CN102796746A - 一种调节茄科类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的基因片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种可以赋予茄科植物积累类黄酮包括芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮等，以及咖啡酰奎尼酸能力的DNA，其基因序列如SEQ ID NO：1所示，该片段从番茄中获得，包含番茄类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成调控基因S1MYB12，发明人提供了该片段的分离克隆、功能验证和应用的具体方法；本发明利用番茄果实特异性表达启动子E8，驱动番茄内源基因S1MYB12在番茄果实中特异表达，大大提高了番茄果实中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量，验证了番茄内源S1MYB12基因具有调节类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的功能。

Description

一种调节茄科类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的基因片段及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种调节茄科类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的基因片段及其具体应用方法，该片段的基因序列物SEQ ID NO：1所示，可以赋予植物积累类黄酮包括芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮等，以及咖啡酰奎尼酸能力。

背景技术

类黄酮（Flavonoids），又称维生素P，常与维生素C伴随存在，指具有α或β-苯基苯稠吡喃酮的一大类物质（张甘良等，2005）。自然界分布广泛，常以游离态或糖苷的形式存在于高等植物及羊齿植物的根、茎、叶、花、果实，是许多中草药的有效成分(Graf et al.,2005;Hertog et a l.,1995）。类黄酮类化合物由于生理活性多样，近年来引起了国内外的广泛关注，研究进展很快。

类黄酮是一类天然的植物次生代谢产物，具有抗氧化和抗病毒病等重要功能。生物类黄酮具有多种生物活性，可用于延缓衰老，治疗和预防癌症、心血管病等疾病，也可用于作物体外喷施，获得对病原物的抵抗能力（Simona et al.,2010;Zhen et al.,2010），具有很大应用价值（Pamela et al.,2007;Butelli1 et al.,2008）。

类黄酮可以作为抗氧化剂、自由基清除剂和二价阳离子鳌合剂，也可以抑菌、抗病毒、消炎、吸引授粉者、保护植物免受病虫害和紫外线损伤，以及作为信号分子、植物抗毒素和化感物质在植物与微生物相互作用中发挥作用（Mol et al.,1998;Harborne et al.,2000;Pietta,2000;Winkel-Shirley,2001），还能对脂类过氧化、血小板聚合、毛细管渗透性和易脆性、环加氧酶和脂肪氧化酶活性进行抑制，花青素类物质还影响着植物的颜色（唐传核，2005）等。类黄酮的生物活性大体概括为以下几个方面：（1）抗氧化和清除自由基作用；（2）抑菌和抗病毒作用；（3）抗炎和抗过敏作用。

咖啡酰奎尼酸（Caffeoyl quinic acid）是一类由奎尼酸和不同数目咖啡酸通过酯化反应综合而成的酚酸类天然化合物，广泛存在于植物界。近20年来，国内外学者就咖啡酰奎尼酸的植物化学和药理学进行了深入研究，发现这类化合物具有一些重要的生物活性，极具临床价值。

绿原酸（Chlorogenic acid），是由咖啡酸（Caffeic acid）与奎尼酸（Quinic acid，1-羟基六氢没食子酸）生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。根据咖啡酰在奎尼酸上的结合部位和数目不同，从理论上讲，单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸所组成的绿原酸异构体共有10种，分别为：1-咖啡酰奎尼酸、3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸、1，3-二咖啡酰奎尼酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸、1，6-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸。到目前为止，从植物中发现的绿原酸异构体有如下：绿原酸（3-咖啡酰奎尼酸）、隐绿原酸（Band510（4-咖啡酰奎尼酸）、新绿原酸（5-咖啡酰奎尼酸）、异绿原酸A（4，5-二咖啡酰奎尼酸）、异绿原酸B（3，4-二咖啡酰奎尼酸）、异绿原酸C（3，5-二咖啡酰奎尼酸）、莱蓟素（1，3-二咖啡酰奎尼酸）。

绿原酸的生物活性:绿原酸被认为是众多药材和中成药抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，通常被作为定性甚至定量的指标。据报道，绿原酸的主要生物活性有（1）对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；（2）对自由基的清除及抗脂质过氧化作用；（3）抗诱变作用；（4）保肝利胆作用；（5）抗菌、抗病毒及解痉等作用。

目前主要通过常规手段利用天然材料（银杏叶、洋葱、柠檬、各种中药材等）为基础的化学方法获得，受到原材料来源不足、含量偏低、初提物成份复杂及相关药理毒性不清等因素的严重限制，由少数公司控制下游产品的生产和销售，价格居高不下。

目前广泛种植的番茄仅含有少量的类黄酮和咖啡酰奎尼酸。利用番茄作为生物反应器生产植物疫苗、化合物等正成为番茄基因工程研究的一个热点。番茄是重要的转基因受体植物，农杆菌介导的番茄叶盘转化法自1986年McCormick等报道以来得到了迅速发展。但是如何能够提高番茄内类黄酮和咖啡酰奎尼酸的含量一直是现有常规技术无法解决的问题。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种可以赋予茄科植物积累类黄酮包括芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮等，以及咖啡酰奎尼酸能力的DNA片段，其基因序列如SEQ ID NO：1所示，该片段从番茄中获得，包含番茄类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成调控基因S1MFB12，发明人提供了该片段的分离克隆、功能验证和应用的具体方法；本发明利用番茄果实特异性表达启动子E8，驱动番茄内源基因S1MYB12在番茄果实中特异表达，大大提高了番茄果实中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量，验证了番茄内源S1MYB12基因具有调节类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的功能；同时建立在此基础上，以栽培型小果番茄作为生物反应器生产类黄酮和咖啡酰奎尼酸生物制品，实行产业化；也可以此获得番茄的工程细胞，通过细胞培养方式生产类黄酮和咖啡酰奎尼酸。同时本发明中用的转化载体可以通过雌二醇的诱导作用剔除筛选标记，得到具有食用安全性的番茄品种，进行品种培育。

发明人首先提供了一种包含S1MYB12基因的DNA片段，其S1MYB12基因的基因序列如SEQID NO：1所示，除此之外，本发明还保护了基于上述基因片段的基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段,上述DNA片段均具有赋予茄科植物积累类黄酮（如芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮等）和咖啡酰奎尼酸的能力。

本发明的发明人首先通过特异引物S1MYB12F1，其基因序列如SEQ ID NO：2所示，和S1MYB12R1，其基因序列如SEQ ID NO：3所示，采用现有技术高保真扩增全长S1MYB12基因，获得基因序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段。

之后发明人通过特异引物E8PF1，其基因序列如SEQ ID NO：4所示，和E8PR1，其基因序列如SEQ ID NO：5所示，以番茄品种中蔬4号基因组DNA为模版，组合扩增出编码E8启动子的DNA序列，其基因序列如SEQ ID NO：6所示。

在获得上述两段基因片段之后，采用Xho I-Spe I双酶切后去掉GFP片段并用上述两段基因片段替换掉常用植物表达载体pX6-GFP中的GFP基因，最终即可获得植物表达载体pX6-E8::S1MYB12。

最终获得的植物表达载体pX6-E8::SlMYB12，导入农杆菌工程菌株AGL1。通过叶盘法转化番茄品种Micro-Tom、CSl09-03、圣女果，分别获得PCR阳性转基因植株。利用HPLC对转基因株系的番茄果实进行了类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量检测，三个番茄转基因材料的果实中以上物质的含量都有明显的提高。

在上述技术的基础上，根据已经克隆的S1MYB12基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选可得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR（polymerase chain reaction）技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的S1MYB12基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含S1MYB12基因的序列包括基因片段的基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。

综上所述，本发明的发明人在国际上首次提供了一种可以赋予茄科植物积累类黄酮包括芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮等，以及咖啡酰奎尼酸能力的DNA片段，该片段从番茄中获得，包含番茄类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成调控基因SlMYB12，发明人提供了该片段的分离克隆、功能验证和应用的具体方法；本发明利用番茄果实特异性表达启动子E8，驱动番茄内源基因S1MYB12在番茄果实中特异表达，大大提高了番茄果实中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量，验证了番茄内源S1MYB12基因具有调节类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的功能；同时建立在此基础上，以栽培型小果番茄作为生物反应器生产类黄酮和咖啡酰奎尼酸生物制品，实行产业化；也可以此获得番茄的工程细胞，通过细胞培养方式生产类黄酮和咖啡酰奎尼酸。同时本发明中用的转化载体可以通过雌二醇的诱导作用剔除筛选标记，得到具有食用安全性的番茄品种，进行品种培育。

附图说明

图1为本发明的全过程流程图；

图2为E8启动子和S1MYB12基因PCR扩增后电泳图，

图中M为TaKaRa DNA Marker DL2,000，1为E8启动子，2为S1MYB12基因；

图3为E8启动子TA克隆经EcoR I酶切后电泳图，

图中M为Trans2K DNA Marker，1和2为E8启动子阳性克隆；

图4为过渡载体pX6-E8经Xho I-Spe I酶切后电泳图，

图中M为rans2K DNA Marker，2、5和6为pX6-E8阳性克隆，1、3和4为构建错误的克隆；

图5为pX6-E8::SlMYB12重组质粒Spe I酶切鉴定电泳图，

图中M为DNA Marker，3为pX6-E8::SlMYB12阳性克隆，剩余为构建错误的克隆；

图6为番茄遗传转化不同时期的示意图；

图中A为愈伤组织诱导后示意图；B为分化产生不定芽时示意图；C为再生苗生根示意图；D为转基因苗移栽大田后植株示意图；E为T0代转基因果实示意图；

图7为转基因植株中目的基因S1MYB12的PCR检测结果示意图，

图中M为TaKaRaλ-EcoT14 I digest，P1为阳性对照，P2为阴性对照，3-8为转基因植株；

图8为野生型（Micro-Tom，CD07T-CK）和转基因果实果肉(CD07T-2)提取液HPLC分析结果示意图，

图9为转基因番茄果实(CD09T-11)果皮与果肉提取液HPLC分析结果示意图，

图中S1为绿原酸；S2为芦丁；S3为山奈酚芸香苷；S4为3，4，5-三咖啡酰奎尼酸；S5为柚皮素查尔酮；

图10为野生型（圣女果）和转基因果实果皮(CD09T-11)提取液HPLC分析结果示意图，

图中S1为绿原酸；S2为芦丁；S3为山奈酚芸香苷；S4为3，4，5-三咖啡酰奎尼酸；S5为柚皮素查尔酮；

图11为果实成熟不同时期芦丁含量变化（CD08T-1）示意图。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；

本发明中所涉及的多种培养基具体如下：

MS培养基：100mL10×MSmax，10mL100×MSmin，10mL100×Fe2-EDTA，10mL100×Tomato Vitamin，30g蔗糖，氢氧化钾或盐酸调pH至5.7-5.8，定容至1L。若为MS固体培养基，加入0.8%琼脂粉。

番茄预、共、后培养基：在上述MS培养基基础上，添加生长素（吲哚三乙酸）和玉米素，终浓度分别为0.2mg/L和2mg/L。

番茄分化培养基：在上述MS培养基基础上，使用前添加羧苄青霉素和卡那霉素，终浓度分别为400mg/L和30mg/L。

番茄生根培养基：在MS培养基基础上，添加生长素和羧苄青霉素，终浓度分别为0.1mg/L和400mg/L。

实施例1果实特异性E8启动子和SlMYB12基因全长cDNA的克隆，植物表达载体的构建：

1．番茄果实特异性E8启动子和S1MYB12基因cDNA的克隆

以番茄品种中蔬4号基因组DNA为模版，引物E8PF1，其基因序列如如SEQ ID NO：4所示，和E8PR1，其基因序列如如SEQ ID NO：5所示，组合扩增，得到预期1.1kb片段（图2所示）。进而将E8PF1/R1组合扩增产物进行TA克隆，连接到PCR产物克隆载体pGEM-T Ea sy载体。转化大肠杆菌DH5α，获得大量克隆。利用特异性引物组合E8PF1/R1对随机挑选的12个克隆进行菌落PCR鉴定，得到8个有目标片段插入的克隆。随机挑选两个克隆提取质粒并使用EcoR I酶切验证，确认其携带目标片段（图3所示），该片段经测序验证，其为编码E8启动子的DNA序列。

根据RT-PCR方法，以番茄Micro-Tom来源的RNA为模板合成第一链cDNA，进而以第一链cDNA为模板，通过特异引物SlMYB12F1，其基因序列如如SEQ ID NO：2所示，和SlMYB12R1，其基因序列如如SEQ ID NO：3所示，高保真扩增全长S1MYB12基因，约1kb（图2所示）。测序结果显示所扩增的S1MYB12与数据库中序列一致，表明克隆成功。

pX6载体选用现有的PX6-GFP，通过常规的Xho I-Spe I双酶切后去掉GFP片段后备用，以与上述E8启动子克隆以及S1MYB12基因连接构建pX6-E8::SlMYB12载体。

试验中用到的引物序列及说明见下表。

2．植物表达载体pX6-E8::SlMYB12的构建

将克隆到TA克隆的E8启动子片段，经Xho I-Spe I双酶切后电泳回收，并与相同酶切回收的pX6-GFP载体连接。转化大肠杆菌后随机挑取6个重组子，经Xho I-Spe I双酶切后电泳检测，三个重组子酶切结果中含有目标片段，大小约1.1kb，表明过渡载体pX6-E8构建成功（如图4）。该过渡载体进一步用E8启动子特异引物E8PF1/R1进行PCR验证，再次证实过渡载体pX6-E8构建成功。

pX6-E8过渡载体经Spe I酶切后，去磷酸化处理，同时胶回收Spe I酶切的S1MYB12cDNA片段。连接转化后采用菌落PCR筛选到1个携带有目标基因片段且插入方向正确的克隆。pX6-E8::SlMYB12经Spe I酶切验证，出现一条约1kb目标条带，再次证实pX6-E8::SlMYB12载体构建成功（图5中3所示）。该重组载体经测序重复验证后导入农杆菌菌株AGL I并进行番茄遗传转化。

实施例2农杆菌介导的番茄遗传转化及转基因植株PCR检测

1．农杆菌介导的番茄遗传转化

利用番茄子叶为外植体，采用农杆菌（AGL I菌株）介导的叶盘转化法，将植物表达载体pX6-E8::SlMYB12分别转化Micro-Tom、CSl09-03、圣女果三个受体材料。一切操作均在严格的无菌环境下进行，转基因操作基本程序如下：

1）种子经75%乙醇消毒1min，有效氯2%NaOCl处理15min，无菌蒸馏水洗涤4-5次，播种于1/2MS培养基，间距适宜，24-26℃暗培养3-4d后转移到16h光照/8h黑暗下培养至子叶完全展开。

2）刀片切除子叶前后两段，留取中间约0.5cm叶片，近轴面朝上置于预培养基，24-26℃暗培养2d。外植体预培养的同时，采用平板划线法，28℃大规模培养含有重组表达载体的农杆菌菌株。

3）MS培养液重悬农杆菌，浓度OD600=0.4-0.6浸泡侵染25-30min。无菌滤纸吸干菌液，近轴面朝上24-26℃黑暗条件共培养2d。

4）无菌蒸馏水洗涤外植体4-5次，每次30min，最后用浓度为250ppm羧苄青霉素水洗30min，无菌滤纸吸干，近轴面朝上24-26℃16h光照/8h黑暗条件后培养3d。

5）外植体转移到分化培养基，每2周继代一次至抗性芽分化。

6）当抗性芽长到2-3cm时，切下并插入生根培养基。当有大量根长出时，洗净根部培养基并移栽到温室。

Micro-Tom、CSl09-03、圣女果三个受体材料各获得20株、30株、45株独立的T0代转基因植株（图6），分别编号CD07T、CD08T、CD09T。再生苗生根后移栽温室，加强对飞虱、蚜虫、红蜘蛛、潜叶蝇等番茄常见虫害的管理和防治，挂果时期适当追施肥料。

2．转基因植株PCR检测

选取幼嫩番茄叶片，利用CTAB法提取转基因和非转基因植株基因组DNA，以包含SlMYB12基因全长cDNA在内的外侧载体引物PX6F1/R1进行PCR检测。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出与pX6-E8::SlMYB12质粒扩增同样大小约2.1kp片段（图7）为阳性植株，Micro-Tom、CSl 09-03、圣女果三种材料阳性植株分别有15株、20株、31株，阳性率分别为：75%、67%、69%。

实施例3番茄果实类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量HPLC分析

转基因番茄在营养生长时期与非转基因植株并无明显差异，生殖生长时期，少数株系果实形状发生改变，脐尖、果实膨大（主要发生于自然光温室种植的Micro-Tom）。从变色期开始，转基因果实的果皮逐渐趋向桔红色或深黄色，对照果实仍然维持相应的红色（Micro-Tom、CSL09-03）或者浅黄色（圣女果），Micro-Tom、CSl09-03背景的转基因果肉颜色仅有轻微改变，圣女果不明显，后续HPLC分析证明了转基因果实的颜色变化与芦丁等类黄酮物质和咖啡酰奎尼酸含量的增加（图8、图9、图10）存在一定联系。番茄果实类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量HPLC分析方法如下：待通过上述步骤获得的番茄成熟收获后，用冷冻干燥机（EYELAFDU-1100，TOKOYO RIKAKIAI CO.LTD）冷冻干燥后研成粉末。以每mg冻干粉末溶于30μl 70%甲醇的比例溶解后，置于-20℃3h进行类黄酮提取，提取液经1600g离心后使用0.45μm滤膜过滤上清液，取20μl过滤液用于HPLC分析，按照Luo等（2009）设置HPLC条件，标准品为芦丁、绿原酸和山奈酚芸香苷（分别购自Sigma和Extrasynthese公司），1,5-二咖啡酰奎尼酸和3,4,5-三咖啡酰奎尼酸购于成都普瑞法科技开发有限公司。

1．果实不同组织类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量比较

利用HPLC对阳性转基因株系进行了类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量检测，三个转基因材料均有明显提高。

其中Micro-Tom背景下果皮芦丁含量最高达到15.66mg﹒g-1DW，与对照相比提高了14倍；山奈酚芸香苷最高达到4.72mg﹒g-1DW，与对照相比提高了8.4倍；另外，咖啡酰奎尼酸含量也有了明显的提高（表1）。CSl09-03背景下，果皮芦丁含量最高达到了7.94mg﹒g-1DW，提高了36.8倍；山奈酚芸香苷最高达到0.28mg﹒g-1DW，1,5-二咖啡酰奎尼酸最高达到0.3mg﹒g-1DW，绿原酸最高达到1.18mg﹒g-1DW，而对照中山奈酚芸香苷、1,5-二咖啡酰奎尼酸、绿原酸含量低于高效液相色谱检测限值未能检出（表2）。圣女果背景下，果皮芦丁最高含量达到了30.46mg﹒g-1DW，与对照相比提到了33.6倍；山奈酚芸香苷最高含量为7.20mg﹒g-1DW，与对照相比提到了112倍；1,5-二咖啡酰奎尼酸含量达到0.15mg﹒g-1DW，绿原酸含量达到3.3mg﹒g-1DW，而对照中1,5-二咖啡酰奎尼酸、绿原酸含量低于高效液相色谱检测限值未能检出（表3）。总体果皮类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量高于果肉（图9、图10）。

此外，所有转基因植株柚皮素查尔酮（S5）含量均有显著提高，由于无标准品，实验未以数值作出说明。总体来看，转基因果实类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量都有了明显的提高。

表1.Micro-Tom类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量统计

表2.Csl09-03类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量统计

表3.圣女果类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量统计

Claims (6)

1.一种赋予茄科植物积累类黄酮和咖啡酰奎尼酸能力的DNA片段，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于：还包括包含有如SEQ ID NO：1所示基因序列的DNA片段。

3.根据权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于：片段内至少包含全长的S1MYB12基因编码序列或经过修饰的该序列，该基因序列编码的蛋白质具有MYB类转录因子蛋白的结构。

4.根据权利要求3所述的DNA片段，其特征在于：片段内还含有其他功能基因片段。

5.如权利要求1所述的基因片段在增加植物类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量上的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：利用如权利要求1所述的DNA片段构建植物表达载体pX6-E8::SlMYB12，并利用该载体转化到茄科植物中增加茄科植物类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量。

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