CN102271697A - 水果提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备茄科(Solanaceae)水果提取物的方法，其中将水果加工以优化所述提取物的血小板聚集抑制活性。所述方法包括：制备匀浆水果的初始混合物；从水果固体中分离出水溶性级分；过滤所述水溶性级分；以及浓缩滤过液中的活性剂。本发明还提供了通过所述方法生产的水果提取物；以及含有糖基化酚酸或酚酯或其衍生物、糖基化类黄酮和核苷的水果提取物。本发明的提取物可用作用于治疗或预防以不适当血小板聚集为特征的医学病症的药物。特别地，所述药物可用于通过减少血小板聚集来维持心脏健康；有益于循环和/或使血流正常化或以其它方式有益于血流。

Description

水果提取物
技术领域
本发明涉及预防血小板聚集并可用作抗血栓剂的水果提取物以及制备所述提取物的方法。
已明确，摄入水果和蔬菜是可降低心血管疾病风险的重要预防性措施。因此，已经进行了相当多的尝试来鉴定在预防心脏病方面起作用的来源于水果和蔬菜的化合物。
人们已表现出对抑制血小板聚集的药剂特别有兴趣。当血小板在循环系统内聚集时，形成大至足以阻塞血管的血栓。然而，在发生完全聚集(full aggregation)之前，血小板可以以活化状态循环。在这种状态下，血小板粘性大大增加，并且它们可彼此粘结，与其它血细胞粘结或者与血液成分(如富脂质乳糜微粒)粘结。这使得形成微聚集体，降低血液流动性、影响局部血流和全身循环。降低血小板聚集性有助于维持血液呈流动和低凝固状态。这通过防止循环内形成微聚集体和防止血小板与血管壁或脂肪斑相粘结而有助于使血流正常化。
鉴于此，人们公认，能够抑制血小板聚集的药剂可用于预防冠状动脉疾病(例如心肌梗塞和中风)以及预防患有心肌梗塞、中风或不稳定型心绞痛的患者中进一步的血栓栓塞事件。此外，这些药剂可用于预防血管成形术和旁路手术后的再狭窄。此外，这些药剂还可用于治疗由血栓栓塞性疾病(例如心肌梗塞)与溶栓治疗相结合而引起的的冠状动脉疾病。
有多种已知的作用于血小板产生和起作用的不同阶段的抗血小板聚集剂。阿司匹林(乙酰水杨酸)是应用和研究得最广泛的。双嘧达莫和噻氯匹定也被使用。阿司匹林的抗血小板活性归因于不可逆地抑制血小板环氧合酶，由此防止血栓烷A2(一种引起血小板聚集的化合物)的合成。吲哚布芬是血小板环氧合酶的可逆抑制剂。一些化合物是血栓烷A2合酶的直接抑制剂，例如吡吗格雷，或者用作血栓烷受体的拮抗剂，例如磺曲苯。
国际专利申请WO 99/55350公开了表现出抑制血小板聚集能力的来自多种水果的水溶性提取物。认为出乎意料的是，发现抗血小板聚集活性是水溶性的，因为相比较而言，当时本领域中已知的活性提取物是脂溶性化合物(例如番茄红素)。发现这些水溶性提取物具有预防或降低血小板聚集的显着效力，并且已经作为具有健康益处的营养补充剂经食品标准局(Food Standards Agency)批准在欧洲上市。
通过质谱(MS)和核磁共振(NMR)谱对WO 99/55350中水果提取物的活性成分进行了分析，发现其含有具有血小板聚集抑制活性的核苷混合物。
本发明是基于本发明人的以下认识：水溶性水果提取物内的核苷可能不是这些提取物内唯一预防抗血小板聚集的化合物。因此，他们付出了相当多的努力来将WO 99/55350中所述水溶性提取物中的活性剂进行进一步分级和表征，以试图提高这些提取物抑制血小板聚集的功效并且开发出加工水果以用于此用途的新方法。
现已发现，可按照得到对血小板聚集具有最佳有益作用的水溶性提取物的方法加工茄科(Solanaceae)水果。这一新认识使得本发明人能够开发出具有抑制血小板聚集功效的新的水果提取物以及制备所述水果提取物的方法。
因此，本发明的第一个方面提供制备茄科家族水果提取物的方法，其中对水果进行加工以优化提取物的血小板聚集抑制活性，所述方法包括：
(a)制备匀浆水果的初始混合物；
(b)从水果固体中分离出水溶性级分；
(c)过滤所述水溶性级分；以及
(d)浓缩滤过液(filtration permeate)中的活性剂。
本发明人决定分析WO 99/55350中所述水果提取物中的活性化合物(参见实施例1)。本发明人出乎意料地发现，天然存在于植物中的许多化合物均有效抑制血小板聚集。这使他们认识到可对WO 99/55350中所述方法进行调整以开发出这样的方法：其将得到所述活性剂成分被保留(即在水果加工过程中活性化合物的损失尽可能最小)或者所述活性剂在生产水果提取物过程中实际上被富集的提取物。经过反复试验后，他们确立了本发明第一个方面的方法的步骤，得到可有效降低血小板聚集并且包含存在于水果中之多种活性水溶性化合物的水果提取物。
(a)制备初始混合物
将整个水果(优选番茄)的果肉(具有或不具有果皮)均质化以形成果泥。
或者，可将可商购的番茄泥用作制备初始混合物的原料。在用于制备提取物的原料是番茄泥的情形下，其优选是通过“冷破碎”(“cold-break”)方法而不是“热破碎”(“hot-break”)方法制得的。术语“冷破碎”和“热破碎”是番茄加工领域众所周知的，并且可商购的番茄泥通常是作为热破碎或冷破碎的果泥而销售的。冷破碎果泥可通过包括将番茄均质化然后进行将番茄加热至不超过约60℃的温度的热处理步骤的方法制得，相比较而言，热破碎果泥是使均质化番茄经历约95℃温度的热处理，参见例如Anthon等，J.Agric.Food Chem.2002，50，6153-6159。
应当通过用水或水溶液(优选去矿物质水)稀释来调节这些果泥的稠度(不论是来自新鲜水果还是可商购的果泥)以形成“初始混合物”。本发明人发现，如果稀释所述初始混合物以使其包含少于33％的固体并且更优选少于20％的固体时，则可在最终水果提取物中实现最佳活性。在本发明的一个优选实施方案中，所述初始混合物包含约10％至15％的固体(例如13％的固体)。
本发明人发现，初始混合物的维持温度可对提取物活性具有显著影响。因此，优选维持温度不超过35℃，并且更优选不超过30℃。
本发明人还发现，初始混合物的pH也影响根据本发明方法制得的提取物的活性。混合物的pH应该是酸性的，优选低于pH 5.5，在一个优选实施方案中，pH应该不高于约4.2。必要时，可通过添加柠檬酸来调节pH。
此外，本发明人发现，还应该控制初始混合物的褐变指数(browningindex)以优化最终提取物的活性。因此，初始混合物的褐变指数(定义为可溶性部分在420nm处的吸光度)在4％固体时优选不超过0.4AU。褐变指数是通过形成类黑精类(melanoidins)(基于糖类和氨基酸的多种组成的聚合缀合物)而引起的可见褐变的指标，其可通过以下步骤来测量：在室温下以3500rpm将50mL初始混合物样品离心10分钟，取出一部分上清液，将其稀释至4％固体(用折光仪测量)，并且用分光光度计测量该溶液在420nm处的吸光度。
本发明人还发现，如果控制初始混合物的温度、pH和褐变指数中的至少之一(如上文所述)，则根据本发明方法的水果提取物的抗聚集活性提高。优选控制这些控制步骤的至少两个(例如温度和pH；或者温度和褐变指数)，更控制优选温度、pH和褐变指数，如上文所述。
最优选在pH小于4.2时将初始混合物的温度维持在不高于30℃，并且褐变指数不超过0.4AU。
(b)从水果固体中分离出水溶性级分
可利用多种标准技术从水溶性级分中除去水不溶性固体。
在此方法的该步骤中，优选从初始混合物中除去大颗粒(即粒径大于500μ)的水不溶性固体。
所述固体可利用以下来除去：
(a)倾析器(例如Westfalia GEA倾析器)；
(b)离心分离步骤(例如旋转盘式离心机)；或者
(c)配有尺寸可调喷嘴的分离器(例如Westfalia MSB-15分离器，利用坯料(blanks)和粒径0.45的喷嘴的混合)。
或者，可使固体沉降，并简单地手动倾析出水溶性级分。
无论使用哪种方法，本发明人发现，对于在水溶性级分中保留最佳生物活性而言，操作温度不应超过60℃。此外，优选通过设备的流速必须使得暴露于此60℃的时间不超过60秒。
理想地，应当在所述分离步骤之后冷却所得水溶性级分。当待贮存所述级分时，优选在分离之后立即将其冷却至＜8℃。
在一个优选实施方案中，本发明方法的步骤(c)可使用倾析器，其运行温度为40-45℃。
任选地，可在所述分离步骤之后进行二次澄清步骤(例如使用AlfaLavaal澄清器)以产生澄清的水溶性级分，其中所有余留的不溶性物质的粒径均＜500μ，并且离心下来的固体(即在室温下以3500rpm离心10分钟后可肉眼观察到沉淀的物质)的体积占所述级分的＜1％。
本发明人发现，如果所述澄清级分(不论是如何产生的)含有少于10％的总固体并且更优选含有约8％或更少的固体时，最终产物将维持最大活性组分浓度。
(c)水溶性级分的过滤
为了除去非常细小的颗粒物质(＜500μ)(例如蛋白质和大的聚合物物质如一些果胶)，应当然后过滤所述水溶性级分并保留滤过液。
过滤可以一步式完成，或者在一系列过滤步骤中进行，从相对粗过滤步骤开始以除去较大颗粒的番茄皮和/或番茄肉的其它水不溶性碎片。然后可进行进一步的过滤步骤以得到基本上澄清的溶液，例如能在不损失固体的情形下通过0.2μ滤器的溶液。
在一个优选实施方案中，本发明方法的步骤(c)包括微滤步骤，其使用配有陶瓷膜滤器的过滤单元(例如配有陶瓷膜滤器(例如PallMembralox P19-30多元件单元)的Tetra Alcros错流过滤MF单元)。还可以使用螺旋卷式膜(Spiral-wound membrane)作为陶瓷膜的替代物。
还可以使用超滤来替代微滤。可以接受多种孔径，例如1.4μ，0.1μ；但是本发明人发现，当使用0.1μ的孔径时，滤过液对生物活性成分的富集最多(即生物活性成分损失尽可能小并尽可能除去非生物活性成分)。
为了保持最佳生物活性，在此过滤步骤过程中，温度应当不高于约35℃，并且应当在除去过滤膜后立即将滤过液冷却至＜8℃。最终透过液的褐变指数应当不超过0.4AU。
本发明人发现，当最初的未过滤物质含有＜10％的固体并且当最终透过液含有约7％的固体和＜0.4AU的褐变指数时，生物活性成分的回收最大并且生物活性成分在过滤透过液中达到最大富集(相对于未过滤物质而言)。
根据步骤(a)-(c)除去的固体具有以下作用：除去果皮和种子碎片、大分子量蛋白质和果胶以及类胡萝卜素(例如番茄红素)/在果胶和蛋白质存在下在水溶液中以液滴形式稳定化的其它脂质。因此，所述方法提供了制备作为水溶性提取物并且还基本上不含番茄红素的番茄提取物的方法。
所述方法(特别是小心控制暴露于＞35℃(优选＞30℃)的温度的时间长度)还确保所制得的不含番茄红素的水溶性提取物不发生导致产生可视褐变的化学降解反应(Maillard反应)，如＜0.4AU的褐变指数值所表明的。这保证氨基酸-糖复合物和类黑精聚合物(其可络合一些生物活性成分)的形成保持在最小水平。因此，所述方法得到其中生物活性成分含量被优化的提取物。
在本发明方法的一个优选实施方案中，所述番茄提取物是基本上不含番茄红素并且能够通过0.2μ滤器而不损失固体的水溶性提取物，并且其褐变指数值＜0.4AU。
(d)浓缩透过液中的活性物质
然后将水性滤过液进行进一步的浓缩/过滤步骤，以提供含有抑制血小板聚集的化合物的生物活性浓缩物。
经过大量实验后，本发明人确定，如果要保留最终提取物的峰值生物活性或者要实现将生物活性物质富集在最终浓缩产物中，则需要小心控制浓缩步骤。发现其原因在于随着固体浓度增加，热依赖性和pH依赖性降解反应的进程加速。因此，他们认识到温度控制以及暴露于温度的时间对于浓缩提取物而言比对于稀提取物更关键。
有几种方法可用于浓缩/富集水溶性物质-条件是提取物温度不允许升高至使得提取物中活性物质降解，并且不允许升高至高于约60℃(对稀级分而言)和低于40℃(对更浓的样品而言)。
利用蒸发技术进行浓缩
减压下溶液的蒸发可以在温度不超过60℃的条件下进行。
优选使用多效蒸发仪，以便当液体通过蒸发仪时可降低温度，保证更浓的材料不暴露于超过40℃的温度，而更稀的材料则可耐受高达60℃的温度。
利用蒸发，可将水溶性提取物浓缩至高达70％固体，例如至20％固体，至50％固体，或者至65％固体。在一个最优选的实施方案中，在步骤(d)浓缩之后，最终提取物包含60-62％的固体。
温度效应可通过测量褐变指数来定量。温度应当足够低，使得最终浓缩产物应当不超过0.8AU。
在步骤(a)、(b)、(c)之后并且利用步骤(d)的蒸发仪形成的最终浓缩物优选褐变指数＜0.8AU，pH 4.0-4.3和密度1.15-1.20。
利用膜处理进行浓缩
或者，也可使用允许水通过膜而将所有其它成分保留在膜内的膜处理。具体技术的实例是反渗透或纳滤。此二者都可以用于在低温下(＜40℃)操作而将水溶性提取物浓缩至所需程度。
干燥技术
还可以使用干燥技术来从水溶性提取物中除去水。合适的干燥技术包括含有或不含有载体物质(例如马铃薯淀粉、木薯淀粉、麦芽糊精)的喷雾干燥、含有或不含有载体材料的真空鼓式干燥、或者含有或不含有载体材料的滚筒干燥。
低糖水果提取物的制备
上述方法被设计用于制备含有原始存在于水溶性提取物中的所有要素的浓缩物。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明第一个方面的方法可适于获得富集(例如25-35倍)有生物活性成分的浓缩物。
将生物活性成分富集在水溶性提取物中可通过除去构成其干物质含量的最主要部分的可溶性糖来实现。
低糖水果提取物可通过在上述步骤(a)、(b)和(c)之后，然后在上述最后浓缩步骤(d)之前在方法中使用另外一个步骤来制得。
除去可溶性糖可通过以下步骤实现：
(1)沉淀，例如通过向溶液中添加乙醇至最终浓度为90％，这将导致游离葡萄糖、果糖和蔗糖沉淀；
(2)通过消化，通过酶(例如葡萄糖氧化酶)部分地除去游离糖；
(3)通过微生物(细菌或酵母)处理；或者
(4)通过对提取物成分进行树脂介导的分离来从水溶性提取物中除去游离糖。
优选通过对提取物成分进行树脂介导的分离来从水溶性提取物中除去游离糖(上述(4))。本发明人开发了一种方法，其中应用食品级树脂(Amberlite FPX66)吸附除了游离糖、有机酸和盐之外的所有提取物成分。这些物质不被树脂吸附并且可在通过树脂之后弃掉。然后通过用乙醇/水混合物(例如50％乙醇或80％乙醇)洗脱来从树脂中回收被吸附到树脂上的提取物成分(其包括氨基酸、生物活性成分和褐变反应产物(Maillard降解产物))。可通过减压下蒸发(例如在防爆的常规蒸发仪中，或者在旋转式离心浓缩器中)或者反渗透来从所得溶液中除去乙醇。
除去糖后，可应用上述步骤(d)中所述的程序调节产物浓度。
所得低糖提取物优选为含有初始基质中＜1％糖和＞95％生物活性成分的浓缩水溶液。
水果提取物
根据本发明第一个方面的方法制备的提取物代表具有出乎意料的预防血小板聚集功效的新型水果提取物。
因此，根据本发明的第二个方面，提供了根据本发明第一个方面的方法制得的能够抑制血小板聚集的水果提取物。
本发明第二个方面的提取物可用于治疗(特别是预防)其发生特征在于不适当血小板聚集的疾病状态。本发明人证明本发明的提取物特别可用于：
(a)预防或减少高凝状态(hypercoagulable state)或血栓前状态(prothrombotic state)状态的发生，例如通常与例如糖尿病、炎性肠病、高血脂相关的；
(b)预防或减少动脉粥样硬化的发生；
(c)预防冠状动脉疾病(例如心肌梗塞和中风并且预防患有心肌梗塞、中风或不稳定型心绞痛的患者中的进一步血栓-溶栓事件)的发生；
(d)预防血管成形术和旁路手术之后再狭窄的形成；
(e)治疗由血栓-溶栓疾病(比如心肌梗塞)与溶栓治疗相结合而引起的冠状动脉疾病；
(f)预防或减少深度静脉血栓的风险；
(g)有益于循环以维持良好的循环健康；
(h)维持心血管系统中的健康血流。
应当理解，本发明的提取物具有通过降低血小板聚集来维持心血管和心脏健康、有益于循环和/或使血流正常化或以其它方式有益于血流(例如在上述(g)和(h)中所述)的一般健康益处。
实际上提取物的这些用途是非常有利的，本发明进一步提供了根据本发明方法制得的水果提取物，其用作使患者血流正常化或以其它方式有益于血流的药物。本发明还提供了包含糖基化酚酸或酚酯或其衍生物、糖基化类黄酮、以及核苷的水果提取物，其用作使患者血流正常化或以其它方式有益于血流的药物。
包含本发明提取物的组合物可用作药物产品，并且还代表有益的功能性食品或“营养品”。因此，所述组合物的优选用途是用作药物和功能性食品或饮料(如下文所述)。
优选的本发明水果提取物是来自成熟的(即红色的)番茄的水性提取物并且是水溶性的。
本文所用的术语“水溶性”意指在室温下(例如在25℃)可溶解的番茄提取物。还发现所述提取物在非常低的温度下(例如在低至4℃的温度下)可溶于水。
所述提取物不包含或包含可忽略不计的浓度的番茄红素。例如，所述提取物包含小于0.5wt％(干重)的番茄红素，例如小于0.1wt％、或小于0.05wt％、或小于0.01wt％、或小于0.005wt％、或小于0.001wt％、或小于0.0005wt％、或小于0.0001wt％(干重)的番茄红素。
所述提取物基本上不含不溶于水的颗粒物质。因此，例如，它们包含小于0.5wt％(干重)的不溶于水的颗粒物质，例如小于0.1wt％、或小于0.05wt％、或小于0.01wt％、或小于0.005wt％、或小于0.001wt％、或小于0.0005wt％、或小于0.0001wt％(干重)的不溶于水的颗粒物质。在一个实施方案中，所述提取物不包含不溶于水的颗粒物质。
本文所用的术语“活性级分”指从番茄提取物中分离出来的能够降低血小板聚集的级分。
本发明人的研究(参见实施例1)证明可制得这样的水果提取物：其中多种生物活性剂被富集或维持在提取物中，其随后可用于预防或治疗特征在于不适当的血小板聚集的医学病症。开发了本发明第一个方面的方法以维持所述生物活性剂。本发明人已确定了根据本发明制备的提取物包含多种生物活性分子，其包括：
(A)本发明提取物中的生物活性酚类化合物
本发明人已证实，水果中包含多种基于酚及其衍生物的分子并且具有预防血小板聚集的功效(参见实施例1)。
已发现，尤其是肉桂酸及其衍生物可特别有效抑制血小板聚集。因此，设计本发明第一个方面的方法以保证提取物包含如式I所示的肉桂酸或其衍生物：
Figure BPA00001380758500111
在式I中，R1和R2和R3可独立地选自H、OH和Ome。
所述化合物可以是肉桂酸本身(其中式I的R1和R2和R3均为H)或者可以是许多衍生物成员之任一种，包括：
4-羟基肉桂酸(对香豆酸)
Figure BPA00001380758500112
3，4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)
Figure BPA00001380758500121
4-羟基-3-甲氧基肉桂酸(阿魏酸)
Figure BPA00001380758500122
4-羟基-3，5-二甲氧基肉桂酸(芥子酸)
Figure BPA00001380758500123
本发明人还鉴定了水果提取物中的另一类植物酚衍生物—苯甲酸及其衍生物，其也能有效抑制血小板聚集。因此，可调整本发明第一个方面的方法以保证所述提取物包含式II所示的苯甲酸或其衍生物：
Figure BPA00001380758500131
在式II中，R1和R2和R3如前文所定义。
因此，本发明第二个方面的优选提取物可包含苯甲酸本身(其中R1R2和R3中每一个均为H)或者是许多衍生物成员中的任何一种，例如：
4-羟基苯甲酸(对羟基苯甲酸)
Figure BPA00001380758500132
3，4-二羟基苯甲酸(原儿茶酸)
Figure BPA00001380758500133
3，4，5-三羟基苯甲酸(没食子酸)
4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(香草酸)
Figure BPA00001380758500142
4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲酸(丁香酸)
Figure BPA00001380758500143
在本发明人的有关水果提取物的工作中，他们出乎意料地发现，通过酯键在羧酸基团上与其它分子缀合形成羧酸酯或者通过醚键在酚羟基取代基上形成糖苷键的酚类生物活性剂特别有效地降低血小板聚集，并因此可用于治疗或预防多种心血管病症的发生。所以，设计本发明第一个方面的方法以保证所述提取物包含与其它分子缀合的酚类生物活性剂。
优选生物活性剂与糖缀合形成糖苷。本发明人发现所述提取物内包含多种不同的生物活性糖苷。因此，术语“糖苷”意指至少一个己糖或戊糖残基与生物活性剂缀合；优选将1-5个并且更优选1-3个单糖单元通过反应添加在所述生物活性化合物的OH基上。最优选将这些糖中的葡萄糖、半乳糖或阿拉伯糖以及二糖/三糖添加到所述化合物上形成酚酸衍生物糖苷。
或者，可将所述生物活性化合物与存在于植物中的多种化合物(例如酒石酸、奎宁酸)缀合形成酯。这些化合物可以是开链化合物例如酒石酸，或者杂环化合物例如奎宁酸，并且可由植物中的碳水化合物途径衍生而来。最优选将酒石酸或奎宁酸添加到化合物上形成酚酯衍生物。
优选本发明的方法使提取物富集包含例如选自以下的糖苷：咖啡酸3-O-糖苷、咖啡酸4-O-糖苷、阿魏酸4-O-糖苷、对香豆酸4-O-糖苷，或者选自包括以下的组的酯化衍生物：咖啡酰奎宁酸(例如3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸或5-O-咖啡酰奎宁酸)、阿魏酰奎宁酸、对香豆酰奎宁酸、咖啡酰酒石酸、阿魏酰酒石酸、对香豆酰酒石酸、奎宁酸衍生物二聚体。
因此，本发明第二个方面的提取物可包含香豆酸或选自其上述化合物的衍生物的至少一种糖苷，并且还可包含苯甲酸或其选自上述化合物的衍生物的至少一种糖苷。
(B)本发明提取物中的生物活性类黄酮化合物
本发明人还证实了最佳血小板聚集抑制作用是在还包含类黄酮或其衍生物的提取物中实现的。
所述提取物优选包含通式(III)的类黄酮：
Figure BPA00001380758500151
其中R5、R6和R7独立地是H、OH。
优选地，所述提取物包含下述类黄酮之一：
最优选所述提取物包含槲皮素或山奈酚或其衍生物。
本发明人还证实，与其它分子缀合的生物活性类黄酮特别有效地降低血小板聚集。因此，在本发明的一个最优选的实施方案中，所述提取物包含如上文所述缀合的(即与例如糖、酒石酸、奎宁酸等缀合)类黄酮化合物。
柚皮素及其衍生物代表着存在于本发明之第二方面的提取物中的另一类类黄酮，本发明人已发现其具有抑制血小板聚集活性。因此，所述提取物可包含通式IV的分子。
Figure BPA00001380758500171
R4、R8和R9如上文所定义。
包含在所述提取物中的通过式IV定义的优选化合物是柚皮素。
Figure BPA00001380758500172
本发明人还证实，与其它分子缀合的通式(IV)的化合物特别有效降低血小板聚集。因此，在本发明的一个最优选的实施方案中，所述提取物包含如上文所述缀合的(即与例如糖、酒石酸、奎宁酸等缀合)类黄酮化合物。
存在于本发明提取物中的一种最优选的糖基化类黄酮化合物是柚皮苷。
Figure BPA00001380758500181
本发明人发现，优选的提取物可包含彼此缀合的如上所述的酚类和类黄酮生物活性化合物。例如，咖啡酸4-O-芸香糖苷是具有抗血小板聚集性质的分子，其中在咖啡酸和芦丁(其包含槲皮素)的糖残基之间具有糖苷键。
(C)核苷/核苷酸
如WO 99/55350所设想，具有抗血小板活性的水果提取物还可包含核苷。所述提取物可包含选自腺苷5’-单磷酸、胞苷、尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷和鸟苷5’-单磷酸中的至少一种核苷。
应当意识到，本发明人已鉴定了番茄提取物的不同级分中的多种生物活性化合物。然后，他们能够调整制备水果提取物的方法，使得他们所鉴定的活性化合物保留和/或富集在该水果提取物中。
根据本发明的第三个方面，提供了一种水果提取物，其包含：
(a)糖基化酚酸或酚酯或其衍生物；
(b)糖基化类黄酮；以及
(c)核苷。
(a)所述糖基化酚酸优选是糖基化肉桂酸或其衍生物。所述提取物最优选包含咖啡酰-4-O-奎宁酸、咖啡酰-4-O-葡糖苷、香豆酰-4-O-糖苷(葡萄糖/半乳糖)或香豆酰-4-O-糖苷(二糖)中的至少一种。所述提取物可包含这些糖苷中的1、2、3种或每一种。在本发明的一个优选实施方案中，本发明第三个方面的水果提取物包含糖基化肉桂酸或其衍生物和苯甲酸或其衍生物，如上文所述。
最优选地，所述提取物包含咖啡酸葡糖苷；和/或对香豆酸己糖/二氢山奈酚己糖；和/或阿魏酸糖苷和/或对香豆酸衍生物。
(b)所述糖基化类黄酮优选是柚皮苷、槲皮素-3-O-葡糖苷或芦丁。所述提取物可包含这些糖苷中的一种、两种或每一种。所述生物活性剂最优选是芦丁。
(c)所述核苷可以是AMP、尿苷、腺苷、鸟苷或GMP中的任意之一。所述提取物可包含这些核苷中的1、2、3、4种或每一种。所述核苷优选是鸟苷和/或腺苷3’-单磷酸。
本发明第三个方面的水果提取物还可任选地包含类固醇糖苷，例如番茄碱。
所述水果提取物优选不含脂肪或类胡萝卜素。
发现两种优选的提取物(其可根据本发明的方法由水果尤其是番茄制得)含有特定浓度(mg/g)的下述生物活性化合物：
(1)根据实施例2所述的方法制得的优选提取物，其包含：
(a)下述糖基化酚酸或酚酯：
咖啡酸葡糖苷(0.01-1mg/g)；
对香豆酸己糖/二氢山奈酚己糖混合物(0.05-2.5mg/g)；
阿魏酸糖苷(0.025-5mg/g)；以及
对香豆酸衍生物(0.01-1mg/g)。
(b)糖基化类黄酮：芦丁(0.01-1mg/g)。
(c)下述核苷/核苷酸：
鸟苷(0.1-5mg/ml)；以及
腺苷3’-单磷酸(0.5-25mg/ml)。
(2)根据实施例3所述的方法制得的优选低糖提取物包含：
(a)下述糖基化酚酸或酚酯：
咖啡酸葡糖苷(1-25mg/g)；
对香豆酸己糖/二氢山奈酚己糖混合物(5-100mg/g)；
阿魏酸糖苷(25-300mg/g)；以及
对香豆酸衍生物(1-25mg/g)
(b)糖基化类黄酮：芦丁(1-25mg/g)
(c)下述核苷/核苷酸：
鸟苷(1-50mg/mg)；以及
腺苷3’-单磷酸(1-50mg/mg)。
表1给出了体现本发明第二或第三方面的两种具体番茄提取物。表1给出了经分离和测定(参见实施例1)并发现具有最大抗血小板活性的16种化合物(第3栏，在第2栏中还提供了编号)。因此，优选根据本发明第二或第三方面的提取物包含这16种生物活性化合物中的每一种。应当理解，优选将本发明第一个方面的方法设计成优化水果提取物中这些化合物的活性。
表1还给出了存在于分别根据实施例2和3所述的方法制得的提取物中每种生物活性化合物的范围(mg/g湿重)。还显示了平均浓度(mg/g)。根据本发明第二或第三方面的最优选提取物包含这些具体范围内的生物活性化合物。
表1：番茄提取物中的抗血小板聚集化合物，根据化合物类型分组
Figure BPA00001380758500211
在对包含在番茄提取物中的生物活性化合物进行详细分析后，本发明人得出这样的结论：另外的16种化合物也具有抗聚集活性。因此认识到根据本发明第二或第三方面的最优选提取物包含表2中所示的32种活性化合物。
表2：包含32种生物活性化合物的最优选提取物
Figure BPA00001380758500221
Figure BPA00001380758500231
根据本发明第三方面的优选提取物包含实施例1中所述级分1、级分2和级分3的重新组合(1.1.3)来形成重组提取物。本发明人发现这样的重组提取物富集上文所述的生物活性剂并且具有出乎意料地提高的抑制血小板聚集的功效。
含有所述水果提取物的药物制剂和营养制剂
本发明的水果提取物可配制成口服施用。因此，可将它们配制成例如溶液、混悬剂、糖浆、片剂、胶囊、锭剂和零食(snack bars)、插入剂(inserts)和贴剂。这些制剂可根据本领域众所周知的方法制得。
例如，所述提取物可配制成糖浆或用于口服施用的其它溶液，例如作为保健饮料。可将选自糖、维生素、调味剂、着色剂、防腐剂和增稠剂的一种或多种赋形剂添加到所述糖浆或溶液中。可添加张力调节剂例如氯化钠或糖以提供特定渗透强度的溶液，例如等张溶液。还可以使用一种或多种pH调节剂(例如缓冲剂)来调节pH至特定值，并优选将其维持在该值。缓冲剂的实例包括柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。
或者，可将所述提取物干燥(例如通过喷雾干燥或冷冻干燥)并将干燥产物配制成固体或半固体剂型，例如片剂、锭剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂或凝胶。
可在不需要任何其它成分的情形下制备包含所述提取物的组合物。或者，它们可通过将其吸附到固体载体上来制备；所述载体例如为糖，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖；或者糖醇，例如木糖醇、山梨醇或甘露醇；或者纤维素衍生物。其它特别有用的吸附剂包括基于淀粉的吸附剂，例如谷物粉，如小麦粉和玉米粉。
对片剂而言，通常可将所述提取物与稀释剂(例如糖，如蔗糖和乳糖)、以及糖醇(例如木糖醇、山梨醇和甘露醇)或者改性纤维素或纤维素衍生物(例如粉末纤维素或微晶纤维素或羧甲基纤维素)相混合。所述片剂通常还将包含选自造粒剂、粘合剂、润滑剂和崩解剂中的一种或多种赋形剂。崩解剂的实例包括淀粉和淀粉衍生物，以及其它可膨胀聚合物，例如交联聚合物崩解剂，如交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和羟乙酸淀粉。润滑剂的实例包括硬脂酸盐，例如硬脂酸镁和硬脂酸。粘合剂和造粒剂的实例包括聚乙烯吡咯烷酮。在稀释剂本身不是非常甜的情形下，可添加甜味剂，例如甘草酸铵或人造甜味剂如阿巴斯甜或糖精钠。
还可将所述提取物配制成用于掺入胶囊中的粉末、颗粒或半固体。当以粉末形式使用时，所述提取物可与上文所述的任何一种或更多种与片剂有关的赋形剂一起配制，或者可以未稀释形式存在。对于半固体形式存在而言，可将所述干提取物溶解或混悬于粘性液体或半固体载体(例如聚乙二醇)或者液体载体例如二醇如丙二醇或者甘油或者植物油或者鱼油，例如选自橄榄油、向日葵油、红花油、月见草油、大豆油、鱼肝油、鲱鱼油等的油。可将这样的提取物填充到硬明胶型胶囊或软明胶型胶囊或者由硬或软明胶等价物制得的胶囊中，对于粘性液体或半固体填充物而言，软明胶胶囊或软明胶等价物胶囊是优选的。
本发明提取物还可以以用于掺入快餐零食(snack food bars)中的粉末形式提供，例如水果条、坚果条和谷物条。对于以快餐零食形式存在而言，所述提取物可与选自下述的任何一种或多种成分混合：干水果例如晒干的番茄、葡萄干和无籽小葡萄干，落花生或谷物例如燕麦和小麦。
本发明的提取物还可以以用于重新构建为溶液之粉末的形式提供。因此，它们还可包含可溶性赋形剂比如糖、缓冲剂比如柠檬酸盐和磷酸盐缓冲剂，以及由碳酸盐例如碳酸氢盐(如碳酸氢钠或碳酸氢铵)与固体酸(比如柠檬酸或酸式柠檬酸盐)形成的泡腾剂。
在一个优选的实施方案中，本发明的提取物以用于掺入胶囊(例如硬明胶胶囊)中的粉末形式提供，并任选地与优选的固体(例如粉末化)赋形剂一起提供。
本发明的固体或半固体剂型可包含高达约1000mg的所述组合物，例如高达约800mg。
所述提取物可以作为食品增补剂或食品添加剂存在，或者可被掺入食品(例如功能食品或营养品)中。
本发明的提取物可以包含规定浓度的具有抑制血小板聚集活性之化合物的单位剂型的形式存在。可对这样的单位剂型进行选择以便达到所期望水平的生物活性。例如，单位剂型可包含高达1000mg(干重)量的本发明组合物，更典型地高达800mg，例如50mg-800mg，例如100mg-500mg。可包含在单位剂型中的组合物的具体量可选自50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg和800mg。
本发明的提取物可与使用说明一起包含在容器、包装或分配器中。
含有本发明提取物的优选产品如实施例5中所述。
剂量
对于所关注疾病和病症的治疗而言，每天施用给患者的本发明提取物的量将取决于所治疗的具体病症或疾病以及其严重程度，并且最终将由医生酌情决定。然而，所施用的量通常是有效治疗目标病症的无毒量。
对于含糖的组合物而言，根据本发明方法制得的水果提取物的推荐日剂量为0.5g至20g，更优选2g至7g。日剂量可为约3g。对于低糖组合物(参见上文)而言，推荐日剂量可为10mg至500mg，更优选约85mg至约150mg。
患有心血管疾病的人患者的典型日剂量方案可为约70mg至285mg、优选约25mg至100mg含水果糖的提取物/kg体重，并且可为约1mg至2.25mg100mg低糖提取物/kg体重。
所述提取物可每天以单剂量单位或多剂量单位施用，例如每日1-4次，优选每天1-2次。最优选以每日单剂量施用所述提取物。
所述提取物可以番茄汁或其浓缩物形式单独施用或者与其它果汁(例如橙汁)混合施用。
治疗效果的指标
可参照多个不同参数来评价含有本发明提取物之组合物提供有益治疗效果的能力。下述实施例提供了用于评价血小板聚集或初期止血(primary haemostasis)的合适方案的细节，可针对血小板聚集或初期止血任一项进行研究以评价治疗效果。实施例中所述的PFA-100
Figure BPA00001380758500261
血小板功能分析仪是用于评价初期止血的相对新型的仪器，但是已经得到了充分验证(参见例如″The platelet-function analyzer(PFA-100
Figure BPA00001380758500262
)forevaluating primary hemostasis”by M.Franchini Hematology，第10卷，第3期，2005年6月，第177-181页)。
可针对此目的进行评价的其它参数包括血液流动性和血流，其中流动性或血流的增加通常是治疗有效的指示。
测量血液流动性的方法
可利用微通道阵列流动分析仪(MC-FAN)直接测量血液流动性，例如利用可购自Arkray的MC-FAN HR300(其模拟毛细血管)。
MC-FAN的合适方案提供于“Determinants of the daily rhythm ofblood fluidity”，作者为Tatsushi Kimura，Tsutomu Inamizu，KiyokazuSekikawa，Masayuki Kakehashi和Kiyoshi Onari(Journal of CircadianRhythms 2009，7：7)。
简而言之，例如通过在单晶硅芯片表面上进行光制成形(photo-fabrication)来形成宽7μm、长30μm、深4.5μm的微槽。合适的芯片尺寸可为约15×15mm。然后再将微槽制备成代表毛细血管的防漏微通道。这种向通道的转化可例如通过用覆盖物(例如光学玻璃平板)紧密覆盖所述通道来实现。合适的槽可通过焊接光学抛光玻璃板而转化成密封的微通道。
微通道的尺寸应使得流过一个流路的流体体积非常小。因此，复制流动通道以方便测量流速是理想的。上文引用的文献描述了设备的制备，其中制备相同大小的8736个流路。然后将硅基底固定到微通道流系统MC-FAN(Hitachi Haramachi Electronics Co.，Ltd，Ibaragi，日本)上，其使得可在与图像显示单元相连的显微镜下直接观察血细胞元件流经微通道。可连续观察流动，并同时自动测定给定体积血液的通过时间。
合适的血液通过体积可表示为在20cm H2O的压力下实际全血通过时间比上盐水溶液通过时间乘以12秒的函数，如下：
Figure BPA00001380758500271
测量血流的方法
多普勒超声血流仪是广泛用于评价体内血流通过完整血管的方法。使用多普勒超声的合适方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括“Measurement of blood flow by ultrasound：accuracy and sources oferror.”By R.W.Gill(Ultrasound Med Biol.1985 Jul-Aug；11(4)：625-41)中所述的那些方法。
附图说明
下面将通过下述实施例(但不限于这些实施例)并参照附图来举例说明本发明，其中：
图1表示下述化合物产生的聚集抑制％对抑制剂溶液浓度的剂量响应曲线的实例：(a)化合物1；(b)化合物5；(c)化合物9；(d)化合物18；(e)化合物23；和(f)化合物30，如实施例1中所述。(a)和(b)表示ADP介导的聚集的抑制％的剂量响应曲线。(c)和(d)表示胶原介导的聚集的抑制％的剂量响应曲线。(e)和(f)表示花生四烯酸介导的聚集的抑制％的剂量响应曲线。
图2定义了根据本发明第一个方面的制备水果提取物的优选方法，如实施例2所述。
图3是利用实施例2中所述方法制得的浆的HPLC色谱图。将生物活性化合物在色谱图上进行了编号。
图4定义了根据本发明第一个方面的制备低糖水果提取物的优选方法，如实施例3所述。
图5是利用实施例3中所述方法制得的浆的HPLC色谱图。将生物活性化合物在色谱图上进行了编号。
图6是摄取番茄提取物(TE)或对照(C)补充剂后3小时，响应于不同血小板激动剂的基线聚集变化％，如实施例4所述。所用的血小板激动剂是二磷酸腺苷(ADP)7.5μmol/L和3μmol/L，以及胶原5mg/L和3mg/L。TE和C补充剂之间的显著性差异示于图中(P＜0.001)。对所有检测而言N＝9。
图7显示在基线(0)、补充TE或C后t＝3小时(3)和补充TE或C后t＝5小时(5)时所记录的平均闭合时间，如实施例6所述。对每一组n＝3。C和TE之间的显著性差异通过*示于图中(P＝0.011)。
实施例1
本发明是基于针对WO 99/55350中所述水果提取物鉴定的抗血小板活性进行的进一步研究。
本发明人进行了大量实验，由此他们将番茄提取物进一步分级，以鉴定该提取物中与其血小板聚集抑制作用有关的化合物。本发明人鉴定了所述水果提取物中许多对血小板聚集没有作用或者作用可忽略不计的为数众多的化合物(不都是化学方法鉴定的；并且并非所有数据均提供在本文中)。然而，本发明人出乎意料地发现，32种具有显著活性的化合物属于本发明第三方面所定义的化学类别。这一发现导致他们开发了本发明第一方面的方法，以使这些化合物的活性可维持/富集在水果提取物中。
1.1方法
1.1.1 WO 99/55350中所述番茄提取物的制备
利用可商购的褐变指数(浓度为12.5g可溶性固体/L的溶液在420nm处的吸光度)＜0.350AU的白利度(Brix)为28-30°(即28-30％的固体，w/w)冷破碎番茄浆作为原材料制备了番茄提取物。将所述浆用超纯水稀释(1∶5)，并通过离心过滤除去大的颗粒物质，然后在室温下利用Westfalia MSB-14分离器(离心盘澄清器)澄清。然后在不超过45℃的温度下通过微滤除去较小的颗粒物质，得到澄清的不含不溶性可沉降(spin-down)固体并能够通过0.2μm滤器而不损失可溶性固体的淡黄色溶液。在小心控制的条件下和不超过50℃的温度下通过蒸发将该溶液浓缩成65°白利度的浆，以限制非酶促褐变反应。在蒸发步骤开始时引入快速巴氏消毒步骤(T＝105℃，3秒)。最终产物表征为褐变指数＜0.600AU和微生物总平板计数＜1000。
1.1.2含目的活性化合物的番茄提取物的富集和无活性物质的去除
为了得到含有更浓生物活性成分的原材料，如下文所述除去产物中的糖。
制备含FPX66树脂(Rohm and Haas)的130L树脂柱并在4℃下于超纯水中平衡。用超纯水将1.1.1中所述物质稀释至约8白利度，并以约260L/分钟的流速通过所述树脂柱，温度维持在4℃。弃去柱滤过液。一旦所需的所有物质均通过柱，则使约130L的冲洗水通过柱并将其弃去。其后，通过以下步骤将已保留在树脂上的化合物洗脱：先使130L热水(75℃)通过柱，然后使130L 80％乙醇通过柱，然后将另外130L热水通过柱。保留所有的洗脱材料并合并，得到约400L含目的化合物的约25％乙醇溶液。
在约30℃的温度下利用Trisep ACM5膜通过反渗透将含目的化合物的稀溶液浓缩。乙醇/水溶剂通过该膜，而溶解在其中的所有化合物则保留在膜内。一旦将所述稀溶液浓缩10倍，即将体积减少至40-50L，则开始渗滤，在此过程中以与滤过液去除速率相同的速率将超纯水加入到截留物中。这样，溶液的乙醇浓度将从25％逐渐减少至＜5％。
然后利用Anhydro喷雾干燥器对含约15-20％固体的乙醇溶液喷雾干燥，得到水含量＜6％的金色细粉末。这是最终的经富集番茄提取物，其用于分离目的抗血小板成分。
1.1.3番茄提取物中各生物活性化合物的分离和表征
通过将1.1.2中所述的干燥粉末溶解在超纯HPLC级水中制备50mg/mL储备溶液。利用Luna C18(2)5μ半制备柱(100×4.6mm)进行半制备HPLC，一次将100μL注射到所述柱上。利用级分收集器，将番茄提取物中所含的UV吸收成分分成3个大级分。级分1主要包含核苷和核苷酸。级分2主要包含酚酸糖苷/酯以及酚酸。级分3主要包含类黄酮糖苷和类黄酮。将所述3个大级分通过冷冻干燥来干燥，并重新溶解在水中得到50mg/mL的溶液。然后依次对每个级分进一步进行半制备HPLC，其中利用相同的柱，但是根据每个级分的极性和洗脱特征采用不同梯度。利用级分收集器从每个大级分收集多达10种单一或混合级分。
将各级分冷冻干燥并重新溶解在1mL纯水中。然后通过分析性HPLC-MS来检测每个级分，利用Luna C18(2)3μ分析柱(100×4.6mm)，运行乙腈/甲酸梯度。通过以二极管阵列检测器收集其UV光谱并通过阳离子模式电喷雾MS检测所产生特征性离子来测定每个分离级分的特征。
必要时，通过进一步HPLC进行最终纯化(例如，以除去微量杂质)。将最终纯化的化合物冷冻干燥并冷冻储存。制备50mg/mL的储备溶液并在HPLC缓冲液中稀释得到6个浓度水平，其用于对HPLC法进行校正，从而可计算出每个单一化合物的响应因子。然后将这些校正曲线和响应因子用于定量番茄提取物中存在的化合物。所分离的生物活性化合物的结构类型/身份如表3所示。
1.1.4测定抑制血小板聚集之活性的方法
设计下文所述实验方案用于测定1.1.3中所分离化合物的IC50值。对一些粗提取物进行了粗略生物测定来评价体外血小板聚集抑制作用(数据未显示)，以帮助选择通过HPLC鉴定的精细级分/化合物进行功能测定。这种方法被认为是为避免需要测定水果提取物中每一种化合物(将是数千种)所需的。
IC50值表示与对照样品相比，在标准条件下在1mL富血小板血浆中诱导50％血小板聚集抑制所需的化合物的量(以mg计)。
32种活性最强的化合物的活性示于表4中。
静脉采血和血液样品
从年龄18-60岁、具有正常血小板功能、未服用药物的健康人志愿者(包括男性和女性)采集了用于体外研究的血液。受试者声明他们在提供血液样品之前最少10天没有服用过药物或已知影响血小板功能的补充剂。通过硅化针头单次静脉穿刺到肘前静脉内将血液采集至柠檬酸化的塑料血液采集管(Sarstedt Monovettes，柠檬酸钠最终浓度13mmol/L)。从采血时间起所有血液保存在37℃。
富血小板血浆的制备
富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是通过将柠檬酸化血液在200×g下离心15分钟来获得的，并在使用前用贫血小板血浆调节至320±20×109/L标准血小板数。PRP用于2小时内的血小板功能测定。
血小板激动剂
下述激动剂用于血小板功能测定。二磷酸腺苷(ADP)，最终浓度为10μmol/L；胶原，最终浓度为5mg/L；花生四烯酸，最终浓度为500U/L(均来自Helena Biosciences，Sunderland，UK)；凝血酶受体激活肽(TRAP)，最终浓度为25nmol/L(Sigma-Aldrich，Poole，UK)。在使用之前立即将储备溶液稀释至温热生理盐水(0.9％NaCl)中来配制激动剂。
血小板抑制剂溶液的制备
在生理盐水、超纯甲醇或超纯DMSO(Sigma-Aldrich，Poole，UK)中配制500g/L至100g/L浓度的单一血小板抑制剂，并冷冻储存备用。然后在临用前用生理盐水稀释储备溶液。
将血小板抑制剂与PRP一起孵育
将450μL PRP与50μL经稀释的抑制剂溶液在低保留epindorrf管中在37℃下一起孵育10分钟。稀释抑制剂溶液使得甲醇或DMSO在PRP样品中的最终浓度始终不超过2％。同时孵育与甲醇或DMSO含量匹配的含有50μL生理盐水的合适对照样品。就每个抑制剂化合物而言，使用5个孵育浓度；最终浓度0.05mg/mL、0.10mg/mL、1.00mg/mL、5.00mg/mL和10mg/mL作为标准。
血小板聚集和聚集抑制的测定
在与血小板抑制剂一起孵育后，将PRP样品转移到玻璃比色皿中，并在血小板聚集仪(PACKS 4，Helena Biosciences，Sunderland，UK)上监测由ADP、胶原、TRAP或花生四烯酸诱导的聚集程度10分钟。与每个样品组一起运行对照样品。由生成的聚集曲线计算每个PRP样品的曲线下面积，并通过比较这些PRP样品与对照样品的曲线下面积来计算每个抑制剂浓度所实现的聚集抑制。聚集抑制表示为相对于对照而言的抑制百分数(％)，并由每个抑制剂化合物获得的6个数据点生成剂量响应曲线。然后使用该曲线来预测该抑制剂化合物的IC50值，如1.2、结果和图1中所示。
对于所获得的每个血液样品而言，可针对2种不同抑制性化合物生成6点剂量响应曲线。重复进行这些实验，以使得对于每一种抑制性化合物而言，在不同天获得了至少3个(通常最多7-10个)不同IC50值(这适用于每种目的激动剂)。然后取不同IC50的平均值并在1.2、结果、表4中引述这些值。
1.2结果
发现具有最强抗血小板活性的32种化合物的物理化学特性(参见下文)总结在表3中。
表3：水果提取物中鉴定的生物活性化合物的物理化学性质
Figure BPA00001380758500331
表4提供了番茄提取物中所鉴定的32种化合物的IC50数据(抑制血小板聚集)。如方法1.1.4中所述测定活性。图1提供了对ADP介导聚集的抑制％对比由以下物质产生的抑制剂溶液浓度的剂量响应曲线的实施例：(a)核苷(胞苷)；(b)核苷酸(腺苷3’-单磷酸)；(c)酚酸糖苷(咖啡酸葡糖苷)；(d)酚酸(咖啡酸)；(e)类黄酮糖苷(槲皮素-3-O-糖苷)；以及(f)类黄酮(槲皮素)。
表4：水果提取物中鉴定的化合物的抗血小板聚集活性
1.3结论
本发明人测试了番茄提取物中存在的许多化合物并且确认表2和3中所鉴定的32种化合物具有预防血小板聚集的功效。此外，他们得出结论，在所分离出的显示具有抗聚集能力的32种化合物中，16种化合物对总生物活性最重要。这16种化合物显示在表1中。
特别地，他们出乎意料地发现，所述生物活性化合物可分为(a)酚类化合物(及其酯和糖苷衍生物)；(b)类黄酮(及其酯和糖苷衍生物)；和(c)核苷酸/核苷。这导致他们认识到存在两类新的具有血小板聚集抑制作用的化合物(酚类和类黄酮)。
在这些化合物中，抗聚集作用最强的非酚类化合物是AMP。用糖和磷酸根残基对核苷进行修饰具有显著提高抗聚集能力的作用。这是出乎意料的，因为早期的工作已确认胞苷和腺苷是抗血小板成分，而核苷酸则不是。
在所鉴定的酚酸衍生的化合物中，总体抗聚集作用最强的是对香豆酸和咖啡酸的糖基化形式。与非糖基化的游离酸相比，这些糖基化化合物响应于所测试的所有激动剂表现出显著更高的抗聚集潜力。这是首次报道这种构效关系。因此，糖基化酚类化合物代表可包含在本发明提取物中并且应当维持/富集在根据本发明第一个方面的方法制得的提取物中的最优选生物活性分子。
用类黄酮衍生物得到了相似的结果。与类黄酮苷元相比，槲皮素和柚皮素的糖苷或其它缀合衍生物具有显著更强的抗聚集作用。就对TRAP和花生四烯酸激动剂的响应而言，这是特别显著的，但是也适用于ADP和胶原激动剂。虽然文献中已经报道了有关游离类黄酮苷元的结构-功能的(非常有限的)研究，但作者并未认识到将苷元与缀合分子进行比较的任何研究。因此，糖基化类黄酮化合物也代表可包含在本发明提取物中并且应当维持/富集在根据本发明第一个方面的方法制得的提取物中的最优选生物活性分子。
有趣的是，注意到当AMP与腺苷的比值减小时所述提取物的总生物活性降低。同样发现，当酚酸糖苷/酯与游离酚酸的比值减小时以及当类黄酮糖苷与游离类黄酮的比值减小时，所述提取物的总生物活性降低。
值得注意的是，制备本发明第三个方面的水果提取物的简单方法公开于1.1.3中。可对根据WO 99/55350中所述方法制得的提取物进行分级，来分离出经鉴定具有抗血小板活性的三个级分。级分1主要包含核苷和核苷酸。级分2主要包含酚酸糖苷/酯以及酚酸。级分3主要包含类黄酮糖苷和类黄酮。然后可将这3个级分重组(级分1+2+3)，以得到具有出乎意料功效的本发明第三个方面的提取物。
实施例2
考虑到已获得的关于番茄提取物中活性化合物的知识，本发明人继续开发了处理水果的方法，以制备其中化合物活性被维持和/或其中这些活性化合物浓度被富集的提取物。
在大量实验之后，本发明人确立了本发明第一个方面的方法对于制备富集实施例1中所述多种活性化合物的提取物而言是最佳的。
在确立了该方法后，本发明人继续开发了可用于工业化规模的本发明方法，以制备可用于制备药物或食品(饮料或食料)的浆。
制备所述浆的方法图示于图2中并且代表本发明第一个方面的一个优选实施方案。
根据图2方法制备的浆代表根据本发明第二个或第三个方面的一种最优选提取物并且具有表2(参见上文)以及表5中所述的特性。
表5：根据本发明第二个或第三个方面的一种最优选番茄提取物的组合物
Figure BPA00001380758500371
所述浆可包含高达70％干物质的简单糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)并且可包含高达50％的水。
利用此方法制备的最优选浆包含多达32种生物活性成分，其按照图3中所示HPLC色谱进行编号并对应于表1-4中所鉴定的编号化合物，如实施例1所述。
这些浆的对优化其生物活性特征重要的一些其它特征如表6(下文)所示。化合物编号参考图3中所示的色谱图和表1-4中所鉴定的化合物。
表6
  化合物编号   描述
  化合物2-6   ＞2.00mg/g
  化合物8   ＞0.05mg/g
  化合物9   ＞0.07mg/g
  化合物10   ＞0.03mg/g
  化合物11   ＞0.30mg/g
  化合物12   ＞0.20mg/g
  化合物13   ＞0.16mg/g
  化合物14   ＞0.13mg/g
  化合物15   ＞0.10mg/g
  化合物23   ＞0.05mg/g
  化合物25   ＞0.16mg/g
  化合物26   ＞0.74mg/g
  化合物27   ＞0.60mg/g
  化合物18，19和21   ＜1.50mg/g
  化合物5：化合物2的比例   ＞3.0
  谷氨酰胺   ＞8.00mg/g
  糠醛衍生物   ＜0.15mg/g
本发明人认识到，当优化本发明提取物的抗血小板活性时，表6中所列出的特征是重要的。根据本发明第二个或第三个方面的最优选提取物具有这些特性。此外，在本发明第一个方面的方法的最优选实施方案中，这些特征可用作质量控制的度量。因此，当以工业化规模生产提取物时，这些特征是尤其有用的控制点。
实施例3
本发明人还开发了可用于本发明制备粉末形式低糖水果提取物的方法的工业化规模的方法。所述粉末也可用于生产药物或食品(饮料或食料)。
制备所述粉末的方法图示于图4中并且代表本发明第一个方面的一个优选实施方案。
根据图4方法制备的提取物还代表第二个或第三个方面的优选提取物。
根据图4方法制备的提取物代表根据本发明第二个或第三个方面的优选提取物并且具有表2(参见上文)和表7中所述的性质。
表7：根据本发明第二个或第三个方面制备的最优选低糖番茄提取物的组合物
Figure BPA00001380758500401
Figure BPA00001380758500411
所述粉末可包含少于1％干物质的简单糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)并且可包含＜6％的水。富集的粉末提取物通常包含高达60％的生物活性化合物。
利用此方法制备的提取物还包含高达33种不同生物活性成分，其按照图5中所示HPLC色谱图进行编号并对应于表1-4中所鉴定的编号化合物，如实施例1所述。
这些粉末的对优化其生物活性特征重要的一些其它特征如表8所示。化合物编号参考图5中所示的色谱图和表1-4。
表8：
  化合物编号   描述
  化合物2-6   ＞15.20mg/g
  化合物8   ＞9.40mg/g
  化合物9   ＞3.70mg/g
  化合物10   ＞0.70mg/g
  化合物11   ＞26.10mg/g
  化合物12   ＞90.80mg/g
  化合物13   ＞85.30mg/g
  化合物14   ＞18.30mg/g
  化合物15   ＞8.60mg/g
  化合物23   ＞8.50mg/g
  化合物25   ＞14.70mg/g
  化合物26   ＞38.00mg/g
  化合物27   ＞50.70mg/g
  化合物18、19和21   ＜38.00mg/g
  化合物1：化合物3的比值   ＞3.0
  谷氨酰胺   ＞52.00mg/g
  糠醛衍生物   ＜0.50mg/g
本发明人认识到，当优化本发明提取物的抗血小板活性时，表8中所列举的特征是重要的。根据本发明第二个或第三个方面的最优选提取物具有这些特性。此外，在本发明第一个方面的方法的最优选实施方案中，这些特征可用作质量控制的度量。因此，当以工业化规模生产提取物时，这些特征是尤其有用的控制点。
实施例4
在下面的实施例中，描述了检测根据实施例2所述方法制得的组合物的抗血小板功效的实验。应当理解，可按照相同方案检测根据实施例3所述方法制得的组合物。
4.1研究方案
4.1.1研究目的和简述
本研究定量研究与对照补充剂相比摄取含有3g番茄提取物浆(根据实施例2所述方法制得)的治疗性饮料对健康受试者的离体抗血小板作用。
4.1.2研究设计
采用单盲研究设计。给禁食受试者插管并在07:00至08:00之间取基线样品。采集基线样品后直接让受试者摄取治疗剂(TE)或对照补充剂。然后在时间t＝3小时时由插管抽取进一步的血液样品。在采样时间点之间给受试者提供少量(25mL)水以避免脱水。
4.1.3受试者
招募两种性别的9名健康成年人参加该研究。受试者年龄为40-65岁，无严重疾病或止血病症的医学史。通过饮食和生活方式问卷和医学筛查评价纳入该研究的适用性，在此期间获得全血计数。低止血计数的个体不被纳入该研究中。在参加该研究之前最少一个月的时间段内，习惯性摄取膳食补充剂(例如鱼油、月见草油)的任何受试者均停止摄取这些补充剂。指导受试者在参加之前10天时间内避免服用已知影响血小板功能的药物。获得了所有受试者的书面知情同意，并且本研究获得了Grampian研究伦理委员会的批准。
4.1.4静脉采血
利用硅化21号蝴蝶型针头给招募参加本研究的受试者插管，以便在对静脉造成最小损伤的情况下采集多个血液样品。为了最小程度地活化止血系统，最多指定3次静脉穿刺。所述插管在整个研究期间保持原位，并且在每个采样时间点抽取约30mL静脉血液样品，每次弃去最初的2mL。在采集血液样品后，用生理盐水冲洗插管以防止阻塞。为了测定血小板功能和凝血时间，将血液采集到塑料注射器中并转移到柠檬酸化血液采集管中(柠檬酸钠最终浓度为13mmol/L)。为测定C-反应蛋白(CRP)，取单个基线血液样品(5mL)加到EDTA抗凝剂(最终浓度1.6g/L)中。为测定每个时间点的纤维蛋白肽A，将4.5mL血液采集到0.5mL含EDTA、抑肽酶(trasylol)和氯甲基酮的混合抗凝剂中。将血液样品在37℃下在手提式培养箱中孵育，以转移到实验室。弃去表现出活化迹象(定义为纤维蛋白肽A浓度高于6μg/L)的任何血液样品。表现出炎性反应升高迹象(以基线C-反应蛋白浓度高于6mg/L为标志)的任何志愿者均在受影响的期间退出该研究，并且在较晚的时间进行预定的介入。
4.1.5离体血小板聚集研究
在每个时间点测定富血小板血浆中ADP和胶原诱导的血小板聚集的程度。不同激动剂浓度可用于模拟不同的生理条件。为了收集非最佳血小板刺激条件下的数据，将标准化的低浓度(ADP为3μmol/L，胶原为3mg/L)定义为非最佳，而标准化的高浓度(ADP为7.5μmol/L，胶原为5mg/L)定义为最佳。这些激动剂浓度用于所有测定。治疗或对照介入后所观察到的对血小板聚集的作用表示为摄取提取物/安慰剂之后与基线值相比的聚集曲线下面积的百分数变化。
4.1.6补充测定
利用半定量乳汁凝聚测试(Dade Behring，UK，其在血浆中的检测水平＞6mg/L)检测高血浆CRP。该阈值用作急性炎性系统活化的指征，例如可能与感染(例如病毒感染或感冒的发作)或损伤(例如跟腱炎)相关的急性炎性系统活化。表现出这种急性活化的样品不应当用于血小板功能研究。
通过ELISA(Zymutest FPA测定，HyphenBioMed，France)检测已经通过膨润土吸附处理除去纤维蛋白原的血浆中的FPA。血浆中FPA存在水平大于6μg/L作为在采血过程中止血系统活化的标志。这样的样品不应当用于血小板功能检测，因为所获得的结果将不可靠。因此，循环CRP水平和血液样品FPA水平用于指示用于血小板检测的样品的适用性。
4.2结果
在本研究过程中所采集的血液样品没有表现出循环CRP水平高于阈值6mg/L，表明在研究取样期间任何受试者均不存在急性期活化。同样，在本研究所采集的血液样品中，没有样品表现出FPA水平高于阈值6μg/L。因此，判断所收到的所有血液样品均适用于血小板功能研究。未纳入该筛查数据。
图6中所示数据举例说明了在基线(t＝0)和摄取治疗补充剂后3小时(t＝3)的血小板聚集测定值。结果表示为与基线值相比的血小板聚集抑制％。
4.3结论
图6表明，与基线血小板聚集相比，本发明的番茄提取物在施用后3小时使ADP介导的聚集降低18％至28％，而使胶原介导的聚集降低3％至12％。与基线血小板聚集相比，摄取对照补充剂3小时后使ADP介导的聚集变化2％至4％，而使胶原介导的聚集变化约2％。就对照补充剂而言，基线与3小时时间点之间无显著性差异，而就补充番茄提取物而言，基线与3小时时间点之间具有显著性差异，P＜0.001。对照和番茄提取物补充剂之间也具有显著性差异，P＜0.001。
这些结果清楚地证实了本发明的番茄提取物可用于治疗以不适当血小板聚集为特征的病症。
此外，本发明人还已经确定了本发明的方法可制备与已知番茄提取物(例如WO 99/55350中所述的那些番茄提取物)相比具有改进特性的新番茄提取物。本发明人比较了在食用通过已知处理方法制备的番茄提取物和利用本发明方法制备的旨在保持糖苷和酯的番茄提取物之后测量的离体抗血小板活性。他们发现，与基线相比，单次剂量的3g本发明番茄提取物使3μmol/L ADP介导的血小板聚集抑制百分率为28％，而已知的提取物只有摄取9g提取物才实现使ADP介导的血小板聚集抑制百分率为约25％。因此，本发明的方法看来使获取物的活性剂富集了约3倍。因此，使用本发明第一个方面的方法可得到更高效的提取物，并且有利地可降低所需的日剂量。
实施例5
本发明人制备了多种代表包含本发明提取物之优选制剂的产品。
含有番茄提取物的酸奶饮料
根据实施例2和3所述制备的番茄提取物均适用于掺入到酸奶饮料中。这样的饮料的实例可如下文所述进行制备。
配制的不含活益生菌培养物的酸奶饮品应当预先进行巴氏灭菌并冷却至4-8℃。冷却的酸奶应当与实施例2中制备的番茄提取物以50∶1的比例混合，或者与实施例3中制备的番茄提取物以1000∶1的比例混合(w/w)。需要检查酸性并用柠檬酸调节酸性，并应当调整风味。如果最终产品中需要益生菌培养物，则应当在调整之后添加益生菌培养物，并且最终混合物应当包装到单次使用式(single-serve)150g瓶中。
这样，每个单次使用式150g瓶应当包含3g根据实施例2制备的番茄提取物或者150mg根据实施例3制备的番茄提取物。这代表单日剂量。就其推荐货架期(通常14至21天)而言，最终产品应当储存在4℃。
含有番茄提取物的涂脂(fat spread)
根据实施例3所述制备或者进一步加工成胶囊(encapsulate)的番茄提取物适于掺入到涂脂中。所述制剂的一个实例可通过巴氏灭菌后以200∶1(w/w)的比例将粉末化低糖番茄提取物加入到预配制的、经巴氏灭菌并冷却的涂脂中而制得。应当将所述混合物以高剪切力均质化以保证均匀分布，并包装到多次使用式(multi-serve)容器中。
标签文本应当包含涂脂的正常日摄入量应当为约30g的信息。每日摄食30g涂脂将导致每日摄入约150mg番茄提取物，这构成单日剂量。就其货架期的持续时间(通常为90天)而言，所述涂脂应当储存在4℃。
含有番茄提取物的基于果汁的饮料
如实施例2和3所述制备的番茄提取物均适于掺入到基于果汁的饮料中。这样的饮料的实例可根据下文所述制得。
用水以1∶5.4的比例稀释橙汁浓缩物。向所述重新构建的果汁中添加0.1％葡萄汁调味剂、0.05％菠萝调味剂和1.2％如实施例2中制备的番茄提取物。测定酸度和甜度，并在需要时添加高达5％的柠檬酸(酸度调节剂)和高达2％蔗糖。在121℃巴氏灭菌90秒。
将经巴氏灭菌的混合物包装在1L纸盒或单次使用式纸盒或瓶中。250mL如上文所述的最终饮料应当包含约3g番茄提取物，相当于单日剂量。标签详文应当包含此信息以及每日饮用250mL的建议。
其它的果汁浓缩物同样适于使用；或者，可制备新鲜果汁、果汁和蔬菜汁的混合物或者含有不等量果泥的混合物。
胶囊
制备根据实施例3所述制得的粉末化低糖番茄提取物的50％w/w溶液。将温度升至60℃。与等体积的以下任一项混合：高熔点脂肪(例如甘油三酯)的熔融和乳化混合物；经分散的多糖(例如果胶、琼脂)的溶液；或者其它合适的聚合物。小心地匀浆以保证正确搅拌。利用例如温控喷雾干燥的技术生产胶囊，控制粒径使最终粒径＜200μ。需要时，可在喷雾干燥之前向分散体系中加入添加剂，例如着色剂、防腐剂或自由流动助剂。
所得胶囊应当包含12％至20％(w/w)的番茄提取物。所述胶囊应当在＜4℃下储存在黑色密封箔包装材料中。当掺入到食品中时，所述胶囊的剂量应当在400mg-700mg/天的范围内。
袋装的(sacheted)即溶型制剂
实施例3中所述的番茄提取物适于掺入到预混合的即溶型单次使用式袋剂(sachet)中。所述制剂的一个实例可通过混合以下物质制得：150mg粉末化低糖番茄提取物；285g麦芽糊精；6.5g草莓奶油调味剂；0.8g三氯蔗糖；3.8g柠檬酸；2.5g天然甜菜红着色剂以及0.25g焦糖。所得的约300g干粉末混合物可以单次使用式箔衬袋剂的形式提供，适于溶解在50mL至300mL水中品尝。每300g混合物包含单日剂量的番茄提取物。
所述粉末状囊剂应当储存在室温下，并且应与关于每日用水摄取一个袋剂的说明一起提供。
片剂
实施例2中所述的番茄提取物可用于制备用作药用或食用补充剂用途的片剂，例如通过直接压片来制片，如下文所述。
实施例2中所述番茄提取物应当在压片前被磨至/研磨至1-3μ的粒径范围。预先研磨的粉末状提取物应当与赋形剂(如微晶纤维素或麦芽糊精M700)一起干混，以提供压片过程中的润滑。40％提取物与60％赋形剂的比例是合适的，但是也可使用10∶90至60∶40的比例。必要时，还可添加粉末化着色剂。
可利用传统压片机，将压力设定为1.5-2.0吨/平方英寸，来制备5kg硬度的212g片剂。这样的片剂每片将包含85mg番茄提取物。推荐储存在层压铝箔泡罩包装中。在这种包装情形下，片剂将在高达45℃的温度下稳定储存。应当一起服用两片，每日一次或两次，以实现推荐的剂量水平。
实施例6
在实施例4中描述了根据实施例2的方法制得的组合物的直接抗血小板效果。为了证明这些抗血小板作用的程度足以影响血液流动性或血流，进行了进一步的工作，其中检测了该组合物对总体初期止血的作用。止血，即通过凝血过程使出血终止，表现为两部分。初期止血指全血在流动条件下形成血小板微聚集体和大聚集体并且在富集胶原的表面(通常是血管壁)形成最初的血小板凝块的能力。次级止血(secondaryhaemostasis)指凝血酶在此初期凝块中诱导形成纤维蛋白网络，这产生更持久的凝块，该凝块需要相当长时间通过纤维蛋白溶解方式来溶解。检测初期止血得出以下数据：当考察番茄提取物组合物在影响血液流动性和血流中的功效时，初期止血可能比单独的聚集数据更具生理相关性。
在以下实施例中，描述了利用血小板功能分析仪PFA-100检测根据实施例2中所述方法制得的组合物的总体初期止血作用的实验。血小板功能分析仪设备已成为测量小血样样品中初期止血的有用工具。该测试系统是微处理器控制的设备，其体外模拟初期止血的血小板依赖期，同时界定流变学因素的作用。基本上，该系统监测涂覆有胶原-ADP或胶原-肾上腺素(COL-EPI)的膜上的血小板相互作用。在受控的流动条件下(剪切速率：4000-5000/s)通过150微米切孔将柠檬酸化血液样品吸到所述膜中。在处理过程中，正在形成的血小板栓子逐渐阻碍血流通过所述切孔。血液样品中血小板的止血能力表示为血小板栓子阻塞所述孔所需的时间(闭合时间)，以秒表示。
6.1研究方案
6.1.1研究目的和简介
本研究考察了摄取3g番茄提取物浆(根据实施例2中所述方法制得)相比于对照补充剂对健康受试者初期止血的体外作用。
6.1.2实验设计
招募6名年龄45-75岁的健康成年人，其止血参数(血液计数)正常，无严重疾病或止血性病症的医学史，并且未摄取饮食补充剂或已知影响血小板功能的药物。获得了书面知情同意，并且该研究获得了Grampian研究伦理委员会的批准。在07:00至08:30之间从禁食受试者取基线血样样品(已用柠檬酸葡萄糖缓冲液进行了抗凝化处理)。采集基线样品后，受试者立即摄取处理剂(TE)或对照补充剂。然后在进食补充剂后t＝3小时和t＝5小时取另外的血样样品。
6.1.5初期止血的离体测量
测量每个时间点时全血样品的PFA-100闭合时间。利用胶原-肾上腺素膜进行测量。简而言之，将含有合适膜的管(cartridge)置于室温下，并将900μl经抗凝化处理的全血插入到每个管的贮存器(resevroir)中。然后立即将管插入到PFA-100的处理单元中。血液在高剪切力下通过管膜自动从贮存器中吸出，直到膜孔闭合(闭合时间)或者直到在无凝块形成的情形下最大300秒。记录闭合时间并打印输出。在取血样后最少30分钟进行所有测量。
6.2结果
每种处理的平均闭合时间图示在图7中。在该图中，所记录的平均闭合时间以基线(相对于补充有处理(TE)或对照(C)的0时)和补充有处理(TE)或对照(C)后的3和5小时表示。对每一组n＝3，数据通过ANOVA进行分析。C和TE之间的显著性差异以*表示在图中(P＝0.011)。
6.3结论
结果表明，摄取代表本发明的番茄提取物的组合物后3和5小时，PFA-100闭合时间相对于基线值而言平均增加24％。摄取对照补充剂3小时后，PFA-100闭合时间相对于基线值而言平均降低16％，5小时后平均降低12％。就对照补充剂而言，基线与3和5小时时间点之间无显著性差异，但就番茄提取物补充剂而言，基线与3和5小时时间点之间有显著性差异，P＝0.011。对照与番茄提取物补充剂之间具有显著性差异(P＝0.011)。
该结果表明，本发明的番茄提取物补充剂组合物增加每个管孔中形成血小板凝块所需的时间，表明血小板止血潜能降低。凝固所需的时间越长，表明血液流动性就越好。
这些结果清楚地表明，本发明的组合物(例如番茄提取物)可有效降低血液流动性。这支持了它们使血流正常化的用途。

Claims (23)

1.一种制备茄科(Solanaceae)水果提取物的方法，其中对所述水果进行加工以优化所述提取物的血小板聚集抑制活性，所述方法包括以下步骤：
(a)制备匀浆水果的初始混合物；
(b)从水果固体中分离出水溶性级分；
(c)过滤所述水溶性级分；以及
(d)浓缩滤过液中的活性剂。
2.权利要求1的方法，其中维持所述初始混合物的温度不超过35℃。
3.权利要求1或2的方法，其中所述初始混合物的pH不超过5.5。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述初始混合物的褐变指数在4％固体时不超过0.4AU，其中所述褐变指数定义为可溶性部分在420nm处的吸光度。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)将所述级分与粒径＞500μ的不溶性固体分开。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)不包括将所述级分的温度升至高于60℃的程序。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(c)得到会通过0.2μ滤器而不损失固体的溶液。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(d)不包括将所述级分的温度升至高于60℃的程序。
9.前述权利要求中任一项的方法，包括在步骤(c)之后从所述水溶性提取物中除去游离糖的额外步骤。
10.根据权利要求9的方法，其中所述糖通过对提取物组分进行树脂介导的分离而除去。
11.一种制备基本上如实施例2或3所述的水果提取物的方法。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法制得的水果提取物。
13.一种水果提取物，包含：
(a)糖基化酚酸或酚酯或其衍生物；
(b)糖基化类黄酮；以及
(c)核苷。
14.权利要求13的水果提取物，其中所述糖基化酚酸或酚酯是糖基化肉桂酸或其衍生物。
15.权利要求14的水果提取物，其中所述糖基化肉桂酸或其衍生物选自咖啡酰-4-O-奎宁酸、咖啡酰-4-O-葡糖苷、香豆酰-4-O-糖苷(葡萄糖/半乳糖)或香豆酰-4-O-糖苷(二糖)。
16.权利要求13的水果提取物，其中所述糖基化肉桂酸或酚酯选自咖啡酸葡糖苷；对香豆酸己糖/二氢山奈酚己糖；阿魏酸糖苷；以及对香豆酸衍生物。
17.权利要求13-16中任一项的水果提取物，其中所述糖基化类黄酮是槲皮素-3-O-葡糖苷或芦丁。
18.根据权利要求13-17中任一项的水果提取物，其中所述核苷选自包括AMP、尿苷、腺苷、鸟苷或GMP的组。
19.权利要求13-18中任一项的水果提取物，其中所述提取物包含表1中所述16种化合物中的每一种。
20.权利要求13-18中任一项的水果提取物，其中所述提取物包含表2中所述32种化合物中的每一种。
21.基本上如实施例2或3所定义的水果提取物。
22.权利要求12至21中任一项的水果提取物，用作治疗或预防以不适当血小板聚集为特征之医学病症的药物。
23.权利要求22的水果提取物，其中所述治疗或预防以不适当血小板聚集为特征的医学病症是用于选自以下的目的：通过减少血小板聚集来维持心脏健康；有益于循环；以及使血流正常化或者以其它方式有益于血流。
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