BRPI0920446B1

BRPI0920446B1 - Método para fabricar um extrato de fruta da família solanaceae, e, uso de um extrato de fruta

Info

Publication number: BRPI0920446B1
Application number: BRPI0920446-6A
Authority: BR
Inventors: Niamh O'Kennedy
Original assignee: Provexis Natural Produts Limited
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-11-02
Publication date: 2024-03-05
Also published as: EP3173088A2; MX2011004531A; KR20170010100A; EP3173088A3; US20110206794A1; CN102271697A; US20140147537A1; KR102032262B1; BRPI0920446A2; DK2349303T3; HUE033986T2; PL3607960T3; JP2018030888A; JP2015057440A; AU2016202312A1; EP4218783A1; WO2010049707A2; WO2010049707A9; GB0819959D0; EP3607960B1

Abstract

método para fabricar um extrato de fruta da família solanaceae, extrato de fruta, composição, e, uso de um extrato de fruta. são fornecidos métodos de fabricar um extrato de frutas da família solanaceae, em que a fruta é processada para otimizar a agregação de plaquetas que inibe a atividade do extrato. os métodos envolvem preparar uma mistura de partida de fruta homogeneizada; separar uma fração solúvel em água de sólidos de frutas; filtração da fração solúvel em água; e concentração dos agentes ativos no permeato de filtração. a invenção também fornece extratos de frutas fabricados através de tais métodos, e também aos extratos de frutas contendo ácido fenólico ou um éster fenólico glicosilado, ou derivados dos mesmos; um flavonóide glicosilado; e um nucleosídeo. os extratos da invenção são úteis como medicamentos para o tratamento ou prevenção de uma condição médica caracterizada pela agregação de plaquetas inapropriada. em particular, os medicamentos podem ser de uso na manutenção de saúde cardíaca através da redução da agregação de plaquetas; beneficiando a circulação; e/ou normalizando ou de outro modo beneficiando o fluxo sanguíneo.

Description

A presente invenção diz respeito a um extrato de fruta que previne a agregação de plaquetas e é útil como um agente antitrombótico e aos métodos de fabricar tais extratos.

É bem estabelecido que o consumo de frutas e vegetais seja uma medida preventiva importante para que o risco de doenças cardiovasculares possa ser reduzido. Portanto, esforço considerável tem sido feito em uma tentativa de identificar os compostos derivados de frutas e vegetais os quais possuem um papel na prevenção de doenças cardíacas.

Interesse particular foi mostrado com relação aos agentes que inibem a agregação de plaquetas. Quando as plaquetas agregam dentro do sistema circulatório, trombos são formados os quais são grandes o suficiente para bloquear os vasos sanguíneos. Contudo, antes da agregação total ocorrer, as plaquetas podem circular em uma condição ativada. Quando neste estado, a viscosidade da plaqueta é muito aumentada, e estas podem aderir umas às outras, a outras células sanguíneas, ou aos componentes do sangue, tais como quilomícrons ricos em lipídeos. Isto causa a formação de micro-agregados, e diminui a fluidez do sangue, afetando localmente o fluxo sanguíneo, e a circulação de modo sistêmico. Reduzir a capacidade de agregação das plaquetas ajuda a manter o sangue em um estado fluido de baixa coagulação. Isto ajuda a normalizar o fluxo sanguíneo, prevenindo-se a formação de micro-agregados dentro da circulação, e prevenindo-se a aderência das plaquetas às paredes dos vasos sanguíneos ou placas graxas.

Com base neste esclarecimento será reconhecido que os agentes capazes de inibir a agregação de plaquetas são de uso na prevenção da doença coronária, por exemplo, infartos do miocárdio e acidente vascular cerebral e na prevenção de outros eventos tromboembólicos em pacientes que já sofreram de infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral ou angina instável. Além disso, tais agentes podem ser de uso na prevenção da restenose após procedimentos de angioplastia e revascularização. Além disso, estes agentes podem ser de uso no tratamento de doença coronária que resulta de distúrbios trombo-embólicos tais como infarto do miocárdio em conjunto com terapia trombolítica.

Existem muitos agentes anti-agregação de plaquetas conhecidos que agem como diferentes estágios na produção e ação das plaquetas. A aspirina (ácido acetilsalicílico) é o mais amplamente usado e estudado. Dipirimidamol e ticlopidina também foram usados. A atividade antiplaquetas da Aspirina é devido à inibição irreversível da ciclo-oxigenase das plaquetas, prevenindo deste modo a síntese de tromboxano A2, um composto que causa a agregação das plaquetas. Indobufeno é um inibidor reversível da ciclo-oxigenase de plaquetas. Alguns compostos são inibidores diretos de tromboxano A2 sintase, por exemplo, pirmagrel, ou agem como antagonistas dos receptores de tromboxano, por exemplo, sulotrobano.

O Pedido de Patente Internacional WO 99/55350 divulga que os extratos solúveis em água de várias frutas apresentam uma capacidade de inibir a agregação de plaquetas. Surpreendentemente, foi considerado que a atividade de agregação anti-plaquetas foi descoberta ser solúvel em água, porque, ao contrário, os extratos ativos conhecidos na técnica neste tempo foram compostos solúveis em lipídeos (por exemplo, licopeno). Estes extratos solúveis em água foram descobertos ter eficácia significante para prevenir ou reduzir a agregação de plaquetas e foram comercializados, com a aprovação da Food Standards Agency na Europa, como um suplemento nutricional com benefícios para a saúde.

O componente ativo do extrato de fruta da WO 99/55350 foi analisado através da espectroscopia de massa (MS) e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e descoberto conter uma mistura de nucleosídeos tendo atividade de inibição de agregação de plaquetas.

A presente invenção é fundamentada na realização em que os nucleosídeos, dentro dos extratos de frutas solúveis em água, podem ser não somente os compostos dentro de tais extratos que previnem a anti-agregação de plaquetas. Eles, portanto empenharam um esforço considerável também para fracionar e caracterizar os agentes ativos dentro dos extratos solúveis em água descritos na WO 99/55350 em uma tentativa de melhorar a eficácia de tais extratos para inibir a agregação de plaquetas e desenvolver novos métodos de processar frutas para tal uso.

Verificou-se que as frutas da família Solanaceae, podem ser processadas de modo que resultam em extratos solúveis em água os quais possuem um efeito benéfico utilizado na agregação de plaquetas. Este novo conhecimento permitiu que foram desenvolvidos novos extratos de frutas, e métodos de fabricá-los, com eficácia para inibir a agregação de plaquetas.

Deste modo, de acordo com um primeiro aspecto da invenção é fornecido um método para fabricar um extrato de fruta das fruta Solanaceae em que a fruta é processada para otimizar a agregação de plaquetas, inibindo a atividade do extrato que compreende as etapas de: (a) Preparar uma mistura de partida da fruta homogeneizada; (b) Separar uma fração solúvel em água dos sólidos de frutas; (c) filtração da fração solúvel em água; e (d) concentração dos agentes ativos no permeato de filtração Decidiu-se analisar os compostos ativos nos extratos de frutas descritos na WO 99/55350 (ver o Exemplo 1). Foram surpreendidos em descobrir vários compostos, descobertos naturalmente em plantas, que foram eficazes para inibir a agregação de plaquetas. Isto os levou a imaginar que os métodos descritos na WO 99/55350 podem ser adaptados para desenvolver métodos que resultarão em extratos em que o teor de tais agentes ativos é mantido (isto é, quantidades mínimas do composto ativo são perdidas durante o processamento das frutas) ou os agentes ativos são atualmente enriquecidos na produção de um extrato de fruta. Após muitas tentativas e erros, foi estabelecido que as etapas de acordo com o método do primeiro aspecto da invenção resulta em extratos de frutas que são eficazes para reduzir a agregação de plaquetas e compreendem vários ativos, solúveis em compostos de água descobertos na fruta.

(a) Preparar uma mistura de partida

A polpa da finta integral, preferivelmente tomates, é homogeneizada, com ou sem a pele da fruta para formar uma pasta.

Altemativamente, as pastas de tomate comercialmente disponíveis podem ser usadas como o material de partida para a preparação da mistura de partida. Onde o material de partida para a preparação dos extratos é uma pasta de tomate, é preferivelmente aquela que foi produzida por intermédio de um processo “quebra a frio” ao invés de um processo de “quebra a quente”. Os termos “quebra a frio” e “quebra a quente” são bem conhecidos no campo do processamento de tomates e as pastas de tomate comercialmente disponíveis são tipicamente vendidas como pastas de quebra a quente ou quebra a frio. A pastas de quebra a frio podem ser preparadas através de um processo que envolve a homogeneização do tomate seguido por uma etapa de processamento térmico em que os tomates são aquecidos até temperaturas de não mais do que de 60°C, ao contrário das pastas de quebra a quente onde os tomates homogeneizados são submetidos ao processamento térmico em temperaturas de cerca de 95°C, ver, por exemplo, Anthon et al., J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 6153-6159.

A espessura de tais pastas (seja de frutas frescas ou de uma pasta comercialmente disponível) deve ser ajustada diluindo-se com água ou com uma solução aquosa (preferivelmente água desmineralizada) para formar uma “mistura de partida”. Verificou-se que a atividade ótima obtida no extrato de fruta final é a mistura de partida é diluída tal que esta contenha menos do que 33 % de sólidos e mais preferivelmente menos do que 20 % de sólidos. Em uma forma de realização preferida da invenção a mistura de partida compreende entre cerca de 10 e 15 % de sólidos (por exemplo, 13 % de sólidos).

Verificou-se que a manutenção da temperatura da mistura de partida pode ter um efeito significante na atividade do extrato. Portanto, é preferido que a manutenção da temperatura não exceda 35°C e mais preferivelmente não exceda 30°C.

Verificou-se que o pH da mistura de partida também afeta a atividade do extrato preparado de acordo com o método da invenção. O pH da mistura deve ser ácido; preferivelmente um pH de menos do que 5,5 e em um forma de realização preferida o pH não deve se elevar acima de 4,2. Ajustes ao pH são necessários e podem ser feitos através da adição de ácido cítrico.

Além disso, verificou-se que o índice de douramento da mistura de partida também deve ser controlado para otimizar a atividade do extrato final. Portanto, o índice de douramento da mistura de partida, definido como a absorvência da porção de solução a 420 nm, preferivelmente não excede 0,4 AU em 4 % de sólidos. O índice de douramento é um índice de douramento visível causada pela formação de melanoidinas (conjugados poliméricos de composição variável, com base em açúcares e aminoácido) e pode ser medido centrifugando-se uma amostra de 50 ml da mistura de partida a 3500 rpm por 10 minutos na temperatura ambiente, removendo uma porção do sobrenadante, diluindo este a 4 % de sólidos como medido através do refratômetro, e a medição da absorvência desta solução a 420 nm em um espectrofotômetro.

Verificou-se que os extratos de frutas de acordo com o método da invenção têm atividade anti-agregação melhorada se pelo menos um da temperatura, pH e índice de douramento são controlados na mistura de partida como divulgado acima. E preferido que pelo menos duas destas etapas de controle (por exemplo, temperatura e pH; ou temperatura e índice de douramento) sejam controlados e é mais preferido que a temperatura, pH e índice de douramento sejam controlados como divulgado acima.

E mais preferido que a mistura de partida seja mantida em uma temperatura que não é maior do que 30°C; em um pH de menos do que 4,2 e com um índice de douramento que não exceda 0,4 AU.

(b) Separar uma fração solúvel em água dos sólidos de frutas.

Os sólidos insolúveis em água podem ser removidos de uma fração solúvel em água usando-se várias técnicas padrão.

E preferido que esta etapa na metodologia remova os sólidos insolúveis em água de tamanho grande (isto é, tamanho de partícula > 500 μ) da mistura de partida.

Tal que os sólidos possam ser removidos através do uso de: (a) um decantador (p°r exemplo, um decantador Westfalia GEA); (b) uma etapa de separação centrífuga (p°r exemplo, uma centrífuga de disco rotativo); ou (c) um separador contendo bocais de tamanho ajustáveis (p°r exemplo, um separador Westfalia MSB-15, usando uma mistura de brancos e bocais com tamanho de 0,45).

Altemativamente, os sólidos podem ser deixados assentar e a fração solúvel em água simplesmente decantada manualmente.

Qualquer que seja o método utilizado, verificou-se que para a retenção da bioatividade ótima na fração solúvel em água, as temperaturas de operação não devem exceder 60°C. Além disso, é preferido que a vazão através do equipamento usado deve ser tal que a exposição à temperatura de 60°C não ocorra por mais do que 60 segundos.

A fração solúvel em água resultante deve ser adequadamente resfriada após a etapa de separação. Quando a fração deve ser armazenada é preferido que, após a separação, esta é imediatamente resfriada até < 8°C.

Nas formas de realização preferidas da etapa (c) do método da invenção um decantador pode ser usado, com temperaturas de operação de 40 a45°C.

Opcionalmente a etapa de separação pode ser seguida por uma segunda etapa de clarificação (p°r exemplo, usando um Clarificador Alfa Lavaal) para produzir uma fração solúvel clarificada em água onde todo o material insolúvel restante tem um tamanho de partícula de < 500 μ, e os sólidos centrifugados (isto é, material que é visivelmente precipitado através da centrifugação a 3500 rpm por 10 minutos na temperatura ambiente) compreendem < 1 % da fração em volume.

Verificou-se que o produto final retém a concentração de componente ativo máxima da fração clarificada (produzido de qualquer forma) contém menos do que 10 % de sólido totais e mais preferivelmente cerca de 8 % de sólidos ou menos.

(c) Filtração da fração solúvel em água

Para remover a matéria particulada muito fina (< 500 μ) (por exemplo, material protéico e polimérico grande tais como algumas pectinas), a fração solúvel em água deve ser então filtrada e o permeato retentido.

A filtração pode ser efetuada em um estágio único, ou em uma série de etapas de filtração, iniciando com uma etapa de filtração relativamente áspera para remover as partículas maiores de pele de tomate e/ou outros fragmentos insolúveis em água da polpa do tomate. Outras etapas de filtração podem ser então efetuadas para fornecer uma solução substancialmente clara, por exemplo, uma solução que passará através de um filtro de 0,2 μ sem a perda de sólidos.

Em uma forma de realização preferida da etapa (c) do método da invenção é compreendida uma etapa de microfiltração usando uma unidade de filtração com filtros de membrana cerâmica (por exemplo, uma unidade de filtração cruzada Tetra Alcross MF equipada com filtros de membrana

cerâmica (por exemplo, unidades de elementos múltiplos Pali Membralox PI9-30)). As membranas em forma de espiral também podem ser usadas como uma alternativa às membranas cerâmicas.

A ultrafiltração também pode ser usada como uma alternativa à microfiltração. Uma faixa de tamanhos de poro é aceitável, por exemplo, 1,4 μ, 0,1 μ; mas Verificou-se que o enriquecimento máximo do permeato de filtração com componentes bioativos (isto é, perdas mínimas de componentes bioativos e a exclusão máxima de componentes não bioativos) ocorre quando os tamanhos de poro de 0,1 μ são usados.

De modo a reter a bioatividade ótima, as temperaturas não devem ser mais elevadas que 35°C durante esta etapa de filtração, e o permeato de filtração deve ser imediatamente resfriado até < 8°C após a saída da membrana de filtração. O índice de douramento do permeato final não deve exceder 0,4 AU.

Verificou-se que a recuperação máxima dos componentes bioativos, e o enriquecimento do permeato de filtração nos componentes bioativos (com relação ao material não filtrado), ocorrem quando o material de partida não filtrado contém < 10 % de sólidos, e quando o permeato final contém aproximadamente 7 % de sólidos e tem um índice de douramento de < 0,4 AU.

A remoção dos sólidos de acordo com as etapas de (a) a (c) tem o efeito de remover os fragmentos da pele e sementes, proteínas e pectinas de alto peso molecular, e carotenóides tais como licopeno/outros lipídeos que são estabilizados nas gotículas dentro da solução aquosa através da presença das pectinas e proteínas. Deste modo, os métodos para fornecer modos de preparar extratos de tomate que são solúveis em extratos de água e também são substancialmente isentos de licopeno.

Os métodos descritos, em particular o controle cuidadoso da extensão da exposição a temperaturas > 3 5°C (preferivelmente > 30°C),também garantem que os extratos solúveis em água isentos de licopeno preparados não tenham que ser submetidos às reações químicas degradativas que resultam na produção do douramento visível (reações de Maillard), como demonstrado pelo valor do índice de douramento < de 0,4 AU. Isto garante que a formação dos complexos de aminoácido - açúcar complexes e polímeros de melanoidina, que podem aprisionar alguns dos componentes bioativos, seja mantida em um mínimo. Deste modo, os métodos descritos resultam em extratos que são otmizados quanto o teor de componente bioativo.

Em uma forma de realização preferida do método da invenção, o extrato de tomate é um extrato solúvel em água substancialmente isento de licopeno e capaz de passar através de um filtro de 0,2 μ sem a perda de sólidos, e com um valor do índice de douramento de < 0,4 AU.

(d) Concentração dos agentes ativos no permeato de filtração

O filtrado aquoso é depois submetido a outras etapas de concentração/ffacionamento para fornecer um concentrado bioativo contendo os compostos responsáveis pela inibição da agregação de plaquetas.

Após muitas experiências, foram estabelecidas que as etapas de concentração precisam de um controle cuidadoso se a bioatividade do pico do extrato final deve ser retida ou se o enriquecimento dos bioativos deve ser obtido no produto final concentrado. A razão para isto foi descoberta ser, que o progresso das reações degradativas dependentes de calor e pH é acelerado ao passo que a concentração dos sólidos aumenta. Eles, portanto perceberam que o controle da temperatura, e a duração da exposição à temperatura, foi mais crucial para os extratos concentrados do que para os extratos diluídos.

Vários métodos podem ser usados para concentrar / enriquecer o material solúvel em água - contanto que a temperatura do extrato não seja deixada se elevar tal que a degradação dos agentes ativos dentro do extrato não seja permitida se elevar acima de cerca de 60°C para diluir as frações e abaixo de 40°C para as amostras mais concentradas.

Concentração Usando Técnicas de Evaporação

A evaporação da solução sob pressão reduzida pode ser usada, sob condições onde as temperaturas não excedam 60°C.

Preferivelmente, um evaporador de efeitos múltiplos é usado, de modo que as temperaturas podem ser diminuídas ao passo que o líquido passa através do evaporador, garantindo que o material mais concentrado não seja exposto às temperaturas > 40°C, considerando que o material mais diluído pode tolerar temperaturas de até 60°C.

Usando a evaporação, o extrato solúvel em água pode ser concentrado até 70 % de sólidos, por exemplo, até 20 % de sólidos, ou até 50 % de sólidos, ou até 65 % de sólidos. Em uma forma de realização mais preferida, o extrato final compreende de 60 a 62 % de sólidos após a concentração de acordo com a etapa (d).

O efeito da temperatura pode ser quantificado medindo-se o índice de douramento. As temperaturas devem ser suficientemente baixas tal que o produto final concentrado não deve exceder 0,8 AU.

O concentrado final formado seguindo as etapas (a), (b), (c) e utilizando um evaporador de acordo com a etapa (d) preferivelmente tem um índice de douramento de < 0,8 AU, um pH de 4,0 a 4,3 e uma densidade de 1,15 a 1,20.

Concentração usando Processos de Membrana

Altemativamente, os processos de membrana que permitem que a água passe através da membrana enquanto retendo todos os outros componentes dentro da membrana também podem ser usados. Os exemplos de técnicas específicas são osmose reversa, ou nanofiltração. Ambas podem ser usadas para concentrar o extrato solúvel em água até o grau necessário, enquanto operando em baixas temperaturas (< 40°C).

Técnicas de secagem

As tecnologias de secagem também podem ser usadas para remover a água do extrato solúvel em água. As técnicas de secagem adequadas incluem secagem por pulverização, com ou sem materiais carregadores (por exemplo, amido de batata, amido de tapioca, maltodextrinas); secagem de tambor à vácuo, com ou sem materiais carregadores; ou secagem de rolo, com ou sem materiais carregadores.

Preparação de Extratos de Frutas com Baixo Teor de Açúcar

Os métodos descritos acima foram intencionados para a produção de um concentrado contendo todos os elementos originalmente presentes no extrato solúvel em água.

Em uma forma de realização preferida da invenção, o método do primeiro aspecto da invenção pode ser adaptado para resultar em um concentrado que é enriquecido (p°r exemplo, de 25 a 35 vezes) nos componentes bioativos.

O enriquecimento dos componentes bioativos dentro do extrato solúvel em água pode ser obtido removendo-se os açúcares solúveis que formam a porção mais ampla do seu teor de matéria seca.

Os extratos de frutas com baixo teor de açúcar podem ser preparados a partir das seguintes etapas (a), (b) e (c) acima e então utilizando uma outra etapa nos métodos ante da etapa de concentração final ((d) acima)

A remoção dos açúcares solúveis pode ser obtida por: (1) precipitação, por exemplo, adicionando-se etanol à solução até uma concentração final de 90 %, que resultará na precipitação de glicose, frutose e sacarose livres; (2) Remoção parcial dos açúcares livres através da digestão, por enzimas (por exemplo, glicose oxidase); (3) através do tratamento microbiano (bactéria ou levedura); ou (4) removendo os açúcares livres do extrato solúvel em água através da separação mediada por resina dos componentes de extrato.

É preferido que os açúcares livres sejam removidos a partir do extrato solúvel em água através da separação mediada por resina dos componentes de extrato ((4) acima). Foi desenvolvido um método em que uma resina de grau alimentício (Amberlite FPX66) é utilizada para absorver todos os componentes de extrato, com a exceção dos açúcares livres, ácidos orgânicos, e sais. Estes não são absorvidos pela resina e podem ser descartados após passar por esta. Os componentes de extrato absorvidos na resina, que compreendem os amino ácidos, componentes bioativos, e produtos de reações de douramento (produtos de degradação de Maillard), são depois recuperados da resina através da eluição com misturas de etanol/água, por exemplo, 50 % de etanol, ou 80 % etanol. O etanol pode ser removido da solução resultante através da evaporação sob pressão reduzida (por exemplo, em um evaporador convencional à prova de explosão, ou em um concentrador de centrífuga Centritherm), ou através da osmose reversa.

Após a remoção dos açúcares, a concentração do produto pode ser ajustada utilizando estes procedimentos divulgados na etapa (d) acima.

O extrato com baixo teor de açúcar resultante é preferivelmente uma solução aquosa concentrada contendo < 1 % de açúcar, e contendo > 95 % dos componentes bioativos contidos na mistura de partida.

Extratos de frutas

Os extratos preparados de acordo com os métodos do primeiro aspecto da invenção representam os novos extratos de frutas com eficácia surpreendente para prevenir a agregação de plaquetas.

Portanto, de acordo com um segundo aspecto da invenção é fornecido um extrato de fruta capaz de inibir a agregação de plaquetas preparado de acordo com os métodos do primeiro aspecto da invenção.

Os extratos de acordo com o segundo aspecto da invenção podem ser usados para tratar, e em particular prevenir o desenvolvimento, de estados de doenças que são caracterizados pela agregação inapropriada das plaquetas. Foi estabelecido que os extratos da invenção são particularmente úteis para: (a) prevenir ou reduzir a ocorrência de um estado hipercoagulável ou pró-trombótico, tal como é muitas vezes associados com condições tais como diabete melito, doença do intestino inflamatório, hiperlipidemia (b) prevenir ou reduzir o desenvolvimento da aterosclerose (c) prevenir o desenvolvimento da doença coronária (p°r exemplo, infartos do miocárdio e acidente vascular cerebral e na prevenção de outros eventos trombo-embólicos em pacientes que já sofreram infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral ou angina instável). (d) prevenir o desenvolvimento da restenose após procedimentos de angioplastia e desvio. (e) tratar doença coronária resultante de distúrbios trombo- embólicos tais como infarto do miocárdio em conjunto com a terapia trombolítica. (f) prevenir ou reduzir o risco de trombose de veia profunda (g) beneficiar a circulação para manter boa saúde circulatória (h) manter um fluxo sanguíneo saudável no sistema cardiovascular.

Será apreciado que os extratos da invenção terão benefícios gerais na saúde para manter a saúde cardiovascular e do coração reduzindo-se a agregação de plaquetas, beneficiando a circulação, e/ou normalizando ou de outro modo beneficiando o fluxo sanguíneo (por exemplo, como descrito em (g) e (h) acima).

De fato, estes usos dos extratos são tão vantajosos, que a invenção também fornece um extrato de fruta preparado de acordo com os métodos da invenção para o uso como um medicamento para normalizar ou de outro modo beneficiar o fluxo sanguíneo em um paciente. A invenção também fornece um extrato de fruta que compreende um ácido fenólico ou um éster fenólico glicosilado, ou derivados dos mesmos; um flavonóide glicosilado; e um nucleosídeo para o uso como um medicamento para normalizar ou de outro modo beneficiar o fluxo sanguíneo em um paciente.

As composições que compreendem os extratos da invenção serão úteis como produtos farmacêuticos, mas também representarão alimentos funcionais benéficos ou “nutracêuticos”. Portanto, os usos preferidos das composições são como medicamentos e alimentos ou bebidas funcionais (como descrito abaixo).

Os extratos de frutas preferidos da invenção são extratos aquosos de tomates maduros, (isto é, vermelhos), e são solúveis em água.

O termo “solúvel em água” como aqui usado significa que os extratos de tomate são solúveis na temperatura ambiente, por exemplo, a 25°C. Os extratos também foram descobertos ser solúveis em água em temperaturas muito menores, por exemplo, em temperaturas tão baixas quanto 4°C.

Os extratos não contêm, contêm concentrações desprezíveis de licopeno. Por exemplo, os extratos contêm menos do que 0,5 % em peso (peso seco) de licopeno, por exemplo, menos do que 0,1 %, ou menos do que 0,05 %, ou menos do que 0,01 %, ou menos do que 0,005 %, ou menos do que 0,001 %, ou menos do que 0,0005 %, ou menos do que 0,0001 %, em peso (peso seco) de licopeno.

Os extratos são substancialmente isentos de material particulado insolúvel em água. Deste modo, por exemplo, estes contêm menos do que 0,5 % em peso (peso seco) de material particulado insolúvel em água, por exemplo, menos do que 0,1 %, ou menos do que 0,05 %, ou menos do que 0,01 %, ou menos do que 0,005 %, ou menos do que 0,001 %, ou menos do que 0,0005 %, ou menos do que 0,0001 %, em peso (peso seco) de material particulado insolúvel em água. Em uma forma de realização, os extratos não contêm material particulado insolúvel em água.

O termo “fração ativa” como aqui usado se refere a uma fração isolada de um extrato de tomate, cuja fração tem a capacidade de reduzir a 5 agregação de plaquetas.

A pesquisa (Ver o Exemplo 1) estabeleceu que os extratos de frutas podem ser preparados, em que vários bioativos são enriquecidos ou mantidos em um extrato que é deve ser subsequentemente usado para prevenir ou tratar condições médicas caracterizadas pela agregação de plaquetas inapropriada. Os métodos do primeiro aspecto da invenção foram desenvolvidos de modo a manter tais bioativos. Foi estabelecido que os extratos preparados de acordo com invenção compreendem várias moléculas bioativas incluindo:

(A) Compostos Fenólicos Bioativos no Extrato da Invenção

Foi estabelecido que várias moléculas com base em fenol e derivados dos mesmos estão contidas dentro da fruta e têm eficácia para prevenir a agregação de plaquetas (ver o Exemplo 1).

Em particular ácido cinâmico, e derivados dos mesmos, foram descobertos ser particularmente eficazes para inibir a agregação de plaquetas.

Portanto, os métodos do primeiro aspecto da invenção foram intencionados para garantir que o extrato compreende ácido cinâmico ou um derivado deste como definido pela fórmula I:

Na fórmula I, R1 e R2 e R3 podem ser independentemente selecionados de H, OH e Ome.

O composto pode ser ácido cinâmico por si (onde Rl, R2 e R3 da fórmula I são H) ou pode ser qualquer um de vários derivados, incluindo: Ácido 4-hidroxicinâmico (ácido p-coumárico) Ácido 3,4-Diidroxicinâmico (Ácido caféico) Ácido 4-hidróxi-3-metóxi cinâmico (Ácido ferúlico) Ácido 4-hidróxi-3,5-dimetóxi cinâmico (Ácido sinápico)

Foi também identificada outra classe de derivados fenólicos vegetais, ácidos benzóicos e derivados dos mesmos, em extratos de frutas que também são eficazes para inibir a agregação de plaquetas. Portanto, os métodos do primeiro aspecto da invenção podem ser ajustados para garantir que o extrato compreende um ácido benzóico ou derivado deste como definido para a fórmula II:

Na fórmula II, RI e R2 e R3 são como previamente definidos.

Portanto, os extratos preferidos de acordo com o segundo aspecto da invenção pode compreender o ácido benzóico por si (em que cada um dos Rl, R2 e R3 são H) ou qualquer um de vários derivados, por exemplo: ácido 4-hidroxibenzóico (ácido p-hidroxibenzóico) Ácido 3,4-Diidroxibenzóico (Ácido protocatecuico), Ácido 3,4,5-Triidroxibenzóico (Ácido gálico) Ácido 4-hidróxi-3,5-metoxibenzóico (Ácido vanílico) Ácido 4-hidróxi-3,5-dimetoxibenzóico (ácido siríngico)

Durante o trabalho com os extratos de frutas eles foram surpreendidos por descobrir que os bioativos fenólicos que são conjugados com outras moléculas por intermédio de uma ligação éster no grupo de ácido carboxílico, para formar um éster carboxílico, ou por intermédio de uma ligação éter em um substituinte hidroxil fenólico, para formar um glicosídeo, foram particularmente eficazes para reduzir a agregação de plaquetas e portanto úteis para tratar ou prevenir o desenvolvimento de uma variedade de condições cardiovasculares. Portanto, o método do primeiro aspecto da invenção foi intencionado para que garantir que o extrato compreendeu um bioativo fenólico conjugado com outras moléculas.

E preferido que os bioativos sejam conjugados aos açúcares para formar glicosídeos. Verificou-se que vários glicosídeos bioativos diferentes estão contidos dentro dos extratos. Portanto, pelo termo “glicosídeo”, intencionamos significar pelo menos um resíduo de açúcar de hexose ou pentose conjugado ao bioativo; preferivelmente de 1 a 5 e mais preferivelmente de 1 a 3 unidades de monossacarídeos são adicionadas através da reação em um grupo OH no composto bioativo. A glicose, galactose ou arabinose e também di-/trissacarídeos destes açúcares são mais preferivelmente adicionados ao composto para formar os glicosídeos derivados de ácido fenólico.

Altemativamente, os compostos bioativos podem ser conjugados a vários compostos encontrados em plantas (p°r exemplo, ácido tartárico, ácido quínico) para formar ésteres. Tais compostos podem ser compostos de cadeia aberta tais como ácido tartárico, ou compostos heterocíclicos tais como ácido quínico e podem ser derivados dos caminhos de carboidrato em plantas. O ácido tartárico ou ácido quínico são mais preferivelmente adicionados ao composto para formar os derivados de éster fenólico.

E preferido que o método da invenção enriqueça o extrato tal que este compreenda um glicosídeo selecionado do grupo que consiste do grupo que compreende: 3-O-glicosídeo do ácido caféico, 4-O-glicosídeo do ácido caféico, 4-O-glicosídeo ácido ferúlico, 4-O-glicosídeo do ácido p- coumárico, ou um derivado esterificado selecionado do grupo que compreende os ácidos Cafeoilquínicos (p°r exemplo, ácido 3-0- Cafeoilquínico, ácido 4-O-cafeoilquínico ou ácido 5-O-cafeoil- quínico), ácido feruloilquínicos, ácidos p-coumaroilquínicos, ácidos Cafeoiltartáricos, ácidos Feruloiltartáricos, ácidos p-Coumaroiltartáricos, dímeros dos derivados de ácido quínico.

Portanto, o extrato do segundo aspecto da invenção pode compreender pelo menos um glicosídeo do ácido cinâmico ou derivado deste selecionado dos compostos listados acima também pode compreendem pelo menos um glicosídeo de um ácido benzóico ou derivado deste selecionados dos compostos listados acima.

(B) Compostos Flavonóides Bioativos no Extrato da Invenção

Foi também estabelecido que a inibição ótima da agregação de plaquetas é obtida nos extratos que também contêm um flavonóide, ou derivados dos mesmos.

O extrato preferivelmente contém um flavonóide da fórmula geral (III): em que R5, R6 e R7 são independentemente H, OH.

Preferivelmente, o extrato compreende um dos seguintes flavonóides:

E mais preferido que o extrato contenha quercetina ou canpferol ou derivados dos mesmos.

Também foi estabelecido que os flavonóides bioativos que são conjugados com outras moléculas são particularmente eficazes para reduzir a agregação de plaquetas. Portanto, em uma forma de realização mais preferida da invenção, o extrato compreende compostos flavonóides conjugados como definido acima (isto é, para açúcares, ácido tartárico, ácido quínico e outros).

A naringenina e derivados dos mesmos representam outros tipos ode flavonóide encontrados nos extratos de acordo com o segundo aspecto da invenção verificou-se ter atividade para inibir a agregação de plaquetas. Portanto, o extrato pode compreender as moléculas da fórmula geral IV. R4, R8 e R9 são como previamente definidos.

Um composto preferido definido pela fórmula IV, contido dentro do extrato, é Naringenina.

Também foi estabelecido que os compostos da fórmula geral (IV) que são conjugados com outras moléculas são particularmente eficazes para reduzir a agregação de plaquetas. Portanto, em uma forma de realização 20 mais preferida da invenção, o extrato compreende os compostos flavonóides conjugados como definido acima (isto é, aos açúcares, ácido tartárico, ácido quínico e outros.

Um flavonóide glicosilado mais preferido encontrado nos extratos da invenção é Naringina.

Verificou-se que os extratos preferidos podem compreender os compostos fenólicos e flavonóides bioativos divulgados acima que são conjugados com cada outro. Por exemplo, ácido caféico 4-0-Rutinosida é uma molécula com propriedades anti-agregação de plaquetas onde uma ligação de glicosídeo é feita entre p ácido caféico e um resíduo de açúcar na Rutina (que compreende Quercetina).

(C) Nucleosídeos/Nucleotídeos

Como considerado na WO 99/55350, os extratos de frutas com atividade anti-plaquetas também pode compreende um nucleosídeo. O extrato pode compreender pelo menos um nucleosídeo selecionado de 5’- monofosfato de adenosina, Citidina, Uridina, Adenosina, Iosina, Guanosina e 5’-monofosfato de Guanosina.

Será apreciado que foram identificados vários compostos bioativos em frações diferentes de extratos de tomate. Eles foram então capazes de adaptar os métodos para preparar os extratos de fruta tal que o compostos ativo que identificaram foram mantidos e/ou enriquecidos em tais extratos de frutas.

De acordo com um terceiro aspecto da invenção é fornecido um extrato de fruta que compreende: (a) ácido fenólico ou um éster fenólico glicosilado, ou derivados dos mesmos; (b) um flavonóide glicosilado; e (c) um nucleosídeo. a) ) O ácido fenólico glicosilado é preferivelmente um ácido cinâmico glicosilado ou um derivado deste. O extrato mais preferivelmente compreende pelo menos um de ácido cafeoíla-4-O-quínico, cafeoíla-4-O- glicosídeo, coumaroila-4-O-glicosídeo (glic/gal) ou coumaroil-4-O-glicosídeo (dissacarídeo). O extrato pode compreender 1, 2, 3 ou cada um destes glicosídeos. Em uma forma de realização preferida da invenção, o extrato de fruta de acordo com o terceiro aspeto da invenção compreende um ácido cinâmico glicosilado ou derivado deste e um ácido benzóico ou derivado deste como divulgado acima.

É mais preferido que o extrato compreenda glicosídeo do ácido caféico; e/ou ácido p-coumárico hexose/diidrocaenpferol hexose; e/ou ácido ferúlico glicosídeo; e/ou um derivado do ácido p-coumárico. b) O flavonóide glicosilado é preferivelmente Naringina, Quercetina-3-O-glicosídeo ou Rutina. O extrato pode compreender um, dois ou cada um destes glicosídeos. O bioativo é mais preferivelmente Rutina. c) O nucleosídeo pode ser qualquer um de AMP, Uridina, Adenosina, Guanosina ou GMP. O extrato pode compreender 1, 2, 3, 4 ou de cada um destes nucleosídeos. O nucleosídeo é preferivelmente Guanosina e/ou 3’-monofosfato de Adenosina.

O extrato de fruta de acordo o terceiro aspecto da invenção também pode opcionalmente conter um glicosídeo esteroidal tal como Tomatidina.

Os extratos de frutas preferivelmente não contêm nenhuma gordura ou carotenóides.

Dois extratos preferidos, que podem ser preparados a partir das frutas e particularmente tomate de acordo com os métodos da invenção, foram descobertos compreender os seguintes compostos bioativos nas concentrações especificadas (mg/g): (1) Um extrato preferido, preparado de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2, compreende: (a) O seguinte ácido fenólico glicosilado ou éster fenólicos: ácido caféico de glicosídeo (0,01 a 1 mg/g); Acido p-coumárico hexose/mistura de diidrocaenpferol hexose (0,05 a 2,5 mg/g) Acido ferúlico glicosídeo (0,025 a 5 mg/g); e Derivado do ácido p-coumárico (0,01 a 1 mg/g). O flavonóide glicosilado: Rutina (0,01 a 1 mg/g). (c) Os seguintes nucleosídeos / nucleotídeos: Guanosina (0,1 a 5 mg/ml); e 3’monofosfato de adenosina (0,5 a 25 mg/ml) (2) um extrato com baixo teor de açúcar preferido, preparado de acordo com os métodos descritos no Exemplo 3, compreende: (a) O seguinte ácido fenólico glicosilado ou éster fenólicos: Acido caféico glicosídeo (1 a 25 mg/g); Acido p-coumárico hexose/mistura de diidrocaenpferol hexose (5 a 100 mg/g); Acido ferúlico glicosídeo (25 a 300 mg/g); e Derivado do ácido p-coumárico (1 a 25 mg/g) (b) o flavonóide glicosilado: Rutina (1 a 25 mg/g) (c) os seguintes nucleosídeos/nucleotídeos: Guanosina (1 a 50 mg/g); e 3’-monofosfato de adenosina (1 a 50 mg/g); Dois extratos de tomate específicos agregando o segundo ou terceiro aspectos da invenção são identificados na tabela 1. A tabela 1 identifica 16 compostos (na coluna 3 eoIDN- também é fornecido na coluna 2) que foram isolados e ensaiados (ver, Exemplo 1) e descobertos ter mais atividade anti-plaquetas. Portanto, é preferido que extratos de acordo com o segundo e terceiro aspectos da invenção compreendam cada um destes 16 compostos bioativos. Será apreciado que os métodos do primeiro aspecto da invenção sejam preferivelmente intencionados otimizar a atividade destes 5 compostos em um extrato de fruta.

A Tabela 1 também identifica as faixas (mg/g peso úmido) de cada composto bioativo encontrado nos extratos preparados de acordo com os métodos especificados nos Exemplos 2 e 3 respectivamente. A concentração média (mg/g) também é mostrada. Os extratos mais preferidos de acordo com 10 o segundo ou terceiro aspectos da invenção compreendem os compostos bioativos nestas faixas especificadas. Tabela 1: Compostos anti-plaquetas no extrato de tomate, agrupado por tipo de composto

Seguindo a análise detalhada dos compostos bioativos contidos dentro de um extrato de tomate, chegou-se à conclusão que outros 16 compostos também tinham atividade anti-agregação. Portanto, foi determinado que os extratos mais preferidos de acordo com o segundo e terceiro aspectos da invenção contêm os 32 compostos bioativos identificados na Tabela 2.Tabela 2: Extratos mais preferidos compreendendo 32 compostos bioativos

Um extrato preferido de acordo o terceiro aspecto da invenção compreende a recombinação da fração 1, fração 2 e fração 3 como indicado no Exemplo 1 (1.1.3) para formar um extrato recombinado. Verificou-se que tal extrato recombinado é enriquecido em bioativos divulgados acima e tinha uma eficácia surpreendentemente melhorada para inibir a agregação de plaquetas.

Formulações Farmacêuticas e Nutracêuticas que Compreendem o Extrato de Frutas

Os extratos de frutas da invenção podem ser formulados para a administração oral. Como tal, estes podem ser formulados como soluções, suspensões, xaropes, tabletes, cápsulas, pastilhas e barras para lanche, suplementos e emplastros por via de exemplo. Tais formulações podem ser preparadas de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, o extrato pode ser formado em um xarope ou outra solução para a administração oral, por exemplo, como uma bebida saudável. Um ou mais excipientes selecionados de açúcares, vitaminas, agentes de sabor, agentes de coloração, conservadores e agentes de engrossamento podem ser incluídos em tais xaropes ou soluções. Os agentes de ajuste de tonicidade tais como cloreto de sódio, ou açúcares, podem ser adicionados para fornecer uma solução de uma força osmótica particular, por exemplo, uma solução isotônica. Um ou mais agentes de ajuste de pH, tais como agentes de tamponamento também podem ser usados para ajustar o pH até um valor particular, e preferivelmente o mantém em um alto valor. Os exemplos de agentes de tamponamento incluem tampões de citrato de sódio/ácido cítrico e tampões de fosfato.

Altemativamente, o extrato pode ser secado (por exemplo, através da secagem por pulverização ou secagem por congelamento) e o produto seco formulado em uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida, por exemplo como um tablete, pastilha, cápsula, pó, granulado ou gel.

As composições contendo os extratos podem ser preparadas sem quaisquer componentes adicionais. Altemativamente, estas podem ser preparadas absorvendo-as em um suporte sólido; por exemplo, um açúcar tal como sacarose, lactose, glicose, frutose, manose ou um álcool de açúcar tal como xilitol, sorbitol ou manitol; ou um derivado de celulose. Outros absorventes particularmente úteis incluem absorventes com base em amido como farinhas de cereais por exemplo farinha de trigo e farinha de milho.

Para a formação do tablete, o extrato pode ser tipicamente misturado com um diluente tal como um açúcar, por exemplo, sacarose e lactose, e alcoóis de açúcar tais como xilitol, sorbitol e manitol; ou celulose modificada ou derivado de celulose tal como celulose em pó ou celulose microcristalina ou carboximetil celulose. Os tabletes também conterão tipicamente um ou mais excipientes selecionados de agentes de granulação, aglutinantes, lubrificantes e agentes de desintegração. Os exemplos de desintegrantes incluem amido e derivados de amido, e outros polímeros expansíveis, por exemplo, desintegrantes poliméricos reticulados tais como carboximetilcelulose reticulada, pirrolidona reticulada e glicolatos de amido. Os exemplos de lubrificantes incluem estearatos tais como estearato de magnésio e ácido esteárico. Os exemplos de aglutinantes e agentes de granulação incluem polivinilpirrolidona. Onde o diluente não é naturalmente muito doce, um adoçante pode ser adicionado, por exemplo, glicirrizinato de amónio ou um adoçante artificial tal como aspartame, ou sacarinato de sódio.

Os extratos também podem ser formulados como pós, grânulos ou semi-sólidos para a incorporação nas cápsulas. Quando usados na forma de pós, os extratos podem ser formulados juntos com qualquer um ou mais dos excipientes definidos acima em relação aos tabletes, ou podem ser apresentados em uma forma não diluída. Para a apresentação na forma de um semi-sólido, os extratos secos podem ser dissolvidos ou colocados em suspensão em um líquido viscoso ou semi-sólido tal como um polietileno glicol, ou um carregado líquido tal como um glicol, por exemplo, propileno glicol, ou glicerol ou um óleo vegetal ou de peixe, por exemplo um óleo selecionado de óleo de oliva, óleo de girassol, óleo de cártamo, óleo de onagrácea, óleo de soja, óleo de fígado de bacalhau, óleo de arenque, etc. Tais extratos podem ser enchidos em cápsulas de gelatina dura ou gelatina macia ou feitas a partir de equivalentes de gelatina dura ou macia, as cápsulas de gelatina macia ou equivalentes à gelatina sendo preferidas para os enchimento de líquido viscoso ou semi-sólidos.

Os extratos de acordo com a invenção também podem ser fornecidos em uma forma de pó para a incorporação em barras alimentícias tipo lanche, por exemplo, barras de frutas, barras de nozes, e barras de cereal. Para a apresentação na forma de barras alimentícias tipo lanche, os extratos podem ser misturados com qualquer um ou mais ingredientes selecionados de frutas secas tais como tomates secos no sol, passas e uvas sultaninas, amendoim ou cereais tais como aveias e trigo.

Os extratos de acordo com a invenção também podem ser fornecidos em uma forma de pó para a reconstituição como uma solução. Ao passo que estes também podem conter excipientes solúveis tais como açúcares, agentes de tamponamento tais como tampões de citrato e fosfato, e agentes efervescentes formados a partir de carbonatos, por exemplo, bicarbonatos tais como bicarbonato de sódio e amónio, e um ácido sólido, por exemplo, ácido cítrico ou um sal do ácido de nitrato.

Em uma forma de realização preferida, um extrato de acordo com a invenção é fornecido em uma forma de pó opcionalmente junto com um excipiente sólido preferido (por exemplo, em pó) para a incorporação em cápsulas, por exemplo, uma cápsula de gelatina dura.

Uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida da presente invenção pode conter até cerca de 1000 mg da composição, por exemplo até cerca de 800 mg.

O extrato pode ser apresentado como suplementos alimentícios ou aditivos alimentícios, ou pode ser incorporado em alimentos, por exemplo alimentos funcionais ou nutracêuticos.

Os extratos da invenção podem ser apresentados na forma de formas de dosagem única contendo uma concentração definida dos compostos com atividade para inibir a agregação de plaquetas. Tais formas de dosagem únicas podem ser selecionadas de modo a obter um nível desejado de atividade biológica. Por exemplo, uma forma de dosagem única pode conter uma quantidade de até 1000 mg (peso seco) de uma composição de acordo com a presente invenção, mais tipicamente até 800 mg, por exemplo de 50 mg a 800 mg, por exemplo, 100 mg a 500 mg. As quantidades particulares da composição que podem ser incluídas em uma forma única de dosagem podem ser selecionadas de 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg e 800 mg.

Os extratos da invenção podem ser incluídos em um recipiente, acondicionamento ou dispensador junto com as instruções para a administração.

Os produtos preferidos que compreendem os extratos de acordo com a invenção são definidos no Exemplo 5.

Dosagem

Para o tratamento das doenças e condições aqui incluídas, a quantidade do extrato de acordo com a invenção administrada a um paciente, por dia, dependerá da condição ou doença particulares sob tratamento e sua gravidade, e principalmente estará sujeita a recomendação do profissional da área médica. A quantidade administrada, contudo, será tipicamente uma quantidade não tóxica eficaz para tratar a condição em questão.

Para uma composição que contém açúcares, a dose diária recomendada de um extrato de fruta preparado de acordo com os métodos da invenção é entre 0,5 g e 20 g e mais preferivelmente entre 2 g e 7 g. Uma dose diária pode ser de cerca de 3 g. Para uma composição com baixo teor de açúcares (ver acima), a dose diária recomendada pode ser entre 10 mg e 500 mg e é mais preferivelmente entre cerca de 85 mg e cerca de 150 mg.

Um regime de dosagem diário típico para um paciente humano que sofre de uma doença cardiovascular pode ser de cerca de 70 mg a 285 mg, preferivelmente cerca de 25 mg a 100 mg por quilograma de peso corporal de um extrato contendo açúcares de frutas e pode ser de cerca de 1 mg a 2,25 mg 100 mg por quilograma de peso corporal de um extrato com baixo teor de açúcar.

O extrato pode ser administrado em unidades de dosagem únicas ou múltiplas por dia, por exemplo de uma a quatro vezes diárias, preferivelmente uma ou duas vezes por dia. E mais preferido que o extrato seja fornecido como uma dose diária única.

Os extratos podem ser administrados na forma de suco de tomate ou concentrados destes sozinho ou em mistura com outros sucos fruta tal como suco de laranja.

Indicações de eficácia terapêutica

A capacidade das composições que compreendem os extratos da invenção de fornecer efeitos terapêuticos benéficos pode ser avaliada com relação a vários parâmetros diferentes. Os exemplos abaixo fornecem detalhes de protocolos adequados para a avaliação da agregação de plaquetas ou principalmente hemostase, a qual pode ser investigada de modo a avaliar a eficácia terapêutica. O analisador da função de plaquetas PFA-100® descrito nos Exemplos é um dispositivo relativamente novo para a avaliação da hemostase primária, mas foi bem validado (ver, por exemplo, “The plateletfunction analyzer (PFA-100®) for evaluating primary hemostasis” por M. Franchini Hematology, Volume 10, Depositado em 3 de junho de 2005 , páginas de 177 a 181).

Outros parâmetros que podem ser avaliados para este propósito incluem a fluidez sanguínea e o fluxo sanguíneo, onde um aumento na fluidez ou fluxo será geralmente um indicativo de um efeito útil do ponto de vista terapêutico.

Métodos de medir a fluidez sanguínea

Uma medição direta da fluidez sanguínea pode ser obtida usando um Analisador de Fluxo de Arranjo de Micro Canal (MC-FAN), tal como o MC-FAN HR300 disponível da Arkray, que imita os vasos capilares.

Um protocolo adequado para o uso de um MC-FAN é fornecido em “Determinants of the daily rhythm of blood fluidity”, por Tatsushi Kimura, Tsutomu Inamizu, Kiyokazu Sekikawa, Masayuki Kakehashi e Kiyoshi Onari (Journal of Circadian Rhythms 2009, 7:7).

Resumidamente, os microssulcos com largura de 7 μm, comprimento de 30 μm, profundidade 4,5 μm são formados, por exemplo, através da foto-fabricação na superfície de um pastilha de cristal de silício única. As dimensões adequadas da pastilha pode ser em tomo de 15 x 15 mm. Os microssulcos são então formados nos microcanais a prova de vazamento que representam os capilares. Esta conversão em canais pode, por exemplo, ser obtida cobrindo rijamente os canais com uma cobertura tal como uma placa de vidro oticamente plana. Os sulcos adequados podem ser transformados em microcanais herméticos servindo-se de uma placa de vidro oticamente polida.

As dimensões dos microcanais são tal que o volume do fluido que flui através de um caminho é extremamente pequeno. Portanto, é desejável replicar os canais fluxo de modo a facilitar a medição da vazão. A referência citada acima descreve a produção de um dispositivo em que 8736 caminhos de fluxo do mesmo tamanho são criados. O substrato de silício pode ser depois montado no sistema de fluxo de microcanais, MC-FAN (Hitachi Haramachi Electronics Co., Ltd, Ibaraki, Japão), que toma possível observar diretamente o fluxo dos elementos das células sanguíneas através do microcanal sob um microscópio controlado a uma unidade de visualização de imagem. O fluxo pode ser continuamente visto enquanto o tempo de passagem para um dado volume de sangue é automaticamente determinado.

Um valor adequado de passagem de sangue pode ser expressado como uma função do tempo de passagem do sangue integral atual sobre o tempo de passagem da solução salina de 12 segundos em uma pressão de 20 cm H2O, como segue:

Métodos de medir o fluxo sanguíneo

A fluxometria de ultrassom por doppler é um método amplamente usado para a avaliação do fluxo sanguíneo através dos métodos adequados em vasos sanguíneos in vivo usando o ultrassom por doppler são bem conhecidos àqueles habilitados na técnica, e incluem aqueles descritos em “Measurement blood fluidity by ultrasound: accuracy and sources of error.” Por R. W. Gill (Ultrasound Med Biol. 1985 Jul-Ago;l 1(4):625-41).

Breve Descrição dos Desenhos

A invenção será agora ilustrada, mas não limitada, pelos seguintes exemplos, e com referência às figuras em anexo, em que: Figura 1: representa os exemplos das curvas de resposta das dosagens de % da inibição da agregação versus concentração da solução inibidora gerada por (a) Composto 1; (b) Composto 5; (c) Composto 9; (d) Composto 18; (e) Composto 23; e (f) Composto 30 como divulgado no Exemplo 1. (a) e (b) representam as curvas de resposta das dosagens da inibição em % da agregação mediada por ADP. (c) e (d) representam as curvas de resposta das dosagens da inibição em % da agregação mediada por colágeno. (e) e (f) representam as curvas de resposta das dosagens da inibição em % da agregação mediada por ácido araquidônico. Figura 2: define um método preferido de acordo com o primeiro aspecto da invenção para fabricar os extratos de frutas como divulgado no Exemplo 2. Figura 3: é um cromatograma de HPLC do xarope produzido usando o método detalhado no Exemplo 2. Os compostos bioativos são numerados no cromatograma. Figura 4: define um método preferido de acordo com o primeiro aspecto da invenção para fabricar os extratos de frutas com baixo teor de açúcar como divulgado no Exemplo 3. Figura 5: é um cromatograma de HPLC do xarope produzido usando o método detalhado no Exemplo 3. Os compostos bioativos são numerados no cromatograma. Figura 6: Mudança em % da agregação da base em resposta aos diferentes agonistas de plaquetas, 3 horas após o consumo de extrato de tomate (TE) ou suplementos de controle (C), como descrito no Exemplo 4. Os agonistas de plaquetas usados foram difosfato de adenosina (ADP) 7,5 μmol/1 e 3 μmol/1, e colágeno 5 mg/1 e 3mg/l. As diferenças significantes entre os suplementos TE e C são indicadas no gráfico (P < 0,001). N = 9 para todas as medições. Figura 7: Mostra os tempos registrados de fechamento médio registrados na base (0), t = 3 horas (3) após a suplementação com TE ou C e t = 5 horas (5) após a suplementação com TE ou C, como descrito no Exemplo 6. n = 3 para cada grupo. As diferenças significantes entre C e TE são indicadas no gráfico por * (P = 0,011).

EXEMPLO 1

A presente invenção é fundamentada em outra pesquisa que foi conduzida em vista da atividade anti-plaquetas identificada no extrato de fruta descrito na WO 99/55350.

Foram conduzidas experiências exaustivas por meio das quais também fracionaram os extratos de tomate para identificar os compostos dentro de tais extratos que foram ligados aos seus efeitos inibidores na agregação de plaquetas. Foram identificados muitos compostos (nem todos identificados do ponto de vista químico; e nem todos os dados são aqui apresentados) com o extrato de fruta que não tinha nenhum efeito ou efeitos desprezíveis na agregação de plaquetas. Contudo, foram surpreendidos em descobrir 32 compostos com impressão de atividade notável nas classes de produtos químicos definidos pelo terceiro aspecto da invenção. Esta descoberta os levou a desenvolver os métodos do primeiro aspecto da invenção de modo que a atividade de tais compostos pôde ser mantida/enriquecida nos extratos de frutas.

1.1 . MÉTODOS 1.1.1 Preparação de um Extrato de Tomate como definido pela WO 99/55350.

Um extrato de tomate foi preparado usando pasta de tomate de quebra a frio comercialmente disponível de 28 a 30°Brix (isto é, 28 a 30 % de sólidos, p/p) tendo um índice de douramento (absorvência em uma solução de concentração de 12,5 g de sólidos solúveis/1 a 420 nm) < 0,350 AU como o material de partida. A pasta foi diluída (1:5) com água ultrapura e matéria grande particulada foi removida através da filtração centrífuga seguido pela clarificação usando um Separador Westfalia MSB-14 (um clarificador de disco de centrífuga) na temperatura ambiente. A matéria particulada menor foi depois removida através da microfiltração em uma temperatura que não excede 45°C, para fornecer uma solução clara cor de palha que não contém nenhum sólido centrifugado insolúvel e é capaz de passar através de um filtro de 0,2 μ sem a perda de sólidos solúveis. Esta solução foi concentrada através da evaporação até um xarope de 65 °Brix, usando condições cuidadosamente controladas e uma temperatura que não excede 50°C até o limite do progresso das reações de douramento não enzimáticas. Uma etapa de pasteurização cintilante (T = 105°C por 3 segundos) foi incorporada no início do procedimento de evaporação. O produto final foi caracterizado por um índice de douramento < 0,600 AU, e uma contagem total da placa microbiana de < 1000.

1.1.2 Enriquecimento do extrato de tomate com os compostos ativos de interesse e remoção dos materiais inativos.

De modo a produzir um material de partida mais concentrado em componentes bioativos, os açúcares foram removidos a partir do produto descrito acima como segue.

Uma coluna de resina de 130 1 contendo resina FPX66 (Rohm and Haas) foi preparada e equilibrada em água ultrapura a 4°C. O material descrito em 1.1.1 foi diluído até aproximadamente 8 Brix com água ultrapura, e passado através da coluna de resina em uma vazão de aproximadamente 260 1/minuto, mantendo a temperatura a 4°C. O permeato da coluna foi descarregado. Uma vez que todo o material necessário foi passado através da coluna, uma lavagem com água de aproximadamente 130 1 foi passada através deste e descarregada. Em seguida, os compostos que foram retentidos pela resina foram eluídos, passando-se 130 1 de água quente (75°C) através das colunas, seguido por 130 1 em 80 % de etanol, seguido por outros 130 1 de água quente. Todo o material eluído foi retido e combinado para fornecer aproximadamente 400 1 de aproximadamente 25 % de solução etanólica contendo os compostos de interesse.

A solução diluída contendo os compostos de interesse foi concentrada através da osmose reversa usando membranas Trisep ACM5 em temperaturas em tomo de 30°C. O solvente de etanol/água passado através desta membrana, enquanto todos os compostos neste dissolvido permaneceram dentro da membrana. Uma vez que a solução diluída foi concentrada 10 vezes, isto é, o volume foi reduzido de 40 a 50 1, a diafiltração foi iniciada, enquanto a água ultrapura foi adicionada ao retentato em uma taxa igual à taxa de remoção do permeato. Deste modo, a concentração de etanol da solução foi gradualmente reduzida de 25 % a < 5 %.

A solução de ~15 a 20 % de sólidos foi depois secada por pulverização usando um secador por pulverização anidro para formar um pó dourado fino com teor de umidade de < 6 %. Este foi o extrato de tomate enriquecido final, que foi usado para isolar os componentes anti-plaquetas de interesse.

1.1.3 Isolamento e caracterização dos compostos bioativos individuais no extrato de tomate

Uma solução de carga de 50 mg/ml foi preparada a partir do pó seco descrito em 1.1.2, dissolvendo-o em água de grau HPLC ultra-pura. O HPLC semi-preparativo foi realizado usando uma coluna semi-preparativa Luna C18(2) 5μ, 100 x 4,6 mm, injetando 100 μl na coluna nesta hora. Usando um coletor de fração, os componentes que absorvem UV contidos no extrato de tomate foram divididos em três frações volumosas. A fração 1 continha muitos nucleosídeos e nucleotídeos. A Fração 2 continha muitos ácidos/ésteres fenólicos glicosídeos e ácido fenólicos. A Fração 3 continha muitos flavonóide glicosídeos e flavonóides. As três frações volumosas foram secadas por secagem por congelamento, e redissolvidas em água para fornecer as soluções de 50 mg/ml. Cada fração foi por sua vez então submetida a outro HPLC semi-preparativo usando a mesmo coluna, mas com gradientes diferentes, adaptados à polaridade e características de eluição de cada fração. De cada fração volumosa, até 10 frações individuais ou misturadas foram coletadas usando um coletor de fração.

As frações individuais foram secadas por congelamento e redissolvidas em 1 ml de água pura. Cada fração foi depois examinada por HPLC-MS analítico, usando uma coluna analítica Luna Cl8(2) 3μ, 100 x 4,6 mm, operando em um gradiente de acetonitrila/ácido fórmico. As características de cada fração isolada foram determinadas pela coleta de seu espectro de UV por intermédio de um detector de arranjo de diodo, e através do exame de seus íons característicos gerados por MS de eletro pulverização no modo iônico positivo.

Onde necessário, as purificações finais (por exemplo, para remover os contaminantes menores) foram realizados por outra HPLC. Finalmente, os compostos purificados foram secados por congelamento e armazenados congelados. As soluções de carga foram preparadas a 50 mg/ml e diluídas em tampão de HPLC para produzir 6 níveis e concentração, que foram usados para calibrar o método de HPLC, de modo que os fatores de resposta puderam ser calculados para cada composto individual. Estas curvas de calibração e fatores de resposta foram depois usados para quantificar o compostos presente no extrato de tomate. Os tipos/identidades estruturais dos compostos bioativos isolados são mostrados na Tabela 3.

1.1.4 Métodos de ensaiar a atividade para inibir a agregação de plaquetas

O protocolo experimental descrito abaixo foi intencionado para determinar os valores IC50 dos compostos isolados como descrito em 1.1.3. Os bioensaios brutos para avaliar a inibição da agregação de plaquetas in vitro foram realizadas em alguns extratos brutos (dados não mostrados) para auxiliar as ffações/compostos finos selecionados identificados por HPLC para a atividade funcional. Este método foi considerado necessário para evitar a necessidade de ensaiar cada e todo composto (seriam milhares) nos extratos de frutas.

Um valor IC50 representa a quantidade de um composto, em mg, necessário para inibir 50 % da agregação de plaquetas induzida sob condições padronizadas em 1 ml de plasma rico em plaquetas, em comparação com as amostras de controle.

A atividade dos 32 compostos mais ativos é dada na Tabela 4. Flebotomia e amostras sanguíneas

O sangue para os estudos in vitro foi coletado a partir de voluntários humanos saudáveis isentos de medicamento, tanto homens quanto mulheres, com de 18 a 60 anos de idade, com função de plaquetas normais. Os pacientes declararam que não consumiram medicamentos ou suplementos conhecidos afetar a função de plaquetas por um mínimo de 10 dias antes de fornecer uma amostra de sangue. O sangue foi coletado após uma venopunção simples a uma veia antecubital através de agulhas siliconizadas em tubos de coleta de sangue citratados de plástico (Sarstedt Monovettes, concentração final de citrato de sódio, 13 mmol/1). Todo o sangue foi mantido a 37°C a partir do tempo da amostragem sanguínea.

Preparação do plasma rico em plaquetas

O plasma rico em plaquetas (PRP) foi obtido através da centrifugação de sangue citratado por 15 minutos a 200 x g, e foi ajustado com plasma pobre em plaquetas até um número de plaquetas padrão de 320 ± 20 x 109/l antes do uso. O PRP foi usado para as medições de função das plaquetas dentro de duas.

Agonistas de plaquetas

Os seguintes agonistas foram usados para as medições de função das plaquetas. O a concentração de difosfato de Adenosina (ADP), foi de 10 μmol/1; colágeno, concentração final 5 mg/1; ácido araquidônico, concentração final de 500 U/L (todos da Helena Biosciences, Sunderland, RU); a concentração final de peptídeo que ativa o receptor de trobina (TRAP) foi de 25 nmol/L (Sigma-Aldrich, Poole, RU). Os agonistas foram preparados a partir de soluções de carga imediatamente antes do uso, diluindo em soluções salinas fisiológicas aquecidas (0,9 % de NaCl).

Preparação das soluções inibidoras de plaqueta

Os inibidores de plaquetas individuais foram preparados em uma concentração entre 500 g/1 e 100 g/1 em solução salina fisiológica, metanol ultra puro ou DMSO ultra-puro (Sigma-Aldrich, Poole, RU) e armazenados congelados até necessários. As soluções de carga foram depois diluídas com solução salina fisiológica imediatamente antes do uso. Incubação dos inibidores de plaquetas com PRP450 μl de PRP foram incubados com 50 μl de solução inibidora diluída a 37°C por 10 minutos, em epindorrfs de baixa retenção. As soluções inibidoras foram diluídas tal que a concentração final de metanol ou DMSO na amostra de PRP nunca excedeu 2 %. As amostras de controle adequadas, contendo 50 μl de solução salina fisiológica igualadas ao teor de metanol ou DMSO como apropriado, foram simultaneamente incubadas. Para cada composto inibidor, 5 concentrações de incubação foram usadas; as concentrações finais de 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml, 1,00 mg/ml, 5,00 mg/ml e 10 mg/ml foram usadas como padrão.

Medição da agregação de plaquetas e inibição da agregação

Após a incubação com inibidores de plaquetas, as amostras de PRP foram transferidas a cadinhos de vidro e o grau de agregação induzido por ADP, colágeno, TRAP ou ácido araquidônico foi monitorado durante 10 minutos em um agregômetro de plaquetas (PACKS 4, Helena Biosciences, Sunderland, RU). Uma amostra de controle foi operada com cada conjunto de amostra. A partir das curvas de agregação geradas, a área sob a curva foi calculada para cada amostra de PRP, e a inibição da agregação obtida em cada concentração inibidora foi calculada comparando-se a área sob a curva para estas amostras de PRP com aquela da amostra de controle. A inibição da agregação foi expressada como inibição em %, se comparado ao controle, e dos 6 pontos de dados obtidos por composto inibidor, uma curva de resposta à dosagem foi formada. Esta curva foi depois usada para determinar o valor IC5o para aquele composto inibidor, como apresentado em 1.2, Resultados, e Figura 1.

Para cada amostra de sangue obtida, curvas de resposta de 6 pontos das dosagens para 2 compostos inibidores diferentes puderam ser geradas. Estas experiências foram repetidas tal que para cada composto inibidor, pelo menos 3 (mais frequentemente de 7 a 10) valores IC50 foram obtidos em dias diferentes, usando o sangue de diferentes pessoas (isto se aplica a cada agonista de interesse). Uma média de IC50s diferentes foi então tomadas e estes valores são apresentados em 1.2, Resultados, Tabela 4.

1.2 RESULTADOS

As propriedades físico-químicas dos 32 compostos descobertas ter mais atividade antiplaquetas (ver abaixo) são resumidas na Tabela 3.Tabela 3: Propriedades Físico-químicas dos Compostos Bioativos Identificados nas Frutas

A Tabela 4 fornece os dados de IC50 (para inibir a agregação de plaquetas) para os 32 compostos identificados no extrato de tomate. A 5 atividade foi ensaiada como descrito no Método 1.1.4. A Figura 1 fornece os exemplos de curvas de resposta das dosagens de inibição em % da agregação mediada por ADP versus a concentração de solução inibidora gerada para (a) um nucleosídeo (citidina); (b) um nucleotídeo (3’-monofosfato de adenosina; (c) um ácido fenólico glicosídeo (glicosídeo do ácido caféico); (d) um ácido fenólico (Ácido caféico); (e) um glicosídeo flavonóide (Quercetin-3-O- glicosídeo); e (f) um flavonóide (Quercetina). Tabela 4: Atividade Antiplaquetas dos Compostos Identificados nos Extratos de Frutas

1.3 CONCLUSÕES

Foram testados vários compostos descobertos dentro dos extratos de tomate e estabeleceram que os 32 compostos identificados nas tabelas 2 e 3 têm eficácia para prevenir a agregação de plaquetas. Além disso eles concluíram que, dos 32 compostos isolados e que mostraram ter capacidade anti-agregamento, 16 destes compostos foram mais importantes para a bioatividade geral. Estes 16 compostos são mostrados na Tabela 1.

Em particular, foram surpreendidos em descobrir que os compostos bioativos podem ser agrupados em (a) compostos fenólicos (e ésteres e derivados de glicosídeo destes); (b) flavonóides (e éster e derivados de glicosídeo destes) e (c) nucleotídeos/nucleosídeos. Isto os leva a afirmar que duas novas classes de compostos (os fenólicos e os flavonóides) existem, os quais possuem um efeito inibidor na agregação de plaquetas.

Destes compostos, o mais anti-agregação dos compostos não fenólicos foi o AMP. A modificação do nucleosídeo por resíduos de açúcar e fosfato teve o efeito de aumentar de maneira substancial o comportamento anti-agregação. Isto foi surpreendente ao passo que o trabalho anterior identificou citidina e adenosina como constituintes anti-plaquetas, mas não os nucleotídeos.

Dos compostos derivados de ácido fenólico identificados, os mais anti-agregação gerais foram as formas glicosiladas de ácido p-coumárico e caféico. Estes compostos glicosilados apresentaram um potencial anti- agregação notavelmente maior em resposta a todos os agonistas testados, se comparado aos ácidos livres não glicosilados. Esta é a primeira vez que uma tal relação de estrutura-função foi indicada. Portanto, os compostos fenólicos glicolisados representam as moléculas bioativas mais preferidas que podem estar contidas nos extratos de acordo com a invenção e que devem ser mantidas/enriquecidas nos extratos preparados de acordo com o método do primeiro aspecto da invenção.

Uma descoberta similar foi feita com relação aos derivados de flavonóide. Os glicosídeos ou outros derivados conjugados de quercetina e naringenina foram notavelmente mais anti-agregação do que os flavonóide gliconas. Isto foi particularmente perceptível em resposta ao TRAP e agonistas do ácido araquidônico, mas também aplicado ao ADP e agonistas de colágeno. Enquanto uma quantidade (muito limitada) de estudos da estrutura- função foram indicados na literatura para os flavonóide agliconas livres, os autores não sabem de qualquer estudo que compare as agliconas e as moléculas conjugadas. Portanto, os compostos de flavonóide glicosilado também representam as moléculas bioativas mais preferidas que podem estar contidas nos extratos de acordo com a invenção e que devem ser mantidas/enriquecidas nos extratos preparados de acordo com o método do primeiro aspecto da invenção.

Foi interessante notar que quando a razão de AMP para adenosina diminuiu, a bioatividade geral do extrato diminuiu. O mesmo foi descoberto acontecer quando a razão do ácido/ésteres fenólicos glicosídeos para ácidos fenólicos livres diminuiu, e quando a razão do flavonóide glicosídeos para flavonóides livres diminuiu.

E valioso notar que um modo simples de produzir um extrato de fruta de acordo com o terceiro aspecto da invenção é divulgado em 1.1.3. Um extrato preparado de acordo com os métodos divulgados na WO 99/55350 pode ser fracionado para isolar as três frações que foram identificadas como tendo atividade anti-plaqueta. A fração 1 continha muitos nucleosídeos e nucleotídeos. A Fração 2 continha muito ácido/ésteres de glicosídeos fenólicos, e ácidos fenólicos. A Fração 3 continha muito glicosídeos de flavonóide e flavonóides. Estas três frações podem então ser recombinadas (fração 1 +2 + 3) para fornecer um extrato de acordo o terceiro aspecto da invenção o qual possui eficácia surpreendente.

EXEMPLO 2

Em vista ao conhecimento adquirido com relação aos compostos ativos dentro extratos de tomate. Continuou-se a desenvolver métodos de processar as frutas para produzir extratos em que a atividade dos compostos foi mantida e/ou em que a concentração de tais compostos ativos foi enriquecida.

Após muita experimentação, foi estabelecido que a metodologia de acordo com o primeiro aspecto da invenção foi ótimo para produzir os extratos enriquecidos em um número significante de compostos ativos identificados no Exemplo 1.

Tendo estabelecido esta metodologia, foi desenvolvido um processo que pode ser usados na escala industrial dos métodos da invenção para produzir um xarope que pode ser usado na fabricação de produtos farmacêuticos ou alimentícios (bebidas ou comidas).

O processo para fabricar tal xarope é ilustrado na Figura 2 e representa uma forma de realização preferida do primeiro aspecto da invenção.

Os xaropes preparados de acordo com o processo da Figura 2 representa extrato mais preferido de acordo com o segundo ou terceiro aspecto da invenção e têm as propriedades definidas na Tabela 2 (ver, acima) e também a Tabela 5.Tabela 5: Composição de um Extrato de Tomate mais preferido de acordo com o segundo ou terceiro aspectos da invenção.

O xarope pode conter até 70 % de matéria de seca de açúcares simples (glicose, frutose e sacarose) e pode conter até 50 % de água.

Os xaropes mais preferidos usando este método contêm até 32 componentes bioativos, que são numerados no cromatograma de HPLC apresentado na Figura 3 e corresponde aos compostos numerados identificados nas Tabelas de 1 a 4 e divulgados nos Exemplo 1.

Algumas características adicionais dos xaropes, que são importantes na otimização do seu perfil de bioatividade, são fornecidas na tabela 6 (abaixo). Os números dos compostos se referem ao cromatograma apresentado na Figura 3 e aos compostos identificados nas Tabelas de 1 a 4.Tabela 6

Foi reconhecido que as características descritas na Tabela 6 foram importantes quando otimizando a atividade anti-plaqueta dos extratos de acordo com a invenção. Os extratos mais preferidos de acordo com o segundo ou terceiro aspectos da invenção têm estas propriedades. Além disso, estas características podem ser usadas como medições para o controle de qualidade nas formas de realização mais preferidas dos métodos do primeiro aspecto da invenção. Portanto, estas características são particularmente úteis ponto de controle quando os extratos são produzidos em uma escala industrial.

EXEMPLO 3

Também foi desenvolvido um processo que pode ser usado na escala industrial dos métodos da invenção para a produção de um extrato de fruta com baixo teor de açúcar na forma de um pó. O pó também pode ser usado na fabricação de produtos farmacêuticos alimentícios (comidas e bebidas).

Um processo para produzir tal pó é ilustrado na Figura 4 e representa uma forma de realização preferida do primeiro aspecto da invenção.

Os extratos preparados de acordo com o processo da Figura 4 também representa os extratos preferidos de acordo com o segundo ou terceiro aspecto.

Os extratos preparados de acordo com o processo da Figura 4 representam um extrato preferido de acordo com o segundo ou terceiro aspectos da invenção e têm as propriedades definidas na Tabela 2 (ver acima) e também na Tabela 7.Tabela 7: Composição de um Extrato de Tomate com Baixo Teor de Açúcar Preferido de Acordo com o Segundo ou Terceiro Aspectos da Invenção

O pó pode conter menos do que 1 % açúcares simples de matéria seca (glicose, frutose e sacarose) e pode conter < 6 % de água. O extrato em pó enriquecido tipicamente contém até 60 % de compostos bioativos.

Os extratos produzidos usando este método também contêm até 33 diferentes componentes bioativos, que são numerados no cromatograma de HPLC apresentado na Figura 5 e correspondem aos compostos numerados identificados nas Tabelas de 1 a 4 e como divulgado no Exemplo 1.

Algumas características adicionais destes pós, que são importantes na otimização do seu perfil de bioatividade, são dados na Tabela 8. Os números dos compostos se referem ao cromatograma apresentado na Figura 5 e nas tabelas de 1 a 4.Tabela 8

Foi reconhecido que as características descritas na tabela 8 foram importantes quando otimizando a atividade anti-plaqueta dos extratos de acordo com a invenção. Os extratos mais preferidos de acordo com o segundo ou terceiro aspectos da invenção têm estas propriedades. Além disso, estas características podem ser usadas como medidas para o controle de qualidade na forma de realização mais preferida dos métodos do primeiro aspecto da invenção. Portanto, estas características são particularmente úteis para o ponto de controle quando os extratos são produzidos em uma escala industrial.

EXEMPLO 4

No seguinte Exemplo, uma experiência é descrita em que a eficácia anti-plaqueta de um composição preparada de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2 foi testada. Será apreciado que as composições preparadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 3 podem ser testados seguindo o mesmo protocolo.

4.1 Protocolo de estudo 4.1.1 Objetivos de estudo descrição curta

Este estudo quantificou o efeito anti-plaquetas ex vivo do consumo de uma bebida de tratamento contendo 3 g de xarope de extrato de tomate (preparado de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2), comparado a um suplemento de controle, em pessoas saudáveis.

4.1.2 Esquema de estudo

Um esquema de estudo cego prosseguiu. Os pacientes em jejum foram canulados e uma amostra de base foi retirada entre 07:00 e 08:00. Diretamente após a coleta da amostra de base, os pacientes consumiram um tratamento (TE) ou um suplemento de controle. Outras amostras sanguíneas foram depois retiradas da cânula no tempo t = 3 horas. Foram oferecidos aos pacientes pequenos volumes (25 ml) de água entre os pontos de tempo de amostragem para evitar desidratação.

4.1.3 Pacientes

9 adultos saudáveis de ambos os sexos foram recrutados ao estudo. Os pacientes tinham de 40 a 65 anos de idade, sem nenhum histórico médico de doenças sérias ou distúrbios hemostáticos. A adequabilidade para a inclusão ao estudo foi avaliada pelos questionários de dieta e estilo de vida e triagem médica, durante a qual uma contagem total de sangue foi obtida. Os indivíduos com baixas contagens hematológicas não foram incluídos no estudo. Qualquer um dos pacientes que consumiu habitualmente suplementos alimentares (por exemplo, óleos de peixe, óleo de organáceas) suspendeu estes suplementos por um período mínimo de um mês antes de participar do estudo. Os pacientes foram instruídos a se abster do consumo de medicamentos conhecidos afetar função das plaquetas por um período de 10 dias antes da participação. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes, e o estudo foi aprovado pelo Grampian Research Ethics Committee.

4.1.4 Flebotomia

Os pacientes recrutados ao estudo foram canulados usando uma agulha em forma de borboleta siliconizada com 21 escalas, para causar o rompimento mínimo à veia enquanto retirando várias amostras sanguíneas. Para minimizar a ativação do sistema hemostático, um máximo de três venopunções foi especificado. A cânula permaneceu no lugar durante todo o período de tempo do estudo, e as amostras de sangue venoso de ~ 30 ml foram retiradas em cada ponto de tempo de amostragem, descartando os primeiros 2 ml em cada ocasião. Após a coleta da amostra de sangue, a cânula foi fluida com solução salina para prevenir o bloqueio. Para as medições da função de plaqueta e tempo de coagulação, o sangue foi coletado em seringas de plástico e transferido em tubos de coleta de sangue citratados (concentração final de citrato de sódio, 13 mmol/1). Para a medição da proteína reativa com C (CRP), uma amostra de sangue de tempo de base simples (5 ml) foi retirada em anticoagulante EDTA (concentração final, 1,6 g/1). Para a medição do fibrinopeptídeo A em cada ponto de tempo, 4,5 ml de sangue foi coletado em 0,5 ml de um anticoagulante misturado contendo EDTA, trasilol e clorometilcetona. As amostras de sangue foram incubadas a 37°C em uma incubadora portátil para transferir ao laboratório. Quaisquer amostras de sangue que mostram a evidência da ativação, definidas como uma concentração de fibrinopeptídeo A maior do que 6 μg/L, foram descarregadas. Qualquer voluntário que apresentou evidência de uma resposta inflamatória elevada, como evidência por uma concentração de proteína reativa em C de base maior do que 6 mg/L, foi retirado do estudo pelo período afetado, e a intervenção agendada foi realizada em uma data posterior.

4.1.5 Agregação ex vivo dos estudos de plaquetas

As medições do grau de ADP e agregação de plaquetas induzida por colágeno no plasma rico em plaquetas foram realizadas em cada ponto de tempo. As diferentes concentrações de agonistas podem ser usadas para aproximar diferentes condições fisiológicas. De modo a coletar os dados sob as condições do estímulo de plaquetas sub-ótimo, uma concentração menor padronizada (3 μmol/1 para ADP, 3 mg/1 para colágeno) foi definida como sub-ótima, enquanto uma concentração superior padronizada (7,5 μmol/L para ADP, 5 mg/1 para colágeno) foi definida como ótima. Estas concentrações de agonistas foram usadas para todas as medições. Os efeitos na agregação de plaquetas observados após o tratamento ou intervenções de controle são expressados como a mudança em porcentagem na área sob a curva de agregação após o consumo do extrato/placebo, comparado aos valores da base.

4.1.6 Medições suplementares

A detecção de alta CRP plasmático foi realizada usando um ensaio de aglutinação de látex semi-quantitativo (Dade Behring, RU), que detectou níveis no plasma de > 6 mg/L. Este limiar é tomado como uma indicação da ativação aguda do sistema inflamatório, tal como pode ser associado com a infecção (por exemplo, início de uma infecção viral ou um resfriamento) ou dano (por exemplo, tendinite). As amostras que apresentaram sinais de tal ativação aguda não devem ser usadas para os estudos de função de plaquetas.

As medições de FPA foram realizadas por ELISA (ensaio de Zymutest FPA, HyphenBioMed, França), no plasma a partir do qual o fibrinógeno foi removido através dos tratamentos de adsorção de bentonita. A presença de FPA no plasma em níveis maiores do que 6 μg/1 foi tomada como uma indicação da ativação do sistema hemostático durante a amostragem sanguínea. Tais amostras não puderam ser usadas para a medição da função das plaquetas ao passo que os resultados obtidos não podem ser confiáveis. Deste modo, os níveis de circulação de CRP e os níveis de amostra sanguínea FPA foram usados para indicar a adequabilidade das amostras para as medições de plaqueta.

4.2 Resultados

Nenhuma amostra de sangue retirada durante este estudo apresentou níveis de circulação de CRP maior do que o limiar de 6 mg/1, indicando que a ativação de fase aguda não estava presente em qualquer paciente durante o estudo dos dias de amostragem. Similarmente, nas amostras de sangue retiradas para este estudo, nenhuma amostra apresentou níveis de FPA maiores do que o limiar de 6 μg/1. Deste modo, todas as amostras de sangue recebidas foram julgadas adequadas para os estudos da função de plaquetas. Estes dados de triagem não são incluídos.

Os dados apresentados na Figura 6 ilustram as medições de agregação de plaquetas realizadas na base (t = 0) e em 3 horas após o consumo dos suplementos de tratamento (t = 3). Os resultados são expressados como inibição em % da capacidade de agregação da plaqueta, comparado aos valores de base.

4.3 Conclusões

A Figura 6 demonstra que os extratos de tomate de acordo com a invenção resultam em uma redução da agregação de base de plaquetas de entre 18 % e 28 % para a agregação mediada por ADP, e entre 3 % e 12 % para a agregação mediada por colágeno, 3 horas após o consumo. O consumo do suplemento de controle resultou em uma mudança da agregação da base entre 2 % e 4 % para a agregação mediada por ADP, e de aproximadamente 2 % para a agregação mediada por colágeno, após 3 horas. As diferenças entre os pontos de tempos da base e de 3 horas não foram significantes para o suplemento de controle, mas foram significantes em P < 0,001 para o suplemento de extrato de tomate. As diferenças entre o suplementos de controle e de extrato de tomate também foram significantes no nível P < 0,001.

Estes resultados demonstram claramente que os extratos de tomate de acordo com a invenção são úteis para tratar as condições caracterizadas pela agregação de plaquetas inapropriada.

Além disso, foi estabelecido que os métodos de acordo com a invenção resultam na produção de novos extratos de tomate com propriedades melhoradas quando comparado aos extratos de tomate conhecidos (por exemplo, aqueles divulgados na WO 99/55350). Foi comparada a atividade anti-plaqueta ex vivo medida após comer o extrato de tomate produzido através do método de processamento conhecido, e o extrato de tomate produzido usando os métodos de acordo com a presente invenção que alvejam a manutenção dos glicosídeos e ésteres. Eles descobriram que uma dose única de 3 g de extrato de tomate de acordo com a presente invenção resultou em uma inibição de 3 μmol/1 de agregação de plaqueta induzida por ADP de 28 % se comparado à base considerando que, os extratos conhecidos resultam em uma inibição da agregação de plaquetas induzida por ADP de ~ 25 % embora isto seja somente obtido pelo consumo de 9 g do extrato. Deste modo, os métodos da presente invenção parecem enriquecer os bioativos no extrato em aproximadamente 3 vezes. Portanto, a utilização dos métodos do primeiro aspecto da invenção resultam em um extrato mais potente e, vantajosamente, a dose diária necessária pode ser reduzida.

EXEMPLO 5

Foram preparados vários produtos que representam as formulações preferidas que compreendem os extratos de acordo com a invenção.Bebidas de iogurte contendo os extratos de tomate.

Os extratos de tomate preparados como descrito nos Exemplos 2 e 3 são ambos adequados para a incorporação em uma bebida de iogurte. Um exemplo de tal bebida pode ser preparado como segue.

Uma bebida de iogurte, formulada sem culturas de probióticos vivas, deve ser pré-pasteurizada e resfriada de 4 a 8°C. O iogurte resfriado deve ser misturado com o extrato de tomate como preparado no Exemplo 2 na razão de 50:1, ou com um extrato de tomate como preparado no Exemplo 3 na razão de 1000:1 (p/p). A acidez deve ser checada e regulada com ácido cítrico, e o sabor deve ser ajustado. Uma cultura probiótica é necessária no produto final, esta deve ser adicionada após o ajuste, e a mistura final deve ser acondicionada em garrafas de porção única de 150 g.

Cada garrafa de porção única de 150 g deve então conter 3 g de extrato de tomate preparado de acordo com o Exemplo 2, ou 150 mg de extrato de tomate preparado de acordo com o Exemplo 3. Isto representa uma dose única diária. Os produtos finais devem ser armazenados a 4°C para usa vida de prateleira recomendada (tipicamente entre 14 e 21 dias).

Pastas espalháveis contendo o extrato de tomate

O extrato de tomate preparado como descrito no Exemplo 3, ou novamente processado para fornecer um encapsulado, é adequado para a incorporação em pastas espalháveis. Um exemplo de tal formulação pode ser produzido através da dosagem de pós-pasteurisação do extrato de tomate em pó com baixo teor de açúcar nos pastas espalháveis pré-formulados, pasteurizado e resfriado na razão de 200:1 (p/p). A mistura deve ser homogeneizada em alto cisalhamento para garantir a distribuição homogênea, e o acondicionamento em recipientes de múltiplas porções.

O texto do rótulo deve incluir a informação de que a ingestão diária normal da pasta espalhável deve ser de aproximadamente 30 g. O consumo de 30 g de pasta espalhável por dia resultará em uma ingestão diária de aproximadamente 150 mg de extrato de tomate, que constitui uma dose diária única. A pasta espalhável deve ser armazenada a 4°C para a duração de sua meia vida (tipicamente 90 dias).

Bebidas com Base em Suco de Fruta Contendo Extratos de Tomate

Os extratos de tomate preparados como descrito nos Exemplos 2 e 3 são ambos adequados para a incorporação em uma bebida com base em suco de fruta. Um exemplo de tal bebida pode ser preparado como segue.

Diluir o suco de laranja concentrado com água na razão de 1:5,4. Para reconstituir o suco, adicionar 0,1 % de sabor de toranja, 0,05 % de sabor abacaxi, e 1.2 % de extrato de tomate como produzido no Exemplo 2. Testar a acidez e a doçura, e adicionar até 5 % de ácido cítrico (regulador de acidez) e até 2 % de sucralose, como necessário. Pasteurizar por 90 segundos al21°C.

Acondicionar a mistura pasteurizada em caixas de 1 1, ou em caixas de ou garrafas de porção única. 250 ml da bebida final como descrita, devem conter aproximadamente 3 g de extrato de tomate, equivalente a uma dose diária única. Os detalhes do rótulo devem conter esta informação e o conselho de beber uma porção de 250 ml por dia.

Outros concentrados de suco de fruta são igualmente apropriados para o uso; altemativamente os sucos de fruta frescos, misturas de sucos de frutas e vegetais, ou misturas contendo quantidades variáveis de polpa podem ser preparados.

Encapsulados

Preparar uma solução a 50 % em p/p de extrato de tomate em pó com baixo teor de açúcar que foi fabricado como descrito no Exemplo 3. Elevar a temperatura até 60°C. Misturar com um volume igual de: uma mistura fundida e emulsificada de gorduras de alta fusão, por exemplo, triglicerídeos; uma solução de polissacarídeos dispersados, por exemplo, pectinas, ágar; ou outros polímeros adequados. Homogeneizar com cuidado para garantir a mistura correta. Produzir um encapsulado usando uma técnica tal como secagem por pulverização de temperatura controlada, controlando o tamanho de partícula de modo que o tamanho de partícula final é de < 200 μ. Os aditivos tais como agentes de coloração, conservadores ou agentes de fluxo livre podem ser adicionados à dispersão antes da secagem por pulverização, como apropriado.

O encapsulado resultante deve conter entre 12 % e 20 % de extrato de tomate em uma base em p/p. O encapsulado deve ser armazenado a < 4°C, no escuro, em materiais de empacotamento de folha lacrada. A dosagem do encapsulado deve ser na faixa de 400 mg a 700 mg por dia, quando incorporada nos produtos alimentícios.

Formulações em sache prontas para dissolver

O extrato de tomate como descrito no Exemplo 3 é adequado para a incorporação em formulações de sache de porção única pré-misturadas, prontas para dissolver. Um exemplo de tal formulação pode ser preparado misturando-se: 150 mg de extrato de tomate com baixo teor de açúcar em pó; 285 g de maltodextrina; 6,5 g de sabor creme de morango; 0,8 g de sucralose; 3,8 g de ácido cítrico; 2,5 g de cor vermelho beterraba natural; e 0,25 g de caramelo. A mistura em pó seco de ~ 300 g pode ser apresentada em um sache de porção única, adequada para dissolver entre 50 ml e 300 ml de água, a gosto. Cada 300 g de mistura contém uma dose única diária de extrato de tomate.

A formulação de sache em pó deve ser armazenada na temperatura ambiente, e apresentada com instruções para consumir um sache por dia em água.

Tabletes

O extrato de tomate como descrito no Exemplo 2 pode ser usado para preparar os tabletes para o uso farmacêutico ou como suplemento alimentício, por exemplo, formação de tablete através da compressão direta, como segue.

O extrato de tomate como descrito no Exemplo 2 deve ser moído/triturado até uma faixa de tamanho de partícula de 1 a 3 μ, antes da formação de tablete. O extrato em pó pré-moído deve ser misturado seco com um excipiente tal como celulose microcristalina, ou maltodextrina M700, para fornecer lubrificação durante o processo de compressão. Uma razão de 40 % de extrato para 60 % de excipiente é adequada, mas as razões de 10:90 a 60:40 também podem ser usadas. Os agentes de coloração em pó também podem ser adicionados como necessário.

Usando uma máquina de formação de tablete convencional, ajustada em uma pressão de 1,5 a 2,0 toneladas/polegada quadrada, 212 g de tabletes de 5 kg de firmeza podem ser produzidos. Tais tabletes conterão 85 mg de extrato de tomate por tablete. O armazenamento em acondicionamentos de bolha de folha de alumínio laminada é recomendado. Em tal acondicionamento, os tabletes serão estáveis ao armazenamento sob temperaturas de até 45° C. Dois tabletes devem ser tomados juntos, uma ou duas vezes por dia, para obter um nível de dosagem recomendado.

EXEMPLO 6

No Exemplo 4 os efeitos anti-plaqueta diretos de uma composição preparada de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2 foram descritos. Para ilustrar que estes efeitos anti-plaqueta são de uma magnitude para afetar a fluidez sanguínea ou fluxo sanguíneo, outro trabalho foi realizado em que os efeitos desta composição na hemostase primária geral foi medida. A hemostase, isto é, a interrupção do sangramento através do processo de coagulação, ocorre em duas partes. A hemostase primária se refere à capacidade do sangue integral formar micro- e macro- agregados de plaqueta sob condições de fluxo, e forma uma coagulação de plaquetas inicial em uma superfície rica em colágeno (normalmente uma parede do vaso sanguíneo). A hemostase secundária se refere à formação de uma rede de fibrina nesta coagulação primária, induzida pela trombina, que leva a uma coagulação mais permanente que leva um tempo significante para dissolver por intermédio da fibrinólise. A medição da hemostase primária fornece os dados que podem ser mais fisiologicamente relevantes do que os dados de agregação sozinhos, quando examinando a eficácia da composição de extrato de tomate que afeta a fluidez sanguínea e deste modo, o fluxo sanguíneo.

No seguinte Exemplo, uma experiência é descrita, em que o efeito da hemostase primária geral de uma composição preparada de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2 foi testada, usando um Analisador da Função das Plaquetas, o PFA-100®. O dispositivo analisados da função de plaquetas tem se tomado uma ferramenta útil para a medição da hemostase primária em pequenas amostras de sangue. Este sistema de testes é um instrumento controlado por um microprocessador que emula a fase dependente de plaqueta in vitro da hemostase primária, enquanto delimitando o papel dos fatores reológicos. Basicamente, o sistema monitora a interação das plaqueta em membranas revestidas com colágeno-ADP (COL-ADP) ou colágeno-epinefrina (COL-EPI). As amostras de sangue citratadas são aspiradas sob condições de fluxo controlado (taxa de cisalhamento: 4.000 a 5.000/s) através de um corte de abertura de 150 micrômetros na membrana. Durante o processo, o tampão de crescimento de plaquetas progressivamente bloqueia o fluxo sanguíneo através do corte de abertura. A capacidade de plaqueta hemostática na amostra de sangue é indicada pelo tempo necessário para o tampão de plaquetas para fechar a abertura (tempo de fechamento), que é expressado em segundos.

6.1 Protocolo de Estudo 6.1.1 Objetivos de estudo e descrição curta

Este estudo examinou o efeito ex vivo do consumo de 3 g de xarope de extrato de tomate (preparado de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2), comparado a um suplemento de controle, na hemostase primária em pessoas saudáveis.

6.1.2 Esquema do Estudo

6 adultos saudáveis de 45 a 75 anos de idade, com parâmetros hemostáticos normais (contagens sanguíneas), sem nenhum histórico médico de doenças graves ou distúrbios hemostáticos, e sem consumir suplementos alimentícios ou medicamentos conhecidos afetar a função da plaqueta, foram recrutados. O consentimento informado por escrito foi obtido, e o estudo foi aprovado pela Grampian Research Ethics Committee. As amostras de sangue de base (anti-coaguladas com tampão de dextrose de citrato ácido) foram retiradas de pessoas em jejum entre 07:00 e 08:30. Diretamente após a coleta das amostras de base, os pacientes consumiram um tratamento (TE) ou um suplemento de controle. Outras amostras de sangue foram então retiradas no tempo t = 3 horas, e t = 5 horas após a suplementação.

6.1.5 Medição ex vivo da hemostase primária

A medição do tempo de fechamento em PFA-100 nas amostras de sangue integral foi realizada em cada ponto de tempo. As medições foram realizadas usando membranas de colágeno-epinefrina. Resumidamente, cartuchos contendo as membranas apropriadas foram trazidos até a temperatura ambiente, e 900 μl de sangue integral anti-coagulado foram inseridos no reservatório de cada cartucho. Os cartuchos foram depois imediatamente inseridos na unidade de processamento do PFA-100. O sangue foi aspirado automaticamente do reservatório através da membrana do cartucho em alto cisalhamento, até a abertura da membrana ser fechada (tempo de fechamento) ou por um máximo de 300 s na hora em que a coagulação se formou. Os tempos de fechamento foram registrados e um impresso foi produzido. Todas as medições foram realizadas em um mínimo de 30 minutos após a amostragem de sangue.

6.2 Resultados

Os tempos médios de fechamento para cada tratamento são apresentados graficamente na Figura 7. Nesta Figura, os tempos de fechamento médios registrados são apresentados em uma base (tempo 0 com relação à suplementação com o tratamento (TE) ou controle (C)), e em 3 horas e 5 horas após a suplementação com TE ou C. n = 3 para cada grupo, e os dados foram analisados por ANOVA. As diferenças significantes entre C e TE são indicadas no gráfico por * (P = 0,011).

6.3 Conclusões

Os resultados demonstram que os extratos de tomate que representam as composições de acordo com a invenção resultam em um aumento médio no tempo de fechamento em PFA-100 de 24 % dos valores de base, 3 e 5 horas após o consumo. O consumo do suplemento de controle resultou em uma diminuição média dos tempos de fechamento base de 16 % após 3 horas, e 12 % após 5 horas. As diferenças entre os pontos de tempo de base e 3 e 5 horas não foram significantes para o suplemento de controle, mas foram significantes em P = 0,011 para suplemento de extrato de tomate. As diferenças entre o suplementos de controle e de extrato de tomate foram significantes ( P = 0,011).

Os resultados mostram que as composições de suplemento de extrato de tomate de acordo com a invenção aumentam o tempo levado para a coagulação de uma plaqueta se formar em cada abertura do cartucho, implicando que o potencial hemostático da plaqueta diminuiu. O tempo mais longo necessário para um coágulo se formar reflete em uma fluidez sanguínea elevada.

Estes resultados demonstram claramente que as composições (tais como extratos de tomate) de acordo com a invenção são úteis na redução da fluidez sanguínea. Isto favorece seu uso na normalização do fluxo sanguíneo.

Claims

1. Método para fabricar um extrato de fruta da família Solanaceae, caracterizado pelo fato de que a fruta é processada para otimizar a atividade de inibição de agregação de plaquetas do extrato compreendendo as etapas de: (a) Preparar uma mistura de partida da fruta homogeneizada em que o pH da mistura de partida não exceda 5,5; (b) Separar uma fração solúvel em água dos sólidos insolúveis com um tamanho de partícula >500μ; (c) Filtrar a fração solúvel em água para gerar uma solução que passe através de um filtro de 0,2μ sem perda de sólidos; e (d) Concentrar os agentes ativos no permeato de filtração; em que as etapas (b) e (d) não envolvem um procedimento que eleve a temperatura da fração acima de 60°C, e em que o extrato é substancialmente livre de licopeno.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura de manutenção da mistura de partida não excede 35°C.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o índice de douramento da mistura de partida, definido como a absorbância da porção solúvel a 420 nm, não excede 0,4 AU em 4 % de sólidos.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de incluir uma outra etapa após a etapa (c) para remover açúcares livres da fração solúvel em água.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o extrato é uma solução aquosa concentrada contendo <1% de açúcar, e contendo >95% de compostos bioativos contidos na mistura de partida.

6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que os açúcares são removidos através da separação mediada por resina.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o extrato é ainda tratado para formar um pó.

8. Uso de um extrato de fruta obtido por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir a condição médica determinada por agregação de plaquetas inapropriada, sendo para um propósito selecionado de prevenir ou reduzir a ocorrência de um estado hipercoagulável ou pró-trombótico; prevenir ou reduzir o desenvolvimento da aterosclerose; prevenir o desenvolvimento da doença coronária; prevenir o desenvolvimento da restenose após procedimentos de angioplastia e desvio; tratar doença coronária resultante de distúrbios trombo- embólicos e prevenir ou reduzir o risco de trombose de veia profunda.