CN103725693A

CN103725693A - 一种荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1及其应用

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Publication number: CN103725693A
Application number: CN201410010821.3A
Authority: CN
Inventors: 胡桂兵; 赖彪; 王惠聪; 秦永华; 黄旭明; 张春阳
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2014-01-09
Filing date: 2014-01-09
Publication date: 2014-04-16

Abstract

本发明公开了一种荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1及其应用，属于生物基因领域。本发明通过设计LcMYB1片段、RACE片段和全长引物，扩增并测序获得LcMYB1基因的核苷酸序列，通过翻译为氨基酸序列并分析基因的结构。从LcMYB1的氨基酸结构上分析LcMYB1可能具有调控荔枝果皮花色素苷生物合成的功能，然后通过转化烟草证实LcMYB1具有调控花色素苷生物合成的功能。为LcMYB1在改进植物色素积累方面应用奠定了基础。

Description

一种荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1及其应用

技术领域

本发明属于生物基因领域，特别涉及一种荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1及其应用。

背景技术

大部分花卉和果蔬颜色的表现主要是由于积累了花色素苷，花色素苷的含量是决定花卉和果蔬品质的一个重要方面。由于花色素苷的抗氧化性使得更多人喜欢红色到紫色的蔬菜和水果。花色素苷除了能给蔬菜、花卉、水果带来丰富鲜艳的颜色，还具有对生物和非生物的胁迫给植物带来伤害的保护作用，比如：紫外线照射、冷胁迫、干旱胁迫反应等（Castellarin et al.2007;Ubi et al.2006;Zhang et al.2012）。最近国内外的研究表明，花色素苷合成代谢的调控是在转录水平上，主要通过调控花色素苷合成代谢过程中结构基因的表达，从而使合成代谢过程中的酶的合成受到影响（Allan et al.,2008）。目前已经被公认的有三类调节花色素苷合成的转录因子，分别是R2R3-MYB、bHLH（basic Hlix-Loop-Hlix）和WD40，它们相互作用共同调节着花色素苷的生物合成。

植物的MYB转录因子是一个非常大的家族，它们调控着植物的次生代谢过程。MYB类转录因子以其结构上都有一段保守的DNA结合区结构域而得名。以DBD（DNA Binding Domain）最为保守，一般包含1-3个不完全重复序列R（Repeat），每个重复片段R由51-52个保守的氨基酸残基和间隔序列组成。在R3区域包含有一个典型的结构域[D/E]Lx₂[R/K]x₃Lx₆Lx₃R，被称为bHLH Motif，它是能与bHLH一类蛋白相互作用的区域；C端有一个motif6的结构域[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]（Takos et al.2006;Zimmermann et al.2004）。拟南芥中至少有154个MYB组成庞大的转录因子家族，这个家族由25个亚族组成。这些转录因子在调控次生代谢，控制细胞形态，介导病原抗性，应答激素信号等方面有十分重要的作用，参与拟南芥花色素苷生物合成转录调控的PAP1和PAP2属于第6亚族（Dubos et al.2010）。近来研究显示参与花色素苷合成转录调控相关的MYB主要属于R2R3-MYB类。

自Paz-Ares等（1987）从单子叶植物玉米中克隆出与色素合成相关的ZmC1基因以来，大量MYB类基因从各种植物中得以分离鉴定。参与调控的MYB大多数属于正调节因子，也有少数具有抑制作用。在烟草中超量表达PAP1能使整株烟草积累花色苷，从而呈现出紫色烟草；而超表达FaMYB1能抑制花色素苷的积累，AtMYBL2突变后拟南芥幼苗积累大量花色素苷（Aharoni et al.2001;Dubos et al.2008;Malone et al.2009）。目前已经从多种植物中克隆到与花色素苷合成调控相关的MYBs。草本植物研究最深入，玉米（Zea mays）Zm P（Chopraet al.1996）、矮牵牛（Petunia hybrida）AN2和PH4（Quattrocchio et al.1999;Quattrocchio et al.2006）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）PAP1和PAP2（Borevitzet al.2000）、金鱼草（Antirrhinum majus）ROSEA1、ROSEA2和VENOSA（Schwinnet al.2006）和龙胆（Gentiana triflora）GtMYB3（Nakatsuka et al.2008）等都被克隆和功能鉴定。

果实的花色素苷生物合成转录调控近年来成为了园艺科学家的研究热点。最近大量的果树果实花色素苷生物合成调控的机理逐渐被阐明，研究主要集中在人们喜爱食用的苹果、葡萄、桃、梨等，因为果色鲜艳的果实能更加吸引人们的眼球，受到消费者的喜爱。调控果实花色素苷生物合成转录调控的转录因子主要为R2R3-MYB类。葡萄根据其花色素苷的积累与否分为红葡萄和白葡萄，而其颜色差异的分子机理就在于MYB基因上游的逆转录转座子的存在与否（Kobayashi et al.2002;Kobayashi et al.2004）。苹果花色素苷合成的转录调控研究得比较早，同时也取得了很多成果。当套袋的苹果去套后，花色素苷会迅速合成，同时在这个过程中MdMYB1的表达会大量增加。转MdMYB1的拟南芥和转基因侵染的葡萄悬浮细胞也积累花色素苷，说明苹果果皮的花色素苷积累受到MdMYB1的调节（Takos et al.2006）。大多数苹果果肉是不积累花色素苷的，但是有少量种质资源苹果果肉是红色的，研究表明果肉花色素苷的积累同样受到MYB转录因子的调节，而与果皮的调控因子MdMYB1不同，果肉的花色素苷生物合成的调控受到MdMYB10调控（Espley et al.2007）。此外还在苹果（Malus×domestica）中克隆到了MdMYBA（Ban et al.2007），在梨（Pyrus pyrifolia）中克隆到了PyMYB10（Feng et al.2010），葡萄（Vitis Vifera和Vitis labruscana）中克隆到了VvMYBA、VvMYBA1、VlMYB1-3、VvMYB5a、VvMYB5b和VlMYBA1（Azuma et al.2008;Cutanda-Perez et al.2009;Deluc et al.2006;Deluc et al.2008;Kobayashi et al.2002;Walker et al.2007），在山竹（Garcinia mangostana L.）中克隆到了GmMYB10（Palapol et al.2009），在杨梅（Myrica rubra）中克隆到了MrMYB1（Niu et al.2010）等调控果实花色素苷生物合成的MYB类转录因子。

荔枝（Litchi chinensis）果实成熟时果面表现出的红色是花色素苷积累的结果。利用液相色谱测定荔枝果皮中的花色素苷，研究结果显示荔枝果皮中主要含有花青素-3-芸香糖苷，此外还有少量的花色素-3葡萄糖苷和锦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷（Lee and Wicker1991）。‘Brewster’荔枝果皮发育过程中绿色的荔枝果皮中主要是锦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷，而成熟的荔枝果皮主要是花青素-3-芸香糖苷（75%），也有一定含量的花青素-3-葡萄糖苷（17%）和锦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷（Rivera-López et al.1999）。

王惠聪等（2002）在研究‘妃子笑’荔枝着色不良原因时发现，果实成熟采收时‘妃子笑’果皮的叶绿素含量是‘糯米糍’的两倍多，认为由叶绿素降解过慢而阻延了花色素苷的合成可能是影响‘妃子笑’果实着色的因素之一。此后进一步研究了酶的活性与果皮花色素苷积累之间的关系，初步确定了荔枝果皮花色素苷的合成与UFGT酶活性有着较大的相关性，而与PAL、CHI、DFR等酶活性没有直接的相关性（王惠聪等,2004）。对荔枝果皮花色素苷生物合成代谢基因的研究起步较晚。近来荔枝果皮花色素苷生物合成代谢相关的结构基因已经克隆并进行了系统的表达研究，结果显示LcUFGT的表达与花色素苷含呈成正相关，在所有的代谢结构基因中LcUFGT在起着更重要的作用（Wei et al.2011;Zhao et al.2012）。而对于荔枝花色素苷合成代谢相关的调控基因尚无报道。

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，提供一种荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供上述荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的氨基酸序列。

本发明的再一目的在于提供上述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1，其核苷酸序列如下所示：

TCGCATTTACTTGGTGCAAGTGCATATAGTGCCACATCTGCGGAGGGTTACATAGGAGTTCGAAAAGGTGCATGGACCGAAGGAGAAGATAATCTTCTGAAGAAATGTGTTGAAATTTATGGCGAACAAAAATGGCATCAAGTTCCTGTTAGAGCAGGGCTAAATCGATGTCGGAAAAGCTGTAGATTGAGATGGCTGAATTATCTGAAGCCAAATATCAAAAGAGGAGAGTTCATGGAAGATGAAGTTGATCTGATTTTGAGGCTGCATAAACTGTTGGGGAATAGATGGTCATTGATTGCTGGTAGGCTTCCTGGAAGAACAGCTAATGATATCAAGAACTATTGGAACACCCATTTACGCAAAAAGGCTGTTGCTTCAAAGCAAGAATCGAAAACAATGACAAGTACTACTACTACTCAAAGCACACAAAAAATCAATGTAATAAAACCTCAACCTCGAACCTTCGCCAAAAAAACATCTGAATGGGTCAATACCAAAATCACCATGGAGGAAAACAGCAGAGACCATTTAGGGCATCCAAATCTTTGCAAGGCATCACCATCTACTTCATTGGATACACCAGATAATAATGAAATGATCATGTGGTGGGAGAGGCTGTTAGAGAGTGGTCAATTTGAGCTAGAAACTCAAAATTCTATGGGATGGTCAGAGAGGCCTACCATGTCCAACTTTTGGGCTGAAATATCACCTCTGAGAACAATGTGTGCAGGTAGTACTGGTTTTGAAGTGAACCAGAACTGCTTGGACAAACATCATGACTTGGATTTCGATGCGACCCTTTGGAATCTTCTAAGTATAGAAGAAGACAATGCAAAG

其中，框中的ATG和TAA分别为LcMYB1核苷酸序列的起始密码子和终止密码子。

上述荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1，其氨基酸序列如下所示：

MSHLLGASAYSATSAEGYIGVRKGAWTEGEDNLLKKCVEIYGEQKWHQVPVRAGLNRCRKSCRLRWLNYLKPNIKRGEFMEDEVDLILRLHKLLGNRWSLIAGRLPGRTANDIKNYWNTHLRKKAVASKQESKTMTSTTTTQSTQKINVIKPQPRTFAKKTSEWVNTKITMEENSRDHLGHPNLCKASPSTSLDTPDNNEMIMWWERLLESGQFELETQNSMGWSERPTMSNFWAEISPLRTMCAGSTGFEVNQNCLDKHHDLDFDATLWNLLSIEEDNAK

上述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的应用，主要在提高植物的花色素苷积累方面应用。

上述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的应用，主要在提高转基因植物的花色素苷积累方面应用。

所述的转基因植物优选为转入LcMYB1基因的植物，更优选为转入LcMYB1基因的烟草。

所述的转入LcMYB1基因，优选为通过将LcMYB1连接到pBI121载体上，获得重组质粒，将重组质粒转化农杆菌EHA105菌株感受态细胞；完成转入LcMYB1基因。

所述的转化优选为冻溶法转化方式。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明获得一种荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的核苷酸序列，并对其氨基酸序列的结构特征和物种比对进行分析。

2.本发明从LcMYB1的氨基酸结构上分析LcMYB1可能具有调控荔枝果皮花色素苷生物合成的功能，然后通过转化烟草证实LcMYB1具有调控花色素苷生物合成的功能。

附图说明

图1是LcMYB1克隆过程电泳图。其中，M，DNA Marker（条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；A，LcMYB1片段；B，LcMYB13＇RACE片段；C，LcMYB15＇RACE片段；D，LcMYB1全长。

图2是LcMYB1推导的氨基酸序列的结构分析。其中，图中所用到的序列基因名称和GenBank登录号为：AtPAP2(AAG42002)，MdMYB10(DQ267896)，MrMYB1(GQ340767)，GmMYB10(FJ197137),VvMYBA1(BAD18977)，VvMYBA2(DQ886419)。

图3是LcMYB1的氨基酸序列与其他植物的MYB蛋白的进化分析。

图4是LcMYB1在‘糯米糍’荔枝不同时期组织或部位表达。

图5是‘糯米糍’荔枝发育阶段LcMYB1的表达分析。

图6是烟草中超表达LcMYB1。其中，A-E为转化过程，F和G为炼苗后叶片积累花色素苷。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1.荔枝果皮选取

分发明的荔枝选取‘糯米糍’荔枝，所用‘糯米糍’荔枝果皮、果肉、叶片、茎取自采自华南农业大学长岗山果园。‘糯米糍’发育阶段样品在花后52天、59天、62天、66天和73天采样。果皮用0.9cm口径的打孔器取果皮圆片，装入锡纸袋迅速用液氮速冻，带回实验室冻存于-80℃冰箱，用于果皮花色素苷含量测定、基因克隆及基因表达分析。‘糯米糍’荔枝果皮、果肉、叶片、茎取自采自华南农业大学长岗山果园。

2.荔枝果皮RNA的提取及检测

荔枝果皮RNA的提取采用北京Tiandz基因公司RNAOUT（具体方法参照说明书）。用DNase I（TaKaRa）消化DNA，具体方法参照说明书。RNA的浓度测定和纯度分析：取1.0μl RNA溶液稀释至100.0μL，用核酸蛋白检测仪测定260、280和320nm的光吸收值，并计算260nm/280nm比值。当OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值介于1.80～2.00时，RNA样品可用于下一步试验。总RNA样品浓度按下列公式计算：RNA浓度=OD₂₆₀*40ngμL^-1*100。为进一步评价总RNA的完整性，取2.0μL总RNA进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

3.cDNA第一链的合成和初始模板均一化

利用SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）合成cDNA用于RACE片段克隆。用于表达的每个样品均取2.0μg总RNA，利用MLV-ReverseTranscriptase Kit（Invitrogen公司）合成cDNA第一链，具体操作均按试剂盒说明书进行。

4.引物设计

根据引物设计的基本原则，用Primer Premier5.0设计出引物，委托上海生物工程有限公司合成。LcMYB1片段、RACE片段、全长和Rea-time PCR扩增所用引物见表1。

表1LcMYB1片段、RACE片段、全长和Real-time PCR引物

5.LcMYB1基因的分离及序列分析：

利用兼并引物克隆得到长度为283bp的片段，然后根据片段设计了RCAE引物，经过扩增得到3＇RACE片段606bp，5＇RACE片段419bp，RACE步骤参见Clontech公司的Smart RACE说明书。兼并引物参照杨梅（Niu et al.2010）上成功克隆的引物。将得到的片段、3＇RACE和5＇RACE的结果经过拼接设计引物得到全长为940bp，ORF框为846bp，编码281个氨基酸，所述的LcMYB1的ORF框的核苷酸序列和氨基酸序列见如下。具体的克隆过程电泳图如图1。如图2所示，将LcMYB1全长核苷酸序列进行翻译，得到的氨基酸序列中含有R2和R3两个不完全重复序列；一个典的结构域[D/E]Lx₂[R/K]x₃Lx₆Lx₃R，被称为bHLH Motif，它是能与bHLH一类蛋白相互作用的区域（Zimmermann et al.2004）；C端有一个motif6的结构域[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]，这个结构已经被证明是调控花色素苷的MYB转录因子所需要的一个重要结构（Lin-Wang et al.2010）。以上结果表明LcMYB1是R2R3-MYB基因家族的一个成员，可能是调控荔枝果皮花色素苷生物合成的转录因子。

利用DNAman软件构建了包括LcMYB1在内的16个调控花色素苷生物合成的R2R3-MYB转录因子的系统进化树，如图3所示。LcMYB1与已经证实调控花色素苷生物合成的转录因子同源性较高，如杨梅（MrMYB1）（Niu et al.2010）、苹果（MdMYB10）（Espley et al.2007）等。

6.LcMYB1在‘糯米糍’荔枝中的表达分析

LcMYB1在‘糯米糍’荔枝中的表达分析采用Real-Time PCR反应（ABI7500Real-Time PCR System）进行。反应体系按照Real-Time PCR Master Mix（TOYOBO，Japan）说明书，反应体积为20.0μL；反应条件如下：50℃，60s；95℃，60s，95℃，15s，56℃，20s，72℃，35s，40个循环；之后进行55-95℃熔解曲线分析。每个样品设3个重复。反应结束后通过熔解曲线鉴定产物的特异性。实验所选用的内参基因参照已经报道稳定性好的ACTIN（HQ615689）。基因相对表达量分析运用2^-△△CT法进行数据处理（Livak and Schmittgen2001），计算LcMYB1的表达水平。以上所有实验均设3次重复，实验用ddH₂O为阴性对照。

LcMYB1在‘糯米糍’荔枝不同时期组织或部位表达的结果如图4。结果表明，LcMYB1在‘糯米糍’红果皮和红色幼叶中的表达量高，在绿果皮中只有微量的表达，在果肉、茎和成熟叶片中均检测不到其表达。这说明LcMYB1的表达具有特异性。而没有表达或者表达很低的组织或者部位（绿果皮、果肉、茎和成熟的叶）中均没有花色素苷的合成。

‘糯米糍’荔枝发育阶段LcMYB1的表达分析的结果图如图5所示，结果显示花后52天荔枝果皮还没有转黄，无花色素苷的合成；随着果皮的发育，果皮花色素苷含量逐渐增加，到果实成熟时达到最高。与此同时，LcMYB1基因开始表达，到果实采收时表达水平最高。

7.LcMYB1基因的功能鉴定

设计上游引物带有BamH I酶切位点和下游引物带Sac I酶切位点的基因特异性植物表达载体构建引物（表2），用于扩增基因的编码区。利用BamH I和Sac I两个酶切位点将LcMYB1连接到pBI121载体上，获得构建好的35S启动子驱动的LcMYB1基因的植物表达载体，命名为pBI121-LcMYB1，通过冻溶法将其转化农杆菌EHA105菌株感受态细胞。经过农杆菌侵染、共培养、筛选培养和生根筛选后，共得到转LcMYB1基因抗性烟草植株的57株。转基因烟草中的花色素苷的积累情况见图6。结果显示转基因烟草花瓣的花色素苷含量明显比对照高，转基因烟草叶片也积累了花色素苷。

表2植物表达载体构建引物

MYB是调控植物次生代谢的重要转录因子家族，其中与花色素代谢相关的主要是R2R3-MYB一类。通过RT-PCR和RACE相结合的方法，我们从荔枝果实上分离到一个R2R3-MYB基因，命名为LcMYB1。LcMYB1的氨基酸序列与已经报道的调控花色素苷生物合成相关的R2R3-MYB的氨基酸序列在R2R3两个保守区具有很高的同源性（见图3）。在LcMYB1的氨基酸序列中存在两个结构域bHLHMotif和motif6，这两个结构域是调控花色素苷的MYB转录因子的重要结构（见图2）（Hichri et al.2011）。从结构上看LcMYB1可能具有调控荔枝果皮花色素苷生物合成的功能。

LcMYB1在‘糯米糍’荔枝不同时期组织或者部位的表达都具有明显的差异。LcMYB1在不积累花色素苷的成熟的叶片、果肉和茎中均没有表达，在绿色果皮中也只有很低的表达，而在红色的果皮和幼叶中表达的水平较高（见图4）。这与杨梅的MrMYB1表达一致，说明LcMYB1的表达具有特异性，即只在有花色素苷合成的部位表达。

在烟草中超表达LcMYB1可以促使烟草叶片积累花色素苷，进一步明确了LcMYB1调控荔枝果皮花色素苷的功能。积累和不积累花色素苷的葡萄、苹果品种的MYB基因启动子区域的变异会使花色素苷的积累发生巨大的变化，而不是基因cDNA突变（Espley et al.2009;Kobayashi et al.2002）。而杨梅MrMYB1基因cDNA的突变和表达量均会影响花色素苷的生物合成。不同荔枝品种的MYB基因启动子的差异或者cDNA的变异是否是造成花色素苷含量的差异还需进一步研究。

葡萄的VvMYBA1能够调控花色素苷合成代谢过程中的下游基因UFGT（Kobayashi et al.2002;Kobayashi et al.2004），与葡萄一样，MrMYB1（杨梅）和GmMYB10（山竹）的作用也是调节下游基因UFGT的表达（Niu et al.2010;Palapol et al.2009）。在与荔枝果皮花色素苷积累正相关的结构基因中，LcUFGT在花色素苷开始积累的后期表达量才有较大的增加，这说明LcUFGT在荔枝果皮花色素苷合成中起着关键性的作用（Wei et al.2011）。LcUFGT与LcMYB1的表达有一定的相关性，LcUFGT的表达是否是由于LcMYB1调控还需要进一步研究。

大部分转LcMYB1基因的植株都能在幼叶积累花色素苷（如图6），这说明在烟草中超表达LcMYB1可以促使烟草叶片积累花色素苷，进一步明确了LcMYB1调控荔枝果皮花色素苷的功能。在拟南芥中超表达AtPAP1或AtPAP2，拟南芥整株苗都可以积累花色素，同样在烟草中超表达AtPAP1或AtPAP2也能使烟草的叶片、花瓣积累花色素苷（Borevitz et al.2000;Malone et al.2009）。在拟南芥中超表达MdMYB1和PyMYB10，拟南芥的幼嫩的种子中能明显积累花色素苷（Feng et al.2010）。在烟草叶片中瞬时表达MdMYB10和MrMYB1能使烟草细胞积累花色素苷，在苹果幼苗中超表达MdMYB10能使整个幼苗呈现红色（Espleyet al.2007）。在烟草中超表MdMYB10，在整个转化培养过程中没有发现愈伤组织、叶片或者其他部位积累花色素苷，当转移至温室种植直到开花后才有和对照明显差异的表型，即花瓣和种子积累大量的花色素苷（Espley et al.2007）。一个来自苹果的基因MdMYB10在苹果中超表达，整个植株积累花色素苷；而在烟草中超表达时，花色素苷积累的部位主要集中在生殖生长器官。以上研究结果在一定程度上说明了LcMYB1基因在调控花色素苷合成代谢过程中起着重要作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1，其特征在于具体核苷酸序列如SEDNO ID：1所示。

2.根据权利要求1所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1，其特征在于：LcMYB1的氨基酸序列如SED NO ID：2所示。

3.权利要求1或2所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的应用，其特征在于在提高植物的花色素苷积累方面应用。

4.根据权利要求3所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的应用，其特征在于：所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1应用在提高转基因植物的花色素苷积累方面应用。

5.根据权利要求4所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的应用，其特征在于：所述的转基因植物为转入LcMYB1基因的植物。

6.根据权利要求4所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的应用，其特征在于：所述的转基因植物为转入LcMYB1基因的烟草。

7.根据权利要求6所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的应用，其特征在于：所述的转入LcMYB1基因为通过将LcMYB1连接到pBI121载体上，获得重组质粒，将重组质粒转化农杆菌EHA105菌株感受态细胞；完成转入LcMYB1基因。

8.根据权利要求7所述的荔枝R2R3-MYB基因LcMYB1的应用，其特征在于：所述的转化为冻溶法转化方式。