CN112080507A - 一种调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4及其表达的蛋白、载体和应用 - Google Patents

一种调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4及其表达的蛋白、载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4及其表达的蛋白、载体和应用，所述关键基因GbMYB4其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明以银杏叶片为材料，克隆了GbMYB4基因，构建含基因GbMYB4的过量表达载体并转入银杏愈伤组织以及拟南芥中，本发明GbMYB4转基因银杏愈伤组织和转基因拟南芥中类黄酮的含量均显著降低，这表明GbMYB4能够抑制类黄酮的合成，对类黄酮进行负调控作用，可以与类黄酮合成的促进类基因相互配合有效控制如银杏类黄酮的合成量，因此调控GbMYB4的表达在提高银杏叶片药用品质等方面具有重要的应用价值。

Description

一种调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4及其表达的蛋 白、载体和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4及其表达的蛋白、载体和应用。
背景技术
银杏(Ginkgo biloba L.)，又名公孙树，是裸子植物门银杏科银杏属多年生乔木，它是中国特有的重要经济林树种。银杏具有很高的药用价值，其中银杏叶的药用价值最为突出。研究发现银杏叶提取物(Extraet of Ginkgo biloba，EGB761)可用于治疗心脑血管疾病和神经系统疾病,且毒副作用小。而类黄酮化合物是控制银杏叶提取物质量的一类重要物质，目前已从银杏叶提取物中分离出40余种类黄酮化合物，主要包含黄酮、黄烷酮、黄酮醇、二氢黄酮醇等。类黄酮化合物的整个合成过程较为复杂，目前在拟南芥中已经分离出多个类黄酮化合物合成的关键酶基因突变体，对应的关键基因包括CHS、CHI、F3'H、F3'5'H等，而这些关键结构基因一般可受到转录因子的转录调控作用。
研究表明，黄酮醇通常可受到单独的MYB转录因子或形成MYB-bHLH二聚体及MYB-bHLH-WD40(MBW)复合物的调控影响。在葡萄中发现VvMYBF1可通过启动激活FLS基因的表达，促进黄酮醇的合成，将VvMYBF1转入到拟南芥myb12突变体中，可以使突变体的黄酮醇缺失表型得到一定的恢复。将MYB22在苹果果肉的愈伤组织中过量表达，发现可促进FLS的表达以及类黄酮的积累；MYB22转入拟南芥myb11/12/111突变体中，能够提高黄酮醇的含量，恢复突变体的缺失表型，说明MYB22能够激活FLS的启动子。日本龙胆GtMYBP3和GtMYBP4能够增强FNS及F3'H的启动子活性，在拟南芥中过量表达能够促进黄酮醇合成相关基因的表达以及黄酮醇的生物合成。在梨果实中，PbMYB9可以结合PbUFGT1启动子诱导黄酮醇积累，最近研究又发现PbMYB12b基因的过量表达能够促进PbCHS和PbFLS基因的表达，提高黄酮醇中槲皮素和异鼠李素类物质的含量。
类黄酮化合物是银杏次生代谢物中最重要的代谢产物之一，是影响银杏叶片GbE的重要成分。目前通过研究已经确定一些基因能够直接促进银杏类黄酮合成。但是对于银杏类黄酮合成进行负调控的基因鲜有报道，因此对银杏黄酮负调控相关基因进行开发研究意义重大，其有利于多方向调控银杏类黄酮合成，从而可以有效地控制银杏类黄酮的合成量，为推广应用生物工程生产银杏次生代谢产物提供技术支撑。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4，该基因的表达能够对银杏类黄酮含量进行有效的负调控。
本发明还提供了所述的调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4表达的蛋白、载体及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4，其核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
本发明所述的调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO.2所示。
本发明所述含有所述的调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4的表达载体。
其中，所述表达载体在GbMYB4基因的5’端组装了组成型强表达启动子CaMV35S，它能使GbMYB4基因在银杏和拟南芥体内高效表达。。
其中，所述表达载体在GbMYB4基因的3’端组装了终止子OCS，可有效终止GbMYB6基因的转录。
其中，所述表达载体上组装有NPTⅡ基因表达盒，作为转基因银杏和拟南芥的筛选标记，可以用卡那霉素进行转基因银杏和拟南芥的筛选。
其中，所述表达载体上组装有LB(T-Border left)和RB(T-Border right)序列，促使组装于其间的GbMYB4基因表达框架和筛选标记基因NPTⅡ整合至银杏和拟南芥受体细胞染色体中。
本发明所述含有所述的表达载体的宿主细胞。
本发明所述的关键基因GbMYB4在调控银杏类黄酮合成中的应用。
本发明所述的关键基因GbMYB4表达的蛋白在调控银杏类黄酮合成中的应用。
本发明以银杏叶片为材料，克隆了GbMYB4基因。同时，采用通过酶切连接将该基因构建到过量表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS，通过同源重组技术构建获得35S::GbMYB4载体。该基因位于启动子CaMV35S之后，在启动子CaMV35S的驱动下，GbMYB4可在银杏和拟南芥体内高效表达，从而调控类黄酮的合成。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过将GbMYB4基因转入银杏和拟南芥体，过量表达GbMYB4基因的转基因银杏和拟南芥体的类黄酮含量都明显降低，说明GbMYB4是抑制银杏类黄酮合成的关键基因，GbMYB4能够抑制或者负调控类黄酮的合成，因此调控GbMYB4的表达在提高银杏叶片药用品质等方面具有重要的应用价值。通过对GbMYB4基因进行克隆和功能研究为采用基因调控技术改良调控银杏黄酮类物质合成提供理论依据，本发明提供的对类黄酮进行负调控基因GbMYB4，其有利于多方向调控银杏类黄酮合成，可以与类黄酮合成的促进类或者正调控基因相互配合有效控制如银杏类黄酮的合成量，并为推广应用生物工程生产银杏次生代谢产物提供技术支撑。
附图说明
图1是GbMYB4的克隆(a)和菌液检测(b)；
图2是pCAMBIA2300-35S-OCS载体结构示意图；
图3是GbMYB4载体构建阳性检测；
图4是构建好的植物表达载体35S::GbMYB4的结构示意图；
图5是GbMYB4转基因银杏愈伤组织的表达量检测；
图6是GbMYB4转基因银杏愈伤组织的类黄酮含量检测；
图7是GbMYB4转基因拟南芥的DNA检测；
图8是GbMYB4转基因银拟南芥的类黄酮含量检测。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
克隆GbMYB4基因
(1)基于银杏基因组和银杏的转录组数据，筛选得到了一个MYB基因，通过序列比对和进化分析命名为GbMYB4。使用Primer Premier 5.0软件进行人工设计GbMYB4的ORF引物。其中，GbMYB4 ORF正向引物(ORF F引物)为seq id no.3：5’-atgggtcggtctccttgctg-3’，gbmyb4 orf反向引物(orf r引物)为seq id no.4：5’-tacccgcagttgcctgtaat-3’。
(2)利用高保真酶PrimeSTAR Max(Takara，日本)PCR扩增，PCR体系如下：
Figure BDA0002667108380000031
将上述混合液轻柔混匀，瞬时低速离心后放置于普通PCR反应仪中，设置如下程序：
Figure BDA0002667108380000041
跑胶：取出PCR仪中的基因扩增产物，利用电泳仪将适量产物点在1％的琼脂糖凝胶上进行检测，25min左右后拿出应用成像系统进行观察，获得目的片段(图1a)。
(3)纯化片段与克隆载体的连接反应
参照pEASY-Blunt Simple Cloning Kit(全式金，中国)操作说明书将胶回收产物连接到克隆载体上，具体体系如下：
Figure BDA0002667108380000042
在微型管中将体系中的溶液混合，室温反应5min。反应结束后放在冰上待用。
(4)大肠杆菌转化
参照Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell产品说明书(全式金，中国)，将已连接的产物与感受态细胞混合，经过冰浴、热激、复苏后，取适量涂布于LB平板上，倒置平板，37℃过夜培养。
(5)阳性克隆筛选及测序分析
从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。
反应体系:
Figure BDA0002667108380000043
Figure BDA0002667108380000051
反应程序：
Figure BDA0002667108380000052
菌液PCR检测为阳性的克隆(图1b)送英骏生物技术公司(上海)测序鉴定，测得GbMYB4的ORF序列为819bp，序列如SEQ ID NO.1所示，用于后续实验，其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1
ATGGGTCGGTCTCCTTGCTGTGAAAAAGCTCATACCAACAAAGGGGCTTGGACCAAAGAGGAAGACGACAGGCTTATTGCACACATTCAGGCTCATGGAGAAGGATGCTGGAGGTCCCTCCCCAAGGCTGCAGGGCTGCTGCGTTGTGGGAAGAGTTGCAGGCTCCGGTGGATAAACTATCTCCGTCCCGACCTCAAGCGTGGGAATTTTTCAGAAGAAGAAGACGAACTCATCATCAAGCTCCACGCCCTCTTAGGGAACAAGTGGTCTCTCATCGCAGGAAGATTGCCCGGTCGCACAGATAACGAAATAAAAAATTATTGGAACACCCATATAAAAAGAAAATTGATTAGCAGGGGCGTAGACCCACAGTCGCATCAACCCATCCAGACCGGCTATCAGTCGGCCAAGCTAATTGCAGCGGATTCTCCACAGATTTTTGCATTCCAGCGGAATACGCCGGAGATGGCAGACTTCTTCGAATACAATGACATGATGAGTACATCAGTGGAGCAGCAGCAGACGGCAGCTCCAGCTAATTCGGATGGTCAGGGCAGTGGAATCGAAGACCATCCGGACCTCAACCTCGAATTGTGTATCAGTTTGCCCTCTGGCCCGGCTAGCATAAGCAGAGCCACCACAGCCGATTCAAAGGAGGTTTCCAGTCCAAATAGTGCCGGGTCGAAGGCAGACGCTGTGTGCTGTCACATGGGATTGCAAATCAATGGAGGAGGCTGCTGTGAGGATAATAGATGCTCACATGAAGACCATGTGGCTGCGACGGCTGGCCATTTTAATTACAGGCAACTGCGGGTATAA
SEQ ID NO.2
MGRSPCCEKAHTNKGAWTKEEDDRLIAHIQAHGEGCWRSLPKAAGLLRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGNFSEEEDELIIKLHALLGNKWSLIAGRLPGRTDNEIKNYWNTHIKRKLISRGVDPQSHQPIQTGYQSAKLIAADSPQIFAFQRNTPEMADFFEYNDMMSTSVEQQQTAAPANSDGQGSGIEDHPDLNLELCISLPSGPASISRATTADSKEVSSPNSAGSKADAVCCHMGLQINGGGCCEDNRCSHEDHVAATAGHFNYRQLRV
实施例2
GbMYB4基因植物表达载体构建
(1)本实验采用TaKaRa QuickCut限制酶(TaKaRa，日本)对pCAMBIA2300-35S-OCS载体(图2)(Genome-wide identification and analysis of thegrowth-regulatingfactor family in Chinesecabbage(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)，Wang etal.BMC Genomics 2014，15:807)和GbMYB4的ORF序列分别进行酶切反应实验，具体反应体系如下：
Figure BDA0002667108380000061
体系中各溶液混合后进行瞬时离心，在37℃水浴锅中保温30min后结束酶切反应，琼脂糖凝胶电泳观察酶切条带，随后分别将目的基因和载体片段切胶回收，用于后续的载体连接反应。
(2)参照TaKaRa T4 DNA Ligase(TaKaRa，日本)操作说明书，将双酶切反应后回收的表达载体与目的DNA片段产物相互连接，体系如下：
Figure BDA0002667108380000062
在微型管中将体系中的溶液混合，在金属浴中16℃反应5-6h。
通过PCR检测，确认GbMYB4的过量表达载体构建成功(图3)，命名为35S::GbMYB4(图4)，如图4所示，所构建的表达载体在GbMYB4基因的5’端组装了组成型强表达启动子CaMV35S，3’端组装了终止子OCS，表达载体上装NPTⅡ基因表达盒，作为转基因银杏和拟南芥的筛选标记，同时表达载体上组装LB(T-Border left)和RB(T-Border right)序列，促使组装于其间的基因表达框架和筛选标记基因NPTⅡ整合至银杏和拟南芥受体细胞染色体中。
(3)转化农杆菌
参照GV3101/EHA105 Chemically Competent Cell产品(全式金，中国)操作说明书，将步骤(2)构建的35S::GbMYB4表达载体质粒与感受态细胞混合，依次经过静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min后，加入培养基振荡培养。取适量涂布于LB平板上，28℃培养箱倒置培养。挑取平板上的单克隆，加入适量的LB液体培养基，28℃，220rpm，培养48h，对菌液测序，获得含有35S::GbMYB4载体的农杆菌。
实施例3
GbMYB4基因的遗传转化
1、拟南芥遗传转化
(1)于正常生长环境种植野生型拟南芥；
(2)选取土壤中培养四周左右刚开花的拟南芥植株，用剪刀剪去已经开过的花和已有角果，用于农杆菌转化；
(3)将实施例2获得含有35S::GbMYB4载体的农杆菌接种到带有Kana和Rif抗生素的LB液体培养基中，放入摇床28℃，过夜培养18-24h，至OD600＝1.0-1.5；
(4)将符合要求的菌液放入离心管中，4℃，6000rpm，10min离心后去掉上清液；
(5)向步骤(4)的沉淀中加入50mL拟南芥转化液(5％蔗糖+0.02％Silwet L-77)，重悬沉淀；
(6)经6000rpm，10min离心后去掉上清，加入转化液后再次重悬沉淀；
(7)将步骤(2)制备的拟南芥整个花序浸泡在转化液中30sec；
(8)侵染过的拟南芥浇水后，用塑料袋覆盖保湿，放于阴暗环境下培养24h后，去除塑料袋，将拟南芥移到光照培养箱中(16h光照/8h黑暗)正常培养生长；
(9)7d后按照上述方法再浸泡一次，正常培养至种子成熟。
2、拟南芥遗传筛选
(1)将上述采收的拟南芥成熟种子干燥后，取适量放入离心管中，加入质量分数15％的次氯酸钠溶液浸泡消毒3min，期间上下反复颠倒摇晃，然后放入体积分数70％的酒精中继续浸泡3min，然后用无菌水冲洗；
(2)将种子铺洒到含有卡那霉素的1/2MS固体培养基的平板中，封口膜封口；
(3)将培养皿放在4℃环境下春化2d，然后转移到23℃人工培养箱中培养，条件为：16h光照/8h黑暗；
(4)种子在培养基中生长10d后，将具有卡那霉素抗性的幼苗植株移入营养土中，继续用光照培养箱(16h光照/8h黑暗)里培养生长，用于后期的阳性检测和类黄酮含量测定。
3、银杏愈伤组织转化
(1)将实施例2获得含有35S::GbMYB4载体的农杆菌涂在LB平板。经过培养后挑取LB平板上的农杆菌单克隆，将其接种到LB液体培养基中，28℃培养16h至OD600为0.5-0.6；
(2)菌液放入离心管中，18℃，3500rpm，15min离心后去掉上清液；
(3)向离心管加入重悬液(100mL MS液体培养基含100μM乙酰丁香酮)重悬底部菌体，并在室温放置2h；
(4)将大小一致的银杏愈伤组织小块放入农杆菌重悬液中，室温静置浸泡15min，然后用镊子轻轻夹出，用无菌滤纸吸掉表面的重悬液液体；
(5)将侵染过的愈伤组织放置在愈伤培养基(MS+4.0mg·L-1NAA+2.0mg·L-1KT+100μM乙酰丁香酮)上，25℃黑暗培养3d，取出放入液氮中速冻，保存在超低温冰箱中，应用于后续的类黄酮含量测定。
4、转基因材料的检测与类黄酮含量的测定
利用实时定量PCR技术，检测外源基因在RNA水平的表达情况，步骤3得到的转基因银杏愈伤组织中GbMYB4的表达量显著升高(图5)。利用植物类黄酮提取试剂盒(苏州柯铭生物技术有限公司，中国)对未转基因(CK，其他培养条件相同)和转基因银杏愈伤组织的类黄酮含量进行测定，发现转基因愈伤组织中的类黄酮含量显著降低(图6)。对步骤2转基因拟南芥进行阳性检测，获得了4个阳性植株(图7)。通过类黄酮含量测定发现，转基因拟南芥中的类黄酮含量低于CK(未转基因，其他培养条件相同)(图8)。这些结果表明，GbMYB4基因抑制或者负调控类黄酮的合成。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4及其表达的蛋白、载体和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggtcggt ctccttgctg tgaaaaagct cataccaaca aaggggcttg gaccaaagag 60
gaagacgaca ggcttattgc acacattcag gctcatggag aaggatgctg gaggtccctc 120
cccaaggctg cagggctgct gcgttgtggg aagagttgca ggctccggtg gataaactat 180
ctccgtcccg acctcaagcg tgggaatttt tcagaagaag aagacgaact catcatcaag 240
ctccacgccc tcttagggaa caagtggtct ctcatcgcag gaagattgcc cggtcgcaca 300
gataacgaaa taaaaaatta ttggaacacc catataaaaa gaaaattgat tagcaggggc 360
gtagacccac agtcgcatca acccatccag accggctatc agtcggccaa gctaattgca 420
gcggattctc cacagatttt tgcattccag cggaatacgc cggagatggc agacttcttc 480
gaatacaatg acatgatgag tacatcagtg gagcagcagc agacggcagc tccagctaat 540
tcggatggtc agggcagtgg aatcgaagac catccggacc tcaacctcga attgtgtatc 600
agtttgccct ctggcccggc tagcataagc agagccacca cagccgattc aaaggaggtt 660
tccagtccaa atagtgccgg gtcgaaggca gacgctgtgt gctgtcacat gggattgcaa 720
atcaatggag gaggctgctg tgaggataat agatgctcac atgaagacca tgtggctgcg 780
acggctggcc attttaatta caggcaactg cgggtataa 819
<210> 2
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Ala His Thr Asn Lys Gly Ala
1 5 10 15
Trp Thr Lys Glu Glu Asp Asp Arg Leu Ile Ala His Ile Gln Ala His
20 25 30
Gly Glu Gly Cys Trp Arg Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg
35 40 45
Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp
50 55 60
Leu Lys Arg Gly Asn Phe Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Ile Ile Lys
65 70 75 80
Leu His Ala Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu
85 90 95
Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Ile
100 105 110
Lys Arg Lys Leu Ile Ser Arg Gly Val Asp Pro Gln Ser His Gln Pro
115 120 125
Ile Gln Thr Gly Tyr Gln Ser Ala Lys Leu Ile Ala Ala Asp Ser Pro
130 135 140
Gln Ile Phe Ala Phe Gln Arg Asn Thr Pro Glu Met Ala Asp Phe Phe
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Asp Met Met Ser Thr Ser Val Glu Gln Gln Gln Thr Ala
165 170 175
Ala Pro Ala Asn Ser Asp Gly Gln Gly Ser Gly Ile Glu Asp His Pro
180 185 190
Asp Leu Asn Leu Glu Leu Cys Ile Ser Leu Pro Ser Gly Pro Ala Ser
195 200 205
Ile Ser Arg Ala Thr Thr Ala Asp Ser Lys Glu Val Ser Ser Pro Asn
210 215 220
Ser Ala Gly Ser Lys Ala Asp Ala Val Cys Cys His Met Gly Leu Gln
225 230 235 240
Ile Asn Gly Gly Gly Cys Cys Glu Asp Asn Arg Cys Ser His Glu Asp
245 250 255
His Val Ala Ala Thr Ala Gly His Phe Asn Tyr Arg Gln Leu Arg Val
260 265 270
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgggtcggt ctccttgctg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tacccgcagt tgcctgtaat 20

Claims (10)

1.一种调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种权利要求1所述的调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4表达的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种含有权利要求1所述的调控银杏类黄酮合成的关键基因GbMYB4的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体在GbMYB4基因的5’端组装了组成型强表达启动子CaMV35S。
5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体在GbMYB4基因的3’端组装了终止子OCS。
6.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体优选组装有NPTⅡ基因表达盒，作为转基因银杏和拟南芥的筛选标记。
7.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体组装有LB(T-Borderleft)和RB(T-Border right)序列，促使组装于其间的基因表达框架和筛选标记基因NPTⅡ整合至银杏和拟南芥受体细胞染色体中。
8.一种含有权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。
9.一种权利要求1所述的关键基因GbMYB4在调控银杏类黄酮合成中的应用。
10.一种权利要求1所述的关键基因GbMYB4表达的蛋白在调控银杏类黄酮合成中的应用。
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