CN102399815A

CN102399815A - 嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因在提高植物耐逆性能中的应用

Info

Publication number: CN102399815A
Application number: CN2011103602983A
Authority: CN
Inventors: 陈珍; 朱诚; 杨卫军
Original assignee: Zhejiang University ZJU; China Jiliang University; Taizhou University
Current assignee: Zhejiang University ZJU; China Jiliang University; Taizhou University
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2012-04-04

Abstract

本发明公开了一种嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicum)MTHl745基因在提高植物耐逆性能中的应用，所述的嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。本发明将嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因导入拟南芥和水稻，显著提高了植物的耐逆(高温、高盐、重金属胁迫)性能，为开发新型转基因植物奠定了基础。

Description

嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因在提高植物耐逆性能中的应用

技术领域

本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及一种嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicum)MTHl745基因在提高植物耐逆性能中的应用。

背景技术

随着环境污染的加剧，重金属、高温、盐碱化、干旱等逆境问题日益突出，严重影响了植物生长，甚至给人类健康带来危害。近年来通过基因工程手段，采用重组DNA和转基因技术向植物导入抗性外源目的基因，已发展成为改良植物耐胁迫的新途径。如过表达小分子热激蛋白sHSP17.7基因(Murakami T，Matusuba S，Funatsuki H，et al.Overexpression of a small heat shock protein，sHSP17.7，confers both heat tolerance and UV-B resistanceof rice plants[J].Molecular Breeding，2004，13：165-175.)、拟南芥热激蛋白分子hsp101(Katiyar-Agarwal S，Agarwal M，Grover A.Heat-tolerant basmati rice engineered by over-expression of hsp101[J].Plant Molecular Biology，2003，51(5)：677-686.)、景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)基因(Feng LL，Wang K，Li Y，et al.Overexpression of SBPase enhances photosynthesis against high temperature stress in transgenic rice plants[J].Plant Cell Reports，2007，26(9)：1635-1646.)均可显著提高转基因水稻的耐热性。过表达Na⁺/H⁺反向转运蛋白、水稻DHAR(脱氢抗坏血酸还原酶)基因可提高拟南芥的耐盐性(Shi H，Wu S J，Zhu J K.Over expression of a plasma membrane Na+/H+ antiporter improves salt tolerance in Arabidopsis[J].Nature Biotechnology.2003，21：81-85.)。Meagher等(Meagher R.Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants[J].Current Opinion in Plant Biology，2000，3(2)：153-162.)构建了汞还原酶(merA)和有机汞裂解酶(merB)基因的表达载体，转入拟南芥后增强了植物对汞的吸收能力。将merA基因转入白杨(Liriodendron tulipifera)后，转基因植物能在汞含量高达500μg/kg土壤中正常生长，与非转基因白杨相比，汞的挥发能力提高了10倍(Rugh CL，Senecoff JF，Meagher RB，et al.Development of transgenic yellow poplar for mercury phytoremediation[J].Nature Biotechnology，1998，16：925-928.)。

蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)，是硫氧还蛋白超家族的一员，位于内质网腔。前期研究发现PDI具有催化蛋白形成二硫键和催化错配二硫键重排的功能，进一步研究发现PDI还具有分子伴侣活性和参与新陈代谢的功能(Ding X，Lv Z M，Zhao Y，et al.MTHl745，aprotein disulfide isomerase-like protein from thermophilic archaea，Methanothermobacter thermoautotrophicum involving in stress response[J].Cell Stress and Chaperones，2008，13：239-246.)。王天宇实验室克隆了玉米PDI基因，Northern分析显示，该基因受干旱、冷、ABA和盐等逆境胁迫诱导表达(Liu Y H，Wang X T，Shi Y S，et al.Expression and characterization of a protein disulfide isomerases in Maize(Zea Mays L.)[J].Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2009，25(3)：229-234.)。

海底热液口高压、高温、高盐、富集化学毒素和重金属等，生活在其中的动物及微生物，为了适应这种极端环境，形成了特异的代谢途径以及生理结构，蕴含着丰富的抗逆基因资源。在陆地生物资源研究开发已经十分深入的今天，深海热液口生物资源的研究与利用具有重大的意义。MTHl745基因来源于嗜热自养甲烷杆菌ΔH^T，含有一个Trx结构域，编码151个氨基酸。我们前期研究中胰岛素混浊度实验和复性还原变性RNaseA分析表明了MTHl745蛋白的还原酶活性和二硫键异构酶活性，同时MTHl745能减少热诱发的柠檬酸合成酶的聚集23％，表明其具有分子伴侣活性(Ding X，Lv Z M，Zhao Y，et al.MTHl745，a protein disulfide isomerase-like protein from thermophilic archaea，Methanothermobacter thermoautotrophicum involving in stress response[J].Cell Stress and Chaperones，2008，13：239-246.)。

发明内容

本发明提供了一种嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因在提高植物耐逆性能中的应用。

一种嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicum)MTHl745基因在提高植物耐逆性能中的应用，所述的嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的耐逆性能为耐高温、耐盐或耐重金属胁迫性能。

所述的植物为拟南芥或水稻。

具体包括：

构建包含所述嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因的表达载体，将表达载体转入植物细胞，培养得到转基因植株。

所述的表达载体包括原始载体以及插入所述原始载体的启动子和终止子，所述的原始载体为pCAMBIA2301或pCAMBIA1301，所述的启动子为CaMV 35S启动子，所述的终止子为NOS终止子。

本发明将嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因导入拟南芥和水稻，拟南芥和水稻的耐逆性能得到显著提高，为开发新型转基因植物奠定了基础。

附图说明

图1为植物表达载体p2301-MTHl745构建示意图；

图2为转基因拟南芥的筛选和鉴定，A：拟南芥种子播种于含30mg/L卡那霉素的培养基上，绿色的为抗性株系；B：转基因植株的PCR检测，M：DL 2000 DNAladder；1：阳性质粒；2：非野生型植株；3-9：转基因植株；其中7为假阳性；

图3为42℃预处理对拟南芥种子萌发和幼苗生长的影响(13d)。(A)正常温度(23/21℃ 16/8h)；(B)42℃预处理24h后恢复正常温度培养；(C)温度处理对拟南芥幼苗根长的影响；(D)温度处理对拟南芥幼苗单株鲜重的影响。*表示同一处理下野生型和转基因植株间差异具有显著性，P≤0.05；**表示差异极显著，P≤0.01。WT：野生型拟南芥Columbia-0型；35S::MTHl745：转MTHl745拟南芥株系，下同。

图4为不同浓度NaCl处理对拟南芥种子萌发和幼苗生长的影响(13d)。(A)0mmol/L NaCl；(B)50mmol/L NaCl；(C)75mmol/L NaCl；(D)NaCl处理对拟南芥幼苗根长的影响；(E)NaCl处理对拟南芥幼苗单株鲜重的影响。

图5为不同浓度HgCl₂处理对拟南芥萌发和幼苗生长的影响(13d)。 (A)0μmol/L HgCl₂；(B)10μmol/L HgCl₂；(C)12μmol/L HgCl₂；(D)15μmol/L HgCl₂；(E)20μmol/L HgCl₂；(F)HgCl₂处理对拟南芥幼苗根长的影响；(G)HgCl₂处理对拟南芥幼苗单株鲜重的影响；

图6为实施例5水稻生长至五叶期分别经不同试剂处理后的表型图；(A)100μmol/L HgCl₂处理54h；(B)300μmol/L CdCl₂处理5d；(C)100mmol/L NaCl处理3d；WT：代表野生型植株；35::MTHl745：代表转基因植株，左边为空白对照。Bar＝2cm。

具体实施方式

实施例1 表达载体p2301-MTHl745构建

培养含质粒pET-28a-MTHl745的大肠杆菌(Ding et al.，2008)，用MTHl745基因的特异性引物(含Kpn I和Pst I酶切位点)进行菌液高保真PCR，将回收纯化的PCR产物连接到中间载体pMD19-T上，转化大肠杆菌DH5α。挑取阳性克隆，PCR及测序鉴定。摇取正确的菌液提取质粒pMD19-MTHl745，Kpn I和Pst I双酶切得目的基因片段。连接插入相同酶切后的pCAMBIA2301载体的多克隆位点中，并在目的基因前后分别添加CaMV 35S启动子和NOS终止子，得植物表达载体p2301-MTHl745(图1)。重组子经酶切鉴定后，冻融法导入农杆菌LBA4404中。

MTHl745特异性引物：

MTHl745-F：5′-CGGGGTACCATGGAGCATGGTAAATTGGATG-3’(Kpn I)

MTHl745-R：5′-AAACTGCAGCTACCCCAGATAGGATATGAGT-3’(Pst I)

实施例2目的基因在拟南芥中的转化

拟南芥野生型种子(Columbia-0)以70％酒精消毒1min、10％NaClO消毒5min后，无菌水冲洗，播于1/2MS培养基(蔗糖10g/L)上。10d后移苗。转移至蛭石与珍珠岩(3∶1)的基质中培养，保持基质湿润，并定期浇灌拟南芥营养液。约3周左右，剪去已经开花的主茎，抑制顶端优势。约4周左右，抽出的侧枝大量开花，可用以浸润。培养条件为23℃/21℃(光照/黑暗)，16h/8h光周期，湿度70％。

取含重组质粒的农杆菌菌液，以YEP液体培养基振荡培养过夜，离心后收集菌体，重悬于现配的5％蔗糖溶液中，悬浮液OD600为0.8～1.0 左右，并加入表面活性剂Silwet，使其终浓度达0.02％。

将拟南芥花序于菌液中浸润30s，用保鲜膜覆盖，28℃暗处平放24h后揭膜。用水喷洒洗去多余Silwet，正常生长，收取种子。

实施例3转化植株的筛选

T1代种子消毒后以添加30mg/L卡那霉素的1/2MS培养基筛选。转化植株正常生长并生根(图2B)，非转化细胞黄化。抗性植株转移至基质中培养，提取叶片基因组DNA做PCR验证。

T2代种子以卡那霉素筛选，分离比为3∶1的推测为单拷贝插入，继续繁殖，获得T3代纯合种子。

实施例4转基因拟南芥的抗逆性研究

温度处理：拟南芥种子(野生型和转基因)经消毒后播种于1/2MS培养基上，分别在42℃预处理0、3、6、12、24h后恢复正常温度(23/21℃，16/8h)培养。方形培养皿竖直放置，下同。

盐胁迫处理：拟南芥种子(野生型和转基因)经消毒后播种于含0、50、75、100mmol/L NaCl的1/2MS培养基上培养。

重金属处理：拟南芥种子(野生型和转基因)经消毒后播种于含0，10，12，15，20μmol/L HgCl₂的1/2MS培养基上培养。

每个处理5株，重复3次。13d后观察拟南芥的生长情况，统计根长和鲜重。

如图3所示，42℃高温处理在一定程度上抑制了拟南芥幼苗的生长，播种后3～12h热处理对根长的影响较小。当热处理时间达24h时野生型植株的根长减少了19.8％，而转基因植株的根长与未经热处理的相当，为相同条件下野生型的1.36倍。分别称取单株鲜重，统计分析后发现，42℃热预处理后植株鲜重减轻，当处理达24h时鲜重仅为对照的68.6％。而转基因植株的鲜重受热处理影响较小，24h处理后鲜重仅减轻了0.071％。可见，MTHl745提高了拟南芥种子的耐热性。

如图4所示，50mmol/L NaCl处理对拟南芥生长的影响并不显著，当浓度升高到75mmol/L时，根长和鲜重都受到了显著的抑制，而转基因幼苗表现出一定的耐盐性。盐处理下转基因幼苗的平均鲜重分别为对照的 1.38和1.56倍。

如图5所示，MTHl745显著促进了10μmol/L HgCl₂处理下拟南芥的生长，转基因幼苗的平均根长为野生型的1.4倍。而当汞浓度继续升高时，根长的促进作用减弱。但鲜重增加，12μmol/L和15μmol/L HgCl₂处理下转基因拟南芥的平均鲜重分别为野生型的1.21倍和1.35倍。

实施例5转基因水稻的抗逆性研究

按照与实施例1～3的类似方法，构建植物表达载体p1301-MTHl745，由农杆菌EHA105介导，以粳稻日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)成熟胚诱导的愈伤组织为转化受体，经一系列筛选，分化得到转基因水稻。选取T2代纯合株系和野生型水稻，以国际水稻所标准营养液(Yoshida etal.，1976)培养至五叶期，分别添加HgCl₂、CdCl₂和NaCl处理，观察水稻幼苗的生长情况。

如图6(A)所示，100μmol/L HgCl₂处理显著抑制水稻的生长，到54h野生型水稻幼苗严重枯萎，而转基因水稻老叶枯黄，新叶仍保持鲜绿。如图6(B)所示，300μmol/L CdCl₂处理对水稻幼苗也产生明显的毒害作用，5d后野生型和转基因水稻根部褐化，生长受阻，但转基因幼苗的抗性优于野生型。如图(C)所示，100mmol/L NaCl处理3d后野生型水稻枯死，而转基因水稻老叶枯萎，新叶仍保持一定的抗性。可见，MTHl745在转基因水稻中的过表达增强了水稻对重金属和盐胁迫的耐性。

Claims

1.嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicum)MTHl745基因在提高植物耐逆性能中的应用，所述的嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的耐逆性能为耐高温、耐盐或耐重金属胁迫性能。

3.根据权利要求1～2任一所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥或水稻。

4.根据权利要求1～2任一所述的应用，其特征在于，包括：

构建包含所述嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因的表达载体，将嗜热自养甲烷杆菌MTHl745基因转入植物细胞，培养得到转基因植株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特在于，所述的表达载体包括原始载体以及插入所述原始载体的启动子和终止子，所述的原始载体为pCAMBIA2301或pCAMBIA1301。

6.根据权利要求4所述的应用，其特在于，所述的启动子为CaMV 35S启动子。

7.根据权利要求4所述的应用，其特在于，所述的终止子为NOS终止子。