CN116790618B - 一种苦荞抗立枯病基因FtEIN3的克隆和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种苦荞抗立枯病基因FtEIN3，如SEQ ID NO.1所示，其编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明利用基因工程手段，将抗立枯病基因FtEIN3基因遗传转化拟南芥进行抗病性分析，该基因能够显著提高转基因拟南芥的抗立枯病能力；为苦荞对于立枯丝核菌的抵抗作用提供了一种新的思路，且发明效果可靠；通过提高苦荞自身抗病性可降低成本、绿色、安全、无环境污染、保护土壤。

Description

一种苦荞抗立枯病基因FtEIN3的克隆和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及基因克隆和利用转基因技术，通过转导FtEIN3基因来提高苦荞抗立枯病的方法。
背景技术
苦荞(Fagopyrum tataricum)为蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)的杂粮作物，其营养物质含量丰富，富含蛋白质、维生素、矿物质以及各种药用类黄酮，如芦丁、槲皮素、异槲皮素和表儿茶素等。此外，苦荞及其制品在预防高血压，增强机体免疫力，以及改善亚健康状态等方面具有较好功效。然而近年来，随着苦荞种植面积不断扩增，苦荞病害的发生种类和危害程度逐年增长。其中，由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的荞麦立枯病，已成为荞麦第一大病害。目前防治荞麦立枯病的传统方法是化学药物喷施，以杀死致病菌或者抑制病菌的生长，虽然该方法效果显著，然而长期使用化学药物会导致土壤微生物种群减少，土壤板结、肥力下降，且后期修复困难，还会带来农药残留等问题，而苦荞立枯病的发生与其自身抗病性密切相关。
EIN3(Ethylene-insensitive 3)转录因子在植物乙烯信号途径中扮演了重要的角色。高等植物中，EIN3转录因子存在于细胞核，激活下游途径的乙烯响应基因，以启动乙烯信号转导。拟南芥中AtMYC2和AtEIN3基因共同参与损伤反应以及调节防御基因表达。此外，EIN3基因还可以增强植物的耐盐性。因此，本研究从苦荞中克隆到一个重要的FtEIN3基因，其对立枯病的抗性功能进行了较系统的探究，填补了EIN3转录因子在苦荞抗病中的研究空白，为进一步研究抗病基因调控苦荞抗立枯病的分子机制奠定了一定的工作基础。
发明内容
为了解决上述问题，本发明克隆了一个苦荞抗立枯病体系中的新的抗病基因，命名为FtEIN3，利用基因工程手段，将抗立枯病基因FtEIN3遗传转化拟南芥进行验证，探究了其在苦荞抗立枯病的作用，旨在提高植株的立枯病抗性。
一方面，本发明提供了一种FtEIN3基因。
所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。
本发明同时提供了包含FtEIN3基因的表达载体和包含前述表达载体的基因工程细胞。
另一方面，本发明提供了FtEIN3基因在抗立枯丝核菌感染中的应用。
优选地，所述的应用为抗立枯病。
优选地，所述的应用对象为植物。
进一步优选地，所述的应用对象为荞麦属植物。
更进一步地，所述的应用对象为苦荞。
具体地，所述的应用可以是荞麦属植物的育种，优选为苦荞育种。
再一方面，本发明提供了FtEIN3基因或表达FtEIN3基因的载体或表达FtEIN3基因的细胞在构建转基因植物中的应用。
具体地，所述的植物过表达FtEIN3基因。
具体地，所述的转基因植物具有立枯病抗性。
又一方面，本发明提供了一种转基因植株的构建方法。
所述的构建方法中包括在植物中过表达FtEIN3基因。
优选地，所述的构建方法中包括将FtEIN3基因插入表达空载体，转化宿主细胞后侵染植物获得转基因植株。
优选地，所述的表达空载体为植物表达载体，进一步优选地，所述的表达空载体为pCAMBIA-1307。
优选地，所述的宿主细胞为具有表达功能的基因工程细胞，优选为农杆菌，进一步优选为农杆菌GV3101。
优选地，所述的构建方法包括以下步骤：
(1)克隆获得转录因子FtEIN3基因；
(2)将FtEIN3基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含FtEIN3基因的植物表达载体；
(3)将步骤(2)所得的含FtEIN3基因的植物表达载体转化农杆菌GV3101，获得用于转化的含FtEIN3基因农杆菌菌株；
(4)并利用步骤(3)所构建的农杆菌菌株遗传转化目的植物。
优选地，所述的克隆FtEIN3基因的方法为PCR。
优选地，所述的PCR引物为1307-FtEIN3 F/R，序列为SEQ ID NO.9-10。
优选地，所述的PCR的运行程序为94℃2min；94℃30s，55℃60s，72℃60s，30个循环。
在一些实施例中，所述的步骤(4)中的目的植物为拟南芥。
在一些实施例中，所述的构建方法中的步骤(1)前还包括无菌苗的培养：用10％次氯酸钠溶液消毒10min和75％乙醇灭菌2min再用无菌水清洗直至水呈澄清为止，对苦荞种子进行消毒，利用MS培养基培养获得苦荞无菌苗。
所述的无菌苗是指将种子放在灭菌的滤纸上吸干水分，种植在MS培养基上；培养条件是温度为22-25℃，光周期为16h/8h，湿度为75％-80％，培养2-4周。
本发明的有益效果：
本发明填补了EIN3转录因子在苦荞抗病中的研究空白；显著提高了转基因拟南芥的抗立枯病能力；为苦荞对于立枯丝核菌的抵抗作用提供了一种新的思路，且发明效果可靠；通过提高苦荞自身抗病性可降低成本、绿色、安全、无环境污染、保护土壤。
附图说明
图1为苦荞FtEIN3基因CDS序列扩增结果。
图2为FtEIN3蛋白的二级结构和三级结构预测。
图3为FtEIN3及其同源蛋白的系统进化树。
图4为苦荞FtEIN3基因的亚细胞定位。
图5为苦荞FtEIN3基因不同单倍型的抗病指数分析。
图6为立枯丝核菌侵染后FtEIN3的组织表达模式。
图7为pCAMBIA1307载体图谱。
图8为FtEIN3转基因拟南芥阳性株系的鉴定和表达分析。
图9为立枯丝核菌侵染后FtEIN3在野生型和转基因拟南芥中的表达量。
图10为FtEIN3转基因拟南芥的抗病性表型。
图11为FtEIN3转基因拟南芥的DAB染色。
图12为FtEIN3转基因拟南芥SOD、POD和MDA活性分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
包括以下步骤：
(1)FtEIN3基因克隆
利用MS培养基培养获得苦荞无菌苗：用10％次氯酸钠溶液消毒10min和75％乙醇灭菌2min再用无菌水清洗直至水呈澄清为止。将种子放在灭菌的滤纸上吸干水分，置于MS培养基上；培养条件是温度为22-25℃，光周期为16h/8h，湿度为75-80％，培养2-4周。
从苦荞(“川荞1号”品系)中克隆获得FtEIN3基因是选取两周龄苦荞幼苗，取幼苗50-100mg，加液氮充分研磨后，使用Trizol法提取总RNA。以此RNA为模板，使用III1st Strand cDNASynthesis Kit(+gDNAwiper)试剂盒(南京诺唯赞生物技术有限公司)进行反转录获得川荞1号的cDNA。
在中国农业科学院荞麦基因资源创新研究组提供立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)处理的苦荞(Tartary Buckwheat)转录组数据库中筛选获得FtEIN3基因，根据FtEIN3的ORF设计特异引物F：SEQ ID NO.3；和R：SEQ ID NO.4，以川荞1号cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因的CDS序列。PCR程序为94℃2min；94℃30s，55℃60s，72℃60s，30个循环。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图1显示，目的基因条带大小在1,500-2,000bp之间，与FtEIN3基因大小一致。将PCR纯化产物连接到pTOPO-Blunt Simple平末端克隆载体上，获得FtEIN3-T载体质粒。送经测序、分析、拼接后得到FtEIN3全长序列。所述FtEIN3基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸为SEQ ID NO.2。
(2)FtEIN3基因生物信息学分析
FtEIN3基因的CDS序列长度为1,623bp，编码540个氨基酸。应用ExPASy网站对其蛋白性质进行分析，结果表明，FtEIN3蛋白的理论相对分子质量为61.10kDa，理论等电点(pI)为5.87，预测的分子式为C2687H4175N751O834S31，不稳定指数为56.84>40，亲水性平均值为-0.774(负值代表亲水)，由此表明FtEIN3
蛋白是不稳定的亲水性蛋白。
FtEIN3蛋白的二级结构如图2中的A所示，由α-螺旋(33.52％)，延伸链(6.67％)，β折叠(2.41％)和无规则卷曲(57.41％)组成，并对其三级结构模型进行模拟(图2中的B)。
使用PlantCare网站对FtEIN3基因启动子区进行分析，发现FtEIN3基因启动子中存在大量TATA-box和CAAT-box核心启动子元件，除此之外，还包含一系列顺式作用元件，例如低温响应元件W-box和LTR、MeJA反应响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif、厌氧诱导响应元件ARE等，结果如表1所示。这些顺式作用元件预示FtEIN3基因可能会参与苦荞多种调控途径，以及对生物与非生物的胁迫响应。
表1FtEIN3基因启动子序列中的顺式作用元件
(3)FtEIN3蛋白进化树构建
通过NCBI在线网站将FtEIN3蛋白序列与不同物种进行比对，得到拟南芥(Arabidopsis thaliana)、日本晴水稻(Oryza sativa Japonica Group)、棉花(Gossypiumhirsutum)、烟草(Nicotiana tabacum)、榴莲(Durio zibethinus)、番茄(Solanumlycopersicum)、玉米(Zea mays)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、木薯(Manihot esculenta)、茶树(Camellia sinensis)的蛋白序列。利用MEGA6.0软件构建系统进化树(图3)，结果表明苦荞FtEIN3与棉花GhEIN3、榴莲DzEIN3亲缘关系较近。图3中，物种与蛋白登陆号分别为：GhEIN3棉花(XP_016754801.2)，DzEIN3榴莲(XP_022752827.1)，SlEIN3番茄(NP_001234546.1)，MeEIN3木薯(XP_021611396.1)，CsEIN3茶树(XP_028099472.1)，AtEIN3拟南芥(NP_180273.1)，NtEIN3烟草(NP_001312585.1)，HvEIN3大麦(KAE8766308.1)，OsEIN3日本晴水稻(XP_015629857.1)，ZmEIN3玉米(ACG45492.1)，TaEIN3小麦(XP_044369909.1)。
(4)苦荞FtEIN3基因的亚细胞定位
应用多个亚细胞定位预测网站(https://wolfpsort.hgc.jp、http://cello.life.nctu.edu.tw、http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2、http://linux1.sofcn/bioinf/Cell-PLoc-2、http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝protcomppl&subgroup＝proloc)来预测FtEIN3基因的亚细胞定位，预测结果均表示FtEIN3基因可能定位在细胞核上。
将构建好的亚细胞定位融合载体质粒1302-FtEIN3-GFP和细胞核maker载体质粒p2300(全称为p2300-35S-H2B-mCherry-OCS)采用农杆菌介导法瞬时共转化到本氏烟草叶片，采用空载体1302-GFP作为对照组。暗置8-12h后，正常培养36-60h，切片，用激光共聚焦显微镜观察。结果显示(图4)：对照组空载体1302-GFP的荧光信号定位在细胞膜和细胞核上，实验组1302-FtEIN3-GFP荧光信号定位于细胞核上。由此表明，苦荞FtEIN3基因定位在细胞核上，与预测结果一致。
(5)FtEIN3基因的多样性分析
选择苦荞7号染色体编码区的5个SNP位点45303553、45303556、45303724、45303860、45303876进行分析，结果如表2所示，5个位点的多样性表现为45303553(T/A)、45303556(A/G)、45303724(C/T)、45303860(A/G)、45303876(A/G)，说明FtEIN3基因存在生物多样性。如表2所示，FtEIN3基因在108个苦荞品种中有5种单倍型：hap1、hap2、hap3、hap4、hap5。其中，hap1包含的苦荞种质资源最多，为64个；对不同单倍型品种进行抗病指数分析，如图5所示，hap3存在极显著差异，为优异单倍型，包含8种苦荞种质资源(JX252、JPN333、GZ414、SC213、GZ253、SX-342、sx137、HB58)，说明在108个苦荞品种中，这8种苦荞种质资源可能具有更高的抗病性。
表2FtEIN3基因的多样性分析
(6)立枯丝核菌侵染后FtEIN3组织表达模式分析
分析立枯丝核菌侵染苦荞后FtEIN3基因在不同部位的表达量，具体方法如下：
在PDA培养基(北京酷来搏科技有限公司)上活化立枯丝核菌(菌株为R.solaniAG4-HGI 3)，28℃培养箱培养2天后，取PDA培养基上的两块大小一致的立枯丝核菌菌饼接种到100mL PDB培养基(北京酷来搏科技有限公司)中，28℃摇床220rpm孵育2-3天得到活化的立枯丝核菌菌液。使用该菌液侵染苦荞幼苗0h，6h，12h，24h，48h，分别选取不同时间段的苦荞幼苗的根系、茎段和叶片提取RNA。以此RNA为模板，使用III 1st StrandcDNASynthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒进行反转录成cDNA。以荞麦组成型表达的FeH3基因为内参，引物序列为FtH3-qPCR-F：SEQ ID NO.5；FtH3-qPCR-R：SEQ ID NO.6。同时设计基因特异引物FtEIN3-qPCR-F：SEQ ID NO.7；FtEIN3-qPCR-R：SEQ ID NO.8，并做3次生物学重复试验，利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)在BAI 7500实时荧光定量PCR仪上检测FtEIN3表达量。本实验中用RQ(相对表达量)＝2-ΔΔCT的算法，计算目标基因的相对表达量；设置表达0h 2-ΔΔCT值为1，计算出立枯丝核菌处理6、12、24和48h的表达倍数。
结果显示(图6)，随着立枯丝核菌侵染时间的增长，FtEIN3基因在根、茎、叶不同组织中的表达量也随之变化。由此可见，在立枯丝核菌侵染苦荞幼苗时，苦荞FtEIN3基因受到胁迫而诱导表达。
(7)FtEIN3过表达载体的构建
将FtEIN3基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含FtEIN3基因的植物表达载体pCAMBIA 1307-FtEIN3，具体方法如下：
设计含XbaI和PstI酶切位点的同源重组引物，以FtEIN3-T质粒为模板，1307-FtEIN3-F/R为引物，PCR扩增FtEIN3的全长序列。上游引物：1307-FtEIN3-F：SEQ ID NO.9和下游引物：1307-FtEIN3-R：SEQ ID NO.10。随后经酶切、回收和连接转化后，将FtEIN3全长序列正向插入pCAMBIA-1307载体的CaMV35S启动子后(载体图谱见图7)，经测序完全后得到过表达重组质粒pCAMBIA1307-FtEIN3。
(8)转化农杆菌
将测序验证正确的pCAMBIA 1307-FtEIN3重组质粒用热激法转化农杆菌GV3101感受态细胞，经菌落PCR鉴定后，将得到pCAMBIA 1307-FtEIN3重组质粒阳性菌，用于侵染拟南芥。
(9)拟南芥遗传转化：
用2盆花期的野生型拟南芥，取50mL侵染液A(50mL OD600＝0.6的pCAMBIA 1307-FtEIN3重组质粒阳性菌)；用蘸花法使拟南芥的花均完全浸泡在液体中，侵染2分钟，暗培养12小时，7天后重复该侵染步骤，得到T0代，收取转基因植株T0代种子，使用潮霉素(Hyg)抗性筛选获得T1代转基因拟南芥(Hyg浓度为100mg/mL)。提取T1代幼苗叶片基因组DNA为模板，以pCAMBIA1307载体通用引物TLF：SEQ ID NO.11作为正向引物，基因特异性引物1307-FtEIN3-R：SEQ ID NO.12作为反向引物进行PCR反应，结果如图8中的A所示，FtEIN3转基因拟南芥的条带单一且与1307-FtEIN3重组质粒大小一致。提取野生型拟南芥(WT)与FtEIN3转基因拟南芥(OE)的RNA，反转录成cDNA后进行qRT-PCR，结果表明，FtEIN3在3个转基因拟南芥株系中确实超表达，有显著差异(图8中的B)。综上，成功获得FtEIN3转基因拟南芥植株，为获取纯和后代，单株收取以进行后续实验。
(10)立枯丝核菌侵染FtEIN3转基因拟南芥的表达模式
将FtEIN3过表达拟南芥(OE3)和野生型拟南芥(WT)在同一条件下正常培养25天。4株拟南芥为一组种在同一盆内，选取3组拟南芥进行立枯丝核菌侵染，每3组分别侵染0h、6h、12h、24h、48h。提取WT和OE3各个侵染时间段的RNA，反转录得到cDNA。采用qRT-PCR方法检测WT和OE3在不同侵染时间段下的表达模式。如图9所示，随着立枯丝核菌侵染时间的增加，WT和OE3的FtEIN3基因相对表达量也逐渐升高。综上，在立枯丝核菌侵染拟南芥时，相比于WT，转基因拟南芥OE3株系中的FtEIN3基因相对表达量显著提高。
(11)FtEIN3过表达拟南芥抗病性检测
转基因拟南芥离体叶片侵染试验：将野生型拟南芥(WT)与FtEIN3转基因拟南芥(OE)正常培育3周，分别取大小相近的叶片作为两组。实验组用于立枯丝核菌离体侵染，对照组不做处理。如图10所示，24h后，对照组的转基因株系与WT没有任何差别；在实验组，WT离体叶片上病斑面积明显大于另外三个转基因株系。因此，在立枯丝核菌侵染条件下，FtEIN3过表达拟南芥株系的离体叶片对立枯病的抗病性明显强于野生型拟南芥。
DAB染色：选取野生型拟南芥(WT)和FtEIN3转基因拟南芥(OE)的离体叶片，一组进行立枯丝核菌侵染处理，一组不做处理。28℃培养箱条件下培养24h后，用DAB染色液(索莱宝生物科技有限公司)对离体叶片染色20min，再用叶绿体脱色液脱色3次以上至叶片无色。如图11所示，在24h立枯丝核菌侵染条件下，染色和脱色后，FtEIN3转基因拟南芥株系离体叶片上的病斑面积明显小于野生型拟南芥，说明在立枯丝核菌侵染0-24h期间，FtEIN3转基因拟南芥离体叶片的抗病性显著强于野生型。
在野生型拟南芥(WT)和FtEIN3转基因拟南芥(OE)正常发育到苗期时，为了研究其体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和丙二醛(MDA)的活性变化，对WT和转基因拟南芥均进行立枯丝核菌侵染处理与不处理。24h后，利用POD、SOD和MDA检测试剂盒(索莱宝生物科技有限公司)分别测定植株的POD、SOD和MDA含量。
如图12所示，SOD活性检测结果说明，WT被立枯丝核菌侵染24h时，SOD活性上升了2.87U/g；三个FtEIN3转基因拟南芥株系中，在侵染24h后，OE1、OE2、OE3的SOD活性分别上升了19.01U/g、17.38U/g、19.87U/g，是WT的6-7倍。POD活性检测结果表明，在WT和FtEIN3转基因拟南芥被立枯丝核菌侵染24h后，POD活性均有显著上升。WT、OE1、OE2、OE3的POD活性分别上升了212.33U/g、294.00U/g、179.67U/g、490.00U/g，其中FtEIN3转基因拟南芥株系OE3的上升幅度是WT的2倍。MDA活性检测结果表明，立枯丝核菌侵染野生型拟南芥24h后，其体内MDA活性上升了4.39nmol/g；而FtEIN3转基因拟南芥株系OE1、OE2、OE3在被侵染后，体内MDA活性分别上升了2.60nmol/g、2.42nmol/g、1.43nmol/g，是WT的0.5倍。
SOD和POD的活性高低反映了拟南芥对于立枯病抗性的强弱，在受到立枯丝核菌侵染时，FtEIN3转基因拟南芥体内的SOD和POD相较于WT上升幅度更大，表明FtEIN3转基因拟南芥相较于野生型拟南芥具有一定的抗病性。MDA活性的上升体现了细胞膜的损伤程度，立枯丝核菌侵染拟南芥时，WT体内的MDA活性更高，表明WT细胞膜损伤程度更严重，FtEIN3转基因拟南芥则与之相反，说明了FtEIN3转基因拟南芥相较于WT具有更高的抗病性。
本发明采用转FtEIN3基因的策略获得了抗立枯病的转基因拟南芥，为苦荞抗立枯病机制提供了一种新型有效方法。本发明对108种苦荞种质资源FtEIN3编码区进行分析，得出了一个优异单倍型hap3，为今后获得抗病性强的苦荞品种提供了参考价值。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种苦荞抗立枯病基因FtEIN3，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的苦荞抗立枯病基因FtEIN3编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
3.过表达权利要求1所述的苦荞抗立枯病基因FtEIN3在抗立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）感染中的应用，其特征在于，所述的应用对象为植物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用为抗立枯病。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的植物为荞麦属植物。
6.苦荞抗立枯病基因FtEIN3或表达苦荞抗立枯病基因FtEIN3的载体或表达苦荞抗立枯病基因FtEIN3的细胞在构建转基因植物中的应用，其特征在于，所述的苦荞抗立枯病基因FtEIN3核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的转基因植物具有立枯病抗性。
8.一种转基因植株的构建方法，其特征在于，包括在植物中过表达权利要求1所述的苦荞抗立枯病基因FtEIN3。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，包括将苦荞抗立枯病基因FtEIN3插入表达载体，转化宿主细胞后侵染植物获得转基因植株。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的表达载体为pCAMBIA1307载体。
11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述的宿主细胞为农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101。
12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）克隆获得苦荞抗立枯病基因FtEIN3；
（2）将苦荞抗立枯病基因FtEIN3可操作性地构建于表达调控序列，形成含苦荞抗立枯病基因FtEIN3的植物表达载体；
（3）将步骤（2）所得的含苦荞抗立枯病基因FtEIN3的植物表达载体转化农杆菌GV3101，获得用于转化的含苦荞抗立枯病基因FtEIN3农杆菌菌株；
（4）利用步骤（3）所构建的农杆菌菌株遗传转化植物。
13.包含权利要求1所述的苦荞抗立枯病基因FtEIN3的表达载体。
14.包含权利要求13所述的表达载体的基因工程细胞。
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Non-Patent Citations (3)

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ETHYLENE INSENSITIVE 3-like 1 protein [Morus notabilis].Genbank登录号：XP_010106128.2.2018,参见全文. *
Iordachescu,M.，等.Dianthus caryophyllus ethylene insensitive 3-like 4 mRNA, complete cds.Genbank登录号：AY728193.1.2009,参见全文. *
苦荞抗立枯病基因FtABCG12的克隆及其功能分析;李光胜，等;作物杂志(第214期);第43-50页 *

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