CN104561044A - 一种提高白桦抗逆性的基因及其编码的蛋白 - Google Patents

一种提高白桦抗逆性的基因及其编码的蛋白 Download PDF

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Abstract

一种提高白桦抗逆性的基因及其编码的蛋白，它涉及一种提高白桦抗性的基因及其编码的蛋白。本发明的目的是提供一种提高白桦抗逆性的基因及其编码的蛋白，为之后培育高抗逆性白桦品种奠定物质基础。提高白桦抗逆性的基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示。本发明BplMYB46基因在白桦中表达具有明显的抗逆能力。

Description

一种提高白桦抗逆性的基因及其编码的蛋白
技术领域
本发明涉及一种提高白桦抗性的基因及其编码的蛋白。
背景技术
白桦(Betula platyphylla Suk.)为桦木科桦属植物，为落叶乔木，生长速度快、是东北地区次生林的先锋树种，耐寒能力强，喜酸性土壤，在胶合板、单板的家具制造以及纸浆材等方面有广泛的应用。由于其重要的生态、观赏和实用经济价值，历来被列为国家科技计划研究的重要树种之一。对白桦品种改良的范围也在不断扩大，其主要目标是培育速生、优质和高抗的林木新白桦品种。但是传统的品种改良手段存在效果不明显，周期长，成功率低的问题。利用基因工程技术进行遗传改良可以解决上述问题，但首先需要找到在白桦中能够提升白桦性能的基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高白桦抗逆性的基因及其编码的蛋白，为之后培育高抗逆性白桦品种奠定物质基础。
本发明提高白桦抗逆性的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提高白桦抗逆性的基因所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明提高白桦抗逆性的基因全长为915bp，编码的蛋白分子由304个氨基酸组成(SEQ ID NO：2)，分子量为34.4kDa，理论等电点为5.95。
本发明提高白桦抗逆性的基因被命名为BplMYB46基因，实验表明本发明提高白桦抗逆性的基因BplMYB46基因导入白桦后受干旱和盐胁迫而明显诱导表达，证明本发明BplMYB46基因参与白桦的抗旱耐盐胁迫应答反应。
用本发明BplMYB46基因构建植物过表达载体，然后通过农杆菌介导法转入野生型白桦中，发现过表达BplMYB46的转基因白桦受NaCl、ABA和Mannitol胁迫后白桦的长势优于对照组野生型白桦，平均鲜重是野生型白桦的1.5倍，平均根长是野生型白桦的2.5倍。受NaCl、ABA和Mannitol胁迫后过表达BplMYB46的转基因白桦中超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)含量明显增加，使过氧化氢含量、活性氧含量和细胞的受损伤程度降低，表明BplMYB46基因具有明显的抗逆能力。
附图说明
图1是具体实施方式二中在非胁迫条件(control)下和在NaCl、ABA、Mannitol的胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)与野生型白桦植株(WT)的生长状况图。
图2是具体实施方式二中在非胁迫条件(control)下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)与野生型白桦植株(WT)的相对鲜重对比图。
图3是具体实施方式二中受NaCl胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)与野生型白桦植株(WT)的相对鲜重对比图。
图4是具体实施方式二中受ABA胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)与野生型白桦植株(WT)的相对鲜重对比图。
图5是具体实施方式二中受Mannitol胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)与野生型白桦植株(WT)的相对鲜重对比图。
图6是具体实施方式二中在非胁迫条件(control)下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)与野生型白桦植株(WT)的相对根长度对比图。
图7是具体实施方式二中受NaCl胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)与野生型白桦植株(WT)的相对根长度对比图。
图8是具体实施方式二中受ABA胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)与野生型白桦植株(WT)的相对根长度对比图。
图9是具体实施方式二中受Mannitol胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)与野生型白桦植株(WT)的相对根长度对比图。
图10是具体实施方式二中DAB染色试验的染色结果图。
图11是具体实施方式二中DCFH-DA染色试验的染色结果图。
图12是具体实施方式二中PI染色试验的染色结果图。
图13是具体实施方式二中SOD活性测定试验的活性检测结果图。
图14是具体实施方式二中POD活性测定试验的活性检测结果图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式提高白桦抗逆性的基因BplMYB46基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本实施方式提高白桦抗逆性的基因BplMYB46基因所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
本实施方式BplMYB46基因全长为915bp，编码的蛋白分子由304个氨基酸组成，如SEQ ID NO：2所示，分子量为34.4kDa，理论等电点为5.95。
具体实施方式二：本实施方式对提高白桦抗逆性的基因BplMYB46基因进行试验：
一、在BplMYB46基因上、下游分别引入Sma I酶切位点，设计合成带有Sma I酶切位点的BplMYB46基因序列及引物；
二、进行PCR扩增；PCR反应为94℃预变性5min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，循环30次，最后在72℃保温5min；
三、收集到的DNA片段纯化后与经Sma I酶切的ProKII载体连接，再转化大肠杆菌Top10菌株；
四、PCR验证和测序鉴定正确的重组质粒(ProkII-BplMYB46)用电导法转入根癌农杆菌EHA105菌株中，得到阳性重组菌；
五、步骤四获得的阳性重组菌采用根癌农杆菌介导法转化野生型白桦，并在含有卡那霉素40mg/L、头孢霉素600mg/L的WPM培养基上进行筛选，壮苗后取2～3片叶子提取白桦DNA进行PCR检测，含有BplMYB46基因的为阳性转基因白桦株系；
六、将步骤五获得的阳性转基因白桦株系和野生型白桦的组培苗转移到土中，在人工气候室中培养；
七、以两个月的土培苗为材料，分别用水、浓度为200mmol/L的NaCl溶液、100μmol/L的脱落酸(ABA)溶液和浓度为300mmol/L的甘露醇(Mannitol)溶液处理阳性转基因白桦株系植株和野生型白桦植株，在人工气候室中培养7～10天，观察和测量胁迫与非胁迫条件下白桦植株的鲜重和根长，并进行3次生物学重复。
本实施方式步骤四中正确的重组质粒ProkII-BplMYB46经PCR扩增可得到与BplMYB46基因大小一致的条带(基因片段)，再经过测序，该片段与BplMYB46基因的核苷酸序列相同。
本实施方式步骤五中壮苗后在苗高3～4cm时取2～3片叶子提取白桦DNA。
本实施方式步骤五获得16个阳性转基因白桦株系，本实施方式步骤六选用其中的两个阳性转基因白桦株系OE9和OE10的组培苗转移到土继续培养。
在非胁迫条件(control)下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)的生长状况与野生型白桦植株(WT)基本保持一致；而在NaCl、ABA以及Mannitol的非生物胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)的白桦长势优于野生型白桦植株(WT)。实验结果如图1所示，实验表明BplMYB46基因在白桦中可成功表达，并使阳性转基因白桦的抗逆性大幅提升。
以野生型白桦植株的根长和鲜重为对照(设置值为1)，进行相对计算，结果如图2～9所示，从图中可以看到在非胁迫条件下(Control)，阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)和野生型白桦植株(WT)的相对鲜重和根长度没有明显的差别；而在NaCl、ABA以及Mannitol的非生物胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)的相对鲜重和根长度大约分别是野生型白桦植株(WT)1.5倍和1.5倍。实验进一步说明BplMYB46基因在白桦具有抗旱、耐盐能力。
将阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)和野生型白桦植株(WT)的两个月组培苗取出，放入分别浓度为150mmol/L的NaCl溶液、50μmol/L的脱落酸(ABA)溶液和浓度为200mmol/L的甘露醇(Mannitol)溶液中进行浸泡处理，取植株叶片用于DAB染色、DCFH-DA染色和PI染色。
1)DAB染色：
分别取未胁迫处理和胁迫处理6h的阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)和野生型白桦植株(WT)叶片，置于离心管中，加入DAB染色液，室温染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。
2)DCFH-DA染色：
分别撕取未胁迫处理和胁迫处理1h的阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)和野生型白桦植株(WT)叶片的下表皮，放入诱导气孔开放液中2h，然后用10mmol/L的DCFH-DA染色液染色15min。染色结束后，用诱导气孔开放液冲洗下表皮三次，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
3)PI染色：
分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)和野生型白桦植株(WT)的根尖，置于PI染色液中，染色30min。然后用去离子水冲洗根尖，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
细胞中H2O2释放出的氧离子能够氧化DAB，形成棕色沉淀，根据染色的深浅，能判断细胞中H2O2释放量的多少，细胞受损伤越严重，H2O2释放的越多。DAB染色结果如图10所示。在非胁迫生长条件下(control)OE9、OE10和WT植株叶片基本无颜色，且相互之间无明显差异，说明H2O2含量大致相同；在ABA、NaCl和Mannitol的非生物胁迫条件下OE9、OE10和WT植株叶片上的颜色发生明显的变化。阳性转基因白桦株系植株叶片上的颜色比野生型白桦叶片上的颜色浅表明OE9和OE10植株叶片内的H2O2的含量较野生型白桦植株(WT)叶片内的H2O2含量少，说明阳性转基因白桦株系植株受胁迫之后的损伤程度低。实验结果证明BplMYB46基因可在白桦植株体内起抗逆作用。
DCFH-DA能够自由穿过细胞膜进入细胞内，胞内的酯酶能将DCFH-DA水解生成DCFH，细胞内的活性氧可以将无荧光的DCFH氧化成有荧光的DCF，通过DCF荧光的强弱可以判断细胞内ROS(reactive oxygen species)的水平。利用DCFH-DA的染色原理，能够通过绿色荧光的多少鉴别转基因白桦细胞内ROS的含量。DCFH-DA染色结果如图11所示。从图11中可以看到，在非胁迫生长(control)条件下OE9、OE10和WT植株叶片气孔保卫细胞上的绿色荧光均很弱，说明ROS含量很低；在NaCl、ABA和Mannitol的非生物胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)和WT植株叶片气孔保卫细胞上的绿色荧光虽均发生变化，但阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)叶片气孔保卫细胞上的绿色荧光较WT弱，说明OE9和OE10植株叶片内ROS的含量比WT少，证明BplMYB46基因的表达能增强植株的抗逆能力。实验结果说明BplMYB46基因在白桦中能够正向调控植物的抗逆功能。
PI(Propidium Iodide)能进入膜不完整的损伤细胞内，与DNA结合后将细胞染成红色，利用PI染色原理，根据染色的深浅鉴别白桦细胞的损伤情况。PI染色结果如图12所示。
在非胁迫(control)条件下OE9、OE10和WT植株根尖上的红色荧光较弱，且相互之间无明显差异，说明细胞损伤情况基本一致；在NaCl、ABA和Mannitol的非生物胁迫条件下OE9、OE10和WT根尖的荧光强度有不同程度的加深。阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)的根尖的红色荧光比WT的弱，说明OE9和OE10植株根尖的损伤程度较WT根尖的损伤程度低。实验结果表明BplMYB46基因在白桦中能提高白桦植株的抗逆能力。
以两个月的土培苗为材料，分别用水和浓度为200mmol/L的NaCl溶液、100μmol/L的脱落酸(ABA)溶液和浓度为300mmol/L的甘露醇(Mannitol)溶液处理阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)和野生型白桦植株(WT)，在人工气候室中培养7～10天，取叶片为材料进行SOD和POD的测定。
1、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：
1)先取1.5ml离心管称重，然后取白桦叶片，液氮研磨后称重，加入1.5ml浓度为1/15mol/L的磷酸缓冲液，4℃静置30min，11000r/min、4℃离心20min，上清即为待测样品酶液，每个样品设3个生物学重复；
2)取酶液500μL，加1.5ml SOD反应液30℃，6级光照培养箱内反应10min；
3)取出后立即用722S分光光度计测各样品560nm处的OD值，用去离子水替代酶液的反应体系作为对照值，并用去离子水替代SOD反应液的反应体系作为对照调零；
4)SOD活性计算：ASOD＝(△A560％×V)/(50％×W×T×v)
式中：△A＝(对照A值-测定A值)/对照A＝(A1-A2)/A1；
V为提取的酶液总体积(ml)；v为反应的酶液体积(ml)；T为反应时间(min)；W为植物材料粉末的净重(g)。
SOD可以催化超氧阴离子自由基的歧化反应，抵抗活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，从而提高植物的抗逆能力，SOD活性测定结果如图13所示。
在非胁迫(control)条件下OE9、OE10和WT的SOD活性大致相同；在NaCl、ABA和Mannitol的非生物胁迫条件下OE9、OE10和WT的SOD活性发生了变化。阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)的SOD活性高于WT，说明OE9和OE10植株的抗逆境胁迫能力比WT植株强。实验结果表明BplMYB46基因在白桦中能够正向调控SOD活性。
2、过氧化物酶(POD)活性测定：
1)取叶片，液氮研样，称重；
2)加1.5ml浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液，4℃反应30min，11000r/min、4℃离心20min，上清即为待测样品酶液，每个样品设3个生物学重复；
3)取酶液0.5ml加0.8％H2O20.5ml和0.1mol/L磷酸缓冲液0.5ml以及0.1mol/L愈创木酚0.5ml；
4)30℃水浴反应10min；
5)用722S分光光度计测各样品470nm处的OD值，以去离子水替代酶液的反应体系为对照值，并以去离子水替代H2O2溶液的反应体系为对照调零；
6)POD活性计算：POD＝(N×△A)/(W×T)
式中：N为稀释倍数，△A＝(对照A值-测定A值)/对照A＝(A1-A2)/A1，
W为材料重量(g)，T为反应时间(min)
在过氧化物酶(POD)催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，过氧化物酶是植物体内降低氧自由基伤害的重要保护酶，和植物的抵御逆境胁迫能力紧密相关，实验结果如图14所示。
在非胁迫(control)条件下OE9、OE10和WT的POD活性大致相同；在NaCl、ABA和Mannitol的非生物胁迫条件下OE9、OE10和WT的POD活性发生了变化。阳性转基因白桦株系植株(OE9和OE10)的POD活性高于WT，说明OE9和OE10植株的抵御逆境胁迫能力比WT强。实验结果表明BplMYB46基因在白桦中能够通过调控植物体内的抗氧化酶活性来提高植物的抗逆能力。
以上试验结果表明BplMYB46基因在白桦中具有明显的抗旱、耐盐能力，且不影响白桦的生长。BplMYB46基因可用于白桦抗逆性品种的转基因培育。

Claims (2)

1.一种提高白桦抗逆性的基因，其特征在于提高白桦抗逆性的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述提高白桦抗逆性的基因所编码的蛋白，其特征在于该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
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