CN107779471B - 嗜热自养甲烷杆菌mth1745基因在提高植物耐逆性能中的应用 - Google Patents

嗜热自养甲烷杆菌mth1745基因在提高植物耐逆性能中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicum)MTH1745基因在提高植物耐逆性能中的应用，所述的嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。本发明将嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基因导入拟南芥和水稻，显著提高了植物的耐逆(高温、高盐、重金属胁迫)性能，为开发新型转基因植物奠定了基础。

Description

嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基因在提高植物耐逆性能中的 应用
技术领域
本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及一种嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicum)MTH1745基因在提高 植物耐逆性能中的应用。
背景技术
维生素C,又名抗坏血酸(L一Ascothatoacid,AsA)是植物体内主要 的抗氧化物质,存在于大多数植物绿色组织中,在植物的生长和代谢过 程中起着重要作用。植物中AsA的重要性不仅在于它为不能正常合 成AsA的少数动物(包括人类)提供丰富的维生素C源；而且近年来的 研究发现,AsA对于植物自身的抗氧化作用、光合保护以及调节生长 发育等都具有非常重要的生理功能。通过基因工程技术提高植物AsA 含量,改良植物营养品质和抗性是分子育种新的发展方向之一。AsA 的代谢工程研究正在逐渐开展,但是缺乏对代谢途径中基因的系统评 价。
蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)，是硫氧 还蛋白超家族的一员，位于内质网腔。前期研究发现PDI具有催化蛋 白形成二硫键和催化错配二硫键重排的功能，进一步研究发现PDI 还具有分子伴侣活性和参与新陈代谢的功能(Ding X,LvZ M,Zhao Y, et al.MTH1745,a protein disulfide isomerase-like protein fromthermophilic archaea,Methanothermobacter thermoautotrophicum involving instress response[J].Cell Stress and Chaperones,2008,13: 239-246.)。王天宇实验室克隆了玉米PDI基因，Northern分析显示， 该基因受干旱、冷、ABA和盐等逆境胁迫诱导表达(Liu Y H,Wang X T,Shi Y S,et al.Expression and characterization of a proteindisulfide isomerases in Maize(Zea Mays L.)[J].Chinese Journal of Biochemistryand Molecular Biology,2009,25(3):229-234.)。
MTHl745能减少热诱发的柠檬酸合成酶的聚集23％，表明其具 有分子伴侣活性(Ding X,Lv Z M,Zhao Y,et al.MTH1745,a protein disulfide isomerase-likeprotein from thermophilic archaea, Methanothermobacter thermoautotrophicuminvolving in stress response[J].Cell Stress and Chaperones,2008,13:239-246.)。
近年来,随着植物基因组学的发展,代谢工程不再仅仅具有理论上 的可行性,而是已经实际上成为了改造物种的有力工具。利用基因组 学的研究进展作为指导,快速克隆植物营养代谢途径相关酶的基因,进 而阐明和调控植物微量营养物质的代谢途径,并利用代谢工程的方法 提高植物营养价值的策略就是Della等(1999)提出的营养基因组学的 概念。这为寻找生产植物源AsA的新方法提供了一个新的方向。
在先前的研究中，发明人将嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基因转 入到植物当中，以其提高织物的耐逆性能。
发明内容
发明人将嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基因转入到拟南芥和水稻， 在转MTH1745基因拟南芥中，发现维生素C的含量高于野生株2倍 以上，而在转MTH1745基因水稻中维生素C的含量变化没有差异性。
虽然在植物的抗逆性研究中，有发现维生素C含量的变化，但是 还没有明确的报道指出转入植物抗逆性基因可提高维生素C的含量。 关于植物体内AsA的生物途径主要存在3种假说:碳链倒位途径 (inversion pathway),邻醛酮糖途径(osonepathway)和L-半乳糖途径 (L-galaetosepathway)。为了提供植物的维生素C含量，研究者们通常 也是从AsA合成路径入手，使AsA合成路径中相关的酶过量表达， 从而达到提高维生素C含量的目的。
然而本发明通过在拟南芥中转入嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基 因，对于提高植物中维生素C的含量取得了意想不到的效果。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯 草。属被子植物门，双子叶植物纲，十字花科植物，其基因组大约为 12500万碱基对和5对染色体。虽然在禾本科植物水稻中转入 MTH1745基因未确定同样的效果，但是十字花科植物中蔬菜可列举：卷心菜、花椰菜(菜花)、绿菜花(西兰花)、大白菜、小白菜、青菜、 油菜、各种甘蓝、西洋菜(豆瓣菜)、芥菜、榨菜、雪里红、大头菜、 芜菁、萝卜、大青萝卜、红萝卜、水萝卜、荠菜、诸葛菜、碎米荠、 独行菜、芝麻菜、芥末(芥菜的种子)、辣根等。因此将MTH1745基 因转入十字花科蔬菜中，可解决传统方法生产AsA无法满足商业化 需求的课题。
因此本法提供了一种提高十字花科植物中维生素C含量的方法， 所述方法是将MTH1745基因转入所述十字花科。
本发明一实施方式中所述MTH1745基因来自嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicum)。
本发明一实施方式中所述MTH1745基因是SEQ ID NO.3所示序 列。
本发明一实施方式中所述十字花科植物是拟南芥。
具体包括：
构建包含所述嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基因的表达载体，将 表达载体转入植物细胞，培养得到转基因植株。
所述的表达载体包括原始载体以及插入所述原始载体的启动子 和终止子，所述的原始载体为pCAMBIA2301或pCAMBIA1301，所 述的启动子为CaMV 35S启动子，所述的终止子为NOS终止子。
附图说明
图1为植物表达载体p2301-MTH1745构建示意图；
图2为转基因拟南芥的筛选和鉴定，A：拟南芥种子播种于含30 mg/L卡那霉素的培养基上，绿色的为抗性株系；B:转基因植株的 PCR检测，M：DL 2000 DNA ladder；1:阳性质粒；2：非野生型植 株；3-9：转基因植株；其中7为假阳性；
图3为42℃预处理对拟南芥种子萌发和幼苗生长的影响(13d)。 (A)正常温度(23/21℃16/8h)；(B)42℃预处理24h后恢复正常温 度培养；(C)温度处理对拟南芥幼苗根长的影响；(D)温度处理对拟 南芥幼苗单株鲜重的影响。*表示同一处理下野生型和转基因植株间 差异具有显著性，P≤0.05；**表示差异极显著，P≤0.01。WT：野生 型拟南芥Columbia-0型；35S::MTH1745：转MTH1745拟南芥株系， 下同。
图4为不同浓度NaCl处理对拟南芥种子萌发和幼苗生长的影响(13 d)。(A)0mmol/L NaCl；(B)50mmol/L NaCl；(C)NaCl处理对拟南芥幼苗 根长的影响；(D)NaCl处理对拟南芥幼苗单株鲜重的影响。
图5为AsA标准品HPLC示意图。
图6为样品的HPLC示意图。
图7显示了拟南芥中AsA含量。
具体实施方式
实施例1 表达载体p2301-MTH1745构建
培养含质粒pET-28a-MTH1745的大肠杆菌(Ding et al.,2008)， 用MTH1745基因的特异性引物(含Kpn I和Pst I酶切位点)进行菌 液高保真PCR，将回收纯化的PCR产物连接到中间载体pMD19-T上， 转化大肠杆菌DH5α。挑取阳性克隆，PCR及测序鉴定。摇取正确的菌液提取质粒pMD19-MTH1745，Kpn I和Pst I双酶切得目的基因片 段。连接插入相同酶切后的pCAMBIA2301载体的多克隆位点中，并 在目的基因前后分别添加CaMV 35S启动子和NOS终止子，得植物 表达载体p2301-MTH1745(图1)。重组子经酶切鉴定后，冻融法导 入农杆菌LBA4404中。
MTH1745特异性引物：
MTH1745-F：5'-CGGGGTACCATGGAGCATGGTAAATTGGATG-3’(Kpn I)
MTH1745-R：5'-AAACTGCAGCTACCCCAGATAGGATATGAGT-3’ (Pst I)
实施例2 目的基因在拟南芥中的转化
拟南芥野生型种子(Columbia-0)以70％酒精消毒1min、 10％NaClO消毒5min后，无菌水冲洗，播于1/2MS培养基(蔗糖 10g/L)上。10d后移苗。转移至蛭石与珍珠岩(3:1)的基质中培养， 保持基质湿润，并定期浇灌拟南芥营养液。约3周左右，剪去已经开 花的主茎，抑制顶端优势。约4周左右，抽出的侧枝大量开花，可用 以浸润。培养条件为23℃/21℃(光照/黑暗)，16h/8h光周期，湿度 70％。
取含重组质粒的农杆菌菌液，以YEP液体培养基振荡培养过夜， 离心后收集菌体，重悬于现配的5％蔗糖溶液中，悬浮液OD600为 0.8～1.0左右，并加入表面活性剂Silwet，使其终浓度达0.02％。
将拟南芥花序于菌液中浸润30s，用保鲜膜覆盖，28℃暗处平放 24h后揭膜。用水喷洒洗去多余Silwet，正常生长，收取种子。
实施例3 转化植株的筛选
T1代种子消毒后以添加30mg/L卡那霉素的1/2MS培养基筛选。 转化植株正常生长并生根(图2B)，非转化细胞黄化。抗性植株转移 至基质中培养，提取叶片基因组DNA做PCR验证。
T2代种子以卡那霉素筛选，分离比为3:1的推测为单拷贝插入， 继续繁殖，获得T3代纯合种子。
实施例4 转基因拟南芥中维生素C含量的测定
样品处理
每株系取0.1g见光后三周的叶片以液氮研磨,加0.1％草酸lmL, 浸泡1小时,超声处理半小时。10,000rpm离心10min,取上清,过0.45 μm滤膜。
高效液相(HPLC)条件
色谱柱:symmetry shield RP18柱(5μm，150×4.6mm)。流动相 为甲醇：0.1％甲酸＝5：95，检测波长245nm，柱温为30℃，流速 1.0ml/min,外标法定量。
绘制标准曲线
精确称取AsA标准品(精确到0.0001g)约10mg,取适量0.1％草酸 溶解,终浓度10mg/mL,梯度稀释成为50μg/mL的Vc标准品溶液,过 0.45μm滤膜。
每次分别进样2μL、5μL、10μL、15μL、20μL，以峰面积对 进样量回归分析,绘制标准曲线。
样品每次进样10μL,将与标品相同保留时间处的峰的峰面积代入 标准曲线方程,计算样品中AsA的含量。
选取上述T3代种子，采取叶片进行测定。结果如图5所示，野 生株(Wt)拟南芥中AsA含量为34.1mg/100gFW，转空白质粒对照 株(CK)中AsA含量为32.7mg/100gFW。而本发明的转MTH1745 基因拟南芥中，AsA含量均在70-80mg/100gFW。也就是说通过本 发明提供的方法得到的转MTH1745基因拟南芥，将其AsA含量提高 了2倍以上。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国计量大学
<120> 嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基因在提高植物耐逆性能中的应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggggtacca tggagcatgg taaattggat g 31
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaactgcagc taccccagat aggatatgag t 31
<210> 3
<211> 453
<212> DNA
<213> 嗜热自养甲烷杆菌（Methanothermobacter thermoautotrophicum）
<400> 3
atggagcatg gtaaattgga tgaagcaagg aagtgggccc tattcggact tctcgcagga 60
ctctcacttg tactcatcat ctacacagtc cagcccagag tgcctcagag cctcacgacg 120
gatgaaaagg accttaaatg gtatactgaa catgatgagg ccataaagga ggcttcgagg 180
acaggtaaaa atgttttcat ggtattttct gcttcatggt gtcctgcatg tcagaaactg 240
gaatctgaga cactacagaa cactgaggtt cagaggaggc tggcagagga tttcatcgca 300
gtcaaaatcg atgttgacac cagtccagcg ctgtcctcga ggtacagaat ttacggggtc 360
ccgacggtaa taatactgga tccctctgga aatgagatcg gaagaaggga gggctacatg 420
agccccgatg aactcatatc ctatctgggg tag 453

Claims (5)

1.MTH1745基因在提高拟南芥中维生素C含量的应用，其特征在于，将MTH1745基因转入拟南芥，培养得到转基因拟南芥植株，
所述MTH1745基因是嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacterthermoautotrophicum)MTH1745基因，所述嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基因的碱基序列是SEQ ID NO.3所示序列。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：
构建包含所述嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基因的表达载体，将嗜热自养甲烷杆菌MTH1745基因转入拟南芥细胞，培养得到转基因拟南芥植株。
3.如权利要求2所述的应用，其中，所述的表达载体包括原始载体以及插入所述原始载体的启动子和终止子，所述的原始载体为pCAMBIA2301或pCAMBIA1301。
4.如权利要求3所述的应用，其中，所述的启动子为CaMV 35S启动子。
5.如权利要求3所述的应用，其中，所述的终止子为NOS终止子。
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