CN103131715A - 一种调控植物类黄酮合成的基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控植物类黄酮合成的基因及应用，以箭叶淫羊藿叶片总RNA反转录得到的cDNA为模版，经过PCR得到一条长为233bp的片段，其与类黄酮相关的R2R3-MYB基因有很高的同源性，通过RACE技术获得了其全长cDNA序列，并命名为EsMYBA1基因，其序列为SEQIDNO.1所示。EsMYBA1基因编码一种R2R3-MYB转录因子，与其它的控制类黄酮合成途径的MYB调控基因有着50%左右的同源性，通过基因工程技术提高EsMYBA1基因的表达量能够诱导类黄酮相关基因的表达，促进花青素的合成与积累。

Description

一种调控植物类黄酮合成的基因及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和生物技术领域。具体涉及一种调控淫羊藿类黄酮合成途径的基因EsMYBA1的分离克隆，功能验证和应用。EsMYBA1具有调控类黄酮合成途径相关基因表达的功能，从而改变类黄酮合成代谢。本发明还涉及EsMYBA1基因在改变植物类黄酮合成代谢上的应用。

背景技术

淫羊藿为小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epimedium)多年生草本植物。淫羊藿作为滋补类中药已有2000多年的历史，最早记载于《神农本草经》，是中国应用最为广泛、最为悠久的中草药之一(郭宝林，肖培根。中药淫羊藿主要种类评述。中国中药杂志，2003，8(4)：303-307)。淫羊藿不仅具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，而且还有抗衰老、改善免疫功能、抑制肿瘤等功效（Ma H,He X,Yang Y，Li M,Hao D,Jia Z.The genus Epimedium:An ethnopharmacological and phytochemical review.Journal of Ethnopharmacology2011;134:519），因而也是最具开发潜力的中药材之一，受到国内学者的高度重视。除此之外，淫羊藿植株的的花和叶形态各异，颜色丰富多彩，具有较高的园林观赏价值(任璘，戴思兰，王瑛。淫羊藿属植物种质资源及其园林应用。武汉植物学研究2008，26(6)：644-649)。到目前，淫羊藿属植物的研究主要集中在形态分类、地理分布、化学成分提取鉴定、药理作用及药材质量评价等方面(李作洲，徐艳琴，王瑛，黄宏文。淫羊藿属药用植物的研究现状与展望。中草药，2005，36：289-295)，而对其分子生物学、遗传学的研究相对滞后，特别是淫羊藿中类黄酮合成代谢的研究甚少。

类黄酮化合物为一大类植物次生代谢产物，具有C6-C3-C6碳骨架结构，广泛存在于植物各种组织中。常见的类黄酮化合物有花青素，原花青素（又称单宁），黄酮醇，黄烷，黄酮以及主要分布在豆科中的异黄酮等（Winkel-Shirley B.Flavonoid biosynthesis.A colorful model for genetics,biochemistry，cell biology，and biotechnology.Plant physiology2001;126:485.）。类黄酮化合物具有众多重要的生物学功能：如着色于花朵、果实和种子以吸引传粉者和种子传播者，抵抗UV照射和病原菌侵害等，还涉及根瘤形成，生长素运输，花粉萌发延伸和雄性不育等生物学过程（Harborne JB,Williams CA.Advances in flavonoid research since1992.Phytochemistry2000;55:481）。更重要的是，因为类黄酮物质对人类健康非常有利，可以预防和治疗癌症，心脑血管疾病，以及与老龄化相关疾病，所以对类黄酮的研究蓬勃发展，也是目前的研究热点之一（Yao LH,Jiang YM,Shi J,

FA,Datta N,Singanusong R,et al.Flavonoids in Food and Their Health Benefits.Plant Foods for Human Nutrition(Formerly Qualitas Plantarum)2004;59:113）。

类黄酮合成途径是植物次生代谢中研究最为清楚的途径之一，参与其合成的结构基因在几个模式植物中得到了分离与功能鉴定，如拟南芥、金鱼草、玉米、矮牵牛、苹果和葡萄等（Holton T,CornishE.Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis.The PlantCell1995;7:1071；Winkel-Shirley B.Flavonoid biosynthesis.A colorful model for genetics,biochemistry，cell biology，and biotechnology.Plant physiology2001;126:485；Koes R,Quattrocchio F，Mol J.The flavonoid biosynthetic pathway in plants:function and evolution.BioEssays2005;16:123）。目前，在转录水平上存在三类基因家族参与类黄酮合成途径的调控，包括MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白。它们相互结合形成一个MYB-bHLH-WD40(MBW)的复合体，结合于类黄酮结构基因的启动子上从而控制靶基因的转录（Ramsay NA,Glover BJ.MYB-bHLH-WD40protein complex and the evolution of cellular diversity.Trends in Plant Science2005;10:63；Hichri I,Barrieu F，Bogs J,Kappel C,Delrot S,Lauvergeat V.Recent advances in the transcriptional regulation of the flavonoid biosynthetic pathway.Journal of Experimental Botany2011;62:2465）。MYB转录因子因其保守的MYB DNA-binding domain（MYB domain）而著称。在植物中，主要以R2R3-MYB类型的MYB基因大量存在。目前，已从许多植物中分离鉴定出了控制类黄酮合成的MYB基因，并且这些MYB基因往往调控类黄酮途径中的某一个分支，如拟南芥AtPAP1和AtPAP2（Borevitz JO,Xia Y，Blount J,Dixon RA,Lamb C.Activation tagging identifies a conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis.The Plant Cell Online2000;12:2383），矮牵牛PhAN2（Quattrocchio F，Wing J,van der Woude K,Souer E,de Vetten N,Mol J,et al.Molecular analysis of the anthocyanin2gene of petunia and its role in theevolution of flower color.The Plant Cell Online1999;11:1433），苹果MdMYB10（EspleyRV，Hellens RP，Putterill J,Stevenson DE,Kutty Amma S,Allan AC.Red colouration inapple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor,MdMYB10.The Plant Journal2007;49:414）控制花青素合成，而拟南芥AtMYB12（Mehrtens F，Kranz H,Bednarek P， Weisshaar B.The Arabidopsis transcription factor MYB12is a flavonol-specific regulator of phenylpropanoid biosynthesis.Plant physiology2005;138:1083）和葡萄VvMYBF1（Czemmel S,Stracke R,Weisshaar B,Cordon N,Haris NN,Walker AR,et al.The grapevine R2R3-MYB transcription factor VvMYBF1regulates flavonol synthesis in developing grape berries.Plant physiology2009;151:1513）控制黄酮醇合成，而葡萄VvMYB5a（Deluc L,Barieu F,Marchive C,Lauvergeat V，Decendit A,Richard T,et al.Characterization of a Grapevine R2R3-MYB Transcription Factor That Regulates the Phenylpropanoid Pathway.Plant Physiology2006;140:499）和VvMYB5b（Deluc L,Bogs J,Walker AR,Ferrier T,Decendit A,Merillon J-M,et al.The Transcription Factor VvMYB5b Contributes to the Regulation of Anthocyanin and Proanthocyanidin Biosynthesis in Developing Grape Berries.Plant Physiology2008;147:2041）调控整个类黄酮合成途径。

大量报道证实，淫羊藿中主要的有效成分是异戊烯化的黄酮醇苷，为类黄酮合成途径中黄酮醇合成分支途径的末端产物（Ma H,He X,Yang Y，Li M,Hao D,Jia Z.The genusEpimedium:An ethnopharmacological and phytochemical review.Journal of Ethnopharmacology2011;134:519）。另外，有效成分类黄酮化合物在不同物种，不同居群，甚至不同个体和组织中的含量均有显著的差异（李作洲，徐艳琴，王瑛，黄宏文。淫羊藿属药用植物的研究现状与展望。中草药，2005，36：289-295；周涛，张小波，郭兰萍，蔺阁，江维克，艾强，张成刚。粗毛淫羊藿不同部位、不同生境中淫羊藿苷、总黄酮含量的变化分析。中国中药杂志，2012,37:1917-1921）。另外，不同环境条件下，淫羊藿主要活性成分的合成也受到影响（魏国燕，陈建军，廖思红，王瑛。光照对淫羊藿活性成分生物合成的影响。植物科学学报，2012,30:415-422）。这些意味着类黄酮合成途径可能受到某些转录因子的调控，如MYB基因。然而，在淫羊藿中有效成分类黄酮化合物的合成及调控分子机制的研究非常少。因此，对控制淫羊藿类黄酮合成MYB基因的挖掘有利于了解淫羊藿中有效成分分子合成的调控模式。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种调控植物类黄酮合成的基因EsMYBA1，其序列为SEQ ID NO：1所示，其编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。该基因可以调控类黄酮生物合成相关基因的表达，从而改变类黄酮代谢产物的合成，为淫羊藿活性成分类黄酮的代谢工程研究奠定基础。

本发明的另一个目的在于了提供一种调控植物类黄酮合成的基因EsMYBA1在调控植物（烟草，拟南芥，淫羊藿）类黄酮合成上的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：

根据已经公布的调控类黄酮合成途径的R2R3-MYB调控基因的氨基酸序列（拟南芥Arabidopsis thaliana AtPAP1,AAG42001;苹果Malus x domestica MdMYB10a,ABB84753;矮牵牛Petunia x hybrida PhAn2,AAF66727），在其保守区域设计一对简并引物，以箭叶淫羊藿叶片总RNA反转录得到的cDNA为模版，经过PCR（polymerase chain reaction）得到一条长为233bp的片段。对此片段进行克隆测序，然后经过Blast分析，发现它与类黄酮相关的R2R3-MYB基因有很高的同源性，于是将此片段作为靶基因的候选序列。随后，通过RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得了其全长cDNA序列，并命名为EsMYBA1基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。EsMYBA1编码一个R2R3-MYB蛋白，其序列为SEQID NO.2所示，具有保守的R2和R3MYB结构域（domain）（图1），并与其它调控花青素生物合成的MYB调控因子聚为一类（图2）。随后，通过构建CaMV35S启动子驱动的EsMYBA1：GFP融合蛋白进行亚细胞定位，发现EsMYBA1的确定位于细胞核中（图3）。然后，通过酵母双杂交证实EsMYBA1可以与7个类黄酮相关的bHLH转录因子（TF，transcription factor）互作（图4），其中EsMYBA1与烟草NtAN1a的互作关系在拟南芥原生质体中通过双分子荧光互补实验（BiFC，bimolecular fluorescence complementation）得到进一步确认（图6）。采用瞬间荧光素酶分析（transient luciferase assay），发现EsMYBA1可以激活类黄酮合成途径中二氢黄酮醇还原酶基因（dihydroflavonol4-reductase，DFR）和花青素苷合成酶基因（anthocyanidin synthase，ANS）的表达，并且在有AtTT8和EsMYBA1共转化的条件下，它可以更大程度地提高激活能力（图8）。

一种调控植物类黄酮合成的基因EsMYBA1在调控植物（烟草，拟南芥，淫羊藿）类黄酮合成上的应用，其步骤是：通过双酶切将EsMYBA1转移到双元表达载体pMV（来源于pBI121双元表达载体）上，置于CaMV35S启动子下，驱动EsMYBA1的超量表达（图9）。利用农杆菌介导的遗传转化将构建好的载体导入到烟草、拟南芥和箭叶淫羊藿中，结果表明部分转基因植株表现出组织颜色的改变和花青素的大量积累（图10,12,14），并发现其中的类黄酮相关基因的表达受到影响，主要为上调表达（图11,13）。这些都说明EsMYBA1基因具有调控类黄酮生物合成的功能。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明采用同源克隆方法分离目的基因EsMYBA1简单有效，不需要事先了解研究物种的序列信息。

2.本发明克隆的EsMYBA1基因具有调控类黄酮生物合成途径的功能，这对阐明淫羊藿中有效成分类黄酮化合物的合成与积累有着重要意义。

3.本发明克隆EsMYBA1基因通过转基因技术可以改变转基因植株中类黄酮相关基因的表达，从而影响类黄酮化合物的生物合成，特别是花青素的生物合成。

附图说明

图1.为一种EsMYBA1与其它类黄酮合成相关的MYB调控基因的氨基酸多重比对示意图。

黑色底纹表示相同氨基酸，灰色则表示相似氨基酸。下划线代表R2和R3MYB domain，方框代表三个保守结构域。箭头则指明intron I和intron II在氨基酸序列上的插入位置。

图2.为一种EsMYBA1与其它类黄酮合成相关的MYB调控基因的亲缘关系分析示意图。

具有相似功能的MYB转录因子聚在一起，并且EsMYBA1位于调控花青素合成相关MYB聚类分支的基部位置。

图3.为一种EsMYBA1在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位示意图。

空载体对照中的荧光信号充满整个细胞，包括细胞核、细胞质和细胞壁，而EsMYBA1-GFP融合蛋白仅在细胞核中有强烈的荧光信号。

图4.为一种EsMYBA1与其它7个来自于调控类黄酮合成的bHLH TF的MYB互作域（MYB-interacting region）的酵母双杂交实验示意图。

用于MYB-bHLH互作实验的7个bHLH TF分别是：Myc-RP(紫苏，Perilla)、Delila(金鱼草，snapdragon)、Lc(玉米，maize)、GL3和TT8(拟南芥，Arabidopsis)以及NtAn1a和NtAn1b(烟草，tobacco)。EsMYBA1不仅具有自激活的能力，还具有与bHLH互作的能力。

图5.为一种用于双分子荧光互补实验的pNYFP和pCYFP载体的CaMV35S-N/CYFP-Tnos表达框和多克隆位点（MCS）示意图。

图6.为一种EsMYBA1与烟草NtAN1a的双分子荧光互补实验示意图。

两个对照组（EsMYBA1-NYFP+pCYFP和pNYFP+NtAN1a-CYFP）没有荧光信号，而实验组（EsMYBA1-NYFP+NtAN1a-CYFP）有明显的荧光信号，并且位于细胞核中。

图7.为一种用于瞬间荧光素酶分析实验的表达载体pGreen II62-SK和pGreen II0800-LUC的T-DNA区域的示意图。

图8.为一种EsMYBA1对类黄酮相关结构基因DFR和ANS启动子的激活实验示意图。

本实验中DFR启动子有三条序列，分别来自于拟南芥（AtDFR），烟草（NtDFR）和淫羊藿（EsDFR），而ANS启动子序列仅来自于箭叶淫羊藿（EsANS）。EsMYBA1具有激活DFR和ANS启动子的能力，并且在AtTT8共转化的条件下，可以更大程度地激活。

图9.为一种EsMYBA1超量表达载体的构建流程示意图。

A：pMV_EsMYBA1表达载体的构建流程图；B：pMV_EsMYBA1表达载体的酶切鉴定和PCR鉴定，箭头所指为双酶切切下的目的片段；C：pMV_EsMYBA1表达载体中的T-DNA区域示意图。

图10.为一种超量表达EsMYBA1的转基因烟草表型观察示意图。

由于EsMYBA1的超量表达，诱导花青素大量积累于转基因烟草的生殖器官和营养器官中，并导致叶片深红色，花器官红色加深，以及未成熟种皮黑紫色。

图11.为一种EsMYBA1超量表达对转基因烟草中类黄酮相关基因表达的影响示意图。

EsMYBA1可以诱导大部分类黄酮相关结构基因和两个bHLH调节基因（NtAN1a和NtAN1b）的上调表达。

图12.为一种超量表达EsMYBA1的转基因拟南芥表型观察示意图。

EsMYBA1单独表达足以诱导拟南芥幼苗中积累大量花青素。

图13.为一种EsMYBA1超量表达对转基因拟南芥中类黄酮相关基因表达的影响示意图。

EsMYBA1可以诱导主要类黄酮相关结构基因的上调表达。

图14.为一种瞬间表达EsMYBA1的淫羊藿离体叶片表型观察示意图。

主要在伤口处，有红色色素的积累。

具体实施方式

实施例1:EsMYBA1基因的分离克隆

采用同源克隆结合RACE技术从箭叶淫羊藿中分离出EsMYBA1基因，过程如下：

首先，按照RNAiso plus试剂（Takara公司，下同）说明书的操作指南，提取箭叶淫羊藿幼嫩叶片的总RNA。具体方法如下：取50-100mg的新鲜组织或冷冻组织，在液氮中充分研磨，将粉末转移至1.5mL离心管，添加1mL RNAiso plus试剂充分裂解，经过氯仿分层和异丙醇沉淀以及乙醇洗涤，最后溶解于50uL的RNase-free ddH₂O中。RNA溶液通过凝胶电泳和紫外分光光度计Nanodrop2000c（ThermoFisher scientific公司，下同）检测其质量和产量，达到反转录要求，随即存于-20oC备用。在反转录之前，使用RQ1RNase-FreeDNase I(Promega公司)消化RNA溶液以去除可能残留的基因组DNA。基因组DNA消化反应体系为10uL，total RNA1ug，1×reaction buffer,RQ1DNase1uL，加ddH₂O至10uL，37°C保温30min，然后加1uL RQ1DNase stop solution终止反应。然后，按照SMART RACEcDNA Amplification Kit（Clontech公司，下同）用户操作指南，反转录淫羊藿叶片总RNA（1-5ug）得到5’和3’RACE-Ready cDNA模版，稀释5-10倍作为后续PCR中的模版，分装并存于-20°C备用。

根据已经公布的类黄酮合成相关的MYB调控基因的氨基酸序列（拟南芥Arabidopsisthaliana AtPAP1,AAG42001;苹果Malus x domestica MdMYB10a,ABB84753;矮牵牛Petunia x hybrida PhAn2,AAF66727），在保守区域设计一对简并引物（正向引物：AARTAYGGNGARGGNAARTGGCA；反向引物：CCARTARTTYTTNACRTCRTTNGC）。PCR反应体系总体积为50uL，包括5’RACE-Ready cDNA模板2uL，1×Ex Taq buffer，0.2mM dNTP，1uM简并引物，1U Ex Taq DNA polymerase（Takara公司，下同），加ddH₂O至50uL。反应程序为：94°C变性3min，94°C30sec、46°C45sec、72°C1min、35cycles，72°C延伸8min。PCR产物上样电泳，显示扩增产物仅为一条大小约为250bp左右的条带，将其切胶回收，

连接至pMD19-T载体（Takara公司，下同），转化DH5α菌株，涂加有氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）抗性的LB固体平板（配方如下：称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，12克琼脂溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。121°C，高压消毒20min，分装于培养皿，4℃冷藏备用，下同），37°C倒置培养12h。挑独立克隆12个，摇菌，用M13引物进行菌液PCR检测（M13.F正向引物：GTAAAACGACGGCCAGT；M13.R反向引物：CAGGAAACAGCTATGAC）。菌液PCR体系（无特殊说明，下同）为20uL，1×Taqbuffer,0.2mM dNTP，0.2uM M13引物，1U Taq DNApolymerase，加ddH₂O至20uL。其中，用牙签蘸一下菌液作为菌液PCR中的模版。PCR反应程序为95°C5min，95°C30sec、53°C30sec、72°C30sec、32cycles，72°C5min。将3个阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司或者华大武汉分公司测序。对测序结果进行blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析，发现此序列与已报道的类黄酮相关的MYB高度相似，我们暂定此序列为候选序列。

在此序列基础上，我们设计了四条基因特异引物(GSP，gene-specific primer)（5’GSP1.MYBA1：CTGATTTGTGTCTCAGCTGGGTGTTCC和5’GSP2.MYBA1：CATCTGTTTCCGAGAAGCTTATGC；3’GSP1.MYBA1：AGGTGCTGAAAATATGCGTTGAG和3’GSP2.MYBA1：GCATAGAATACCTCAAAGGGCAG），分别用来扩增目的基因的5’RACE和3’RACE末端。结合制备好的5’和3’RACE-ready cDNA模版，按照SMARTRACE cDNA Amplification Kit的说明书进行两轮巢式PCR（nested PCR）扩增目的基因的5’RACE和3’RACE末端，我们成功获得了大小分别长为约300bp和700bp的片段。如上文所述的，将其切胶回收、克隆测序，得到候选基因的5’和3’末端序列。通过CAP3（http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php）程序拼接这两条序列得到候选基因的全长cDNA序列。再在此序列基础上，进一步设计一对全长GSP引物（MYBA1.F，正向引物：TAGAGAACTTAAATGAAGCCAGAT和MYBA1.R，反向引物：AGAAAACAATGCAAAAATAGAATC）去扩增靶基因的全长cDNA序列。全长cDNA扩增的反应体系为50uL，5’RACE-Ready cDNA2uL，1×PrimeStar buffer，0.2mM dNTP，0.2uM GSP，1U PrimeStar DNA Polymerase（Takara公司，下同），加ddH₂O至50uL。反应程序为98°C变性，98°C15sec、56°C15sec、72°C1min、32cycles，72°C延伸8min。PCR扩增出一条主带，切胶回收，通过加A反应，连接至pMD19-T载体上，并克隆测序。其中加A反应体系为10uL，回收的PCR产物7uL，10×Taq buffer1uL，2mM dATP1uL，5U/uLTaq DNApolymerase1uL，72°C保温15-30min即可完成加A反应。

测序分析结果表明：获得了一种分离的基因，将其命名为EsMYBA1，其序列为SEQ IDNo．1所示的核苷酸序列。利用NCBI的开放阅读框寻找程序（ORF finder，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）确定EsMYBA1基因的开放阅读框（ORF，openreading frame），推导出核苷酸序列编码的多肽，一种分离的多肽，其序列为SEQ ID No．2所示的氨基酸序列。

对分离得到的EsMYBA1基因进行序列分析和亲缘关系分析。利用NCBI的ConservedDomains工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在线进行保守区域分析，结果表明该基因编码一种R2R3-MYB蛋白，属于R2R3-MYB TF family（转录因子家族）（图1）。通过Blast分析表明EsMYBA1蛋白与其它的类黄酮相关的MYB转录因子有着50%左右的相似性（identity），例如与甜橙Citrus sinensis Ruby蛋白有50%相似性；但仅考虑在R2和R3MYB domain之内比较，则表现出更高的相似性，例如与拟南芥Arabidopsis thalianaPAP1蛋白有74%相似性。另外，对不同物种的具有调控类黄酮合成的MYB蛋白进行多重比对和亲缘关系分析，结果如图1和图2.图1表明EsMYBA1除了拥有R2和R3MYB保守域之外，还具有三个保守的结构域：分别是与bHLH互作域（Zimmermann IM,Heim MA,Weisshaar B,Uhrig JF.Comprehensive identification of Arabidopsis thaliana MYB transcriptionfactors interacting with R/B like BHLH proteins.The Plant Journal2004;40:22），从花青素合成相关的MYB中鉴定出来的ANDV模体（motif）（Lin-Wang K,Bolitho K,Grafton K,KortsteeA,Karunairetnam S,McGhie T,et al.An R2R3MYB transcription factor associated withregulation of the anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae.BMC Plant Biology2010;10:50）和拟南芥ArabidopsisR2R3-MYB亚家族（subfamily）6具有的motif6（StrackeR,WerberM,Weisshaar B.The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana.Current Opinion in PlantBiology2001;4:447.）。亲缘关系分析也支持了EsMYBA1与调控花青素合成的MYB有更近的亲缘关系（图2）。

实施例2:亚细胞定位

首先，通过酶切连接将EsMYBA1基因的完整ORF转移至含有GFP报告基因的克隆载体pBI221-GFP上，然后利用基因枪轰击洋葱表皮细胞，在激光共聚焦显微镜下观察拍照。供亚细胞定位分析的载体构建过程具体如下：设计一对GSP(正向引物:GCGGATCCATGAAGCCAGATTTTAGTGAGAT，下划线BamHI酶切位点；反向引物:5'CGGTCGACTTCAAAATTCCAAAAGTTCAAG，下划线SalI酶切位点)，以含有EsMYBA1全长序列的重组质粒pMD19-T为模板，用高保真PrimeStar DNA polymerase扩增其ORF，PCR体系为实施例1所述。直接PCR产物回收，BamHI和SalI双酶切，将酶切后回收目的片段连接至经过同样双酶切的克隆载体pBI221-GFP(含有CaMV35S:GFP-Tnos表达框（WeiP-C,Tan F，Gao X-Q,Zhang X-Q,Wang G-Q,Xu H,et al.Overexpression of AtDOF4.7,anArabidopsis DOF Family Transcription Factor,Induces Floral Organ Abscission Deficiency inArabidopsis.Plant Physiology2010;153:1031），形成35S：EsMYBA1-GFP融合蛋白。质粒DNA提取按照质粒小量提取试剂盒（E.Z.N.

Plasmid Mini Kit I，Omega bio-tek公司,下同）的说明书进行，3mL过夜培养的菌液用于抽提，最后洗脱体积为50uL。双酶切体系为50uL，质粒DNA或者PCR产物1ug，1.5×Tango buffer，BamHI和SalI（Takara公司，下同）各1uL，加ddH₂O至50uL，37°C酶切1-3h。对构建好的重组质粒进行通过BamHI和SalI双酶切，PCR扩增和测序三重判断标准确认载体构建成功。其中，PCR扩增所用引物为载体上的CaMV35S启动子通用引物（35S.F：ATGACGCACAATCCCACTATC）和EsMYBA1ORF的反向引物（序列如上）。然后，参考冷泉港实验手册(cold spring harborprotocol)中的方法，将构建的35S：EsMYBA1-GFP重组载体在基因枪Biolistic PDS-1000(Bio-Rad公司)的轰击下，导入至洋葱表皮细胞中，再将轰击后的洋葱表皮细胞放置于25°C条件下暗培养24h左右，然后在共聚焦显微镜下观察拍照（Von Arnim A.SubcellularLocalization of GUS-and GFP-Tagged Proteins in Onion Epidermal Cells.Cold Spring HarborProtocols2007;2007:pdb.prot4689）。同时，以空质粒pBI221-GFP(35S:GFP)作为阳性对照。图3亚细胞定位表明EsMYBA1位于细胞核中。

实施例3:酵母双杂交

为了验证EsMYBA1是否具有与其它调控类黄酮合成的bHLH TF互作的能力，我们利用酵母双杂交实验（yeast two hybrid）进行分析。使用的酵母双杂交体载体为pAD-GAL4-2.1和pBD-GAL4Cam(Stratagene公司，简写为pAD和pBD，下同)，它们分别含有GAL4蛋白的AD（激活区，activating domain）和BD（结合区，binding domain），均位于ADH1（乙醇脱氢酶1,alcohol dehydrogenase1）启动子下方。首先，通过双酶切EcoRI/SalI将EsMYBA1的ORF克隆至pAD和pBD载体中，得到重组载体pAD-EsMYBA1和pBD-EsMYBA1，并对此重组质粒进行酶切，PCR和测序鉴定。扩增EsMYBA1的ORF所用引物为GCGAATTCATGA AGCCAGATTTTAGTGAGAT（下划线为EcoRI酶切位点）和CGGTCGACTTCAAAATTCCAAAAGTTCAAG（下划线为SalI酶切位点），所用DNA聚合酶为PrimeStar DNA polymerase以确保序列高保真度。对重组质粒的菌液PCR鉴定用扩增EsMYBA1ORF的正向引物和pAD和pBD载体上的T7启动子通用引物（AATACGACTCACTATAGGGCT）。同时，包含有7个调控植物类黄酮合成的bHLH TFs的MYB-interaction domain(MYB互作区域)的pBD重组质粒由肯塔基大学袁凌教授提供，见文献（Pattanaik S,Kong Q,Zaitlin D,Werkman JR,Xie CH,Patra B,et al.Isolation andfunctional characterization of a floral tissue-specific R2R3MYB regulator from tobacco.Planta2010;231:1061；Bai Y，Pattanaik S,Patra B,Werkman JR,Xie CH,Yuan L.Flavonoid-relatedbasic helix-loop-helix regulators,NtAn1a and NtAn1b,of tobacco have originated from twoancestors and are functionally active.Planta2011;234:363），它们分别是Myc-RP^aa1-199(紫苏，Perilla)、Delila^aa1-201(金鱼草，snapdragon)、Lc^aa1-212(玉米，maize)、GL3^aa1209和TT8^aa1204(拟南芥，Arabidopsis)以及NtAn1a^aa1-195andNtAn1b^aa1-195(烟草，tobacco)。随后，按照GAL4two-hybridphagemidvectorkits（Stratagene公司）的说明书进行操作，通过LiAC-PEG转化方法将构建好的pAD-EsMYBA1和pBD-bHLH重组质粒导入到酵母菌株AH109（Clontech公司）细胞中。转化的酵母细胞先在二缺培养基上（SD-亮氨酸-色氨酸，synthetic drop-outmedium-Leu-Trp）筛选，然后将通过筛选的斑点转移到四缺培养基上进一步筛选（SD-亮氨酸-色氨酸-腺嘌呤-组氨酸，synthetic drop-out medium-Leu-Trp-Ade-His）。同时，以pAD-MYBA1和pBD质粒作为阴性对照。首先，我们发现EsMYBA1具有自激活的能力（图4），因为pBD-EsMYBA1+pAD组合可以在二缺和四缺培养基上生长，而对照没有生长。随后，仅用pBD-bHLHs与pAD-EsMYBA1组合进行实验，结果表明EsMYBA1与7个bHLHTFs具有互作关系（图4）。

实施例4:双分子荧光互补实验

为了进一步确认EsMYBA1与NtAN1a的互作关系，我们用双分子荧光互补技术（BiFC，bimolecular fluorescence complementation）在拟南芥叶肉原生质体中进行确认。BiFC中使用的载体为pNYFP和pCYFP（图5），分别含有黄色荧光蛋白（yellow fluorescentprotein）的N末端和C末端，并处于CaMV35S启动子之下，由肯塔基大学袁凌教授提供（Pattanaik S,Kong Q,Zaitlin D,Werkman JR,Xie CH,Patra B,et al.Isolation and functional characterizationof a floral tissue-specific R2R3MYB regulator from tobacco.Planta2010;231:1061）。首先，利用双酶切XhoI和BamHI将EsMYBA1的ORF构建至pNYFP载体中，形成EsMYBA1-NYFP融合载体。利用一对GSP（正向引物：GCCTCGAGATGAAGCCAGATTTTAGTGAGAT；反向引物CGGGATCCTTCAAAATTCCAAAAGTTCAAG，下划线分别为XhoI和BamHI酶切位点）和高保真DNA聚合酶（PrimeStar DNA polymerase）扩增EsMYBA1基因的ORF。其中，反向引物中去掉了终止子，以便形成融合蛋白。然后XhoI和BamHI双酶切酶切PCR产物和pNYFP质粒DNA，回收相应的目的片段，连接转化至DH5α细胞。菌液PCR筛选阳性克隆，所用引物为35S.F和上面的反向引物。并将阳性克隆进行XhoI和BamHI双酶切鉴定和测序鉴定。将构建好的EsMYBA1-NYFP载体抽提质粒DNA备用。另外，含有NtAN1a基因（GenBank Accession：HQ589208）的pCYFP载体也由袁凌教师提供，见文献（Bai Y，Pattanaik S,Patra B,Werkman JR,Xie CH,Yuan L.Flavonoid-related basic helix-loop-helixregulators,NtAn1a and NtAn1b,of tobacco have originated from two ancestors and arefunctionally active.Planta2011;234:363）。

其次，制备拟南芥叶肉原生体质及PEG转化参考文献中的方法（Yoo S-D,Cho Y-H,Sheen J.Arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient gene expressionanalysis.Nat Protocols2007;2:1565），过程如下：配制好Enzyme solution（配制20mM MES(pH5.7)，内含1.5%cellulase R10，0.4%macerozyme R10，0.4M mannitol和20mM KCl，55°C加热10min，然后冷却至室温，再加终浓度为10mM CaCl₂及0.1%BSA）。切割在短日照生长约3-4周的拟南芥哥伦比亚生态型的叶片，切成0.5-1mm的条状，放到含EnzymeSolution的培养皿中酶解，室温，50rpm，摇3h(最好有光照)。过滤，收集原生质体（protoplast），再转入10mL离心管中，100g离心3min，并弃上清。然后，用7-8mLW5solution（配制2mM MES，pH5.7，内含154mM NaCl,125mM CaCl₂和5mM KCl，室温保存）清洗沉淀小求（pellet），并轻轻晃动,100g离心3min，重复2-3次，每次都小心去除上清，不要倒掉细胞。加入一定量的W5solution（约2.5ml,视细胞多少而定），冰上静置30min以上，离心，弃上清，再加入2.5ml MMG（配制4mM MES，pH5.7，内含0.4M mannitol和15mMMgCl₂，室温保存）（与W5solution等体积）重悬，即准备好原生质体。PEG介导的转化：先加入质粒DNA10ug，再加入100uL原生质体，再加入前两者等体积的PEG溶液（配制20-40%PEG4000，内含0.2M mannitol和100mM CaCl₂），混匀，静置10min，再加入前三者体积两倍的W5solution，上下颠倒混匀。然后，100g离心2min,吸弃上清。加入200uL W5solution，轻轻混匀后于室温下保温16h左右，再100g离心2min收集原生质体，去除上清液，将样品置于冰上进行下一步分析或者保存于-80°C备用，将收集的原生质体样品在共聚焦显微镜下进行活体细胞的荧光成像。除了EsMYBA1-NYFP载体和NtAN1a-CYFP载体共转化作为处理样品，我们还设置了两组阴性对照（EsMYBA1-NYFP+pCYFP和pNYFP+NtAN1a-CYFP）。另外，在PEG转化构建好的载体时，同时转化了mCherry-VirD2NLS质粒作为转染成功和核定位信号的阳性对照（Lee L-Y，Fang M-J,Kuang L-Y，Gelvin S.Vectors for multi-color bimolecular fluorescence complementation to investigate protein-proteininteractions in living plant cells.Plant Methods2008;4:24）。图6显示BiFC结果为EsMYBA1与NtAN1a在拟南芥原生质体中有互作关系，并且发生于细胞核中。

实施例5：瞬间荧光素酶分析

为了分析EsMYBA1基因对类黄酮合成途径中的DFR和ANS启动子是否具有转录活力，我们采用在本式烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中进行瞬间荧光素酶分析（transientluciferase assay）。实验使用的载体和方法均参考此文献（Hellens RP，Allan AC,Friel EN,Bolitho K,Grafton K,Templeton MD,et al.Transient expression vectors for functional genomics,quantification ofpromoter activity and RNA silencing in plants.Plant Methods2005;1:13）。报告载体（reportervector）为pGreenII0800-LUC，含无启动子的LUC报告基因，同时带有CaMV35S启动子驱动的Ren报告基因作为内参。将目的启动子片段克隆此报告载体，激活下游LUC的表达（图7）。激活载体（effector vector）为pGreen II62-SK，内含CaMV35S-MCS-TerCaMV表达框，将转录因子克隆至此载体，用于超量表达转录因子（图7）。本实验中使用的转录因子为EsMYBA1和AtTT8（GenBank accession:NM_117050），使用的启动子为DFR和ANS，其中DFR来自三个物种，拟南芥（AtDFR，Tair accession:AT5G42800）、烟草（NtDFR，GenBank accession:FJ472649）和箭叶淫羊藿（EsDFR，GenBank accession:KC335205），ANS来自于箭叶淫羊藿（EsANS，GenBank accession KC335207）。利用CTAB方法（Doyle JJ,DoyleJL.Isolation ofplant DNA from fresh tissue.Focus1990;12:13.）抽提烟草，拟南芥哥伦比亚生态型和箭叶淫羊藿幼叶的基因组DNA，用Nanodrop2000c检测其质量和浓度。再使用高保真PrimeStar DNA polymerase扩增AtDFR，NtDFR和EsDFR，以及EsANS的启动子片段，所用引物分别为AtDFR.F:GAGATTGGCACCACCTTCGCCTC和AtDFR.R:TTTTGTGGTTATATGATAGATTGTGCT（1277bp）；NtDFR.F:GCTCATAATGACTCGATTACG和NtDFR.R:CAGAAATGAAAGGTAGAAGAG（566bp）；EsDFR.F：GATGTTTTTCTATGTCGGTCTCTAT和EsDFR.R：GCTATATTTTCTTCAAGCTTTTCT（1429bp）；EsANS.F:ACGAGTTGGGGATTACTG和EsANS.R:GGTTACAAAAACAGATTTTCTCTTG（1566bp）。先将目的启动子片段克隆至pMD19-T载体，用M13.F和启动子片段的反向引物筛选正方向的阳性克隆。再将克隆测序，将测序正确的克隆抽提质粒DNA，用KpnI/PstI双酶切，将启动子片段转移至经过同样酶切的pGreen II0800-LUC载体中。并对得到的重组质粒进行PCR和酶切鉴定，抽提质粒DNA备用。同时，克隆含有ORF的AtTT8和EsMYBA1基因至激活载体pGreen II62-SK。过程大致如下：首先扩增EsMYBA1和AtTT8目的片段，克隆至pMD19-T载体，扩增EsMYBA1所用引物为GCGAATTCATGAAGCCAGATTTTAGTGAGAT（下划线为EcoRI酶切位点）和AGAAAACAATGCAAAAATAGAATC（741bp），扩增AtTT8所用引物为GTATCTCCGGGAACGATGGATG和TTGGCATCAATAAAGTTAGGGTCTA（1594bp）。用M13.F和基因序列的正向引物筛选正方向的阳性克隆，并测序。然后利用EcoRI/KpnI双酶切转移EsMYBA1至pGreen II62-SK，而用PstI/KpnI双酶切转移AtTT8至pGreen II62-SK载体。再对获得的重组质粒通过PCR和双酶切鉴定，其中PCR使用CaMV35S.F和基因序列的方向引物进行确认。最后，通过电击转化方法将构建好的报告载体或者和激活载体的质粒DNA导入到农杆菌菌株GV3101中，加25mg/L利福平（Rifampicin）和25mg/L庆大霉素（Gentamicin）以及50mg/L卡那霉素（Kanamycin）抗性筛选，并通过菌液PCR确认转化成功。值得注意的是在pGreen II系列质粒DNA转化至农杆菌中时，必须连同辅助质粒pSoup一起共转，否则pGreen II不能在农杆菌中存活。

农杆菌浸染本式烟草的方法也参考上述文献，过程如下：本式烟草种植于温室中，22°C和自然光线下生长。当植株生长到6片叶子时，选择超过1cm的最幼嫩叶片作为浸染的对象。挑含有构建好的载体的农杆菌GV3101单克隆于LB（加有50mg/L Kan）中，28°C过夜培养，按照一定比例用浸染液（10mM MgCl₂,0.5uM乙酰丁香酮acetosyringone）稀释，调整OD₆₀₀至0.2，温室下放置2h左右，作为制备好的农杆菌浸染液。按照100uL含有报告载体的农杆菌和900uL含有激活载体的农杆菌菌液混合，然后取300uL这种农杆菌混合通过针注射到幼叶上，每个叶片上注射2个点。在温室条件下，生长3-14days。利用dualluciferase assay reagents（promega公司）测定萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）和海肾荧光素酶（renilla luciferase）的活力。在浸染和保温2-3days后，用叶片打孔器收集小叶盘，大小2cm左右。在500uL裂解液（Passive lysis buffer）中研磨，然后取5uL1/100稀释过的粗提液置于40uL luciferase assay buffer中，测定荧光强度，然后再加40uL Stop and Glowbuffer,再次测量荧光强度，并将两者的比值（Luc/Ren ratio）作为衡量转录因子对启动子激活能力的大小指标。使用的荧光检测器为GloMax multi detection system（promega公司）。每个处理至少包含4棵植株，实验重复三次。仅使用含有不同启动子的报告载体的农杆菌浸染，作为背景对照。实验结果表明EsMYBA1对DFR（包括AtDFR、NtDFR和EsDFR）和EsANS启动子均具有激活能力，并且在AtTT8共转条件下，激活能力更大（图8），这也说明EsMYBA1与AtTT8之间存在互作关系。

实施例6：超量表达转基因验证基因功能

为了进一步验证EsMYBA1调控类黄酮合成途径的功能，我们利用农杆菌介导的遗传转化将EsMYBA1超量表达于烟草、拟南芥和箭叶淫羊藿中，然后分析转基因植株后代表型变化及类黄酮相关基因的表达。其中，箭叶淫羊藿由于缺乏稳定遗传转化体系，仅实行了瞬间表达验证。转基因功能验证大致如下。

1.超量表达载体构建

超量表达载体为双元载体pMV，经双元表达载体pBI121改造而来，内含CaMV35S-GUS-Tnos表达框，由华中农业大学张俊红博士惠赠（张俊红。番茄Aux/IAA基因的克隆与功能分析。博士学位论文。武汉：华中农业大学，2006）（图9）。超量表达载体构建流程如图9所示。将包含有EsMYBA1ORF的片段连接至pMD19-T克隆载体上，并使用M13.F和EsMYBA1.F引物PCR筛选正向插入的阳性克隆。随后抽提阳性克隆质粒DNA，使用SalI/KpnI双酶切重组质粒DNA，回收目的小片段。同时，使用XhoI/KpnI双酶切pMV质粒DNA，回收载体骨架大片段，将两回收片段相连，转化大肠杆菌DH5α感受态。SalI/KpnI双酶切体系同上所述，只是KpnI代替BamHI；而XhoI/KpnI双酶切体系略微不同，酶切缓冲液为1×M buffer。通过菌液PCR筛选阳性克隆,使用pMV上的CaMV35S通用引物35S.F和EsMYBA1.R。并抽提重组质粒DNA做XbaI/KpnI双酶切鉴定，最后送阳性克隆测序进一步确认，并将构建成功的超量表达载体命名为pMV_EsMYBA1，其T-DNA区域示意图如图8。用小量质粒DNA提取试剂盒（同上）抽提超量表达载体pMV_EsMYBA1质粒DNA，最后用ddH₂O 洗脱DNA。通过电击转化方法将pMV_EsMYBA1质粒DNA转入至农杆菌菌株EHA105，加25mg/L利福平（Rifampicin，Rif）和50mg/L卡那霉素（Kanamycin，Kan）抗性筛选，并通过菌液PCR确认转化成功（Weigel D,Glazebrook J.Transformation ofAgrobacterium Using Electroporation.Cold Spring Harbor Protocols2006;2006:pdb.prot4665）。同时，将空载体pMV也转化至EHA105，作为后续转基因实验的对照组。最后，将分别含有pMV_EsMYBA1表达载体和pMV空载体的农杆菌EHA105保存于-20°C备用。

2.农杆菌介导的遗传转化及表型观察

转化受体烟草为普通烟草(Nicotiana tabacum)自交系，采用叶盘法转化（Horsch R,FryJ,Hoffmann N,Eichholtz D,Rogers SG,Fraley R.A simple and general method for transferringgenes into plants.Science1985;227:1229）。通过农杆菌介导的遗传转化将pMV_EsMYBA1载体导入至烟草中。大致转化过程如下：制备农杆菌工程菌液，将含有pMV_EsMYBA1或pMV的农杆菌EHA105涂布于LB固体平板（带有25mg/LRif和50mg/LKan），28°C培养2-3day，形成单克隆后保存平板于4°C备用，每两周划线复活。挑单克隆于5mL液体LB培养基中（加有25mg/LRif和50mg/LKan），一般培养36-48h，调整OD₆₀₀到0.8-1.2左右。收集无菌烟草的幼叶，切成1cm左右的小块，浸泡于农杆菌菌液中，时间8-10min左右，然后取出叶片，在滤纸上晾干，然后转入共培养基（MS+6-BA1mgL+NAA0.1mg/L）中，黑暗条件下培养2天。随后，再转移到选择培养基（MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+Kan200mg/L+Cef300mg/L,Cefotaxime头孢霉素）上，每两周继代一次，直至分化出抗性芽，最后转移到生根培养基(1/2MS+Kan200mg/L+Cef300mg/L)中生根壮苗。最后移栽至钵内，在温室内生长至开花结果。另外，使用带有pMV空载体的EHA105转化得到的转基因烟草为对照植株。MS培养基配方见文献（Murashige T,Skoog F.A revised medium for rapid growthand bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant1962;15(3):473-497）。

当具有卡那抗性的转基因烟草幼苗移栽成活后不久，收集幼嫩的小叶片，用CTAB（Doyle JJ,DoyleJL.Isolation ofplant DNA from fresh tissue.Focus1990;12:13.）方法抽提叶片基因组DNA，通过凝胶电泳和Nanodrop2000c检测DNA的质量和浓度。通过超量表达载体上的CaMV35S通用引物35S.F和EsMYBA1.R引物结合的PCR来鉴定转基因阳性植株。在18棵待测T₀代转基因烟草中，PCR呈阳性的有15棵。其中，有四棵表型出明显的表型变化,主要体现在营养器官和生殖器官均呈现深红色或者深紫色（图10）。具体表现为叶片从顶端往下深红色逐渐加深，但是较对照来说，整株生长缓慢，生育期长。对照花为粉红色或者淡红色，而转基因植株花为深红色，甚至为黑红色，而且在花的4个发育时期中，从开始就着深红色直至花冠全部展开。在表现显著的转基因植株中，花丝也表现为深红色，甚至部分植株的花药也为红色；雌蕊器官也都表现为深红色。在果实方面，对照未成熟蒴果表皮为绿色，里面未成熟种子为淡黄色;而转基因植株的蒴果表皮为黑紫色，种子也为黑紫色。当种子成熟时，对照和转基因植株的种子颜色似乎没有明显的差别。

参考文献中的方法转化拟南芥（Zhang X,Henriques R,Lin S-S,Niu Q-W，Chua N-H.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.NatProtocols2006;1:641），所用转化受体为拟南芥哥伦比亚生态型（Arabidopsis thaliana ecotypeColumbia）。拟南芥材料的准备。拟南芥种植于培养室中，培养条件为24°C白天/20°C晚上，。待拟南芥花序抽苔约1cm高时，剪去主花序。待植株发出侧生花序，并生长至花蕾期时，进行转化实验。制备含有构建好的pMV_EsMYBA1或pMV载体的农杆菌EHA105菌液，挑单克隆转入含有Kan50mg/L和Rif25mg/L的LB液体培养基中，28°C过夜培养。第二天，将初始培养液按照1:50或1:100稀释，再继续培养18-24h左右。室温下，5500g离心20min收集菌体，然后悬浮于浸染液中（5%蔗糖+0.05%Silwet L-77），调整OD₆₀₀约为0.8左右，混匀后置于烧杯中待用。把待转化的拟南芥倒置，将整个花序轻轻的浸没在浸染液中，数秒后移出。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好保湿，处于弱光或者黑暗下培养过夜。第二天将塑料袋揭开，移至培养室中培养。培养一个月左右收获种子，装于离心管中于4°C中干燥保存。将收获的T₀代拟南芥种子消毒后播于筛选培养基中（1/2MS培养基+0.8%agar+50mg/L Kan）进行筛选。消毒程序为95%乙醇消毒30-60sec，然后于含有0.05%Tween20的50%漂白液（2.6%次氯酸钠）浸泡5min，再用无菌水清洗3-4次。将筛选平板先置于4°C冷处理，然后转移至培养室中生长7-10天萌发，培养条件为24°C，16h光照/8h黑暗。选择经过Kan筛选后长势良好，真叶叶片及生长点呈深绿色且根部可以扎入培养基的植株，初步确定为阳性苗，移栽入土中。经Kan筛选获得的阳性T₀代植株有18棵，在随后的T₁代株系中有2个株系有表型变化。超量表达EsMYBA1的拟南芥幼苗出现大量红色色素的积累，意味着花青素的大量合成和积累，而对照植株中没有此表型变化（图12）。

由于淫羊藿缺乏稳定的遗传转化体系，所以暂时仅做了EsMYBA1在淫羊藿离体叶片中的瞬间表达。农杆菌介导的淫羊藿遗传转化方法与烟草转化相似，也采用叶盘法（HorschR,Fry J,Hoffmann N,Eichholtz D,Rogers SG,Fraley R.A simple and general method fortransferring genes into plants.Science1985;227:1229）。收集无菌的箭叶淫羊藿幼嫩叶片，切成小块，经含有pMV_EsMYBA1或者pMV载体的农杆菌EHA105浸染后，黑暗条件下共培养3day，然后拍照观察。图14表明，在超量表达EsMYBA1的淫羊藿叶片的伤口处，有明显的红色色素出现，而对照（表达pMV空载体）没有红色斑点的出现，这意味着由于EsMYBA1的瞬时表达，花青素大量合成与积累。

3.转基因植株中类黄酮相关基因的表达分析

为了分析外源EsMYBA1基因的超量表达是否对转基因植株中类黄酮相关基因的表达有所影响，我们采用定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）分析了类黄酮相关基因的表达水平。首先，利用RNAiso plus试剂抽提新鲜或者冷冻组织的总RNA，包括烟草的花和叶片以及拟南芥幼苗，用分光光度计Nanodrop2000c检测其质量和浓度。然后，取1ug总RNA进行反转录，反转录试剂盒为PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Takara公司)，反转录之前使用其中的gDNA eraser消化总RNA中的可能存在的基因组DNA。消化反应体系为10uL，5×gDNA Eraser buffer2uL,gDNA Eraser1uL,总RNA1ug，加RNase free ddH₂O至10uL。42°C保温2min，然后至于4°C保温。将此反应产物10uL全部用来反转录，体系为5×Primescript buffer24uL,RT primer mix1uL,Primescript RT enzyme mix I1uL，RNasefree ddH₂O4uL。37°C反转录15min，然后85°C失活，再恒温于4°C，最后将反转录cDNA产物稀释5-10倍作为qPCR中的模板，置于-20°C保存备用。参考SYBR Premix Ex Taq II（TliRNaseH Plus）(Takara公司)说明书进行引物设计（表1）和qPCR反应。qPCR反应体系为2×SYBR premix Ex Taq II25uL，10uM GSP各2uL，ROX reference dye II1uL,cDNA模板2uL，加RNase free ddH₂O至50uL。qPCR反应在ABI公司PRISM7500型定量PCR仪上完成。qPCR反应程序采用两步法：95°C预变性30sec；95°C变性5sec，60°C退火延伸34sec，循环数40；反应结束后继续运行溶解曲线程序（95°C，15sec；60°C，1min；95°C，15sec），以确保目的产物的特异扩增。以NtTub1和AtTub2分别作为烟草和拟南芥的内参基因，使用comparative Ct(2^ΔΔCt)方法来确定基因的相对表达量，其中参照样品的表达量定为“1”（Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the2^ΔΔCt Ctmethod.Methods2001;25:402）。

表1用于qPCR分析的引物清单

超量表达EsMYBA1的转基因烟草中，首先用半定量RT-PCR确认EsMYBA1在烟草中是否超量表达。利用上文反转录得到的cDNA模板，结合EsMYBA1的全长引物序列和ExTaqDNApolymerase，PCR扩增EsMYBA1基因。同时，以淫羊藿Actin基因（EsActin.F，正向序列：GCCATTCAGGCTGTTCTTTC和EsActin.R,反向序列：GGTAAGATCGCGACCTGCTA）作为内参。图11a显示在四个超量表达EsMYBA1的转基因烟草的花和叶片组织中均有EsMYBA1的表达，而在对照植株中（表达空载体pMV的转基因烟草）均没有EsMYBA1的表达。图11b显示了类黄酮生物合成相关的大部分结构基因和两个调控基因在花和叶片中均上调表达，包括NtPAL,NtCHI,NtF3H,NtDFR和NtANS以及NtAN1a和NtAN1b两个bHLH转录因子，特别是后四个基因的表达量上调剧烈，而Nt4CL和NtFLS的表达量下降。在超量表达EsMYBA1的转基因拟南芥幼苗中，类黄酮生物合成的结构基因表达变化模式与烟草中大致相似（图13），主要结构基因AtCHS，AtCHI，AtF3H，AtF3’H，AtDFR和AtLDOX上调表达，特别是后两者上升剧烈，而AtFLS同样也是下调表达。

                         SEQUENCE LISTING

<110>  中国科学院武汉植物园

<120>  一种调控植物类黄酮合成的基因及应用

<130>  一种调控植物类黄酮合成的基因及应用

<160>  2    

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  753

<212>  DNA

<213>  Epimedium sagittatum

<400>  1

tagagaactt aaatgaagcc agattttagt gagatgttca agtctggtgt tagaaagggc     60

gcatggacca aagaagaaga tgaggtgctg aaaatatgcg ttgagaaata tggagttggg    120

aattggcata gaatacctca aagggcaggt ctgaatcgat gtcgaaagag ctgcaggatg    180

agatggttga actatcttaa tcccagcatc aatcgaggag tgtttaggga agatgaaatt    240

gacctcatgc tcaaaatgca taagcttctc ggaaacagat ggtcactgat tgcaggaaga    300

cttcctggtc ggacagccaa tgatgtgaag aacttctgga acacccagct gagacacaaa    360

tcagtgttga ataacaaaga caaggaaagg atactacccc ctaaaaaggt tgaagtcata    420

aagccacatc ctaggatatt caaacccgta cctacacggt taactgggga acctgctttc    480

tgcaaccttc aagaacaaca acaagaagaa ggaaaccaac acccagtagc agaagatact    540

atttggtggg aagaactact atctcatgat aaggaaatga atcatggcac gtctgtttct    600

tttggaaggg aagaggtggt ctcaaccaca aactctacgg aagaagaaag gaaggcggca    660

ctatttagtg atgttgattt cgaatttcag gatttcagtg acttgaactt ttggaatttt    720

gaatgaactg attctatttt tgcattgttt tct                                 753

<210>  2

<211>  237

<212>  PRT

<213>  Epimedium sagittatum

<400>  2

Met Lys Pro Asp Phe Ser Glu Met Phe Lys Ser Gly Val Arg Lys Gly

1               5                   10                  15     

Ala Trp Thr Lys Glu Glu Asp Glu Val Leu Lys Ile Cys Val Glu Lys

            20                  25                  30         

Tyr Gly Val Gly Asn Trp His Arg Ile Pro Gln Arg Ala Gly Leu Asn

        35                  40                  45             

Arg Cys Arg Lys Ser Cys Arg Met Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Asn Pro

    50                  55                  60                 

Ser Ile Asn Arg Gly Val Phe Arg Glu Asp Glu Ile Asp Leu Met Leu

65                  70                  75                  80 

Lys Met His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg

                85                  90                  95     

Leu Pro Gly Arg Thr Ala Asn Asp Val Lys Asn Phe Trp Asn Thr Gln

            100                 105                 110        

Leu Arg His Lys Ser Val Leu Asn Asn Lys Asp Lys Glu Arg Ile Leu

        115                 120                 125            

Pro Pro Lys Lys Val Glu Val Ile Lys Pro His Pro Arg Ile Phe Lys

    130                 135                 140                

Pro Val Pro Thr Arg Leu Thr Gly Glu Pro Ala Phe Cys Asn Leu Gln

145                 150                 155                 160

Glu Gln Gln Gln Glu Glu Gly Asn Gln His Pro Val Ala Glu Asp Thr

                165                 170                 175    

Ile Trp Trp Glu Glu Leu Leu Ser His Asp Lys Glu Met Asn His Gly

            180                 185                 190        

Thr Ser Val Ser Phe Gly Arg Glu Glu Val Val Ser Thr Thr Asn Ser

        195                 200                 205            

Thr Glu Glu Glu Arg Lys Ala Ala Leu Phe Ser Asp Val Asp Phe Glu

    210                 215                 220                

Phe Gln Asp Phe Ser Asp Leu Asn Phe Trp Asn Phe Glu

225                 230                 235        

 

 

Claims (5)

1.一种分离的基因，序列为SEQ ID NO.1 所示。

2.权利要求1所述的基因编码的蛋白质，序列为SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的基因在调控烟草类黄酮合成上的应用。

4.权利要求1所述的基因在调控拟南芥类黄酮合成上的应用。

5.权利要求1所述的基因在调控淫羊藿类黄酮合成上的应用。

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