que son transfectadas o transformadas con un constructo de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácido nucleico mediante una serie de diferentes principios. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar a partir de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Los ejemplos de genes marcadores seleccionares incluyen los genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptll que fosforila neomicina y canamicina, o hpt que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia, por ejemplo, a bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo, bar que provee resistencia a Basta®; aroA o gox que provee resistencia al glifosato o los genes que confieren resistencia, por ejemplo, a imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proveen un rasgo metabólico (tales como manA que le permite a las plantas utilizar mañosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo, ß-glucuronidasa, GUS o ß- galactosidasa con sus sustratos con color, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tales como el sistema de luciferina/luciferasa) o fluorescencia (proteína fluorescente verde, GFP, y sus derivados). Esta lista representa sólo una pequeña cantidad de posibles marcadores. El trabajador experto está familiarizado con dichos marcadores. Se prefieren diferentes marcadores según el organismo y el método de selección.

Se sabe que luego de la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en las células vegetales, sólo una minoría de las células absorbe el ADN extraño y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizados. Para identificar y seleccionar estos integrantes, usualmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (tales como aquellos descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los cuales estos genes no sean funcionales mediante, por ejemplo, eliminación por métodos convencionales. Asimismo, las moléculas de secuencia de ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable se pueden introducir en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usados en los métodos de la invención, o de otro modo en un vector separado. Se pueden identificar las células que fueron transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, las células que integraron el marcador seleccionable sobreviven, mientras que las otras células mueren).

Debido a que los genes marcadores, en particular los genes de resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no son necesarios o son indeseados en la célula huésped transgénica, una vez que los ácidos nucleicos han sido introducidos con éxito, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos utiliza en forma ventajosa técnicas que permiten la eliminación o escisión de estos genes marcadores. Uno de dichos métodos es conocido como cotransformación. El método de cotransformación usa dos vectores simultáneamente para la transformación, en donde un vector tiene el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo vector tiene el/los gen(es) marcador(es). Una gran proporción de transformantes recibe o, en el caso de las plantas, comprende (hasta 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de la transformación con Agrobacterias, los transformantes usualmente reciben sólo una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el T-ADN, que usualmente representa el cásete de expresión. Los genes marcadores luego se pueden eliminar de la planta transformada mediante la realización de cruzas. En otro método, los genes marcadores integrados en un transposón se utilizan para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds). Los transformantes se pueden cruzar con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con un constructo de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, en forma transitoria o estable. En algunos casos (aprox. 10%), el transposón sale del genoma de la célula huésped una vez que se produce con éxito la transformación, y se pierde. En otros casos, el transposón salta a una ubicación diferente. En estos casos, el gen marcador se debe eliminar mediante la realización de cruzas. En microbiología, se desarrollaron técnicas que posibilitan o facilitan la detección de dichos eventos. Otro método ventajoso es lo que se conoce como sistemas de recombínación, cuya ventaja es que se puede prescindir de la eliminación por cruza. El sistema más conocido de este tipo es el denominado sistema Cre/lox. Creí es una recombinasa que elimina las secuencias ubicadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, se lo elimina una vez que se ha producido con éxito la transformación mediante la expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son los sistemas HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Es posible una integración específica de sitio en el genoma de la planta de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Obviamente, estos métodos también se pueden aplicar a microorganismos tales como levadura, hongos o bacterias.

Transgénico/Transgén /Recombinante A los fines de la invención, "transgénico", "transgén" o "recombinante" significa, en relación por ejemplo a una secuencia de ácidos nucleicos, un cásete de expresión, constructo génico o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con las secuencias de ácidos nucleicos, casetes de expresión o vectores de acuerdo con la invención, todas aquellas construcciones obtenidas por métodos recombinantes en los cuales (a) las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas útiles en los métodos de la invención, o (b) secuencia(s) de control genético que está ligada operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o (c) a) y b) no se encuentran en su ambiente genético natural o fueron modificadas por métodos recombinantes, en donde es posible que la modificación sea, por ejemplo, una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. Ambiente genético natural significa el locus cromosómico o genómico natural en la planta original o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, preferentemente, se retiene, al menos en parte, el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos. El ambiente flanquea la secuencia de ácidos nucleicos al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 bp, preferentemente, al menos 500 bp, preferentemente, en especial al menos 1000 bp, con máxima preferencia, al menos 5000 bp. Un cásete de expresión natural - por ejemplo la combinación natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido útil en los métodos de la presente invención, como se definió anteriormente - se convierte en un cásete de expresión transgénica cuando este cásete de expresión es modificado por métodos de síntesis no naturales ("artificiales") tales como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Los métodos adecuados se describen, por ejemplo, en US 5565350 o WO 00/15815.

Por lo tanto, a los fines de la invención, una planta transgénica significa, como se indicó anteriormente, que los ácidos nucleicos utilizados en el método de la invención no se encuentran en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de manera homologa o heteróloga. Sin embargo, como se mencionó, transgénico también significa que, mientras que los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o utilizados en el método de la invención se encuentran en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia fue modificada con respecto a la secuencia natural y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales fueron modificadas. Preferentemente, transgénico significa la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un locus no natural en el genoma, es decir que tiene lugar la expresión homologa o, preferentemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. Las plantas transgénicas preferidas se mencionan en la presente.

En una forma de realización de la invención, una secuencia de ácidos nucleicos "aislada" se ubica en un ambiente cromosomal no nativo.

Modulación El término "modulación" significa, con respecto a la expresión o expresión génica, un proceso en el que el nivel de expresión es cambiado por dicha expresión génica en comparación con la planta de control, el nivel de expresión se puede aumentar o disminuir. La expresión original no modulada puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN (rARN, tARN) o mARN estructural con la posterior traducción. El término "modulación de la actividad" o el término "modular la actividad" significa cualquier cambio de expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención o proteínas codificadas, que genera mayor rendimiento y/o mayor crecimiento de las plantas.

Expresión El término "expresión" o "expresión génica" significa la transcripción de un gen específico o genes específicos o constructo genético específico. El término "expresión" o "expresión génica" significa, en particular, la transcripción de un gen o genes o constructo genético en ARN (rARN, tARN) o mARN estructural con o sin la posterior traducción de la última en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y el procesamiento del producto de mARN resultante.

Mayor expresión/sobreexpresión Como se usa en la presente, el término "mayor expresión" o "sobreexpresión" significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión original del tipo silvestre.

Los métodos para aumentar la expresión de los genes o productos génicos están documentados en el arte e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por promotores adecuados, el uso de mejoradores de la transcripción o mejoradores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que actúan como elementos promotores o mejoradores se pueden introducir en una posición adecuada (típicamente corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido a fin de regular en forma ascendente la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptído de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos se pueden alterar in vivo mediante mutación, eliminación y/o sustitución (véase, Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al., W09322443) o se pueden introducir promotores aislados en una célula de planta en la orientación y distancia adecuadas de un gen de la presente invención a fin de controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión de un polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificante de polinucleótidos. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de planta o de T-ADN. La secuencia del extremo 3' a agregar puede derivar, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa o, alternativamente, de otro gen de planta o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariótico.

También se puede agregar una secuencia intrónica a la región 5' no traducida (UTR) o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción tanto en los constructos de expresión vegetales y animales aumenta la expresión génica a nivel del ARNm y de las proteínas hasta 1000 veces (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1183-1200). Dicha mejora intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones del maíz intrón Adh1-S 1 , 2 y 6, el intrón Bronze-1 es conocido en el arte. Para información general véase: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Menor expresión La referencia en la presente a "menor expresión" o "reducción o eliminación sustancial" de la expresión significa una disminución en la expresión de un gen endógeno y/o en los niveles de polipéptidos y/o en la actividad de polipéptidos con respecto a las plantas de control. La reducción o sustancial eliminación es, en orden creciente de preferencia, al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ó 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de reducción en comparación con las plantas de control.

Para la reducción o sustancial eliminación de la expresión de un gen endógeno en una planta, es necesario que los nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos tengan una longitud suficiente. A fin de realizar el silenciamiento génico, ésta puede tener tan pocos como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 , 10 o menos nucleótidos, alternativamente ésta puede ser igual al gen entero (incluso UTR 5' y/o 3', ya sea total o parcialmente). La porción de nucleótidos sustancialmente contiguos puede derivar del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen blanco) o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés. Preferentemente, la porción de nucleotidos sustancialmente contiguos es capaz de formar uniones de hidrógeno con el gen blanco (ya sea cadena sentido o antisentido), con mayor preferencia, la porción de nucleotidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidad de secuencia con el gen blanco (ya sea cadena sentido o antisentido). Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito de los diversos métodos analizados en la presente para la reducción o sustancial eliminación de la expresión de un gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión se puede lograr mediante herramientas y técnicas de rutina. Un método preferido para la reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno es mediante la introducción y expresión en una planta de un constructo genético en el cual el ácido nucleico (en este caso una porción de nucleotidos sustancialmente contiguo derivados del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las proteínas de interés) se clona como una repetición invertida (total o parcialmente), separada por un espaciador (ADN no codificante).

En dicho método preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o elimina sustancialmente mediante el silenciamiento mediado por ARN con el uso de una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte de éste (en este caso, una porción de nucleótidos sustancialmente contiguos derivada del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), preferentemente, capaz de formar una estructura de horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias de control. Una secuencia de ácidos nucleicos de ADN no codificante (un separador, por ejemplo un fragmento de la región de unión a la matriz (MAR), un intrón, un poliligador, etc.) se ubica entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Luego de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura autocomplementaria (total o parcialmente). Esta estructura de ARN bicatenario se denomina ARN horquilla (hpARN). El hpARN es procesado por la planta en siARN que se incorpora en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El RISC además diva los transcriptos de mARN, reduciendo sustancialmente de este modo la cantidad de transcriptos de mARN a ser traducidos en polipéptidos. Para más detalles generales, véase, por ejemplo, Grierson et al. (1998) WO 98/53083; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050).

La realización de los métodos de la invención no depende de la introducción y expresión en una planta de un constructo genético en el cual el ácido nucleico se clona como una repetición invertida, sino que se pueden utilizar uno o más de los diversos métodos de "silenciamiento génico" conocidos para lograr los mismos efectos.

Uno de dichos métodos para reducir la expresión del gen endógeno es el silenciamiento de la expresión génica mediado por ARN (regulación descendente). En este caso, el silenciamiento es activado en una planta por una secuencia de ARN bicatenario (dsARN) que es sustancialmente similar al gen endógeno blanco. Este dsARN es procesado adicionalmente por la planta en alrededor de 20 a alrededor de 26 nucleótidos denominados ARN cortos de interferencia (siARN). Los siARN se incorporan en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) que diva los transcriptos de mARN del gen blanco endógeno, reduciendo sustancialmente de esta manera la cantidad de transcriptos de mARN que se deben traducir en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde al gen blanco.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN incluye la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de éstas (en este caso, una porción de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en orientación sentido en una planta. "Orientación sentido" se refiere a una secuencia de ADN que es homologa de uno de sus transcripto de mARN. Por lo tanto, en una planta se habrá introducido al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia adicional de ácidos nucleicos reducirá la expresión del gen endógeno, originando un fenómeno conocido como cosupresión. La reducción de la expresión génica será más pronunciada si se introducen varias copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos en la planta, ya que existe una correlación positiva entre los niveles altos de transcriptos y la activación de la cosupresión.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN involucra el uso de secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de ácidos nucleicos "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos "sentido" que codifica una proteína, es decir, complementaria de la cadena codificante de una molécula de cADN bicatenario o complementaria de una secuencia de transcriptos de mARN. Preferentemente, la secuencia de ácidos nucleicos antisentido es complementaria del gen endógeno a silenciar. La complementariedad puede estar ubicada en la "región codificante" y/o en la "región no codificante" de un gen. El término "región codificante" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos. El término "región no codificante" se refiere a secuencias de 5' y 3' que flanquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominadas regiones 5' y 3' no traducidas).

Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido se pueden diseñar de acuerdo con las reglas de formación de pares de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede ser complementaria de la secuencia entera de ácidos nucleicos (en este caso, una porción de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), pero también puede ser un oligonucleótido que es antisentido con respecto a sólo una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (incluso UTR 5' y 3' de mARN). Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria de la región que rodea al sitio de inicio de la traducción de un transcripto de mARN que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido adecuada es conocida en el arte y puede comenzar desde alrededor de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácidos nucleicos antisentido de acuerdo con la invención se puede construir mediante síntesis química y reacciones de ligadura enzimática utilizando los métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) se puede sintetizar químicamente con nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de distintas maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos sentido y antisentido, por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido son muy conocidos en el arte. Las modificaciones conocidas de nucleótidos incluyen metilación, delación y "caps" y sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, tal como inosina. Otras modificaciones de nucleótido son conocidas en el arte.

La secuencia de ácidos nucleicos antisentido se puede producir de forma biológica usando un vector de expresión en el cual se ha subclonado una secuencia de ácidos nucleicos en orientación antisentido (es decir, el ARN transcripto desde el ácido nucleico insertado tendrá orientación antisentido con respecto al ácido nucleico blanco de interés). Preferentemente, la producción de secuencias de ácidos nucleicos antisentido en plantas ocurre por medio de un constructo de ácidos nucleicos integrado de forma estable que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido ligado operativamente y un terminador.

Las moléculas de ácido nucleico utilizadas para el silenciamiento en los métodos de la invención (ya sea introducidas en una planta o generadas in situ) se hibridan o se unen a transcriptos de mARN y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir de este modo la expresión de la proteína, por ejemplo, mediante la inhibición de la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ocurrir mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos antisentido que se une a dúplex de ADN, mediante interacciones específicas en la cavidad principal de la hélice doble. Se pueden introducir secuencias de ácidos nucleicos antisentido en una planta mediante transformación o inyección directa en un sitio específico de tejido. Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido se pueden modificar para que se dirijan a células seleccionadas y luego administrarlas de forma sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse de manera tal que se unen específicamente a receptores o antígenos que se expresan en la superficie celular seleccionada, por ejemplo, mediante la unión de la secuencia de ácidos nucleicos antisentido a los péptidos o anticuerpos que se unen a los antígenos o receptores de la superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también se pueden dirigir a células utilizando los vectores descritos en la presente.

De acuerdo con otro aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos antisentido es una secuencia de ácidos nucleicos a-anomérica. Una secuencia de ácidos nucleicos a-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario donde, a diferencia de las unidades b habituales, las cadenas son paralelas entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucí Ac Res 15: 6625-6641 ). La secuencia de ácidos nucleicos antisentido también puede comprender 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucí Ac Res 15, 6131 -6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

La reducción o sustancial eliminación de la expresión del gen endógeno también se puede realizar mediante el uso de ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico con actividad de ribonucleasa que son capaces de clivar una secuencia de ácidos nucleicos monocatenarios, tal como un mARN, con la cual tienen una región complementaria. De este modo, las ribozimas (por ejemplo, las ribozimas hammerhead (descritas en Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585-591 ) se pueden usar para clivar de modo catalítico transcriptos de mARN que codifican un polipéptido, reduciendo sustancialmente, de este modo, la cantidad de transcriptos de mARN a traducir en un polipéptido. Se puede diseñar una ribozima que tiene especificidad para una secuencia de ácidos nucleicos (véase por ejemplo: Cech et al. patente estadounidense No. 4.987.071 ; y Cech et al. patente estadounidense No. 5.1 16.742). Alternativamente, se pueden usar transcriptos de mARN que corresponden a una secuencia de ácidos nucleicos para seleccionar un ARN catalítico que tenga actividad de ribonucleasa específica a partir de un pool de moléculas de ARN (Bartel and Szostak (1993) Science 261 , 1411-1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas es conocido en el arte (por ejemplo, Atkins et al. (1994) WO 94/00012; Lenne et al. (1995) WO 95/03404; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 and Scott et al. (1997) WO 97/381 16).

El silenciamiento génico también se puede lograr mediante mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de T-ADN o inserción de transposón) o mediante estrategias como las descritas, entre otros, en Angelí and Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083) o Baulcombe (WO 99/15682).

El silenciamiento génico también puede ocurrir si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un ácido nucleico/gen aislado que se introduce posteriormente en una planta. La reducción o sustancial eliminación puede ser causada por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, el polipéptido se puede unir a varias proteínas que interactúan; por lo tanto, una o más mutaciones y/o truncamientos pueden generar un polipéptido que aún es capaz de unirse a proteínas que interactúan (tales como proteínas receptoras) pero que no puede exhibir su función normal (tal como un ligando de señalización).

Otro enfoque al silenciamiento génico es mediante el direccionamiento de secuencias de ácidos nucleicos complementarias de la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o mejoradores) para formar estructuras helicoidales triples que evitan la transcripción del gen en las células blanco. Véase Helene, C, Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991 ; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y Maher, L.J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

Otros métodos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o interferencia en la vía de señalización en la cual se encuentra involucrado el polipéptido, serán bien conocidos por el experto en el arte. En particular, se puede prever que las moléculas fabricadas por el hombre pueden ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido blanco o para interferir con la vía de señalización en la cual está involucrado el polipéptido blanco.

De modo alternativo, se puede preparar un programa de barrido para identificar, en una población de plantas, las variantes naturales de un gen, en donde dichas variantes codifican polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también se pueden usar para realizar, por ejemplo, recombinación homóloga.

Se puede usar microARN (miARN) artificial y/o natural para knock out la expresión génica y/o la traducción de mARN. Los miARN endógenos son ARN pequeños monocatenarios que generalmente tienen 19-24 nucleótidos de longitud. Funcionan principalmente para regular la expresión génica y/o la traducción de mARN. La mayoría de los microARN (miARN) de plantas tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias blanco. Sin embargo, existen blancos naturales con hasta cinco faltas de coincidencia. Se los procesa a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras características de replegamiento mediante RNasas bicatenarias específicas de la familia Dicer. Luego del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) mediante la unión a su componente principal, una proteína Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad de RISC, ya que forman pares de base para dirigirse a ácidos nucleicos, principalmente mARN, en el citoplasma. Los posteriores eventos reguladores incluyen el clivaje de mARN blanco y la destrucción y/o inhibición de la traducción. De este modo, a menudo se reflejan los efectos de la sobreexpresión de miARN en menores niveles de genes blanco.

Los microARN (amiARN) artificiales, que típicamente tienen 21 nucleótidos de longitud, se pueden modificar mediante ingeniería genética específicamente para regular de forma negativa la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. Los determinantes de la selección de microARN vegetal blanco son muy conocidos en el arte. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento del blanco y se pueden usar para ayudar en el diseño de amiARN específicos (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Las herramientas convenientes para el diseño y la generación de amiARN y sus precursores también están disponibles al público (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121- 1133, 2006).

Para una performance óptima, las técnicas de silenciamiento génico usadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas.

Preferentemente, se introduce una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie de planta determinada en esa misma especie. Por ejemplo, se transforma una secuencia de ácidos nucleicos del arroz en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito indispensable que la secuencia de ácidos nucleicos a ser introducida se origine a partir de la misma especie vegetal que la planta en la cual será introducida. Es suficiente que haya homología sustancial entre el gen endógeno blanco y el ácido nucleico a ser introducido.

Se describieron con anteriormente ejemplos de varios métodos para la reducción o sustancial eliminación de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en el arte podrá fácilmente adaptar los métodos de silenciamiento antes mencionados a fin de lograr la reducción de expresión de un gen endógeno en una planta entera o en sus partes, por ejemplo, mediante el uso de un promotor adecuado.

Transformación El término "introducción" o "transformación", como se indica en la presente, abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno a una célula huésped, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal posterior, sea por organogénesis o por embriogénesis, se puede transformar con un constructo genético de la presente invención y regenerar una planta completa a partir de ella. El tejido particular elegido variará según los sistemas de propagación clonal disponibles y más adecuados para la especie particular a transformar. Los ejemplos de tejidos blanco incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, brotes axilares y meristemas de raíz) y tejido del meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotilo). El polinucleótido se puede introducir en forma transitoria o estable en una célula huésped y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, se lo puede integrar en el genoma del huésped. La célula vegetal transformada resultante luego se puede utilizar para regenerar una planta transformada en una forma conocida por los expertos en el arte.

La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies de plantas es actualmente una técnica bastante rutinaria. Ventajosamente, se puede utilizar cualquiera de los diversos métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula ancestral adecuada. Los métodos descritos para la transformación y regeneración de las plantas a partir de tejidos de planta o células de planta se pueden utilizar para la transformación transitoria o estable. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la absorción de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación con virus o polen y microproyección. Los métodos se pueden seleccionar del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1 102); microinyección en material de planta (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrativos) y similares. Las plantas transgénicas, incluso plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacterium. Un método de transformación ventajoso es la transformación en la planta. Con este fin, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen en las semillas de la planta o inocular el meristema de la planta con agrobacterias. Se ha demostrado que es particularmente oportuno de acuerdo con la invención permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe en la planta intacta o al menos en los primordios de la flor. La planta se cultiva posteriormente hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los métodos para la transformación de arroz mediada por Agrobacterium incluyen métodos muy conocidos para la transformación del arroz, tales como los descritos en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente europea EP 1198985 A1 , Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan a la presente por referencia como si se indicaran en su totalidad. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como se describe en Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), cuyas descripciones se incorporan a la presente por referencia como si se indicaran en su totalidad. Dichos métodos se describen también a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o el constructo que se desea expresar se clonan, preferentemente, en un vector que es adecuado para la transformación de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucí. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas por dicho vector luego se pueden utilizar de la manera conocida para la transformación de plantas, tales como plantas utilizadas como modelo, como Arabidopsis (dentro del alcance de la presente invención, Arabidopsis thaliana no se considera una planta de cultivo) o plantas de cultivo tales como, por ejemplo, las plantas de tabaco, por ejemplo mediante la inmersión de hojas machacadas u hojas picadas en una solución de agrobacterias y luego el cultivo en un medio adecuado. La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens se describe, por ejemplo, en Hófgen and Willmitzer en Nucí. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Además de la transformación de células somáticas, que luego se deben regenerar en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemas de plantas y, en particular, las células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, produciendo las plantas transgénicas. De este modo, por ejemplo, las semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y las semillas se obtienen a partir de las plantas en desarrollo, de las cuales cierta proporción es transformada y, por lo tanto, transgénica [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]. Los métodos alternativos se basan en la eliminación reiterada de las inflorescencias y la incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con las agrobacterias transformadas, por la cual las semillas transformadas también se pueden obtener en un momento posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente eficaz es el método de infiltración con vacío con sus modificaciones, tal como el método de "inmersión floral". En el caso de infiltración con vacío de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión de agrobacterias [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci París Life Sci, 316: 1 194-1 199], mientras que en el caso del método de "inmersión floral" el tejido floral en desarrollo se incuba por poco tiempo con una suspensión de agrobacterias tratada con tensoactivos [Clough, SJ and Bent AF ( 998) The Plant J. 16, 735-743]. En ambos casos se cosecha una cierta proporción de semillas transgénicas y estas semillas se pueden distinguir de las semillas no transgénicas por el cultivo en las condiciones selectivas antes descritas. Además, la transformación estable de los plástidos es ventajosa porque los plástidos se heredan por vía materna en la mayoría de los cultivos, lo cual reduce o elimina el riesgo de flujo de transgenes mediante polen. La transformación del genoma del cloroplasto generalmente se obtiene mediante un proceso que se representa en forma esquemática en Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. En síntesis, las secuencias a transformar se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre las secuencias flanqueadoras homologas del genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueadoras homologas dirigen la integración específica de sitio en el plastoma. La transformación de los plástidos ha sido descrita para diferentes especies de plantas y se provee una reseña en Bock (2001 ) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21 ; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21 , 20-28. Recientemente se ha informado otro progreso biotecnológico en forma de transformantes de plástidos libres de marcadores, que se pueden producir mediante un gen marcador cointegrado transitorio (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

Las células vegetales modificadas genéticamente se pueden regenerar mediante todos los métodos conocidos por el experto en el arte. Se pueden encontrar métodos adecuados en las publicaciones antes mencionadas de S.D. Kung and R. Wu, Potrykus o Hófgen and Willmitzer.

Generalmente, después de la transformación, las células vegetales o los agrupamientos de células se seleccionan para determinar la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes expresables en plantas cotransferidos con el gen de interés, luego de lo cual el material transformado se regenera en una planta entera. Para seleccionar las plantas transformadas, el material de planta obtenido en la transformación es, como regla, sometido a condiciones selectivas a fin de que las plantas transformadas se puedan distinguir de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas del modo antes descrito se pueden plantar y, luego de un período de crecimiento inicial, se pueden someter a una selección adecuada mediante pulverización. Otra posibilidad consiste en cultivar las semillas, en caso de ser adecuado, luego de su esterilización, en placas de agar mediante el uso de un agente de selección adecuado a fin de que sólo las semillas transformadas puedan crecer hasta ser plantas. De modo alternativo, las plantas transformadas se controlan para detectar la presencia de un marcador seleccionare, tales como aquellos descritos anteriormente.

Luego de la regeneración y transferencia de ADN, las plantas posiblemente transformadas también se pueden evaluar, por ejemplo, mediante el uso de análisis Southern, para determinar la presencia del gen de interés, la cantidad de copias y/o la organización genómica. De modo alternativo o adicional, se pueden controlar los niveles de expresión del nuevo ADN introducido mediante el uso de análisis Northern y/o Western, ambas técnicas son bien conocidas por los expertos en el arte.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar mediante diversos medios, tales como mediante propagación clonal o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, se puede autocruzar una planta transformada de primera generación (o T1) y seleccionar transformantes homocigotas de segunda generación (o T2), y las plantas T2 se pueden propagar además mediante técnicas de reproducción clásicas. Los organismos transformados generados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el cásete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado en un acodo no transformado).

En esta solicitud, una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal transformada con - o indistintamente transformada por - un constructo o transformada con un ácido nucleico significa una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal que tiene dicho constructo o dicho ácido nucleico como un transgén debido al resultado de la introducción de dicho constructo o ácido nucleico mediante medios biotecnológicos. Por lo tanto, la planta, parte de planta, semilla o célula vegetal comprende dicho constructo recombinante o dicho ácido nucleico recombinante. Cualquier planta, parte de planta, semilla o célula vegetal que ya no contiene dicho constructo recombinante o dicho ácido nucleico recombinante luego de la introducción en el pasado se denomina segregante nulo, nulicigota o control nulo, pero no se considera una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal transformada con dicho constructo o con dicho ácido nucleico dentro del significado de la presente solicitud.

Marcación por activación de T-ADN La marcación por activación de T-ADN (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353), incluye la inserción de T-ADN, que usualmente contiene un promotor (también puede ser un mejorador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb corriente arriba o corriente abajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirige la expresión del gen blanco. En general, la regulación de la expresión del gen blanco por su promotor natural se altera y el gen cae bajo el control del promotor recién introducido. El promotor está típicamente incluido en un T-ADN. Este T-ADN se inserta en forma aleatoria en el genoma de la planta, por ejemplo, mediante infección con Agrobacterium, y conduce a la expresión modificada de los genes cerca del T-ADN insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de los genes cercanos al promotor introducido.

TILLING El término "TILLING" es la abreviatura de "Targeted Induced Local Lesions In Genomes" (Lesiones locales inducidas dirigidas en genomas) y se refiere a una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificada. TILLING también permite la selección de plantas que portan dichos variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir expresión modificada, ya sea en potencia o ubicación o duración (por ejemplo, si las mutaciones afectan al promotor). Estas variantes mutantes pueden exhibir mayor actividad que la exhibida por el gen en su forma natural. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con métodos de barrido de alto rendimiento. Las etapas que habitualmente se siguen en TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP and Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishlng Co, pp. 16-82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Bioiogy, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) preparación de ADN y agolpamiento de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización y apareamiento para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, cuando se detecta la presencia de un heterodúplex en un pool como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del individuo mutante; y (g) secuenciación del producto de PCR mutante. Los métodos para TILLING son muy conocidos en el arte (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; reseñado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Recombinación homologa La recombinación homologa permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homologa es una tecnología estándar que se utiliza en forma rutinaria en las ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levadura o musgo Physcomitrella.. Los métodos para realizar la recombinación homologa en las plantas han sido descritos no sólo para las plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para las plantas de cultivo, por ejemplo, arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8) y hay enfoques que son aplicables en general, independientemente del organismo blanco (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

Rasgos relacionados con el rendimiento Los rasgos relacionados con el rendimiento comprenden uno o más de los siguientes: rendimiento, biomasa, rendimiento de semilla, vigor temprano, índice de verdor, mayor tasa de crecimiento, mejores rasgos agronómicos (tales como mejor eficiencia en el uso del agua (WUE), eficiencia en el uso de nitrógeno (NUE), etc.).

Rendimiento En general, término "rendimiento" significa un producto mensurable de valor económico, típicamente relacionado con un cultivo, área y período de tiempo específicos.

Las partes individuales de las plantas contribuyen directamente al rendimiento sobre la base de su cantidad, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado para un cultivo y año, el cual se determina dividiendo la producción total (incluye tanto la producción cosechada como la producción calculada) por metro cuadrado plantado. El término "rendimiento" de una planta se puede referir a la biomasa vegetal (biomasa de raíz y/o brote), a los órganos reproductivos y/o a los propágulos (tales como semillas) de esa planta.

Si se toma el maíz como ejemplo, el aumento del rendimiento se puede manifestar como uno o más de los siguientes: aumento de la cantidad de plantas establecidas por metro cuadrado, aumento de la cantidad de mazorcas por planta, aumento de la cantidad de hileras, cantidad de granos por hilera, peso del grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de la mazorca, aumento de la tasa de llenado de semillas (que es la cantidad de semillas llenas dividido por la cantidad total de semillas y multiplicado por 100), entre otros Si se toma el arroz como ejemplo, el aumento del rendimiento se puede manifestar como el aumento de uno o más de los siguientes: cantidad de plantas por metro cuadrado, cantidad de panículas por planta, longitud de la panícula, cantidad de espículas por panícula, cantidad de flores (florcillas) por panícula, aumento de la tasa de llenado de semillas (que es la cantidad de semillas llenas dividido por la cantidad total de semillas y multiplicado por 100), aumento del peso de mil granos, entre otros. En el arroz, la tolerancia a la inmersión también puede dar como resultado mayor rendimiento.

Vigor temprano "Vigor temprano" o "vigor de crecimiento temprano" o "vigor de emergencia" o "vigor de las plántulas" se refieren al crecimiento activo, sano y equilibrado durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y pueden ser el resultado de un mejor estado físico de la planta debido, por ejemplo, a que las plantas se adaptan mejor a su medio ambiente (es decir, optimizan el uso de recursos de energía y los reparten entre los brotes y las raíces). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran mayor supervivencia de las plántulas y mejor establecimiento del cultivo, lo que habitualmente da como resultado campos muy uniformes (en donde el cultivo crece de manera uniforme, es decir, la mayoría de las plantas alcanza los diversos estadios del desarrollo sustancialmente al mismo tiempo), y a menudo mejor y mayor rendimiento.

Aumento de la tasa de crecimiento El aumento de la tasa de crecimiento puede ser específico de una o más partes de una planta (incluso semillas) o puede ser de casi la totalidad de la planta. Las plantas con mayor tasa de crecimiento pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede significar el tiempo necesario para que se desarrolle desde la semilla madura seca hasta la etapa en la cual la planta produjo semillas maduras secas, similares al material de inicio. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tales como velocidad de germinación, vigor temprano, tasa de crecimiento, índice de verdor, tiempo de floración y velocidad de maduración de la semilla. El aumento de tasa de crecimiento puede ocurrir en una o más etapas del ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente todo el ciclo de vida de la planta. El aumento de la tasa de crecimiento durante las etapas tempranas del ciclo de vida de una planta puede reflejar mejor vigor. El aumento de la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta, lo cual permite sembrar las plantas más tarde y/o cosecharlas antes de lo que sería posible de otro modo (se puede obtener un efecto similar con tiempo de floración más temprano). Si se aumenta lo suficiente la tasa de crecimiento, esto puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo, sembrar y cosechar plantas de arroz seguido de la siembra y cosecha de otras plantas de arroz, todo dentro de un período de crecimiento convencional). De modo similar, si se aumenta lo suficiente la tasa de crecimiento, esto puede permitir la siembra adicional de semillas de distintas especies de plantas (por ejemplo, sembrar y cosechar plantas de maíz seguido, por ejemplo, de la siembra y cosecha opcional de soja, papa o cualquier otra planta adecuada). También pueden ser posibles cosechas adicionales de los mismos rizomas, en el caso de algunas plantas de cultivo. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un aumento de la producción de biomasa anual por metro cuadrado (debido a un aumento de la cantidad de veces (por ejemplo, por año) que se puede cultivar y cosechar cualquier planta particular). Un aumento de la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que la de sus contrapartes de tipo silvestre, debido a que las limitaciones territoriales para el desarrollo de un cultivo con frecuencia están determinadas por condiciones ambientales adversas al momento de la plantación (estación temprana) o al momento de la cosecha (estación tardía). Dichas condiciones adversas se pueden evitar si se acorta el ciclo de cosecha. La tasa de crecimiento se puede determinar al derivar varios parámetros de las curvas de crecimiento, dichos parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 90% de su tamaño máximo), entre otros.

Resistencia al estrés El aumento de la tasa de rendimiento y/o de crecimiento ocurre si la planta se encuentre en condiciones sin estrés o si la planta está expuesta a varios tipos de estrés, en comparación con las plantas de control. Las plantas típicamente responden a la exposición al estrés mediante un crecimiento más lento. En condiciones de estrés severo, la planta puede incluso detener su crecimiento por completo. Por otra parte, el estrés leve se define en la presente como cualquier estrés al que está expuesta una planta que no causa el cese por completo del crecimiento de una planta sin la capacidad de reiniciar el crecimiento. El estrés leve, en el sentido de la invención, conduce a una reducción del crecimiento de las plantas estresadas de menos de 40%, 35% ó 25%, con mayor preferencia, menos de 20% ó 15% en comparación con la planta de control en condiciones sin estrés. Debido a los adelantos en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con plaguicidas), no es frecuente encontrar distintos tipos de estrés severo en plantas de cultivo cultivadas. En consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés leve es a menudo una característica indeseable en la agricultura. El estrés leve es el estrés biótico y/o abiótico (ambiental) cotidiano al cual está expuesta una planta. El estrés abiótico se puede deber a sequía o exceso de agua, estrés anaeróbico, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y temperaturas cálidas, frías o de congelación. El estrés abiótico puede ser estrés osmótico causado por estrés hídrico (en particular, debido a sequía), estrés salino, estrés oxidativo o estrés iónico. El estrés biótico típicamente es el estrés causado por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, nemátodos e insectos.

En particular, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones sin estrés o en condiciones de sequía leve para obtener plantas con mayor rendimiento con respecto a plantas de control. Como se informó en Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan de manera adversa el crecimiento y la productividad de la planta. Se sabe que el estrés por sequía, salinidad, temperaturas extremas y el estrés oxidativo están interconectados y pueden inducir el crecimiento y daño celular mediante mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describe un grado particularmente alto de "comunicación cruzada" entre estrés por sequía y estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o la salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, lo cual da como resultado la interrupción de la homeóstasis y la distribución iónica en la célula. El estrés oxidativo, que frecuentemente acompaña al estrés por alta o baja temperatura, por salinidad o por sequía, puede causar la desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos tipos de estrés ambientales a menudo activan vías de señalización celular y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas por estrés, la regulación en forma ascendente de antioxidantes, la acumulación de solutos compatibles y la detención del crecimiento. Como se usa en la presente, el término condiciones "sin estrés" son las condiciones ambientales que permiten el crecimiento óptimo de las plantas. Los expertos en el arte conocen las condiciones normales del suelo y climáticas para una ubicación determinada. Las plantas en condiciones óptimas de crecimiento (que crecen en condiciones sin estrés) usualmente rinden, en orden creciente de preferencia, al menos 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% o 75% de la producción promedio de dicha planta en un ambiente determinado. La producción promedio se puede calcular sobre la base de una cosecha y/o estación. Los expertos en el arte conocen el rendimiento promedio de la producción de un cultivo.

La deficiencia de nutrientes puede ser el resultado de la falta de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

El término "estrés salino" no está restringido a la sal común (NaCI), sino que puede ser uno o más de los siguientes: NaCI, KCI, LiCI, MgCI2, CaCI2, entre otros.

Incremento/Meiora/Aumento Los términos "incremento", "mejora" o "aumento" son indistintos y significan, en el sentido de la solicitud, al menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ó 10%, preferentemente, al menos 15% ó 20%, con mayor preferencia, 25%, 30%, 35% ó 40% más de rendimiento y/o crecimiento en comparación con las plantas de control como se definen en la presente.

Raíces Como se usa en la presente, el término "raíz" abarca todas las partes "por debajo del suelo" o "subterráneas" de la planta, que sirven como soporte, absorben minerales y agua del suelo circundante y/o almacenan reservas de nutrientes. Estos incluyen bulbos, cormos, tubérculos, raíces tuberosas, rizomas y raíces carnosas. Un mayor rendimiento de las raíces se puede manifestar como uno o más de los siguientes: aumento de la biomasa de la raíz (peso total) que puede ser en cada raíz y/o por planta y/o por metro cuadrado; mayor índice de cosecha, que se expresa como una proporción del rendimiento de las partes cosechables, tales como raíces, dividido por la biomasa total.

Un mayor rendimiento de las raíces también se puede manifestar como un mayor tamaño de las raíces y/o volumen de las raíces. Además, un mayor rendimiento de las raíces también se puede manifestar como un aumento del área de la raíz y/o longitud de la raíz y/o ancho de la raíz y/o perímetro de la raíz. Un mayor rendimiento también puede dar como resultado una arquitectura modificada o puede ocurrir debido a una arquitectura modificada.

Rendimiento de las semillas Un mayor rendimiento de las semillas se puede manifestar como uno o más de los siguientes: a) mayor biomasa de semilla (peso total de la semilla) que puede ser en base a cada semilla y/o por planta y/o por metro cuadrado; b) mayor cantidad de flores por planta; c) mayor cantidad de semillas (llenas); d) mayor tasa de llenado de semillas (que se expresa como la proporción entre la cantidad de semillas llenas dividido por la cantidad total de semillas); e) mayor índice de cosecha, que se expresa como la proporción del rendimiento de las partes cosechables, tales como semillas, dividido por la biomasa total; y f) mayor peso de mil granos (TKW), que se extrapola de la cantidad de semillas llenas contadas y su peso total. Un mayor TKW puede ser el resultado de un mayor tamaño de las semillas y/o peso de las semillas, y también puede ser el resultado de un mayor tamaño del embrión y/o endosperma.

Un mayor rendimiento de las semillas también se puede manifestar como un mayor tamaño de las semillas y/o volumen de las semillas. Asimismo, un mayor rendimiento de las semillas también se puede manifestar como una mayor área de la semilla y/o longitud de la semilla y/o ancho de la semilla y/o perímetro de la semilla. Un mayor rendimiento también puede dar como resultado una arquitectura modificada o puede ocurrir debido a una arquitectura modificada. índice de verdor Como se usa en la presente, el "índice de verdor" se calcula de imágenes digitales de plantas. Para cada píxel que pertenece a la planta objeto de la imagen, se calcula la proporción del valor de verde con respecto al valor de rojo (en el modelo RGB para la codificación de color). El índice de verdor se expresa como el porcentaje de píxeles para los cuales la proporción verde-rojo excede un umbral determinado. En condiciones normales de crecimiento, en condiciones de crecimiento con estrés salino y en condiciones de crecimiento con disponibilidad reducida de nutrientes, el índice de verdor de las plantas se mide en la última formación de imágenes antes de la floración. Por el contrario, en condiciones de crecimiento con estrés por sequía, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera formación de imágenes después de la sequía.

Biomasa Como se usa en la presente, el término "biomasa" se refiere al peso total de una planta. Dentro de la definición de biomasa, se puede hacer una distinción entre la biomasa de una o más partes de una planta, que pueden incluir uno o más de los siguientes: - partes aéreas, tales como, por ejemplo, biomasa de brotes, biomasa de semillas, biomasa de hojas, etc.; - partes aéreas cosechables, tales como, por ejemplo, biomasa de brotes, biomasa de semillas, biomasa de hojas, etc.; partes subterráneas, tales como, pero sin limitarse a, biomasa de raíces, tubérculos, bulbos, etc.; - partes subterráneas cosechables, tales como, pero sin limitarse a, biomasa de raíces, tubérculos, bulbos, etc.; - partes cosechables parcialmente insertadas o en contacto con el suelo, tales como, pero sin limitarse a, remolacha y otras áreas del hipocotilo de la planta, rizomas, estolones o rizomas reptantes. - biomasa vegetativa, tal como biomasa de raíces, biomasa de brotes, etc.; - órganos reproductivos; y propágulos, tales como semillas.

Reproducción asistida por marcador Dichos programas de reproducción algunas veces requieren la introducción de variaciones alélicas mediante el tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando, por ejemplo, mutagénesis EMS; alternativamente, el programa puede comenzar con una colección de variantes alélicas del denominado origen "natural" causado de manera no intencional. Luego se realiza la identificación de variantes alélicas, por ejemplo, mediante PCR. Luego sigue una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que produce mayor rendimiento. Generalmente, la selección se realiza mediante el control del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. El crecimiento se puede controlar en un invernadero o en el campo. Otras etapas opcionales incluyen la cruza de plantas en las cuales la variante alélica superior se identificó con otra planta. Esto se puede usar, por ejemplo, para realizar una combinación de características fenotípicas de interés.

Uso como sondas en ( mapeo genético) El uso de ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés para el mapeo genético y físico de genes requiere solamente una secuencia de ácidos nucleicos de al menos 15 nucleótidos de longitud. Estos ácidos nucleicos se pueden utilizar como marcadores de polimorfismos de longitud del fragmento de restricción (RFLP). Los Southern blots (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de ADN genómico vegetal digerido por restricción se pueden sondear con los ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés. Los patrones de banda resultantes luego se pueden someter a análisis genéticos mediante el uso de programas de computación tales como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1 : 174-181) a fin de construir un mapa genético. Además, los ácidos nucleicos se pueden usar para sondear Southern blots que contienen ADN genómico tratado con endonucleasa de restricción de un conjunto de individuos que representan los progenitores y la progenie de una cruza genética definida Se observa la segregación de los polimorfismos de ADN y se usa para calcular la posición del ácido nucleico que codifica la proteína de interés en el mapa genético que se obtuvo previamente con esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331 ).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes vegetales para usar en el mapeo genético se describen en Bernatzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Repórter 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de cADN específicos mediante la metodología descrita anteriormente o sus variaciones Por ejemplo, para el mapeo se pueden usar poblaciones de intercruza F2, poblaciones de retrocruza, poblaciones apareadas al azar, líneas isogénicas cercanas y otros conjuntos de individuos. Tales metodologías son muy conocidas por los expertos en el arte.

Las sondas de ácidos nucleicos también se pueden usar para el mapeo físico (es decir, la ubicación de secuencias en mapas físicos; véase Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y las referencias allí citadas).

En otra forma de realización, las sondas de ácidos nucleicos se pueden usar en el mapeo de hibridación in situ por fluorescencia directa (FISH) (Trask (1991 ) Trends Genet. 7:149-154). Si bien los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de clones grandes (varios kb a varios cientos de kb; véase Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir la realización del mapeo FISH con sondas más cortas.

Se pueden realizar diversos métodos basados en la amplificación de ácidos nucleicos para el mapeo genético y físico mediante el uso de ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen la amplificación específica de alelos (Kazazian (1998) J. Lab. Clin. Med 1 1 :95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligadura específica de alelos (Landegren et al. (1988) Science 241 :1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671 ), mapeo de híbrido por radiación (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y mapeo Happy (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para utilizar en la reacción de amplificación o en las reacciones de extensión de cebadores. El diseño de dichos cebadores es muy conocido por los expertos en el arte. En los métodos que utilizan mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar diferencias de secuencias de ADN entre los progenitores de la cruza por mapeo en la región correspondiente con la secuencia de ácidos nucleicos de la presente. Sin embargo, esto generalmente no es necesario para los métodos de mapeo.

Planta Como se usa en la presente, el término "planta" abarca plantas enteras, antecesores y progenie de las plantas y partes de plantas, incluso semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluso tubérculos), flores y tejidos y órganos, en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca células de plantas, cultivos en suspensión, tejidos de callos, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular, plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluso forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos para alimentación, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [cañóla, colza oleaginosa, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucúrbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleífera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japónica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soya max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangif ra indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. Cpor ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Púnica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Sa/x sp., Sambucus spp., Sécale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. Cpor ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., V/gna spp., V/o/a odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.

Con respecto a las secuencias de la invención, una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos de origen vegetal tiene la característica de un uso de codón optimizado para la expresión en plantas, y del uso de aminoácidos y sitios reguladores comunes en plantas, respectivamente. Las plantas de origen pueden ser cualquier planta, pero son, preferentemente, las plantas descritas en el párrafo anterior.

Planta(s) de control La elección de plantas de control adecuadas es una parte rutinaria en la preparación experimental y puede incluir las correspondientes plantas de tipo silvestre o las correspondientes plantas sin el gen de interés. Generalmente, la planta de control es de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta a evaluar. La planta de control también puede ser un nulicigota de la planta a evaluar. Los nulicigotas (también denominados plantas de control nulas) son individuos que carecen del trasngen por segregación. Además, se cultivó una planta de control en las mismas condiciones de crecimiento que las plantas de la invención. En general, la planta de control se cultiva en las mismas condiciones de crecimiento y, por lo tanto, cerca de las plantas de la invención y al mismo tiempo. Como se usa en la presente, una "planta de control" se refiere no sólo a las plantas completas, sino también a las partes de las plantas, incluso semillas y partes de semillas. El fenotipo o los rasgos de las plantas de control se evalúan en condiciones que permiten la comparación con la planta producida de acuerdo con la invención, por ejemplo, las plantas de control y las plantas producidas de acuerdo con el método de la presente invención se cultivan en condiciones similares, preferentemente, en condiciones idénticas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ahora se ha descubierto que modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) produce plantas que tienen mayor rendimiento y/o mejores rasgos relacionados en el rendimiento, con respecto a las plantas de control. De acuerdo con una primera forma de realización, la presente invención provee un método para mejorar el rendimiento y/o los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, en donde dicho método comprende transformar una planta con un constructo recombinante para aumentar la actividad o expresión en una planta de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) y, opcionalmente, seleccionar las plantas que tienen mayor rendimiento y/o mejores rasgos relacionados con el rendimiento.

Un método preferido para modular la expresión y actividad de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) en una planta es mediante la introducción y expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica esta fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa).

Cualquier referencia de aquí en adelante a una "proteína útil en los métodos de la invención" significa una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa), como se define en la presente. Cualquier referencia de aquí en adelante a un "ácido nucleico útil en los métodos de la invención" significa un ácido nucleico capaz de codificar dicha fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa). El ácido nucleico que se desea introducir en una planta (y, por lo tanto, útil para realizar los métodos de la invención) es cualquier ácido nucleico que codifica el tipo de proteína que se describirá a continuación, en adelante también denominado "ácido nucleico ??G o "gen ??G.

La enzima fosforribosil pirofosfato sintetasa (EC 2.7.6.1 ) también se denomina ribosa-fosfato difosfoquinasa.

Preferentemente, una "fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa)" de la invención (es decir, el polipéptido POI), como se define en la presente, se refiere a cualquier polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene al menos uno de los dominios cortos, tales como el dominio IPR000842 de Interpro, el dominio IPR000836 de Interpro o el dominio IPR005946 de Interpro.

En una forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos contiene al menos dos, con mayor preferencia, al menos los tres dominios: el dominio IPR000842 de Interpro, el dominio IPR000836 de Interpro y el dominio IPR005946 de Interpro.

Además, una "fosforirbosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa)" de la invención (es decir, el polipéptido POI), como se define en la presente, se refiere a cualquier polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene al menos un dominio, tal como un dominio IPR000842 de Interpro y/o un dominio IPR000836 de Interpro y/o un dominio IPR005946 de Interpro y/o una secuencia de aminoácidos que comprende cualquiera de las secuencias de polipéptidos que se muestran en SEQ ID NO.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, y un homólogo de éstas (como se describió en la presente) o a un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende la molécula de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO.: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27 y un homólogo de ésta (como se describe en la presente) y/o comprende al menos uno de cualquiera de los motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a.

Preferentemente, la fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) comprende una secuencia de aminoácidos que contiene al menos un dominio, tal como un dominio IPR000842 de Interpro y/o un dominio IPR000836 de Interpro y/o un dominio IPR005946 de Interpro, y una secuencia de aminoácidos que tiene 35% o más de identidad con cualquiera de las secuencias de polipéptidos que se muestran en SEQ ID NO.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, o con un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende la molécula de ácido nucleico que se muestra en SEQ ID NO.: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27 y, aún con mayor preferencia, también comprende al menos uno de cualquiera de los motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a.

En una forma de realización, la fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) se caracteriza porque comprende uno o más de los siguientes motivos MEME: Motivo 1 (SEQ ID NO:32) IKRFADGEIWQLQESVRGCDV[F^L[VL]QPTC^P^NENLMELLIM[IV]DACRRAS Motivo 2 (SEQ ID NO:33) FAKKLSDAPLAIVDKRRHGHNVAEVMNLIGDV[KR]GKVA[VI]MVDDMIDTAGTI Motivo 3 (SEQ ID NO: 34): H[QE]EGAREVYAC[CT]THAVFSPPAIERLSSGL[FL]QEVI[IV]TNT[IL]P[VL][AS]EKNYFPQ L Motivo 3a (SEQ ID NO:35) H[QE]EGAREVYAC[CT]THAVFSPPAIERLSSGL[FL]QEVI[IV]TNT[IL]P[VL][AS]EKN[HY]F PQL Los motivos 1 a 3 se derivaron con el algoritmo MEME (Bailey and Elkan, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994.), En cada posición dentro de un motivo MEME, se muestran los residuos que están presentes en el conjunto de incógnitas de secuencias con una frecuencia mayor de 0,2. El Motivo 3a se derivó manualmente. Los residuos entre corchetes representan alternativas.

En una forma de realización preferida, el aminoácido en la posición 46 del motivo 3a es histidina.

Además, la presente invención se refiere a un homólogo del polipéptido POI y a su uso en el método de la presente invención. El homólogo de un polipéptido POI tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia total con el aminoácido representado por SEQ ID NO: 2 y/o representado por sus ortólogos y parálogos indicados en SEQ ID NO.: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, siempre que la proteína homologa comprenda uno o más de los motivos o dominios antes indicados. La identidad de secuencia total se determina con un algoritmo de alineamiento global, tal como el algoritmo de Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), preferentemente, con parámetros predeterminados y, preferentemente, con secuencias de proteínas maduras (es decir, sin considerar las señales de secreción o los péptidos de tránsito).

En una forma de realización, el nivel de identidad de secuencia se determina mediante la comparación de las secuencias de polipéptidos en la longitud total de la secuencia de SEQ ID NO: 2.

En comparación con la identidad de secuencia total, la identidad de secuencia generalmente será mayor cuando sólo se consideren dominios o motivos conservados. Preferentemente, los motivos en un polipéptido POI tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con uno o más de los Motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a.

En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico de la presente invención no consiste en SEQ ID NO.: 3 y el polipéptido de la presente invención no consiste en SEQ ID No. :4.

Los términos "dominio", "característica" y "motivo" se definen en la sección "definiciones" de la presente.

En una forma de realización, los polipéptidos tipo PRS1 que se usan en los métodos, constructos, plantas, partes cosechables y productos de la invención son polipéptidos tipo PRS1 , pero se excluyen los polipéptidos de las secuencias descritas en: a. SEQ ID NO: 4016 o el codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 292, ambos de la solicitud de patente internacional WO2009/134339; o b. SEQ ID NO: 9451 o el codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 3871 , ambos de la solicitud de patente estadounidense US2009/019601 ; o c. SEQ ID NO: 497 o 13893 o el codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 497 o 13893, ambos de la solicitud de patente estadounidense US 2009/094717; d. la base de datos GenBank® (véase Nucleic Acids Research, 2008 Jan:36(Database issue):D25-30 y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ ) desde el 7 de marzo de 201 1 con el identificador EEF07369.1 o EEE72505.1.

Preferentemente, la secuencia de polipéptidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo. En otra forma de realización, los polipéptidos de la invención, cuando se usan en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con no más de 4, 3 o 2 puntos de ramificación jerárquicos lejos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 Además, los polipéptidos POI (al menos en su forma nativa) generalmente se describen como fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa). SEQ ID NO.: 1 codifica para una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) de Populus trichocarpa. La fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) cataliza la producción de fosforribosil pirofosfato mediante la transferencia de la mitad beta, gama difosforil de ATP en el C-1 hidroxilo de ribosa-5 fosfato (Khorana et al., 1958). PRS es necesaria para la biosíntesis de novo de la coenzima de nucleótidos NAD de purina y pirimidina, y el rescate de bases preformadas de purina, pi midina y piridina (Krath et Hove-Jensen, 1999). Las proteínas PRS se dividen en 2 clases, los ORS clásicos en enzimas de reagrupamiento de clase I de bacterias, mamíferos y plantas, y proteínas PRS específicas de plantas. La estabilidad y actividad de las enzimas de clase I, pero no de clase II, dependen de Pi (fosfato inorgánico).

El aumento de expresión o actividad de los polipéptidos POI, cuando se expresan en una planta, por ejemplo, de acuerdo con los métodos de la presente invención, se indican en los Ejemplos 6 y 7, producen plantas que tienen mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa de brotes y/o mayor biomasa de raíces, con respecto a las plantas de control. Además, el efecto positivo del aumento de actividad o cantidad del polipéptido POI en una planta o célula vegetal de la biomasa de raíz sugiere que este aumento de actividad o cantidad también puede conferir un efecto positivo sobre el rendimiento en condiciones de estrés abiótico y, en particular, en condiciones de estrés por sequía.

La presente invención se ilustra mediante la transformación de plantas con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 1 que codifica la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2, respectivamente. Sin embargo, la realización de la invención no se restringe a estas secuencias; los métodos de la invención se pueden realizar, ventajosamente, mediante el uso de cualquier ácido nucleico que codifica POI o polipéptido POI, como se define en la presente, por ejemplo, enumerado en la Tabla A y en el listado de secuencias como los polipéptidos indicados en SEQ ID No.: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 y sus homólogos, ortólogos o parálogos.

En la Tabla A de la sección de Ejemplos de la presente, se brindan ejemplos de ácidos nucleicos que codifican fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa). Dichos ácidos nucleicos son útiles en la realización de los métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos son secuencias ejemplares de ortólogos y parálogos del polipéptido POI representado por SEQ ID NO: 2, los términos "ortólogos" y "parálogos" son como se definen en la presente. Otros ortólogos y parálogos se pueden identificar fácilmente mediante la realización de la denominada búsqueda blast recíproca, como se describe en la sección de definiciones; en donde la secuencia incógnita es, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, el segundo BLAST (retro BLAST) sería contra las bases de datos de secuencias originales, por ejemplo, una base de datos de álamos.

La invención también provee ácidos nucleicos que codifican POI y polipéptidos POI desconocidos hasta el momento, útiles para conferir mejores rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, se provee una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: (i) un ácido nucleico representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 , 3, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27; (iii) un ácido nucleico que codifica el polipéptido representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, como resultado de la degeneración del código genético, dicho ácido nucleico aislado se puede derivar de una secuencia de polipéptidos representada por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 y, con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (iv) un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 30 %, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27 y, con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (v) una molécula de ácido nucleico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iv) en condiciones de hibridación rigurosa y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (vi) un ácido nucleico que codifica una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%. 71%, 72%, 73%. 74%. 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 y cualquiera de las otras secuencias de aminoácidos de la Tabla A y, preferentemente, que confiere mayor biomasa de brotes y/o mayor biomasa de raíces, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, también se provee un polipéptido aislado seleccionado de: (¡) una secuencia de aminoácidos representada por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26; (¡i) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 y cualquiera de las otras secuencias de aminoácidos de la Tabla A y, preferentemente, que confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (iii) derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en (i) o (ii) anteriores; o (¡v) una secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de la invención.

En consecuencia, en una forma de realización, la presente invención se refiere a un constructo de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención o que confiere la expresión de un polipéptido POI de la invención.

Las variantes de ácidos nucleicos también pueden ser útiles para poner en práctica los métodos de la invención. Los ejemplos de dichas variantes incluyen ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las Tabla A de la sección de Ejemplos, en donde los términos "homólogo" y "derivado" son como se definen en la presente. También son útiles en los métodos de la invención los ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Los homólogos y derivados útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la proteína no modificada de la cual derivan. Otras variantes útiles para poner en práctica los métodos de la invención son las variantes en las cuales se optimiza el uso del codón o en las cuales se retiran los sitios blanco de miARN.

Otras variantes de ácidos nucleicos útiles para poner en práctica los métodos de la invención incluyen porciones de ácidos nucleicos que codifican fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa), ácidos nucleicos que se hibridan con ácidos nucleicos que codifican fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa), variantes de empalme de ácidos nucleicos que codifican POI, variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos POI y variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos POI obtenidos por transposición génica. Los términos secuencia de hibridación, variante de empalme, variante alélica y transposición génica son como se describen en la presente.

En una forma de realización de la presente invención, la función de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención es conferir información para una proteína que aumenta el rendimiento o los rasgos relacionados con el rendimiento, cuando una secuencia de ácidos nucleicos de la invención se transcribe y traduce en una célula vegetal viva.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos POI no necesitan ser ácidos nucleicos de longitud completa, ya que la realización de los métodos de la invención no depende del uso de secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa. De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una porción de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, y que tiene sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección Ejemplos, en particular, de un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2.

Se puede preparar una porción de un ácido nucleico, por ejemplo, realizando una o más eliminaciones en el ácido nucleico. Las porciones se pueden utilizar en forma aislada o se pueden fusionar con otras secuencias codificantes (o no codificantes) a fin de producir, por ejemplo, una proteína que combine varias actividades. Cuando se fusiona con otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido luego de la traducción puede ser más grande que el previsto para la porción de proteína.

Las porciones útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido POI como se define en la presente y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la porción es una porción de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la porción tiene al menos 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos consecutivos de longitud, en donde los nucleótidos consecutivos son cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la porción es una porción del ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27. Con máxima preferencia, la porción es una porción del ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. Preferentemente, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de polipéptidos POI que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende uno o más de los Motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a y/o tiene actividad biológica de una HRGP y/o comprende la molécula de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, o es un ortólogo o parálogo de éstas. Por ejemplo, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de polipéptidos POI que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 en lugar de con cualquier otro grupo, y comprende uno o más de los Motivos 1 o 2, y tiene actividad biológica de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) y tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es un ácido nucleico capaz de hibridarse, en condiciones de rigurosidad reducida, preferentemente en condiciones de rigurosidad, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, como se define en la presente, o con una porción como se define en la presente.

En una forma de realización, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1 o con una porción de éste en condiciones de rigurosidad media o alta, preferentemente, rigurosidad alta, como se definió anteriormente. En otra forma de realización, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1 en condiciones rigurosas.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento y mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Las secuencias de hibridación útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido POI, como se define en la presente, y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, en particular de un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2. Preferentemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o con una porción de cualquiera de estas secuencias, en donde una porción es como se definió con anterioridad, o la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Con máxima preferencia, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1 o con una porción de éste.

Preferentemente, la secuencia de hibridación codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que, cuando tiene longitud total y se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de polipéptidos POI que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo y/o que comprende uno o más de los Motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a, y/o tiene actividad biológica de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) y/o tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, o es un ortólogo o parálogo de éstas. Por ejemplo, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de polipéptidos POI que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo y que comprende uno o más de los Motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a, y tiene actividad biológica de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) y tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es una variante de empalme que codifica un polipéptido POI, como se definió con anterioridad; una variante de empalme es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de empalme de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Las variantes de empalme preferidas son las variantes de empalme de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1 , o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 2. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de empalme, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de polipéptidos POI que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo y/o que comprende uno o más de los Motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a, y/o tiene actividad biológica de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) y/o tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, o es un ortólogo o parálogo de éstas. Por ejemplo, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de polipéptidos POI que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo y que comprende uno o más de los Motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a, y tiene actividad biológica de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1, PRPP sintetasa) y tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

Otra variante de ácido nucleico útil para realizar los métodos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, como se definió anteriormente en la presente; una variante de alélica es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Los polipéptidos codificados por las variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido POI de SEQ ID NO: 2 y cualquiera de los aminoácidos representados en la Tabla A de la sección de Ejemplos, preferentemente, como el polipéptido POI de SEQ ID NO: 2. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y el uso de estos alelos naturales está comprendido en los métodos de la presente invención. Preferentemente, la variante alélica es una variante alélica de SEQ ID NO: 1 , o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 2. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante alélica, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de polipéptidos POI que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo y/o que comprende uno o más de los Motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a, y/o tiene actividad biológica de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) y/o tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, o es un ortólogo o parálogo de éstas. Por ejemplo, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de polipéptidos POI que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo y que comprende uno o más de los Motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a, y tiene actividad biológica de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1, PRPP sintetasa) y tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

También se puede usar transposición génica o evolución dirigida para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos POI, como se definieron anteriormente; el término "transposición génica" es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento y mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, en donde la variante de ácido nucleico se obtiene mediante transposición génica.

Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de ácido nucleico que se obtiene por transposición génica, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de polipéptidos POI que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo y/o que comprende uno o más de los Motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a, y/o tiene actividad biológica de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) y/o tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, o es un ortólogo o parálogo de éstas. Por ejemplo, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 1 , se agrupa con el grupo de polipéptidos POI que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo y que comprende uno o más de los Motivos 1 , 2, 3, 3a, preferentemente, 1 , 2 o 3a, y tiene actividad biológica de una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa) y tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

Además, las variantes de ácidos nucleicos también se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida a sitio. Hay varios métodos disponibles para lograr la mutagénesis dirigida a sitio, en donde los más comunes son los métodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos POI pueden derivar de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico se puede modificar de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico mediante manipulación humana deliberada. Preferentemente, el ácido nucleico que codifica el polipéptido POI se selecciona de un organismo indicado en la Tabla A, por ejemplo, de una planta.

Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el polipéptido POI de SEQ ID NO:4 se puede generar del ácido nucleico que codifica el polipéptido POI de SEQ ID NO:2 mediante la alteración de varios nucleótidos. Los polipéptidos POI que difieren de la secuencia de SEQ ID NO: 2 por uno o varios aminoácidos se pueden usar para aumentar el rendimiento de las plantas en los métodos y constructos de la invención y plantas de la invención. Por ejemplo, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 4 se puede generar de la secuencia de SEQ ID NO: 2 mediante la inserción de ácidos nucleicos adicionales en la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 , de manera que frente al codón 158 de SEQ ID NO:1 , que codifica para treonina en la posición 158 de SEQ ID NO:2, se insertan los codones de manera qeu se insertan los siguientes aminoácidos antes de dicha treonina en el polipéptido resultante: Alanina- Serina-Fenilalanina- Metionina Esto se pueden lograr, por ejemplo, mediante la inserción de la secuencia de ácidos nucleicos de GCAAGTTTTATG en la posición 472 de SEQ ID NO:1.

En otra forma de realización, la presente invención se extiende a ADN cromosómico recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos útil en los métodos de la invención, en donde dicho ácido nucleico está presente en el ADN cromosómico como resultado de métodos recombinantes, es decir, dicho ácido nucleico no se encuentra en el ADN cromosómico en su entorno natural. Dicho ADN cromosómico recombinante puede ser un cromosoma de origen natural, en donde dicho ácido nucleico se inserta por medios recombinantes, o puede ser un minicromosoma o una estructura cromosómica no natural, por ejemplo, un cromosoma artificial. La naturaleza del ADN cromosómico puede variar, siempre que el pasaje estable en las sucesivas generaciones del ácido nucleico recombinante útil en los métodos de la invención, y permita la expresión de dicho ácido nucleico en una célula vegetal viva, que genera mayor rendimiento o rasgos aumentados relacionados con el rendimiento de la célula vegetal o planta que comprende la célula vegetal.

En otra forma de realización, el ADN cromosómico recombinante de la invención está comprendido en una célula vegetal.

La realización de los métodos de la invención genera plantas que tienen mayor rendimiento y mejores rasgos relacionados con el rendimiento. En particular, la realización de los métodos de la invención genera plantas que tienen mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa de brote y/o mayor biomasa de raíz, con respecto a las plantas de control. Los términos "rendimiento" y "rendimiento de semilla" se describen en mayor detalle en la sección "definiciones" de la presente.

La referencia en la presente a mejores rasgos relacionados con el rendimiento significa un aumento de vigor temprano y/o biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que pueden incluir partes aéreas (cosechables) y/o partes subterráneas (cosechables). En particular, dichas partes cosechables son semillas y/o raíces, y la realización de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen mayor tasa de llenado de semillas y biomasa de raíces y brotes, con respecto a las plantas de control.

En una forma de realización, las partes cosechables son remolachas.

La presente invención provee un método para aumentar el rendimiento, en comparación con las plantas de control nulas, en particular, rendimiento de semillas, según se mide por la cantidad de semillas y la cantidad de semillas llenas, y mejores rasgos relacionados con el rendimiento, en particular, mayor biomasa de brote y/o mayor biomasa de raíz, con respecto a las plantas de control. Este método comprende modular, preferentemente, aumentar la expresión o actividad de un polipéptido POI en una planta, por ejemplo, modular o aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, como se define en la presente. Además, el efecto positivo del aumento de actividad o expresión del polipéptido POI en una planta o célula vegetal de la biomasa de raíz y tasa de llenado de semillas sugiere que esto también puede conferir un efecto positivo sobre el rendimiento en condiciones de estrés abiótico y, en particular, en condiciones de estrés por sequía.

Debido a que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen mayor rendimiento, por ejemplo, rasgos relacionados con el rendimiento, tales como mayor biomasa de brote y/o mayor biomasa de raíz, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (durante al menos parte de su ciclo de vida), con respecto a la tasa de crecimiento de las plantas de control en una etapa correspondiente de su ciclo de vida.

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la realización de los métodos de la invención genera plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento con respecto a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar la tasa de crecimiento de las plantas, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, como se define en la presente.

La realización de los métodos de la invención le brinda a las plantas cultivadas en condiciones sin estrés mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones sin estrés, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI.

La realización de los métodos de la invención le puede brindar a las plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, en particular en condiciones de deficiencia de nitrógeno, mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI.

La realización de los métodos de la invención también le puede brindar a las plantas cultivadas en condiciones de estrés salino mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de estrés salino, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI.

La realización de los métodos de la invención le puede brindar a las plantas cultivadas en condiciones de sequía leve mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de sequía leve, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI.

La invención también provee constructos genéticos y vectores para facilitar la introducción y/o expresión en plantas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos POI. Los constructos génicos se pueden insertar en vectores, que pueden estar disponibles en el comercio, adecuados para la transformación en plantas y para la expresión del gen de interés en las células trasformadas. La invención también provee el uso de un constructo génico, como se define en la presente en los métodos de la invención.

Más específicamente, la presente invención provee un constructo que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, como se definió anteriormente; (b) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (c) una secuencia de terminación de la transcripción.

Preferentemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido POI es como se definió anteriormente; Los términos "secuencia de control" y "secuencia de terminación" son como se definen en la presente.

La invención además provee plantas transformadas con un constructo tal como se define anteriormente. En particular, la invención provee plantas transformadas con un constructo tal como se definió anteriormente, cuyas plantas tienen mejor rendimiento y/o rasgos aumentados relacionados con el rendimiento, como se describen en la presente.

Las plantas se transforman con un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. El experto en el arte conoce los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huésped que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés se liga operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor) en los vectores y constructos de la invención.

En una forma de realización, las plantas de la invención se transforman con un cásete de expresión que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos antes descritos. El experto en el arte conoce los elementos genéticos que deben estar presentes en el cásete de expresión a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huésped que contienen la secuencia de interés. En los casetes de expresión de la invención, la secuencia de interés se liga operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor). El promotor en dicho cásete de expresión puede ser un promotor no natural para el ácido nucleico antes descrito, es decir, un promotor que no regula la expresión de dicho ácido nucleico en su entorno natural.

En otra forma de realización, los casetes de expresión de la invención confieren mayor rendimiento o rasgos relacionados con el rendimiento a una célula vegetal viva, cuando se introdujeron en dicha célula vegetal y dan como resultado la expresión del ácido nucleico antes definido, comprendido en los casetes de expresión.

Los casetes de expresión de la invención pueden estar comprendidos en una célula huésped, célula vegetal, semilla, producto agrícola o planta.

De forma ventajosa, se puede utilizar cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos, pero preferentemente, el promotor es de origen vegetal. Un promotor constitutivo es particularmente útil en los métodos. Preferentemente, el promotor constitutivo es un promotor constitutivo ubicuo de intensidad media. Véase la sección "Definiciones" de la presente para las definiciones de los diversos tipos de promotores. También son útiles en los métodos de la invención los promotores específicos de raíz. En general, por "promotor de potencia media" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel más bajo que un promotor fuerte, en particular a un nivel que es, en todos los casos, inferior al obtenido bajo el control de un promotor 35S CaMV.

Debe quedar claro que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, representado por SEQ ID NO: 1, ni a la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI cuando es dirigido por un promotor constitutivo o cuando es dirigido por un promotor específico de raíz.

Preferentemente, el promotor constitutivo es un promotor de intensidad media, más preferentemente seleccionado de un promotor derivado de una planta, por ejemplo, un promotor de origen cromosomico vegetal, tal como un promotor GOS2, con mayor preferencia, el promotor es un promotor GOS2 del arroz (SEQ ID NO: 29). A veces, el promotor GOS2 se denomina promotor PR0129 o PRO0129. Con mayor preferencia, el promotor constitutivo es representado por una secuencia de ácidos nucleicos sustancialmente similar a SEQ ID NO: 29, con máxima preferencia, el promotor constitutivo es representado por SEQ ID NO: 29. Véase la sección "Definiciones" de la presente para más ejemplos de promotores constitutivos.

Opcionalmente, se pueden utilizar una o más secuencias terminadoras en el constructo introducido en una planta. Preferentemente, el constructo comprende un cásete de expresión que comprende un promotor GOS2 y el ácido nucleico que codifica el polipéptido POI. Además, puede haber una o más secuencias que codifican marcadores seleccionables en el constructo introducido en una planta.

De acuerdo con una característica preferida de la invención, la expresión modulada es una mayor expresión o actividad, por ejemplo, sobreexpresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, por ejemplo, de una molécula de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO.: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27, o un parálogo u ortólogo de ésta, por ejemplo, como se indica en la Tabla A. Los métodos para aumentar la expresión de ácidos nucleicos o genes, o productos génicos, están muy documentados en el arte y se proveen ejemplos en la sección de definiciones.

Como se mencionó anteriormente, un método preferido para modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI es mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI; sin embargo, los efectos de realizar el método, es decir, aumentar el rendimiento y mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento, también se pueden lograr mediante otras técnicas conocidas, que incluyen, pero sin limitación, rotulado por activación de T-ADN, TILLING, recombinación homologa. En la sección de definiciones se provee una descripción de estas técnicas.

La invención también provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, que comprende la introducción y expresión en una planta de cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, como se definió anteriormente en la presente.

Más específicamente, la presente invención provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, en particular, mayor rendimiento de semillas, tasa de llenado de semillas, biomasa de raíces y brotes, en comparación con las plantas de control nulas, en donde el método comprende: (i) introducir y expresar en una planta o célula vegetal un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI o un constructo genético que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI; y (¡i) cultivar la célula vegetal en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta.

Además, el efecto positivo de este constructo en la biomasa de raíces sugiere que este constructo también puede conferir un efecto positivo sobre el rendimiento en condiciones de estrés abiótico y, en particular, en condiciones de estrés por sequía. El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido POI, como se define en la presente.

El ácido nucleico se puede introducir directamente en una célula vegetal o en la planta misma (incluso introducirlo en un tejido, órgano o cualquier otra parte de la planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce, preferentemente, en una planta mediante transformación. El término "transformación" se describe en mayor detalle en la sección "definiciones" de la presente.

En una forma de realización, la presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente y a todas las partes de la planta y sus propágulos. La presente invención abarca plantas o sus partes (incluso semillas) que se pueden obtener mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o las partes de éstas comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, como se definió anteriormente. La presente invención también abarca la progenie de una célula, tejido, órgano o planta entera primaria transformada o transfectada que fue producida mediante cualquiera de los métodos antes mencionados, en donde el único requisito es que la progenie exhiba la(s) misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) que la(s) producida(s) por el progenitor en los métodos de acuerdo con la invención.

En otra forma de realización, la presente invención también se extiende a células de plantas transgénicas y semillas, que comprenden la molécula de ácido nucleico de la invención en un cásete de expresión vegetal o en un constructo de expresión vegetal.

En otra forma de realización, la semilla de la invención comprende, de manera recombinante, los casetes de expresión de la invención, los constructos de (expresión) de la invención, los ácidos nucleicos antes descritos y/o las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos antes descritos.

Otra forma de realización de la presente invención se extiende a células vegetales que comprenden el ácido nucleico antes descrito, en un cásete de expresión vegetal recombinante.

Aún en otra forma de realización, las células vegetales de la invención son células que no se propagan, por ejemplo, las células no se pueden usar para regenerar una planta entera de esta célula en su conjunto mediante el uso de técnicas de cultivo celular estándar, es decir, métodos de cultivo celular, pero excluyendo métodos de transferencia de núcleos, organelas o cromosomas in vitro. Si bien las células vegetales generalmente tienen la característica de totipotencia, algunas células vegetales no se pueden usar para regenerar o propagar plantas intactas de dichas células. En una forma de realización de la invención, las células vegetales de la invención son dichas células.

En otra forma de realización, las células vegetales de la invención son células vegetales que no se sostienen a sí mismas por fotosíntesis mediante la síntesis de hidratos de carbono y proteínas de sustancias inorgánicas, tales como agua, dióxido de carbono y sales minerales, es decir, se las puede considerar una variedad no vegetal. En otra forma de realización, las células vegetales de la invención son una variedad no vegetal y no se pueden propagar.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido POI, como se definió anteriormente. Las células huésped de la invención pueden ser cualquier célula seleccionada del grupo que consiste en células bacterianas, tales como células de especies de E.coli o Agrobacterium, células de levadura, células de hongos, algas o cianobacterias o células vegetales. En una forma de realización, las células huésped de acuerdo con la invención son células vegetales. Las plantas huésped para los ácidos nucleicos o el vector usado en el método de acuerdo con la invención, el cásete de expresión o constructo o vector son, en principio, ventajosamente, todas las plantas que son capaces de sintetizar los polipéptidos usados en el método de la invención.

En una forma de realización, las células vegetales de la invención sobreexpresan la molécula de ácido nucleico de la invención.

La invención también incluye métodos para la producción de un producto que comprende a) cultivar las plantas de la invención y b) producir dicho producto de o mediante las plantas de la invención o partes de estas plantas, que incluyen semillas. En otra forma de realización, los métodos comprenden las siguientes etapas: a) cultivar las plantas de la invención, b) retirar las partes cosechables, como se definieron anteriormente, de las plantas, y c) producir dicho producto de o mediante las partes cosechables de la invención.

Los ejemplos de dichos métodos serían cultivar plantas de maíz de la invención, cosechar las mazorcas del maíz y retirar los granos. Estos se pueden usar como forraje o se pueden procesar para obtener almidón o aceite como productos agrícolas.

El producto se puede generar en el lugar donde se cultivó la planta, o se pueden retirar las plantas o partes de éstas del lugar en donde se cultivaron las plantas para obtener el producto. En general, se cultiva la planta, se retiran las partes cosechables deseables de la planta, de ser posible en ciclos repetidos, y se obtiene el producto de las partes cosechables de la planta. La etapa de cultivar la planta se puede realizar solo una vez cada vez que se llevan a cabo los métodos de la invención, mientras que las etapas de producción del producto se pueden realizar varias veces, por ejemplo, mediante el retiro reiterado de las partes cosechables de las plantas de la invención y, de ser necesario, mediante el procesamiento adicional de estas partes para obtener el producto. También es posible reiterar la etapa de cultivo de las plantas de la invención y almacenar las partes de plantas o partes cosechables hasta que se lleva a cabo una vez la generación del producto para las plantas o partes de las plantas acumuladas. Además, las etapas de cultivar las plantas y obtener el producto se pueden superponer en el tiempo, incluso se pueden realizar, en gran medida, de manera simultánea o secuencial. En general, las plantas se cultivan durante cierto tiempo antes de obtener el producto.

Ventajosamente, los métodos de la invención son más eficaces que los métodos conocidos porque las plantas de la invención tienen mayor rendimiento y/o tolerancia a un estrés ambiental, en comparación con una planta de control que se usa en métodos comparables.

En una forma de realización, los productos obtenidos mediante los métodos de la invención son productos vegetales, tales como, pero sin limitación, productos alimenticios, forraje, suplementos alimenticios, suplementos para forraje, fibras, cosméticos o productos farmacéuticos. Los productos alimenticios para humanos se consideran composiciones para la nutrición o para complementar la nutrición. Los productos alimenticios para animales y los suplementos alimenticios para animales, en particular, se consideran productos alimenticios.

En otra forma de realización, los métodos de la invención para la producción se usan para obtener productos agrícolas tales como, pero sin limitación, extractos vegetales, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono, grasas, aceites, polímeros, vitaminas y similares.

Es posible que un producto vegetal consista, en gran medida, en uno o más productos agrícolas.

Aún en otra forma de realización, las secuencias de polinucleótidos o las secuencias de polipéptidos de la invención están comprendidas en un producto agrícola.

En otra forma de realización, las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias proteicas de la invención se pueden usar como marcadores de productos, por ejemplo, para un producto agrícola obtenido por los métodos de la invención. El marcador se puede usar para identificar un producto que se obtuvo medíante un proceso ventajoso que genera no solo mayor eficacia del proceso, sino también mejor calidad del producto, debido a una mayor calidad del material vegetal y de las partes cosechables usados en el proceso. Los marcadores se pueden detectar mediante varios métodos conocidos en el arte, por ejemplo, pero sin limitación, métodos basados en PCR para la detección de ácidos nucleicos o métodos basados en anticuerpos para la detección de proteínas.

Los métodos de la invención se pueden aplicar de forma ventajosa a cualquier planta. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, remolacha, remolacha azucarera, girasol, cañóla, achicoria, zanahoria, mandioca, alfalfa, trébol, colza, linaza, algodón, tomate, papa y tabaco. Con mayor preferencia, la planta es una planta monocotiledónea. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. Con mayor preferencia, la planta es un cereal. Los ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, sécale, trigo einkorn, teff, sorgo milo y avena.

En una forma de realización, las plantas que se usan en los métodos de la invención se seleccionan del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, soja, algodón, colza oleaginosa, que incluye cañóla, caña de azúcar, remolacha azucarera y alfalfa.

En otra forma de realización de la presente invención, las plantas de la invención y las plantas que se usan en los métodos de la invención son plantas de remolacha azucarera con mayor biomasa y/o mayor contenido de azúcar de las remolachas.

La invención también se extiende a las partes cosechables de una planta tales como, pero sin limitación, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, raíces, rizomas, tubérculos y bulbos, cuyas partes cosechables comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido POI. La invención además se refiere a productos derivados o producidos, preferentemente, derivados o producidos directamente, de una parte cosechable de dicha planta, tal como pellets secos o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos POI, como se describen en la presente, y el uso de estos polipéptidos POI para mejorar cualquiera de los rasgos relacionados con el rendimiento antes mencionados en plantas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido POI, como se describe en la presente, o los mismos polipéptidos POI, se pueden usar en programas de reproducción, en donde se identifica un marcador de ADN que se puede ligar genéticamente a un gen que codifica un polipéptido POI. Para definir un marcador molecular se pueden usar ácidos nucleicos/genes o los mismos polipéptidos POI. Este marcador de ADN o proteína luego se puede usar en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, como se definió anteriormente en los métodos de la invención Además, las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido POI pueden ser útiles en los programas de reproducción asistidos por marcador. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos POI también se pueden usar como sondas para mapear de forma genética y física los genes de los cuales son parte, y como marcadores para los rasgos ligados a esos genes. Dicha información puede ser útil para la reproducción de plantas a fin de desarrollar líneas con los fenotipos deseados.

En una forma de realización, se realiza cualquier comparación para determinar los porcentajes de identidad de secuencia - en el caso de una comparación de ácidos nucleicos, sobre la región codificante completa de SEQ ID NO: 1 , o - en el caso de una comparación de secuencias de polipéptidos, sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 2.

Por ejemplo, en esta forma de realización, una identidad de secuencia del 50% significa que sobre la región codificante completa de SEQ ID NO: 1 , el 50 por ciento de todas las bases son idénticas entre la secuencia de SEQ ID NO: 1 y la secuencia relacionada. De modo similar, en esta forma de realización, una secuencia de polipéptidos es 50 % idéntica a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2, cuando el 50 por ciento de los residuos de aminoácidos de la secuencia representada en SEQ ID NO: 2 se encuentran en el polipéptido evaluado, al comparar desde la metionina de inicio hasta el final de la secuencia de SEQ ID NO: 2.

En una forma de realización, las secuencias de ácidos nucleicos que se usan en los métodos, constructos, plantas, partes cosechables y productos de la invención son secuencias que codifican POI, pero con exclusión de los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de polipéptidos descritas en cualquiera de los siguientes: a) SEQ ID NO: 4016 o el codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 292, ambos de la solicitud de patente internacional WO2009/134339; o b) SEQ ID NO: 9451 o el codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 3871 , ambos de la solicitud de patente estadounidense US2009/019601 ; o c) SEQ ID NO: 497 o 13893 o el codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 497 o 13893, ambos de la solicitud de patente estadounidense US 2009/094717; d) la base de datos GenBank® (véase Nucleic Acids Research, 2008 Jan;36(Database issue):D25-30 y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ ) desde el 7 de marzo de 2011 con el identificador EEF07369.1 o EEE72505.1.

En otra forma de realización, la secuencia de ácidos nucleicos que se usa en la invención son las secuencias que no son los polinucleótidos que codifican las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en las proteínas enumeradas en la tabla A, y las que tienen al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90, 93, 95, 98 o 99% de identidad de nucleótidos, cuando se alinean de manera óptima con las secuencias que codifican las proteínas enumeradas en la tabla A. ítems: 1. Un método para mejorar el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde dicho polipéptido comprende al menos uno de los siguientes dominios: dominio IPR000842 de Interpro, dominio IPR000836 de Interpro y dominio IPR005946 de Interpro. 2. Método de acuerdo con el ítem 1 , en donde dicho polipéptido comprende uno o más de los siguientes motivos: Motivo 1 (SEQ ID NO:32) IKRFADGEIYVQLQESVRGCDV[FY]L[VL]QPTC[PT]P[AT]NENLMELLIM[IV]DACRRA; Motivo 2 (SEQ ID NO:33) FAKKLSDAPLAIVDKRRHGHNVAEVMNLIGDV[KR]GKVA[VI]MVDDMIDTAGTI; o Motivo 3 (SEQ ID NO:34) H[QE]EGAREVYAC[CT]THAVFSPPAIERLSSGL[FL]QEVI[IV]TNT[IL]P[VL]tAS]EKNYF PQL Motivo 3a (SEQ ID NO:35) H[QE]EGAREVYAC[CT]THAVFSPPAIERLSSGL[FL]QEVI[IV]TNT[IL]P[VL][AS]EKN[H Y]FPQL 3. Método de acuerdo con el ítem 1 o 2, en donde dicha expresión modulada se realiza mediante la introducción y expresión en una planta de una molécula de ácido nucleico que codifica una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa). 4. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 3, en donde dicho polipéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (i) un ácido nucleico representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 o 27; (iii) un ácido nucleico que codifica el polipéptido representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, como resultado de la degeneración del código genético, dicho ácido nucleico aislado se puede derivar de una secuencia de polipéptidos representada por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 y. con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (iv) un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 30 %, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27 y, con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (v) una molécula de ácido nucleico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iv) en condiciones de hibridación rigurosa y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; o (vi) un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

Método de acuerdo con cualquier ítem anterior, en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento, preferentemente, mayor biomasa de brote y/o mayor biomasa de raíz, con respecto a las plantas de control.

Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 5, en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estrés.

Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 5, en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de estrés por sequía, estrés salino o deficiencia de nitrógeno. 8. Constructo que comprende: (i) ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, como se define en cualquiera de los ítems 1 a 7; (ii) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de la transcripción. 9. Uso de un constructo de acuerdo con el ítem 8 en un método para producir plantas que tienen mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa de brote y/o mayor biomasa de raíz, con respecto a las plantas de control. 10. Planta, parte de planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con el ítem 9 o que se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 7, en donde dicha planta o parte de ésta comprende un ácido nucleico recombinante que codifica dicho polipéptido, como se define en cualquiera de los ítems 1 a 10. 11. Método para la producción de una planta transgénica que tiene mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control, que comprende: (i) introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, como se define en cualquiera de los ítems 1 a 7; y (ii) cultivar la célula vegetal en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta. 12. Partes cosechabies de una planta de acuerdo con el ítem 10, en donde dichas partes cosechabies son, preferentemente, biomasa de brote y/o raíz y/o semillas. 13. Productos derivados de una planta de acuerdo con el ítem 10 y/o de partes cosechabies de una planta de acuerdo con el ítem 12. 14. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en cualquiera de los ítems 1 a 7 para aumentar el rendimiento, en particular, aumentar la biomasa de brote y/o la biomasa de raíz, con respecto a las plantas de control. 15. Las partes cosechabies de una planta de la invención, en donde dichas partes cosechabies son, preferentemente, biomasa de brote y/o raíz y/o semillas, en donde la parte cosechable comprende el ácido nucleico de la invención. 16. Productos derivados de una planta de la invención y/o de partes cosechabies de la invención, en donde los productos comprenden el ácido nucleico de la invención. 17. Molécula de ácido nucleico de la invención, en donde la molécula no es cualquier molécula de la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: enumerada en la columna 2 de la Tabla A, excepto por SEQ ID NO:1. 18. Polipéptido de la invención, en donde el polipéptido no es cualquier polipéptido de la secuencia de SEQ ID NO: enumerada en la columna 3 de la Tabla A, excepto por SEQ I D NO: 2. 19. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en cualquiera de los ítems anteriores para aumentar el rendimiento, en particular, aumentar la biomasa de brote y/o la biomasa de raíz, con respecto a las plantas de control.

En la solicitud, los términos "que tiene la secuencia de SEQ ID NO:" y "como se representa en SEQ ID NO: " se pueden usar de manera indistinta.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se describirá a continuación con referencia a las siguientes figuras en las cuales: La Figura 1 muestra un árbol filogenético de polipéptidos POI.

La Figura 2 representa el vector binario que se usa para una mayor expresión en Oryza sativa de un ácido nucleico que codifica POI bajo el control de un promotor GOS2 (pGOS2) del arroz.

La Figura 3 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:2 y secuencias relacionadas (SEQ ID NO: números impares de 4 a 28). El fondo gris claro marca que están conservados en la mayoría de las secuencias, el fondo oscuro marca aminoácidos fuertemente conservados. Los aminoácidos con fondo gris claro y los que tienen fondo blanco permiten la diferenciación entre la secuencia de SEQ ID NO:2 y las otras secuencias. Se muestra una secuencia de consenso al final del alineamiento.

La Figura 4 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y 4 de la presente solicitud. El fondo gris oscuro marca aminoácidos idénticos. Como se puede observar, es posible transferir el polipéptido de SEQ ID NO:2 al de SEQ ID NO: 4 con la adición de unos pocos aminoácidos.

EJEMPLOS La presente invención se describirá a continuación con referencia a los siguientes ejemplos, que se proveen solamente a modo ilustrativo. Los siguientes ejemplos no pretenden definir completamente o, de otro modo, limitar el alcance de la invención.

Manipulación de ADN: a menos que se indique de otro modo, las técnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con los protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001 ) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Coid Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y métodos estándar para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications (UK).

Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 Se identificaron secuencias (de cADN de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 entre aquellas que se mantienen en la base de datos Entrez Nucleotides en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) mediante el uso de herramientas de búsqueda de secuencias en base de datos, tales como Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). El programa se usa para encontrar regiones de similitud local entre secuencias mediante la comparación de secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos con bases de datos de secuencias y mediante el cálculo de la importancia estadística de las coincidencias. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 se usó para el algoritmo TBLASTN, con parámetros predeterminados, y se activó el filtro para ignorar las secuencias de baja complejidad. El resultado del análisis se examinó mediante comparación de a pares y se lo calificó de acuerdo con el puntaje de probabilidad (valor E), donde el puntaje refleja la probabilidad de que un alineamiento en particular se produzca al azar (cuanto menor es el valor E, más importante es la coincidencia). Además de los valores E, las comparaciones también se calificaron por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere a la cantidad de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos) comparadas a lo largo de una longitud particular. En algunos casos, los parámetros predeterminados se pueden ajustar para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo, se puede aumentar el valor E para mostrar coincidencias menos rigurosas. De este modo, se pueden identificar coincidencias cortas casi exactas.

De modo similar, se pueden identificar las secuencias relacionadas con SEQ ID NO:1 y 2.

El listado de secuencias provee una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; por ejemplo, seleccionadas de la Tabla A.

Tabla A: En la Tabla A se muestran ejemplos de polipéptidos y ácidos nucleicos POI.

Las secuencias se unieron tentativamente y se revelaron al público mediante institutos de investigación, tales como The Institute for Genomic Research (TIGR; comenzando con TA). La base de datos Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) se puede usar para identificar dichas secuencias relacionadas, ya sea por búsqueda de palabra clave o usando el algoritmo BLAST con la secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de polipéptidos de interés. Se crearon bases de datos especiales de secuencias de ácidos nucleicos para organismos particulares, como por ejemplo, mediante el Joint Genome Institute. Asimismo, el acceso a bases de datos registradas permite la identificación de nuevas secuencias de polipéptidos y ácidos nucleicos.

Preferentemente, el POI es una fosforribosil pirofosfato sintetasa y tiene una actividad descrita de la siguiente manera: Rib-5-? + ATP -> PRPP + AMP. La enzima PRS se clasifica como EC 2.7.6.1.

Se publica un ensayo, por ejemplo, en Krath and Hove -Jensen, 1999: La actividad de PRPP sintasa se evaluó a 30°C mediante la modificación de un procedimiento previamente descrito (Arnvig et al. ,1990). El extracto de células bacterianas (o vegetales) (10 mL) se mezcló con 40 mL de una mezcla de reacción (ambas previamente calentadas a 30°C) para obtener las siguientes concentraciones finales: 5 mm de Rib-5-?, 3 mm de [g-32P]ATP (10 GBq/mol) preparado como se describe en Jensen et al. (1979), 5 mm de MgCI2, 20 mm de NaF y 50 mm de Tris-HCI (pH 7,6) o 50 mm de tampón de fosfato de potasio y 50 mm de Tris-HCI (pH 7.6). Las muestras (10 mL) se retiraron en intervalos y se mezclaron con 5 mL de 0,33 m HCOOH. Esto se aplicó a la hoja TLC de polietilenimina-celulosa (Baker-flex, J.T. Baker). Luego del secado, el cromatograma se desarrolló en 0,85 m de KH2P04, que se había ajustado previamente a pH 3,4 con 0,85 m de H3P04. La actividad de PRPP sintasa de cloroplastos y mitocondria se se evaluó con el mismo procedimiento, excepto que se incluyeron PEP (12,5 mm) y piruvato quinasa (2,5 mg L21 de mezcla de reacción; Boehringer Mannheim) en el ensayo. La radioactividad se cuantificó en Instant Imager (modelo 2024, Packard, Meriden, CT). La concentración proteica se determinó con el procedimiento de ácido bicinconínico (Smith et al., 1985) con productos químicos provistos por Pierce, y con BSA como el estándar.

SEQ ID NO: 2 muestra una fosforribosil pirofosfato sintetasa del álamo. Pertenece a una pequeña familia de al menos 4 genes en espinaca y Arabidopsis (Krath et al., 1999; Krath and Owe-Jensen, 1999). Algunas enzimas se pueden ubicar en diferentes compartimentos celulares, mitocondria, cloroplasto o citosol.

Ejemplo 2: Alineamiento de secuencias de polipéptidos POI El alineamiento de secuencias de polipéptidos se realiza con el algoritmo de alineamiento progresivo ClustalW (2.0) (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31 :3497-3500) con parámetros estándar (alineamiento lento, matriz de similitud: Gonnet (o Blosum 62 (si los polipéptidos están alineados), penalidad por apertura de brecha 10, penalidad por extensión de brecha: 0,2). Se puede realizar edición manual menor para optimizar adicionalmente el alineamiento.

También se puede construir un árbol filogenético de polipéptidos POI con un algoritmo de agrupamiento por unión a vecino como el que se provee en el programa AlignX de Vector NTI (Invitrogen).

Ejemplo 3: Cálculo del porcentaje de identidad global entre las secuencias de polipéptidos Los porcentajes globales de similitud e identidad entre secuencias de polipéptidos de longitud completa se pueden determinar con el algoritmo ClustalW 2.0 de alineamiento progresivo (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31 :3497-3500) con parámetros predeterminados.

Los porcentajes globales de similitud e identidad entre secuencias de polipéptidos de longitud completa útiles para realizar los métodos de la invención también se pueden determinar mediante uno de los métodos disponibles en el arte, el software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein o DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software albergado por Ledion Bitincka). El software MatGAT genera matrices de similitud/identidad para las secuencias de ADN o proteínas sin que se necesario el prealineamiento de datos. El programa realiza una serie de alineamientos de a pares usando el algoritmo de alineamiento global de Myers y Miller (con una penalidad por apertura de brecha de 12 y una penalidad por extensión de brecha de 2), calcula la similitud e identidad usando, por ejemplo, Blosum 62 (para polipéptidos) y luego ingresa los resultados en una matriz de distancia.

Ejemplo 4: Identificación de dominios comprendidos en secuencias de polipéptidos útiles para la realización de los métodos de la invención Los motivos se identifican con el algoritmo MEME (Bailey and Elkan, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994). En cada posición dentro de un motivo MEME, se muestran los residuos que están presentes en el conjunto de incógnitas de secuencias con una frecuencia mayor de 0,2. Los residuos entre corchetes representan alternativas.

Los dominios se identificaron con la base de datos Interpro.

La base de datos Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos de firmas que se utilizan habitualmente para búsquedas basadas en texto y en secuencias. La base de datos InterPro combina estas bases de datos, que utilizan diferentes metodologías y diversos grados de información biológica sobre proteínas bien caracterizadas, para derivar firmas de proteínas Las bases de datos que colaboran incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom y Pfam, Smart y TIGRFAM. Pfam es una gran colección de alineamientos de secuencias múltiples y modelos Markov ocultos que abarcan muchos dominios y familias de proteínas comunes. Pfam se encuentra en el servidor de Sanger Institute en el Reino Unido. InterPro se encuentra en el European Bioinformatics Institute en el Reino Unido.

En consecuencia, los siguientes dominios se identificaron como comprendidos en las secuencias de polipéptidos útiles en la realización de los métodos de la invención: dominio IPR000842 de Interpro (posiciones 189 a 204 de SEQ ID NO: 2); dominio IPR000836 de Interpro (aminoácidos 223 a 311 de SEQ ID NO: 2) y dominio IPR005946 de Interpro (posiciones 61 a 375 de SEQ ID NO: 2). Para los detalles de estos dominios, véase la base de datos Interpro, versión 31.0 del 9 de febrero de 2011 , en http://www.ebi.ac.uk/interpro/.

El análisis con el software de dominio conservado en el NCBI United States National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cqi) mostró que las secuencias contienen un dominio denominado PLN02369 ribosa-fosfato pirofosfoquinasa que comienza en la posición 70 del aminoácido y finaliza en la posición 374 de SEQ ID NO:2.

Otros análisis detectaron la presencia de un dominio PFAM PF00156 desde la posición 223 de aminoácido hasta la posición 311 de SEQ ID NO:2. Se sabe que PF00156 se caracteriza por dominios de fosforribosil transferasa (versión 24 de PFAM, véase http://pfam.sanger.ac.uk/ y "The Pfam protein families datábase"; R.D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J.E. Pollington, O.L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Datábase Issue 38:D211 -222 Ejemplo 5: Predicción de topología de las secuencias de polipéptidos POI TargetP 1.1 predice la ubicación subcelular de proteínas eucarióticas. La asignación de la ubicación se basa en la presencia prevista de cualquiera de las presecuencias N-terminal: péptido de transito a cloroplasto (cTP), péptido de direccionamiento a mitocondria (mTP) o péptido de señal de la vía secretora (SP). Los puntajes sobre los cuales se basa la predicción final no son realmente probabilidades y no necesariamente suman uno. Sin embargo, la ubicación con el puntaje más alto es la más probable de acuerdo con TargetP, y la relación entre los puntajes (la clase de confiabilidad) puede indicar el nivel de certeza de la predicción. La clase de confianza (RC) está en el rango de 1 a 5, donde 1 indica la predicción más factible. TargetP se conserva en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca.

Para las secuencias que se prevé que contienen una presecuencia N-terminal, también se puede predecir un posible sitio de clivaje.

Se seleccionaron varios parámetros, tales como grupo de organismo (no planta o planta), conjuntos de límites (ninguno, conjunto de límites predefinidos o conjunto de límites especificados por el usuario) y el cálculo de predicción de sitios de clivaje (sí o no). Se pueden usar muchos otros algoritmos para realizar dichos análisis, incluso: ChloroP 1 ,1 alojado en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca; • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor versión 1.2 alojado en el servidor del Institute for Molecular Bioscience, Universidad de Queensland, Brisbane, Australia; PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2,5 alojado en el servidor de la Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá; TMHMM, alojado en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca; PSORT (URL: psort.org) PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656-1663, 2003).

Ejemplo 6: Clonación de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican POI La secuencia de ácidos nucleicos se amplificó por PCR usando como molde una biblioteca de cADN de plántulas de Populus trichocarpa personalizada (en pDONR222.1; Invitrogen, Paisley, UK). La biblioteca de cADN que se usó para clonar se personalizó de diferentes tejidos (por ejemplo, hojas, raíces) de Populus trichocarpa. Se recolectó una planta jóven de P. trichocarpa en Bélgica.

Se realizó PCR con ADN polimerasa Hifi Taq en condiciones estándar, con 200 ng de molde en 50 µ? de mezcla PCR. Los cebadores utilizados fueron prm15363 (SEQ ID NO: 30; sentido): ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgagtttcaatggccctc y prm15364 (SEQ ID NO: 31 ; inverso, complementario): ggggaccactttgtacaagaaagctgggttaaaagggtctaccaccaatg que incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway. La secuencia in silico del ORF de SEQ ID NO:1 y su 3" UTR se muestran en SEQ ID NO:36. El cebador prm15364 es inverso y complementario de los pares de bases 1 129 y siguientes.

El fragmento de PCR amplificado se purificó también mediante métodos estándar.

Luego se realizó la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento PCR se recombinó in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología de Gateway, un "clon de entrada", pPOI. El plásmido pDONR201 se compró a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

El clon de entrada que comprendía SEQ ID NO: 1 luego se usó en una reacción LR con un vector de destino usado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los límites de T-ADN: un marcador seleccionable vegetal; un cásete de expresión del marcador controlable; y un cásete Gateway para la recombinación LR in vivo con la secuencia de ácidos nucleicos de interés ya clonada en el clon de entrada Un promotor GOS2 del arroz para la expresión constitutiva se ubicó corriente arriba de este cásete de Gateway Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante GOS2::POI se transformó en la cepa LBA4044 de Agrobacterium de acuerdo con los métodos conocidos en el arte.

Ejemplo 7: Transformación de plantas Transformación de arroz El Agrobacterium que contiene el vector de expresión se utilizó para transformar plantas de Oryza sativa. Se quitaron las cáscaras de las semillas secas maduras del cultivar de arroz japonés Nipponbare. Se realizó la esterilización mediante la incubación durante un minuto en 70% de etanol, seguido por 30 minutos en 0,2% de HgC12, seguido por 6 lavados de 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles luego se germinaron en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callos). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se extrajeron callos embriogénicos, derivados de escutelo, y se propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o se propagaron por subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Las piezas de callos embriogénicos se subcultivaron en medio fresco 3 días antes del cocultivo (para estimular la actividad de división celular).

La cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene el vector de expresión se utilizó para el cocultivo. Se inoculó Agrobacterium en un medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28°C. Luego se recogieron las bacterias y se suspendieron en un medio de cocultivo líquido a una densidad (OD6oo) de alrededor de 1. La suspensión luego se transfirió a una placa de Petri y se sumergen los callos en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos de los callos luego se secaron en un papel de filtro y se transfirieron a un medio de cocultivo solidificado, y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25 °C. Los callos cocultivados se cultivaron en un medio que contiene 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28 °C en presencia de un agente de selección. Durante este período, se desarrollan islas de callos resistentes que crecen rápidamente. Después de transferir este material a un medio de regeneración e incubación a la luz, se liberó el potencial embriogénico y se desarrollaron brotes en las siguientes cuatro a cinco semanas. Se retiraron los brotes de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contenía auxina, desde el cual se transfirieron al suelo. Los brotes endurecidos se cultivaron en condiciones de alta humedad y días cortos en un invernadero.

Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes para una construcción. Los transformantes primarios se transfirieron de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero. Después de un análisis de PCR cuantitativo para verificar la cantidad de copias del inserto de T-ADN, sólo se conservaron las plantas transgénicas de única copia que presentan tolerancia al agente de selección para cosechar la semilla T1. Las semillas luego se cosecharon de tres a cinco meses después del trasplante. El método produjo transformantes de único locus en una proporción de más de 50 % (Aldemita and Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Ejemplo 8: Transformación de otros cultivos Transformación de maíz La transformación del maíz (Zea mays) se puede realizar con una modificación del método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación depende del genotipo en el maíz y sólo genotipos específicos pueden ser transformados y regenerados. La línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o los híbridos con A188 como progenitor son una buena fuente de material donante para la transformación, pero también se pueden utilizar exitosamente otros genotipos. Las espigas se cosechan de la planta de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando el embrión inmaduro tiene una longitud de alrededor de 1 a 1,2 mm. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan por medio de organogénesis. Los embriones extraídos se cultivan en medio de inducción de callos, luego en medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, pero se pueden utilizar varios marcadores de selección). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25 °C durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollan los brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizamiento de maíz y se incuban a 25 °C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de trigo La transformación del trigo se puede realizar con el método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. Habitualmente, se usa el cultivar Bobwhite (disponible de CIMMYT, Méjico) para la transformación. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión y las plantas transgénicas se recuperan por medio de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones se cultivan in vitro en medio de inducción de callos, luego en medio de regeneración, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, pero se pueden utilizar varios marcadores de selección). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25 °C durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollan los brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizamiento y se incuban a 25 °C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se transplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de soja La soja se transforma de acuerdo con una modificación del método descrito en la patente US 5.164.310 de Texas A&M. Diversas variedades de soja comercial son susceptibles de transformación con este método. Habitualmente, se usa el cultivar Jack (disponible de Illinois Seed foundation) para la transformación. Las semillas de soja se esterilizan para la siembra in vitro. Se extraen el hipocotilo, la radícula y un cotiledón de plántulas jóvenes de siete días. El epicotilo y el cotiledón restante se cultivan adicionalmente para que desarrollen nodulos axilares. Estos nodulos axilares se extraen y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión. Después del tratamiento de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren al medio de selección. Los brotes regenerados se extraen y se colocan en un medio de alargamiento de brotes. Los brotes cuya longitud no excede 1 cm se colocan en medio de enraizamiento hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de colza/canola Los pecíolos cotiledonarios y los hipocotilos de plántulas jóvenes de 5-6 días se utilizan como explantes para el cultivo de tejido y se transforman de acuerdo con Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). El cultivar comercial Westar (Agriculture Canadá) es la variedad estándar que se utiliza para la transformación, pero también se pueden utilizar otras variedades. Las semillas de cañóla se esterilizan en superficie para la siembra in vitro. Los explantes de pecíolos cotiledonarios con el cotiledón unido se extraen de las plántulas in vitro y se inoculan con Agrobacterium (que contiene el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante del pecíolo en la suspensión bacteriana. Los explantes luego se cultivan durante 2 días en medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, 3 % de sacarosa, 0,7 % de Phytagar a 23 °C, 16 horas de luz. Después de dos días de cocultivo con Agrobacterium, los explantes de pecíolos se transfieren a medio MSBAP-3 que contiene 3 mg l de BAP, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días, y luego se cultivan en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración de los brotes. Cuando los brotes tienen 5 - 10 mm de longitud, se los corta y transfiere a medio de alargamiento de brotes (MSBAP-0,5, que contiene 0,5 mg/l de BAP). Los brotes de alrededor de 2 cm de longitud se transfieren al medio de enraizamiento (MSO) para la inducción de raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de alfalfa Se puede transformar un clon de regeneración de alfalfa (Medicago sativa) con el método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847). La regeneración y transformación de alfalfa dependen del genotipo y, por lo tanto, se requiere una planta regeneradora. Se han descrito métodos para obtener plantas regeneradoras. Por ejemplo, éstas se pueden seleccionar del cultivar Rangelander (Agriculture Canadá) o de cualquier otra variedad de alfalfa comercial como se describe en Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 11 1-1 12). Alternativamente, se selecciona la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) para usar en el cultivo de tejidos (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659). Los explantes de pecíolos se cocultivan, durante la noche, con un cultivo de C58C1 pMP90 de Agrobacterium tumefaciens (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se cocultivan durante 3 días en la oscuridad en medio de inducción SH que contiene 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4,35 g/L de K2S04 y 100 pm de acetosiringinona. Los explantes se lavan en medio Murashige-Skoog de concentración media (Murashige and Skoog, 1962) y se colocan en placas en el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfieren a medio de desarrollo BOÍ2Y que no contiene reguladores del crecimiento, ni antibióticos y 50 g/L de sacarosa. Posteriormente, los embriones somáticos se germinan en medio Murashige-Skoog de concentración media. Las plántulas con raíces se transplantan a macetas y se cultivan en un invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de algodón El algodón se transforma con Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con el método descrito en US 5.159.135. Las semillas de algodón se esterilizan en superficie en 3% de solución de hipoclorito de sodio durante 20 minutos y se lavan en agua destilada con 500 pg/ml de cefotaxima. Luego se transfieren las semillas al medio SH con 50 pg/ml de benomilo para la germinación. Se extraen los hipocotilos de las plántulas que tienen de 4 a 6 días, se los corta en trozos de 0,5 cm y se los coloca en 0,8% de agar. Se usa una suspensión de Agrobacterium (aprox. 108 células por mi, diluidas de un cultivo de toda la noche transformado con el gen de interés y marcadores de selección adecuados) para la inoculación de los explantes de hipocotilos. Luego de 3 días a temperatura ambiente y luz, los tejidos se transfieren a un medio sólido (1 ,6 g/l de Gelrite) con sales Murashige y Skoog con vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50:151-158 (1968)), 0,1 mg/l de 2,4-D, 0,1 mg/l de 6-furfurilaminopurina y 750 pg/ml de MgCL2, y con 50 a 100 pg/ml de cefotaxima y 400-500 pg/ml de carbenicilina para eliminar las bacterias residuales. Se aislan las líneas celulares individuales luego de dos a tres meses (con subcultivos cada cuatro a seis semanas) y se cultivan adicionalmente en un medio selectivo para la amplificación del tejido (30°C, fotoperíodo de 16 horas). Posteriormente, los tejidos transformados se cultivan adicionalmente en medio no selectivo durante 2 a 3 meses para que se generen embriones somáticos. Los embriones de aspecto saludable de al menos 4 mm de longitud se transfieren a tubos con medio SH en vermiculita fina, suplementado con 0,1 mg/l de ácido indol acético, 6 furfurilaminopurina y ácido giberélico. Los embriones se cultivan a 30°C con un fotoperíodo de 16 horas, y los plantines en la etapa de 2 a 3 hojas se transfieren a macetas con vermiculita y nutrientes. Las plantas se vuelven más resistentes y posteriormente se las transfiere al invernadero para continuar el cultivo. Transformación de la remolacha azucarera Las semillas de la remolacha azucarera (Beta vulgaris L.) se esterilizan en 70% de etanol durante un minuto, seguido de 20 min. con agitación en 20% de lejía de hipoclorito, por ejemplo, lejía regular Clorox® (disponible en el comercio de Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, EEUU). Las semillas se enjuagan con agua estéril y se secan con aire, seguido de la colocación en placas en un medio de germinación (medio basado en Murashige and Skoog (MS)) (véase Murashige, T., and Skoog, 1962. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue cultures. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497) que incluye vitaminas B5 (Gamborg et al.; Nutrient requirements of suspensión cultures of soy-bean root cells. Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8.) suplementado con 10 g/l de sacarosa y 0,8% de agar). Básicamente, el tejido de los hipocotilos se usa para la iniciación de cultivos de brotes de acuerdo con Hussey and Hepher (Hussey, G., and Hepher, A., 1978. Clonal propagation of sugarbeet plants and the formation of polylpoids by tissue culture. Annals of Botany, 42, 477-9) y se mantienen en un medio basado en MS suplementado con 30g/l de sacarosa más 0,25mg/l de becilamino purina y 0,75% de agar, pH 5,8 a 23-25X, con un fotoperíodo de 16 horas.

La cepa de Agrobacterium tumefaciens que tiene un plásmido binario que alberga un gen del marcador seleccionable, por ejemplo, nptil, se usa en los experimentos de transformación. Un día antes de la transformación, se desarrolla un cultivo líquido de LB, que incluye antibióticos, en un agitador (28°C, 150 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica (O.D.) a 600 nm de ~1. Los cultivos bacterianos desarrollados durante la noche se centrifugan y resuspenden en un medio de inoculación (O.D. ~1 ) que incluye Acetosyringone, pH 5,5.

El tejido a base de brotes se corta en rodajas (1 ,0 cm x 1 ,0 cm x 2,0 mm aproximadamente). El tejido se sumerge durante 30 segundos en un medio líquido de inoculación bacteriana. El exceso de líquido se retira mediante secado con papel de filtro. El cocultivo ocurre durante 24-72 horas en un medio basado en MS, que incluye 30g/l de sacarosa, seguido de un período no selectivo, que incluye el medio basado en MS, 30g/l de sacarosa con 1 mg/l de BAP para inducir el desarrollo de brotes y cefotaxim para eliminar Agrobacterium. Luego de 3-10 días, los explantes se transfieren a un medio selectivo similar que alberga, por ejemplo, canamicina o G418 (50-100 mg/l dependiente de genotipo).

Los tejidos se transfieren a un nuevo medio cada 2-3 semanas para mantener la presión de selección. La muy rápida iniciación de los brotes (luego de 3-4 días) indica la regeneración de meristemas existentes, en lugar de la organogénesis de meristemas transgénicos recién desarrollados. Los brotes pequeños se transfieren luego de varias rondas de subcultivo al medio de inducción de raíces que contiene 5 mg/l de NAA y canamicina o G418. Se realizan etapas adicionales para reducir el potencial de generar plantas transformadas que sean quiméricas (parcialmente transgénicas). Las muestras de tejido de los brotes regenerados se usan para el análisis de ADN.

Otros métodos de transformación de la remolacha azucarera se conocen en el arte, por ejemplo, los de Linsey & Gallois(Linsey, K., and Gallois, P., 1990. Transformation of sugarbeet (Beta vul-garis) by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Experimental Botany; vol. 41 , No. 226; 529-36) o los métodos publicados en la solicitud internacional publicada como W09623891A.

Transformación de la caña de azúcar Los husos se aislan de plantas de caña de azúcar de 6 meses cultivadas en el campo (véase Arencibia A., at al., 1998. An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L.) transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Research, vol. 7, 213-22; Enriquez-Obregon G., et al., 1998. Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrabac-terium-mediated transformation. Planta, vol. 206, 20-27). El material se esteriliza por inmersión en 20% de lejía de hipoclorito, por ejemplo, lejía regular Clorox® (disponible en el comercio de Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, EEUU) durante 20 minutos. Las secciones transversales de alrededor de 0,5 cm se colocan en el medio en la dirección de relleno. El material vegetal se cultiva durante 4 semanas en un medio basado en MS (Murashige, T., and Skoog, 1962. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue cultures. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497), que incluye vitaminas B5 (Gamborg, O., et al., 1968. Nutrient requirements of suspensión cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8) suplementado con 20g/l de sacarosa, 500 mg/l de hidrolisato de caseína, 0,8% de agar y 5mg/l de 2,4-D a 23°C en la oscuridad. Los cultivos se transfieren luego de 4 semanas a un nuevo medio idéntico.

La cepa de Agrobacterium tumefaciens que tiene un plásmido binario que alberga un gen del marcador seleccionable, por ejemplo, hpt, se usa en los experimentos de transformación. Un día antes de la transformación, se desarrolla un cultivo líquido de LB, que incluye antibióticos, en un agitador (28°C, 150 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica (O.D.) a 600 nm de ~0,6. Los cultivos bacterianos desarrollados durante la noche se centrifugan y resuspenden en un medio de inoculación basado en MS (O.D. ~0,4) que incluye Acetosyringone, pH 5,5.

Los trozos de callos embriogénicos de caña de azúcar (2-4 mm) se aislan sobre la base de las características morfológicas como estructura compacta y color amarillo, y se secan durante 20 minutos en la campana de flujo, seguido de inmersión en un medio líquido de inoculación bacteriana durante 10-20 minutos. El exceso de líquido se retira mediante secado con papel de filtro. El cocultivo ocurre durante 3-5 días en la oscuridad sobre papel de filtro, que se coloca en la parte superior del medio basado en MS, que incluye vitaminas B5, que contiene 1 mg/l de 2,4-D. Luego del cocultivo, los callos se enjuagan con agua estéril, seguido de un período no selectivo en un medio similar que contiene 500 mg/l de cefotaxime para eliminar Agrobacterium. Luego de 3-10 días, los explantes se transfieren al medio selectivo basado en MS, que incluye vitaminas B5, que contiene 1 mg/l de 2,4-D, durante otras 3 semanas y que alberga 25 mg/l de higromicina (dependiente de genotipo). Todos los tratamientos se realizan a 23°C en condiciones de oscuridad.

Los callos resistentes también se cultivan en un medio que carece de 2,4-D, que incluye 1 mg/l de BA y 25 mg/l de higromicina, en un fotoperíodo de 16 h de luz; esto genera el desarrollo de estructuras de brotes. Los brotes se aislan y cultivan en un medio selectivo de enraizamiento (basado en MS, que incluye 20g/l de sacarosa, 20 mg/l de higromicina y 500 mg/l de cefotaxime).

Las muestras de tejido de los brotes regenerados se usan para el análisis de ADN.

Otros métodos de transformación de la caña de azúcar se conocen en el arte, por ejemplo, de la solicitud internacional publicada como WO2010/151634A y la patente europea concedida EP1831378.

Ejemplo 9: Procedimiento de evaluación fenotípica 9.1 Preparación de la evaluación Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfirieron de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero para el cultivo y la cosecha de la semilla T1. Se retuvieron seis eventos, de los cuales la progenie de T1 segregó 3:1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos, se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgén (heterocigotas y homocigotas) y aproximadamente 10 plántulas T1 que no tenían el transgén (nulicigotas) mediante el control de la expresión del marcador visual. Las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotas se cultivaron lado a lado en posiciones al azar. Las condiciones del invernadero fueron de días cortos (12 horas de luz), 28°C a la luz y 22°C en la oscuridad y humedad relativa de 70%. Las plantas cultivadas en condiciones sin estrés se regaron en intervalos regulares para asegurar que el agua y los nutrientes no fueran limitantes y para satisfacer las necesidades de las plantas a fin de que completaran su crecimiento y desarrollo.

Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

Control de sequía Se cultivaron plantas de semillas T2 en tierra para maceta en condiciones normales hasta que alcanzaron la etapa de espigazón. Luego se las transfiere a una sección "seca" donde dejan de recibir irrigación. Se insertan sondas de humedad en macetas elegidas al azar para controlar el contenido de agua en el suelo (SWC). Cuando el SWC es inferior a ciertos umbrales, las plantas se riegan nuevamente de forma automática y continua hasta alcanzar de nuevo un nivel normal. A continuación, las plantas se transfieren nuevamente a condiciones normales. El resto del proceso de cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) es igual que para las plantas no cultivadas en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento en condiciones normales.

Control de la eficacia en el uso de nitrógeno Se cultivan plantas de arroz de semillas 12 en tierra para maceta en condiciones normales excepto por la solución de nutrientes. Las macetas se riegan, desde que son transplantadas hasta su maduración, con una solución de nutrientes específica con contenido reducido de nitrógeno N (N), usualmente de 7 a 8 veces menos. El resto del proceso de cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) es igual que para las plantas no cultivadas en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento en condiciones normales. Control de estrés salino Las plantas se cultivan en un substrato hecho de fibras de coco y argex (proporción 3 a 1 ). Se usa una solución normal de nutrientes durante las primeras dos semanas luego de trasplantar los plantines al invernadero. Luego de las dos primeras semanas, se agregan 25 mM de sal (NaCI) a la solución de nutrientes hasta que se cosechan las plantas. Luego se miden los parámetros relacionados con las semillas. 9.2 Análisis estadístico: Prueba F Se utilizó ANOVA (análisis de variantes) de dos factores como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de la planta. Se realizó una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se realizó para controlar el efecto del gen en todos los eventos de transformación y para verificar el efecto total del gen, también conocido como efecto global del gen. El umbral de significancia para un efecto global y verdadero del gen se fijó en un nivel de probabilidad de 5% para la prueba F. Un valor significativo de la prueba F indica un efecto del gen, es decir que no es sólo la mera presencia o posición del gen lo que causa las diferencias en el fenotipo. 9.3 Parámetros medidos Medición de parámetros relacionados con ¡a biomasa Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

Se determinó el área aérea de la planta (o biomasa del follaje) al contar la cantidad total de pixeles en las imágenes digitales de las partes aéreas de las plantas diferenciadas del fondo. Este valor se promedió para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración. Los experimentos muestran que el área aérea de la planta medida de este modo se correlaciona con la biomasa de las partes aéreas de la planta. El área aérea es el área medida en el punto de tiempo en el cual la planta ha alcanzado su máxima biomasa de follaje. El vigor temprano es el área aérea de la planta (plántula) tres semanas posteriores a la germinación. El aumento en la biomasa de la raíz se expresa como un aumento en la biomasa total de la raíz (medida como la biomasa máxima de las raíces observada durante el ciclo de vida de una planta); o como un aumento en el índice de raíz/brote (medido como la relación entre la masa de la raíz y la masa del brote durante el período de crecimiento activo de la raíz y del brote).

Una fuerte indicación de la altura de la planta es la medición de la gravedad, es decir, determinar la altura (en mm) del centro de gravedad de la biomasa del follaje. Esto evita la influencia de una sola hoja erguida, sobre la base de la asíntota del ajuste de curvas o, si el ajuste es insatisfactorio, sobre la base del máximo absoluto.

El vigor temprano se determinó al contar la cantidad total de pixeles de las partes aéreas de las plantas diferenciadas del fondo. Este valor se promedió para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración. Los resultados descritos más adelante son para plantas tres semanas después de la germinación.

Medición de parámetros relacionados con las semillas Las panículas primarias maduras se cosecharon, contaron, embolsaron, rotularon con códigos de barras y luego se secaron durante tres días en un horno a 37°C. Luego se trillaron las panículas, y se recogieron y contaron todas las semillas. Las cáscaras llenas se separaron de las vacías con un dispositivo de soplado de aire. Las cáscaras vacías se descartaron y la fracción restante se contó nuevamente. Las cáscaras llenas se pesaron en una balanza analítica. La cantidad de semillas llenas se determinó al contar la cantidad de cáscaras llenas que permanecieron después de la etapa de separación. El rendimiento total de las semillas se midió pesando todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta. La cantidad total de semillas por planta se midió al contar la cantidad de cáscaras cosechadas de una planta. El peso de mil granos (TKW) se extrapola a partir de la cantidad de semillas llenas contadas y su peso total. El índice de cosecha (HI) en la presente invención se define como la relación entre el rendimiento total de la semilla y el área aérea (mm2), multiplicado por un factor 106. La cantidad total de flores por panícula, como se define en la presente invención, es la relación entre la cantidad total de semillas y la cantidad de panículas primarias maduras. La tasa de llenado de semillas, como se define en la presente invención, es la proporción (expresada como %) de la cantidad de semillas llenas con respecto a la cantidad total de semillas (o florcillas).

Ejemplo 10: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas transgénicas Los resultados de la evaluación de las plantas transgénicas de arroz en la generación T1 y que expresan un ácido nucleico que comprende el marco de lectura abierto más largo en SEQ ID NO: 1 en condiciones sin estrés se indican a continuación. Véase los Ejemplos previos para detalles de las generaciones de las plantas transgénicas.

Los resultados de la evaluación de las plantas transgénicas de arroz en condiciones sin estrés se indican a continuación.

Las plantas transgénicas que sobreexpresan el POI bajo el promotor constitutivo GOS2 mostraron mayor rendimiento, en comparación con las plantas de control nulas. Más en particular, las plantas transgénicas exhibieron mayor biomasa de brote (13,5%), biomasa de raíz (1 1 ,3%), altura de la planta (8,6%), gravedad de la planta (8,3%), cantidad de florcillas por panícula (11 ,0%), tasa de llenado (6,1%).

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, caracterizado porque comprende modular la expresión en una planta de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde dicho polipéptido comprende al menos uno de los siguientes dominios: dominio IPR000842 de Interpro, dominio IPR000836 de Interpro y dominio IPR005946 de Interpro.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho polipéptido comprende uno o más de los siguientes motivos: Motivo 1 (SEQ ID NO: 32): IKRFADGEIYVQLQESVRGCDV[FY]L[VL]QPTC[PT]P[AT]NENLMELLIM[IV]DACRRA; Motivo 2 (SEQ ID NO: 33): FAKKLSDAPLAIVDKRRHGHNVAEVMNLIGDV[KR]GKVA[VI]MVDDMIDTAGTI; o Motivo 3a (SEQ ID NO: 35): H[QE]EGAREVYAC[C?THAVFSP AIERLSSGL[FL]QEVI[IV]T T[IL]P[VL][AS]EK N[HY]FPQL

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicha expresión modulada se realiza mediante la introducción y expresión en una planta de una molécula de ácido nucleico que codifica una fosforribosil pirofosfato sintetasa (tipo PRS1 , PRPP sintetasa).

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho polipéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (i) un ácido nucleico representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 o 27; (iii) un ácido nucleico que codifica el polipéptido representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26, preferentemente, como resultado de la degeneración del código genético, dicho ácido nucleico aislado se puede derivar de una secuencia de polipéptidos representada por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 y, con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (iv) un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 30 %, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41 %, 42%, 43<>/0 | 44o0i 45??? 46?/? | 47o/0| 48??? 49%i .50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25 o 27 y, con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (v) una molécula de ácido nucleico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iv) en condiciones de hibridación rigurosa y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; o (vi) un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento, preferentemente, mayor biomasa, con mayor preferencia, mayor biomasa de brote y/o mayor biomasa de raíz, con respecto a las plantas de control.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estrés.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de estrés por sequía, estrés salino o deficiencia de nitrógeno.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica un POI es de origen vegetal, preferentemente, de una planta dicotiledónea, con mayor preferencia, de un árbol dicotiledóneo, con mayor preferencia, del género Populus, con máxima preferencia, de Populus trichocarpa.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido POI codifica cualquiera de los polipéptidos enumerados en la Tabla A o es una porción de dicho ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridarse con una secuencia complementaria de dicho ácido nucleico.

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de los polipéptidos indicados en la Tabla A.

1 . Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dicho ácido nucleico codifica el polipéptido representado por SEQ ID NO: 2.

12. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado porque dicho ácido nucleico se liga operativamente a un promotor constitutivo, preferentemente, a un promotor constitutivo de intensidad media, preferentemente, a un promotor vegetal, con mayor preferencia, a un promotor GOS2, con máxima preferencia, a un promotor GOS2 del arroz.

13. Planta, parte de planta, incluso semillas, o célula vegetal que se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque dicha planta, parte de planta o célula vegetal comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido POI, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 11 o 12.

14. Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en: (i) una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 ; (ii) el complemento de una molécula de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1; (iii) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, preferentemente, como resultado de la degeneración del código genético, dicha molécula de ácido nucleico aislada se puede derivar de una secuencia de polipéptidos representada por SEQ ID NO: 2 y, con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; una molécula de ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 30 %, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de moléculas de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y, con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; una molécula de ácido nucleico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iv) en condiciones de hibridación rigurosa y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de (i) a (vi) que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido tiene actividad de fosforribosil pirofosfato sintetasa; una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de (i) a (viii) anteriores, en donde la molécula de ácido nucleico no es cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas como SEQ ID NO: x del listado de secuencias, en donde x es un número impar desde 3 inclusive hasta 27 inclusive.

Un polipéptido aislado caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste (i) un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1; (ii) un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, (iií) un polipéptido codificado por un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 30 %, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%. 50%, 51%. 52%. 53%, 54%, 55%, 56%. 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%. 70%. 71%. 72%, 73%, 74%. 75%. 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%. 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%. 91%, 92%, 93%, 94%. 95%, 96%. 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 y, con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (¡v) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que se híbrida con el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1 , en condiciones de hibridación rigurosa y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, en relación con las plantas de control; (v) un polipéptido que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%. 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (vi) un polipéptido de acuerdo con cualquiera de (i) a (v), en donde el polipéptido tiene actividad de fosforribosil pirofosfato sintetasa; (v¡¡) un polipéptido de acuerdo con cualquiera de (i) a (vii) anteriores, en donde el polipéptido no es cualquiera de los polipéptidos descritos como SEQ ID NO: x del listado de secuencias, en donde x es un número par desde 4 inclusive hasta 28 inclusive.

16. Constructo caracterizado porque comprende: (i) ácido nucleico que codifica dicho polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 8, 9, 10, 11 o 12, o la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 14 o una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 15; (ii) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (¡ii) una secuencia de terminación de la transcripción.

17. Constructo de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque una de dichas secuencias de control es un promotor constitutivo, preferentemente, un promotor constitutivo de intensidad media, preferentemente, un promotor vegetal, con mayor preferencia, un promotor GOS2, con máxima preferencia, un promotor GOS2 del arroz (SEQ ID NO: 28).

18. Uso de un constructo de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, caracterizado porque es en un método para producir plantas que tienen mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa de brote y/o mayor biomasa de raíz, con respecto a las plantas de control.

19. Planta, parte de planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, caracterizada porque se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 8, 9, 10, 11 o 12, en donde dicha planta o parte de ésta comprende un ácido nucleico recombinante que codifica dicho polipéptido, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 8, 9, 10, 11 o 12.

20. Método para la producción de una planta transgénica que tiene mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control, caracterizado porque comprende: (i) introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 11 o 12, o la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 14 o el polipéptldo de acuerdo con la reivindicación 15; y (ii) cultivar la célula vegetal en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta.

21. Planta transgénica que tiene mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente, mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control y, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, caracterizada porque es el resultado de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 8, 9, 10, 1 1 o 12, o una célula vegetal transgénica derivada de dicha planta transgénica.

22. Partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 13, 18, 19 o 21 , caracterizadas porque dichas partes cosechables son, preferentemente, biomasa de brote y/o raíz y/o semillas.

23. Productos caracterizados porque son derivados de una planta de acuerdo con la reivindicación 13, 18, 19 o 21 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 20.

24. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 8, 9, 10, 11 o 12, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 14 o el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque es para aumentar el rendimiento, en particular, mayor biomasa, con respecto a las plantas de control.

25. Un método para la obtención de un producto, caracterizado porque comprende las etapas de cultivar las plantas de acuerdo con la reivindicación 13, 18, 19 o 21 y obtener dicho producto de o mediante (i) dichas plantas; o (ii) partes, que incluyen semillas, de dichas plantas.

26. Constructo de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, caracterizado porque está comprendido en una célula vegetal.

27. Cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el ácido nucleico codifica un polipéptido que no es el polipéptido seleccionado del grupo de secuencias representadas por a. SEQ ID NO: 4016 o el codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 292, ambos de la solicitud de patente internacional WO2009/134339; o SEQ ID NO: 9451 o el codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 3871 , ambos de la solicitud de patente estadounidense US2009/019601 ; o SEQ ID NO: 497 o 13893 o el codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 497 o 13893, ambos de la solicitud de patente estadounidense US 2009/094717. RESUMEN Un método para mejorar, en plantas, varios rasgos relacionados con el rendimiento de importancia económica. Más específicamente, un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI (proteína de interés). También, plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, en donde dichas plantas tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control. También, provee ácidos nucleicos que codifican POI y constructos que los comprenden desconocidos hasta el momento, útiles en la realización de los métodos de la invención.