BR102015026078A2 - Method for production of transgenic plants and plants with resistance to bacteria that have the quorum sensing system - Google Patents

Abstract

resumo método para produção de plantas transgênicas e plantas com resistência a bactérias que possuem o sistema quorum sensing a presente invenção refere-se a um método para produção de plantas transgênicas com resistência a bactérias que possuem o sistema quorum sensing e às plantas transgênicas do grupo citros resistentes a doença huanglongbing ou hlb. contra o hlb, foi utilizado para transformação o gene aiia, que codifica a enzima ahl-lactonase. essa enzima inativa as acil homoserinas lactonas (ahls) produzidas por bactérias fitopatogênicas, impedindo que esse componente de comunicação entre as mesmas (quorum-sensing) funcione em plantas transgênicas, e potencialmente impedindo o desenvolvimento do processo de doença em plantas inoculadas.

Description

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS E PLANTAS COM RESISTÊNCIA A BACTÉRIAS QUE POSSUEM O SISTEMA "QUORUM SENSING" CAMPO DA INVENÇÃO

[01] A presente invenção está relacionada ao processo de criação de resistência à capacidade de comunicação entre bactérias que possuem o sistema Quorum sensing como as espécies de Candidatus Liberibacter sp. e outras. A invenção se insere no campo de aplicação da Agricultura e da Engenharia genética, mais especificamente, de novas plantas ou processos para obtenção das mesmas, uma vez que se refere a um método para produção de plantas transgênicas com resistência a bactérias que possuem o sistema Quorum sensing e às plantas transgênicas resistentes à doença Huanglongbing ou HLB e outras que possuem o sistema Quorum sensing.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[02] Huanglongbing, ou HLB, é o nome oficial dessa doença de citros de grande importância mundial, mas que estava restrita aos continentes Asiático e Africano até meados dos anos 2000. Foi detectada no Estado de São Paulo em 2004 e, posteriormente, no Paraná e no Estado americano da Flórida em 2005. O HLB tem causado grandes prejuízos nessas áreas por reduzir significativamente a produção e a qualidade dos frutos remanescentes. É normalmente considerado como o principal problema do setor produtivo, pois afeta todos os citros comerciais, como limas, laranjas, limões, tangerinas, e outros, e não há resistência genética natural a essa doença dentro dessas espécies.

[03] O HLB está associado à presença de bactérias ainda não cultivadas do gênero Candidatus Liberibacter spp. e existem 2 espécies detectadas até o momento (asiática e americana) no Brasil. Na Flórida ocorre apenas a variante asiática. Ambas são consideradas agressivas e com grande potencial para causar danos em árvores hospedeiras. Essas bactérias moram dentro dos vasos do floema das plantas cítricas, e esses vasos são os responsáveis pela redistribuição de açúcares, hormônios e vários outros compostos vitais para as plantas hospedeiras. Portanto, essas bactérias se alojam em um tecido rico em nutrientes, e talvez em função disso, observa-se, em condições experimentais, que elas são capazes de causar sintomas mesmo em baixas concentrações.

[04] O nome oficial HLB (Huanglongbing) foi proposto em uma convenção de virologistas e é uma reverência ao problema descrito na China desde o final do século XIX, onde produtores enxergavam ramos amarelos nas árvores doentes . O nome "Greening" é usado na África do Sul e em outros países, em função do esverdeamento e coloração irregular de frutos em árvores afetadas.

[05] As Liberibacters podem ser transportadas para novas plantas por meio de um inseto vetor alado chamado Diaphorina citri Kuwayama, que pertence ao grupo dos psilídeos e que também se alimenta de seiva de citros. Esse inseto, sem a presença das bactérias, não causa danos econômicos em citros, mas com as mesmas, o dano causado pela doença pode ser grave, inviabilizando a produção econômica de frutos. As bactérias não apenas utilizam o inseto como meio de transporte, mas também são capazes de se reproduzirem, aumentando significativamente suas populações dentro do mesmo. Em termos simples, as bactérias usam o inseto como meio de transporte e como residência temporária. Seria possível considerar esse patossistema em citros semelhante à Dengue em humanos. Aparentemente, as bactérias não molestam o inseto, e esses, além de eficientes vetores, podem voar e a princípio serem carreados facilmente por correntes de ar a distâncias maiores. Uma consequência nefasta de todas essas características é que a doença pode se disseminar por longas distâncias, ainda não determinadas com exatidão, mas que certamente transcendem divisas de cerca de fazendas, de regiões, e de países com elevada eficiência. Em condições experimentais, o variante asiático já foi detectado em plantas testes apenas 30 dias após a inoculação a 2 km de distância, embora os sintomas visuais tenham aparecido somente após 3 ou 4 meses (na maioria dos casos, demora entre cinco e seis meses). Nesses experimentos plantas inoculadas, mas ainda sem sintomas, também foram capazes de transmitir a doença via enxertia de borbulhas de ramos assintomáticos.

[06] Em condições de campo, o produtor estará sempre atrás do progresso da doença, uma vez que plantas infectadas, mas sem sintomas passam despercebidas, mas já são fontes de inóculo. Por isso, é essencial que ações de controle sejam pelo menos rápidas e eficientes para que exista alguma chance de êxito no processo. Atualmente o controle dessa complexa doença é baseado no plantio de mudas sadias, na redução de inóculo, através da eliminação de plantas doentes no campo (com enormes prejuízos para o produtor) e na tentativa quase sempre ineficiente de controle do inseto vetor, através de pulverizações com agrotóxicos, que em muitos casos chegam a ser realizadas semanalmente (com sério impacto ambiental e em segurança alimentar). Apesar dos esforços, o progresso da doença foi notório tanto no Brasil quanto na Flórida nos últimos anos, evidenciando que os métodos atuais não foram eficazes contra a doença. Portanto, torna-se imperativo gerar resistência a essa doença através da engenharia genética.

[07] Não há relatos de variedades comerciais de citros que sejam naturalmente resistentes a essa doença, inviabilizando em grande parte esforços em melhoramento genético clássico, via cruzamento de espécies. Por outro lado, a utilização da engenharia genética permite uma abordagem muito mais ampla na criação de estratégias contra o HLB. As Liberibacters possuem um mecanismo de comunicação entre indivíduos, chamado Quorum sensing, utilizado para a determinação da densidade populacional de indivíduos no ambiente. Essa percepção faz com que as bactérias alterem seus níveis de expressão gênica, ativando e/ou reduzindo grupos de genes capazes de estimular a multiplicação e a virulência das mesmas e, consequentemente, gerar danos nas plantas hospedeiras.

[08] A presente invenção gerou plantas transgênicas de citros capazes de produzir uma enzima que quebra quimicamente a molécula usada como sinal trocado pelas bactérias no floema. Com isso, as plantas hospedeiras transgênicas passam a ter uma reação enzimática de defesa que mitiga o sistema de Quorum sensing das bactérias, fazendo com que as mesmas não tenham mais a noção de densidade populacional. Isso evita, ou minimiza, o processo de multiplicação das bactérias e reduz o aparecimento de sintomas e de danos em plantas afetadas. Essa estratégia não evita a infecção da planta hospedeira pela Liberibacter, mesmo porque isso seria impossível em função da quantidade indeterminada de Psilídeos contagiosos dispersos pelas áreas produtivas, mas reduz a multiplicação das bactérias e gera plantas tolerantes ao HLB.

[09] Qualquer mecanismo de resistência genética ao HLB trará grande economia ao setor produtivo e a segurança alimentar para a população, em função da produção de frutas cítricas e de sucos com qualidade, além de vantagens ambientais consideráveis em função da redução de aplicação de agrotóxicos nos pomares. O HLB tem inviabilizado a produção de citros em várias regiões na Flórida, na região central do estado de São Paulo e em outras regiões do mundo.

ESTADO DA TÉCNICA

[10] O documento "Plants resistant to pathogenic microorganisms growing in vascular tissues" descreve plantas transgênicas resistentes a infecções causadas por microrganismos limitados ao floema, que compreende a indução da expressão de uma proteína quimérica ou de fusão - uma proteína de floema de Citrus aurantifolia (CsPP16), um ligante proteico e uma proteína com atividade antimicrobiana. A presente invenção não entra em conflito com este estado da técnica, pois as plantas transgênicas propostas usam apenas uma proteína que evita a comunicação entre as bactérias, ou seja, com efeito indireto sobre as mesmas, pois dificulta a multiplicação. Não há ação antimicrobiana direta, enquanto que o referido documento não descreve como é essa atividade antimicrobiana.

[11] O documento US2013205443 refere-se a composições, organismos, sistemas, e um método para aumentar a capacidade inata das plantas (ex.: citros) para responder ao contato com um agente patogênico. Tal documento trata de proteínas/genes de defensina. Essa proteína tem ação direta na bactéria e, portanto, não tem relação com a presente invenção.

[12] O documento "Response of citrus transgenic plants expressing stx ia gene to Candidatus Liberibacter asiaticus" descreve plantas de citros transgênicas transformadas com o gene STX IA e um estudo da resistência das mesmas à doença HLB. A função do gene STX é antimicrobiana direta, atua na membrana celular da bactéria. O mecanismo de ação é diferente do proposto na presente invenção.

[13] O documento "Desarrollo de alternativas biotecnológicas para la obtención de plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck resistentes a la enfermedad de la cancrosis de los cítricos" descreve plantas transgênicas de laranjas (Citrus sinensis L. Osbeck) resistentes a cancrosis a partir da expressão do peptídeo antimicrobiano dermaseptina. Tal documento não entra em conflito com a presente invenção, pois a proteína antimicrobiana dermaseptina é um antibiótico com ação direta e citada para Xanthomonas que causa outra doença chamada Cancro Cítrico, enquanto que as plantas transgênicas propostas usam apenas uma proteína que evita a comunicação entre as bactérias, ou seja, com efeito indireto para o tratamento de outra doença, o HLB.

[14] O documento "Breeding citrus for hlb resistance at the USDA/ARS U.S. Horticultural Research Laboratory, Ft. Pierce, Florida" refere-se a estratégias transgênicas para o desenvolvimento de plantas de citros resistentes ao HLB. Tais estratégias estão relacionadas a proteínas antimicrobianas que são antibióticos que tentam matar as bactérias ou por lise da membrana celular, ou atuando sobre seu processo de respiração através de danos oxidativos. É diferente da estratégia adotada pela presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[15] A presente invenção refere-se a um método para produção de plantas transgênicas com resistência a bactérias que possuem o sistema Quorum sensing e as plantas transgênicas resistentes a doença HLB e outras que possuem o sistema Quorum sensing. Contra o HLB, foi utilizado para transformação o gene aiiA, que codifica a enzima AHL-lactonase. O referido gene está indicado na SEQ. ID. N° 1. Essa enzima inativa as acil homoserinas lactonas (AHLs) produzidas por bactérias fitopatogênicas, impedindo que esse componente de comunicação entre as mesmas (Quorum-sensing) funcione em plantas transgênicas, e potencialmente impedindo o desenvolvimento do processo de doença em plantas inoculadas. Está sob o controle do promotor constitutivo CaMV 35S (Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter), indicado na SEQ. ID. N° 2. As transformações foram realizadas em explantes de seções transversais finas de epicótilo de plântulas cultivadas in vitro e de tecidos de ramos maduros com co-cultivação com Agrobacterium tumefaciens, estirpe EHA 105, contendo o plasmídeo com o transgene de interesse de acordo com a construção utilizada. Os explantes foram selecionados em meio com antibióticos. Foi confirmada a presença desse transgene em plantas de laranjeira doce (Citrus sinensis L. Osbeck), Citrumeleiro Swingle (Citrus paradisi Macf. x Poncirus trifoliata L. Raf.) e Citrangeiro Carrizo (Citrus sinensis L. Osb. X Poncirus trifoliata L. Raf.) .

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[16] A Figura 1 mostra o mapa do vetor, construção PBI- AI, representando as regiões: promotor CaMV35S (Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter), gene de seleção NPTII (Neomycin Phosphotransferase II) que confere resistência ao antibiótico canamicina, o gene de interesse aiiA que codifica a enzima AHL lactonase, e o terminador NOS (nopalina sintetase).

[17] A Figura 2 mostra fragmentos de DNA amplificados pela reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) das plantas transgênicas (números 7916 a 7996) contendo o gene de interesse aiiA; A primeira coluna da esquerda representa apenas um marcador do tamanho molecular de DNA, a planta 7914 não é transgênica; a coluna "aiiA" é o controle positivo da reação e a coluna "Branco" o negativo.

[18] A Figura 3 mostra a enxertia por garfagem lateral mostrando o ramo usado como inóculo do HLB, proveniente de planta (Laranjeira Valência) sintomática no campo, enxertado no tronco da planta transgênica (Citrangeiro Carrizo) candidata a ser resistente ao HLB.

[19] A Figura 4 mostra uma planta contendo a brotação proveniente do inóculo que foi enxertado por garfagem lateral no tronco da planta transgênica cujos brotos ainda não mostraram sintomas do HLB.

[20] A Figura 5 representa graficamente a concentração relativa de bactéria presente em cada amostra.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[21] A presente invenção provê um método para produção de plantas transgênicas com resistência a bactérias que possuem o sistema Quorum sensing e plantas transgênicas resistentes à doença HLB e outras que possuem o sistema Quorum sensing.

[22] O sistema Quorum sensing está presente em algumas bactérias sendo utilizado pelas mesmas para a aferição relativa da quantidade de células bacterianas presentes em um determinado ambiente. Bactérias com esse sistema possuem um conjunto de genes que expressam sinais, como a lactona, que são exportados para fora da célula e são quantificados por bactérias no mesmo ambiente. Isto faz com que essas bactérias consigam perceber a quantidade relativa das mesmas.

[23] A ocorrência de doenças em plantas causadas por bactérias que possuem o sistema Quorum sensing está relacionado ao título dessas bactérias no hospedeiro. Portanto, a mitigação dos sinais (lactonas) emitidos por essas bactérias perturba a capacidade de sua reprodução.

[24] A invenção compreende a inserção de um gene em plantas que passaram a expressar a enzima lactonase, responsável pela quebra de lactonas, reduzindo drasticamente a capacidade de comunicação entre as células bacterianas que causam a doença HLB, e outras doenças que também utilizam o sistema Quorum sensing.

[25] O método desenvolvido consiste nas etapas de: I. Prover células de uma planta com uma molécula de DNA quimérica compreendendo uma primeira e segunda região onde; I.1 A primeira região compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 243 nucleotídeos consecutivos, os quais tem similaridade substancial com a sequência com cerca de 243 nucleotídeos consecutivos na região sense do gene que codifica para uma enzima da via biossinética do peptídeo lactonase, conforme indicado na SEQ. ID. N° 1; 1.2 A segunda região compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 195 nucleotídeos consecutivos, os quais tem similaridade substancial com a sequência complementar com cerca de 195 nucleotídeos consecutivos da região sense do promotor biossintético CaMV35S, conforme indicado na SEQ. ID. N° 2; 1.3 A primeira e a segunda região são capazes de formar uma região espaçadora entre elas; e II. Identificar aquelas plantas onde a expressão da enzima da via biossintética do peptídeo lactonase é posteriormente regulada.

[26] Na etapa I a planta é selecionada dos grupos da Família Rutaceae Juss, Subfamília Aurantioideae, Tribos Citreae e Clauseneae, e Subtribos que compreendam os genêros Citrus sp., Poncirus sp., Fortunella sp., Murraya sp., Severinia sp. Microcitrus sp., Atalantia sp., e seus híbridos.

[27] Em um aspecto da presente invenção, o método proposto transforma uma célula de uma planta do gênero Citrus sp., Poncirus trifoliata L. Raf. e seus híbridos com uma molécula de ácido nucleico que expressa o peptídeo lactonase, em que a expressão desse peptídeo provê resistência a um patógeno bacteriano com o mecanismo Quorum sensing.

[28] A molécula de DNA compreende regiões do gene que codifica uma enzima da via biossintética do peptídeo lactonase, sendo esta o princípio ativo do sistema Quorum sensing.

[29] A transformação compreende infectar com Agrobacterium tumefaciens e/ou bombardear com micro projéteis dita célula da planta compreendendo o dito ácido nucléico que expressa o dito peptídeo Lactonase.

[30] A presente invenção refere-se também a uma molécula quimérica de DNA para expressão do gene alvo em uma célula de uma planta que compreende: I. Um promotor ou região promotora capaz de ser reconhecida por RNA polimerases em célula de plantas, operacionalmente ligados a: II. Uma região de DNA que, quando transcrita, produz uma molécula de RNAm compreendendo regiões de RNA específicas ao gene contendo: a) Uma região compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 243 nucleotídeos consecutivos, os quais tem similaridade substancial com a sequência com cerca de 243 nucleotídeos consecutivos da região sense do gene que codifica para uma enzima da via biossintética do peptídeo lactonase, conforme indicado na SEQ. ID. N° 1;

[31] O gene utilizado que expressa a enzima lactnonase foi obtido a partir de bacilos de solo descrito no trabalho publicado por Dong et al 2000, e depositado no Genebank sob acesso n. AF196486. Foi montado em uma sequência quimérica de DNA contendo um promotor (35S) e um gene de seleção (NPTII) . Essa construção foi introduzida em Agrobacterium tumefaciens e usada na transformação genética de plantas cítricas.

[32] O Microrganismo Agrobacterium tumefaciens, compreende a construção pBI-AI contendo o gene aiiA, que codifica a enzima AHL lactonase, o terminador nopalina sintetase (NOS) e o gene para resistência a canamicina (NPTII, ou neomycin phosphotransferase II) , sob controle do promotor CaMV35S, conforme indicado na SEQ. ID. N° 2.

[33] Ainda, a presente invenção inclui plantas transgênicas compreendendo o gene aiiA que codifica a enzima AHL-lactonase que quebra os sinais produzidos por bactérias patogênicas, mitigando o sistema Quorum sensing das mesmas, e gerando resistência ao HLB e outras doenças. Isso minimiza a capacidade de multiplicação das bactérias proporcionando o desenvolvimento das plantas infectadas.

[34] As ditas plantas transgênicas são selecionadas dos grupos da Família Rutaceae Juss, Subfamília Aurantioideae, Tribos Citreae e Clauseneae, e Subtribos que compreendam os genêros Citrus sp., Poncirus sp., Fortunella sp., Murraya sp., Severinia sp. Microcitrus sp., Atalantia sp., e seus híbridos.

[35] As plantas transgênicas são transformadas com uma molécula de ácido nucleico que expressa o peptídeo lactonase, em que a expressão desse peptídeo provê resistência a um patógeno bacteriano com o mecanismo Quorum sensing, apresentando assim um fenótipo de resistência a doenças que possuem o sistema Quorum sensing como o HLB (Huanglongbing) e outras com o mesmo sistema.

[36] A presente invenção também inclui a progênie, o porta enxerto, o embrião somático, o meristema (radicular, apical, gema e borbulha lateral), a célula e a semente das referidas plantas transgênicas.

Exemplo de concretização da invenção [37] Segmentos de epicótilo de Citrus sp., Poncirus trifoliata L. Raf. e seus híbridos foram transformados geneticamente via Agrobacterium tumefaciens, estirpe EHA105, contendo a construção pBI-AI (Figura 1) e receberam o gene de interesse aiiA, definido na SEQ. ID. N° 1. A Figura 2 mostra fragmentos de DNA das plantas transgênicas com a inserção do transgene amplificado por reação de PCR (Polimerase Chain Reaction).

[38] Essas plantas passaram por duas fases, a primeira constituiu no co-cultivo in vitro de explantes de Citrus sp. expostos à Agrobacterium tumefaciens. A segunda etapa, os explantes selecionados e candidatos a serem transgênicos foram estabelecidos em vasos, em casas de vegetação por 2 anos.

[39] Os materiais transgênicos de Citrus sp. foram multiplicados e em seguida foram desafiadas sob pressão de HLB. Para tanto, ramos de plantas doentes coletados no campo foram enxertados na parte aérea das plantas transgênicas candidatas a serem resistentes (Figura 3).

[40] Vinte e quatro meses após a inoculação, em condições controladas de estufa, as plantas transgênicas não demonstraram sintomas da doença, enquanto as brotações do inóculo já possuíam sintomas típicos do HLB (Figura 4).

[41] Todas as plantas transgênicas desafiadas com HLB foram submetidas a testes de diagnóstico por PCR de Tempo Real, para a avaliação quantitativa das mesmas. A Tabela 1 mostra os resultados para os Citrangeiros Carrizo avaliados.

[42] O experimento consistiu em enxertar um inóculo pela técnica de garfagem lateral de um ramo com sintomas típicos do HLB em laranjeira Valência no tronco de plantas transgênicas de Citrangeiro Carrizo com a finalidade de transmitir a doença na planta transformada. Desta forma, em uma mesma planta estão presentes o material transgênico e o material contaminado com HLB (inóculo), proporcionando as condições ideais de contaminação da doença através do contato de tecidos.

[43] A análise dos sintomas visuais e a quantificação relativa do agente causal do HLB foram realizadas a partir de métodos já descritos na literatura, que consistem respectivamente na análise visual para os padrões de clorose assimétrica nas folhas e na amplificação de DNA alvo da bactéria no tecido vegetal avaliado. O mosqueamento em folhas de plantas com HLB foi utilizado para a avaliação da presença ou não de sintomas da doença na planta. A amplificação de DNA alvo por PCR em Tempo Real foi utilizado para a quantificação relativa do agente causal do HLB, a bactéria Candidatus Liberibacter sp., no tecido vegetal avaliado (Tabela 1). Enquanto a brotação proveniente do inóculo desenvolveu os sintomas típicos da doença, a brotação proveniente do material transgênico não apresentou os sintomas (Figura 4).

Tabela 1: Avaliação quantitativa das plantas transgênicas desafiadas com HLB

Planta Tipo de Ct Média Ct Média Ct Espécie ID Amostra________________________amostra____Ct______GAPDH_____GAPDH

Carrizo 33,54 21,17 1 33,56 21,17 (transgênico) 33,46 21,17 6869 Valência 23,59 21,43 2 23,62 21,33 _______________________(inóculo)_______23,65_____________21,24____________ Carrizo 29,3 20,56 1 29,02 20,59 (transgênico) 28,75 20,63 6621 Valência 23,13 21,26 2 23,11 21,23 (inóculo) 23,1 21,21 Valência 22,97 20,64 7937 2 22,97 20,69 (inóculo) 22,98 20,75 Carrizo 24,16 21,61 6268 3 29,72 22,86 (controle) 35,29 22,05 - 39,5 H2O 4 - 39,5 39,5 _______________________________________39,5________________-_______________ 22,33 20,66 P Las 5 - 22,73 20,63 ____________________________________ 22,84 _________ 20,6 __________ [44] A análise feita pela técnica de PCR de Tempo Real gera informações quantitativas do alvo de DNA amplificado. Os valores chamados de "Ct" referem-se ao número de ciclos de amplificação do DNA alvo que geraram a detecção de uma determinada fluorescência da sonda de DNA utilizada na amplificação do DNA da bactéria Canditatus Liberibacter sp. Um valor baixo de Ct significa que a reação do PCR começou antes de outra amostra com um valor de Ct maior, ou seja, tinha uma quantidade de alvo (DNA da bactéria) maior que a outra amostra. A diferença de valores entre os dois Cts é proporcional à diferença de concentração entre os alvos amplificados. É calculado pela função exponencial f(x)=2n, onde a variável "n" é a diferença de Cts entre duas amostras. Por exemplo, a planta n.° 6869 possui um valor médio de Ct da amostra "1" de 33,56 e da amostra "2" de 23, 62. A diferença entre eles é de Δ^=33,56 - 23, 62 = 9, 94, ou seja, a amostra "2" (inóculo) possui f(x)=29,94 = 982 vezes mais bactérias do que a amostra "1" (Citrangeiro Carrizo transgênico).

[45] A planta 6621 apresentou uma diferença de Cts de Δ^=29, 02 - 23, 11 = 5, 91, ou seja, a amostra "2" (inóculo) possui f(x)=25,91= 60 vezes mais bactérias do que a amostra "1" (Citrangeiro Carrizo transgênico).

[46] Pode-se observar ainda que as médias dos Cts do controle endógeno GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), como esperado, não demonstrou grande variação de amplificação.

[47] Em outro experimento foi analisado novamente a quantidade relativa de bactéria presente em cada amostra (Figura 5). Nessa análise, o controle não transgênico (planta 6150) foi utilizado como normalizador para servir de referência para alta infecção, e, portanto, considerado como 100%. As demais plantas transgênicas (7908 a 18.594), contendo o gene aiiA, que codifica a enzima AHL lactonase, apresentaram níveis muito inferiores de Canditatus Liberibacter sp.(C.L.as.): 13,68% para a planta 7 908; 5,30% para a planta 7937; e inferior a 1,6% para todas as demais. A amostra 1C+Las foi o controle positivo da reação e a H2O o controle negativo.

[48] As plantas de Carrizo transgênico 7915, 6572 e 18.595 tiveram níveis bem baixos nas concentrações de bactéria, em torno de apenas 0,05% em relação ao controle normalizador não transgênico (100%), e não demonstram nenhum sintoma visual. O normalizador geral utilizado foi a planta não transgênica 6150, usado como base para a comparação relativa dos resultados. O controle negativo (H2O) obteve um Ct indeterminado, sendo assim considerado como zero ou negativo, e o 1C+L.as. foi o controle positivo. Pode-se verificar que os inóculos que apresentaram sintomas visuais, demonstraram também alta taxa de concentração da bactéria determinada pela técnica de PCR de tempo Real, enquanto as plantas transgênicas contendo a enzima Lactonase, expressa pelo gene de interesse aiiA, que quebra os sinais produzidos pelas Liberibacters mitigando o sistema Quorum sensing das mesmas, minimizou a capacidade de multiplicação das bactérias do HLB proporcionando um desenvolvimento satisfatório das plantas infectadas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (19)

1. Método para produção de plantas transgênicas com resistência a bactérias que possuem o sistema Quorum sensing caracterizado por compreender os estágios de: 1. Prover células de uma planta com uma molécula de DNA quimérica compreendendo uma primeira e segunda região onde; 1.1 A primeira região compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 243 nucleotídeos consecutivos, os quais tem similaridade substancial com a sequência com cerca de 243 nucleotídeos consecutivos na região sense do gene que codifica para uma enzima da via biossinética do peptídeo lactonase, conforme definido na SEQ. ID. N° 1; 1.2 A segunda região compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 195 nucleotídeos consecutivos, os quais tem similaridade substancial com a sequência complementar com cerca de 195 nucleotídeos consecutivos da região sense do promotor biossintético CaMV35S, conforme definido na SEQ. ID. N° 2; 1.3 A primeira e a segunda região são capazes de formar uma região espaçadora entre elas; e II. Identificar aquelas plantas onde a expressão da enzima da via biossintética do peptídeo lactonase é posteriormente regulada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da planta ser selecionada dos grupos da Família Rutaceae Juss, Subfamília Aurantioideae, Tribos Citreae e Clauseneae, e Subtribos que compreendam os genêros Citrus sp., Poncirus sp., Fortunella sp., Murraya sp., Severinia sp. Microcitrus sp., Atalantia sp., e seus híbridos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de transformar uma célula de uma planta da Família Rutaceae Juss, Subfamília Aurantioideae, Tribos Citreae e Clauseneae, e Subtribos que compreendam os genêros Citrus sp. , Poncirus sp., Fortunella sp., Murraya sp., Severinia sp. Microcitrus sp., Atalantia sp., e seus híbridos, com uma molécula de ácido nucleico que expressa o peptídeo lactonase, em que a expressão desse peptídeo provê resistência a um patógeno bacteriano com o mecanismo Quorum sensing.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da molécula de DNA compreender regiões múltiplas do gene que codifica uma enzima da via biossintética do peptídeo lactonase.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato da enzima da via biossintética do peptídeo lactonase ser o princípio ativo do sistema Quorum sensing.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a transformação compreender infectar com Agrobacterium tumefaciens e/ou bombardear com micro projeteis dita célula da planta compreendendo o dito ácido nucléico que expressa o dito peptídeo Lactonase.

7. Molécula quimérica de DNA para expressão do gene alvo em uma célula de uma planta, caracterizada por compreender: I. Um promotor ou região promotora capaz de ser reconhecida por RNA polimerases em célula de plantas, operacionalmente ligados a: II. Uma região de DNA que, quando transcrita, produz uma molécula de RNAm compreendendo regiões de RNA específicas ao gene alvo contendo: a) Uma primeira região compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 243 nucleotídeos consecutivos, os quais tem similaridade substancial com a sequência com cerca de 243 nucleotídeos consecutivos da região sense do gene que codifica para uma enzima da via biossintética do peptídeo lactonase, conforme definido na SEQ. ID. N° 1; b) Uma segunda região de DNA não transcrito compreendendo uma sequência complementar com cerca de 195 nucleotídeos consecutivos da região sense do promotor biossintético CaMV35S, conforme definido na SEQ. ID. N° 2; c) Uma primeira e uma segunda região capazes de formar uma região espaçadora entre elas, e d) Onde a molécula de DNA quimérica, quando provida de células de plantas , expressa o gene que codifica para uma enzima da via biossintética do peptídeo lactonase.

8. Molécula quimérica de DNA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato da planta ser selecionada do grupo da Família Rutaceae Juss, Subfamília Aurantioideae, Tribos Citreae e Clauseneae, e Subtribos que compreendam os genêros Citrus sp., Poncirus sp., Fortunella sp., Murraya sp., Severinia sp. Microcitrus sp., Atalantia sp., e seus híbridos.

9. Microrganismo Agrobacterium tumefaciens, caracterizado por compreender a construção pBI-AI contendo o gene aiiA, conforme definido na SEQ. ID. N° 1, que codifica a enzima AHL lactonase, o terminador nopalina sintetase (NOS) e o gene para resistência a canamicina (NPTII), sob controle do promotor CaMV35S, conforme definido na SEQ. ID. N° 2.

10. Planta transgênica caracterizada por compreender o gene aiiA que codifica a enzima AHL-lactonase que quebra os sinais produzidos por bactérias patogênicas, mitigando o sistema Quorum sensing das mesmas.

11. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por ser selecionada dos grupos da Família Rutaceae Juss, Subfamília Aurantioideae, Tribos Citreae e Clauseneae, e Subtribos que compreendam os genêros Citrus sp., Poncirus sp., Fortunella sp., Murraya sp., Severinia sp. Microcitrus sp., Atalantia sp., e seus híbridos.

12. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por ser transformada com uma molécula de ácido nucleico que expressa o peptídeo lactonase, em que a expressão desse peptídeo provê resistência a um patógeno bacteriano com o mecanismo Quorum sensing.

13. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por apresentar um fenótipo de resistência a doenças que possuem o sistema Quorum sensing como o HLB (Huanglongbing) e outras com o mesmo sistema.

14. Progênie caracterizada por ser da planta transgênica definida na reivindicação 10.

15. Porta enxerto caracterizado por ser da planta transgênica definida na reivindicação 10.

16. Embrião somático caracterizado por ser da planta transgênica definida na reivindicação 10.

17. Meristema radicular, apical e lateral, gema e borbulha caracterizado por ser da planta transgênica definida na reivindicação 10.

18. Célula caracterizada por ser da planta transgênica definida na reivindicação 10.

19. Semente caracterizada por ser da planta transgênica definida na reivindicação 10.