CN103571842B - 水稻OsPAR1蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用 - Google Patents
水稻OsPAR1蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103571842B CN103571842B CN201210282421.9A CN201210282421A CN103571842B CN 103571842 B CN103571842 B CN 103571842B CN 201210282421 A CN201210282421 A CN 201210282421A CN 103571842 B CN103571842 B CN 103571842B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- plant
- paraquat
- encoding gene
- albumen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L paraquat dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 title claims abstract 11
- 101001098529 Homo sapiens Proteinase-activated receptor 1 Proteins 0.000 title abstract description 8
- 101000713169 Homo sapiens Solute carrier family 52, riboflavin transporter, member 2 Proteins 0.000 title abstract description 8
- 102100036862 Solute carrier family 52, riboflavin transporter, member 2 Human genes 0.000 title abstract description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 30
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 15
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 6
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 2
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 abstract description 20
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 abstract description 20
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 abstract description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract 1
- INFDPOAKFNIJBF-UHFFFAOYSA-N paraquat Chemical compound C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 INFDPOAKFNIJBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 14
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 14
- 241000746966 Zizania Species 0.000 description 9
- 235000002636 Zizania aquatica Nutrition 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 4
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 101100518958 Arabidopsis thaliana PAR1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical group 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 101710196039 Actin-11 Proteins 0.000 description 2
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 2
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 2
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 1
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108010081996 Photosystem I Protein Complex Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002420 orchard Substances 0.000 description 1
- -1 oxygen radical Chemical class 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了水稻OsPAR1蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用。本发明提供了一种提高或降低植物百草枯抗性的方法，及用于降低OsPAR1基因表达物质的发夹RNA、小干扰RNA及干扰载体和干扰片段。实验证明，过表达株系在0.5μM百草枯浓度下就有白化的表型且叶绿素含量明显下降，而干扰株系在0.5μM~5μM百草枯浓度下无白化表型且叶绿素含量无明显变化。两叶一心期，使用200μM百草枯水溶液对水稻叶片进行喷洒，2天后干扰株系植株叶片大部分都保持绿色，叶绿素分解较少；过表达株系植株叶片全部发白枯死。本发明为提高植物百草枯抗性或培育抗百草枯作物品种提供了一种新的途径，在农业生产上具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻OsPAR1蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用。
背景技术
百草枯（paraquat，1,1’-dimethyl-4,4’-bipiridyl；1,1’-二甲基-4,4’-联吡叮，分子量257.2）是一种非选择性的速效触杀型除草剂，它是继草甘磷之后的第二大除草剂。百草枯被广泛应用于防除各种一年生杂草；对多年生杂草有强烈的杀伤作用，但其地下茎和根能萌出新枝；对已木质化的棕色茎和树干无影响。同时，百草枯还适用于防除果园、桑园、胶园及林带的杂草，也可用于防除非耕地、田埂、路边的杂草，对于玉米、甘蔗、大豆以及苗圃等宽行作物，可采取定向喷施百草枯来防除杂草。百草枯自上世纪六十年代由原英国卜内门化学工业有限公司(ICI)研究开发，迄今在农业种植中的广泛应用已经有50多年的历史，目前在世界范围内有100多个国家使用百草枯。百草枯在1984年首次被引进中国市场，自上世纪90年代以来，随着农业生产技术的发展，我国很多农药企业先后开始大量生产百草枯原药，目前百草枯已经在我国的农业生产得到广泛应用。
百草枯为速效触杀型灭生性季胺盐类除草剂，植物对其吸收极其迅速，叶片接触百草枯以后，有效成分对叶绿体层膜破坏力极强，使光合作用和叶绿素合成很快中止，叶片着药后2-3小时即开始受害变色，百草枯对单子叶和双子叶植物绿色组织均有很强的破坏作用。在光下生长的植物中，百草枯主要作用于其叶绿体，叶绿体含有绿色植物的光合系统，能吸收光能并制造糖分。百草枯作用于光系统Ⅰ(photosystemⅠ)的光合膜系统，该系统能产生自由电子以推动光合作用。光系统Ⅰ产生的自由电子与百草枯离子发生反应，产生自由基结构。氧可以迅速将这些自由基还原，并在这一过程中产生过氧化物。产生的过氧化物具有极高的化学活性，它能攻击不饱和膜脂肪酸，迅速打开并分解细胞膜及组织。百草枯离子与自由基的反应过程中会反复产生更多的过氧化物，直至停止产生自由电子，植物将迅速枯萎死亡。因此，百草枯是光合作用的一种电子传递抑制剂。在光系统Ⅰ中它还能竞争性地抑制NADP的还原，还原后的百草枯迅速再氧化产生一系列的超氧化物阴离子，活性氧自由基的毒害能引起脂质的过氧化反应和细胞膜的损伤。
发明内容
本发明的目的是提供水稻OsPAR1蛋白的新用途。该蛋白的氨基酸序列如序列表序列1所示，所述新用途即所述蛋白可用于调控目的植物的百草枯抗性，或调节序列表序列1所示蛋白表达量的物质或方法可用于调控目的植物叶片的百草枯抗性。
本发明提供一种发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及位于所述茎环序列两侧的序列A和序列B组成，所述序列A与所述序列B反向互补；所述序列A为序列表序列1所示蛋白的编码基因中200-500bpDNA转录得到的RNA序列。
所述蛋白的编码基因中的200-500bp的DNA中含有所述蛋白的编码基因的5’UTR区或3’UTR区的部分或全部。
所述蛋白的编码基因具体可为序列表序列2所示的DNA分子，其中，所述5’UTR区为序列表序列2的自5’末端第1位至第127位核苷酸；所述3’UTR区为序列表序列2的自5’末端第1781位至第2202位核苷酸。
所述序列A具体可为序列表中序列3的自5’末端第1位至第430位核苷酸序列。
所述茎环序列具体可为序列表中序列3的自5’末端第431位至第908位核苷酸序列。
由上述任一所述发夹RNA衍生的小干扰RNA也属于本发明的保护范围。
本发明提供上述任一所述RNA（发夹RNA或小干扰RNA）的编码基因。
所述RNA的编码基因可为如下1）或2）的DNA分子：
1）式I所示的DNA片段，（I）SEQ正向-X-SEQ反向，
所述SEQ正向是序列表序列2中包括第1763位至第2192位的核苷酸段，
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补，
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补；
2）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且抑制序列表序列1所示蛋白表达的DNA分子。
所述SEQ正向的核苷酸序列具体可为序列表序列2中第1763位至第2192位核苷酸序列。
本发明保护下述3）或4）的DNA分子：
3）其核苷酸序列为序列表序列2的第1763位至第2192位核苷酸段；
4）在严格条件下与3）限定的DNA序列杂交的DNA分子。
本发明保护含有上述任一所述RNA的编码基因或DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
所述重组载体具体可为载体pTCK303-OsPAR1-RNAi，所述载体pTCK303-OsPAR1-RNAi为在载体pTCK303的SpeI和KpnI的位点间插入了序列表序列4所示的DNA片段。
本发明提供一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中序列表序列1所示蛋白的表达，得到百草枯抗性高于所述目的植物的转基因植物。
所述抑制目的植物中序列表序列1所示蛋白的表达可通过将上述任一所述RNA的编码基因导入目的植物中表达上述任一所述RNA实现；
所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物；
所述单子叶植物具体为水稻。
本发明还提供另一种培育转基因植物的方法，是将序列表序列1所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到百草枯抗性低于所述目的植物的转基因植物；
所述序列表序列1所示蛋白的编码基因可为如下5）-9）中任一所述基因：
5）序列表序列5所示的DNA分子；
6）序列表序列2中第128位至1780位所示的DNA分子；
7）序列表序列2所示的DNA分子；
8）与5）或6）或7）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子；
9）在严格条件下与5）或6）或7）或8）限定的DNA序列杂交且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子；
所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物；
所述单子叶植物具体为水稻。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
实验证明，过表达株系在0.5μM百草枯浓度下就有白化的表型且叶绿素含量明显下降，野生型在5μM百草枯浓度下会出现白化表型且叶绿素含量明显下降，而干扰株系在0.5μM~5μM百草枯浓度下无白化表型且叶绿素含量无明显变化。两叶一心期，使用200μM百草枯水溶液对水稻叶片进行喷洒（每200cm2面积内喷洒15mL），2天后干扰株系植株叶片大部分都保持绿色，叶绿素分解较少；野生型植株部分叶片发白枯死；过表达株系植株叶片全部发白枯死。与野生型植株叶片相比，过表达株系植株分蘖期离体叶片经100μM百草枯水溶液浸泡后叶绿素降解明显。本发明为提高植物百草枯抗性或培育抗百草枯作物品种提供了一种新的途径，在农业生产上具有重要意义。
附图说明
图1为转基因水稻的PCR鉴定电泳图。其中，M为分子量标准，Vect为载体pTCK303阳性对照。
图2为转基因水稻的实时荧光定量PCR检测结果。其中，图B为对图A中野生型和干扰株系的放大图。
图3为转基因水稻的芽期对不同浓度百草枯水溶液的敏感性表型。
图4为不同浓度百草枯水溶液处理后的转基因水稻叶绿素含量结果。
图5为转基因水稻在两叶一心期对百草枯的抗性表型。
图6为分蘖期转基因水稻离体叶片的百草枯抗性表型。其中，图A为野生型水稻和过表达株系的对比图，图B为野生型水稻和干扰株系的对比图。
图1-6中，WT为野生型水稻日本晴，OX1和OX2为过表达株系，L1、L2和L3为干扰株系。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
野生型水稻日本晴（OryzaSativaL.cv.Nipponbare）：参考文献：SaotomeA,KimuraS,MoriY,UchiyamaY,MorohashiK,SakaguchiK..CharacterizationoffourRecQhomologuesfromrice(OryzasativaL.cv.Nipponbare).BiochemBiophysResCommun.2006,345(4):1283-1291.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
载体pTCK303：参考文献：Wang,Z.,Chen,C.B.,Xu,Y.Y.,Jiang,R.X.,Han,Y.,Xu,Z.H.,andChong,K.Apracticalvectorforefficientknockdownofgeneexpressioninrice(OryzasativaL.).PlantMolBiolRep,2004,22,409-417.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
实施例1、水稻OsPAR1蛋白及其编码基因的获得
拟南芥中AtPAR1基因突变体会导致拟南芥增加对百草枯的抗性。根据NCBI提供的拟南芥和水稻的PAR1同源基因序列，利用DNAMAN软件对其进行进化树分析，选取与拟南芥AtPAR1(Atlg31830）同源关系最近的水稻基因Os03g0576900，命名为OsPAR1，其基因组序列如序列表序列5所示，全长cDNA序列如序列表序列2所示，其中自序列表序列2的第128位至1780位为开放阅读框，编码序列表序列1所示的蛋白OsPAR1。
实施例2、水稻OsPAR1基因过表达载体的构建
以野生型水稻日本晴(OryzasativaL.cv.Nipponbare)的基因组DNA为模板，用引物F1和B1进行PCR扩增，得到5.3kb的PCR产物，将该PCR产物纯化后，与经过EcoRV酶切的载体pBluescriptSK（默克公司，ST212205）的载体骨架片段连接，获得重组载体SK-OsPAR1，经测序证实，重组载体SK-OsPAR1是在载体pBluescriptSK的EcoRV位点间插入了序列表序列5的第1-5289位所示的序列。
将重组载体SK-OsPAR1用BamHⅠ和NheⅠ双酶切，回收5.3kb的片段，与经过BamHⅠ和NheⅠ双酶切的植物诱导表达载体pTCK303的载体骨架片段连接，获得重组载体pTCK303-OsPAR1，经测序证实，重组载体pTCK303-OsPAR1是在载体pTCK303的BamHⅠ和NheⅠ位点间插入了序列表序列5第1-5289位所示的序列。
上述引物的序列如下：
引物F1：5’-GGATCCAACCCAACTATTACCAACAA-3’（带下划线的碱基为限制性内切酶BamHⅠ识别序列）；
引物B1：5’-GCTAGCAGCAGAACGTATCCTACACA-3’（带下划线的碱基为限制性内切酶NheⅠ识别序列）。
实施例3、水稻OsPAR1基因RNAi重组表达载体的构建
提取野生型水稻日本晴(OryzasativaL.cv.Nipponbare)的总RNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，用引物F2和B2进行PCR扩增，得到430bp左右的扩增产物，将该产物回收纯化后，与经过EcoRV双酶切的载体pBluescriptSK的载体骨架片段连接，获得重组载体SK-OsPAR1-RNAi，经测序证实，重组载体SK-OsPAR1-RNAi是在载体pBluescriptSK的EcoRV位点间插入了序列表序列2的第1763位至2192位的序列。
上述引物的序列如下：
引物F2：5’-GGGGTACCACTAGTATCCCACTTGTGTGCTGACC-3'（带下划线的碱基为限制性内切酶KpnI和SpeI识别序列）；
引物B2：5'-CGGGATCCGAGCTCAGCGGAATGGAATTGACTGA-3'（带下划线的碱基为限制性内切酶BamHI和SacI识别序列）。
将重组载体SK-OsPAR1-RNAi用SpeI和SacI双酶切，回收430bp左右的酶切片段（命名为SEQ正向），与经过SpeI和SacI双酶切植物诱导表达载体pTCK303的载体骨架片段连接，将SEQ正向的DNA片段沿着SpeI到SacI的方向连接到pTCK303的SpeI和SacI位点间获得中间载体；将重组载体SK-OsPAR1-RNAi用KpnI和BamHI双酶切，回收430bp左右的酶切片段，与经过KpnI和BamHI双酶切中间载体的载体骨架片段连接，将SEQ正向的DNA片段沿着KpnI到BamHI的方向连接到pTCK303的KpnI和BamHI位点间获得水稻OsPAR1基因RNAi重组表达载体pTCK303-OsPAR1-RNAi，经测序证实，载体pTCK303-OsPAR1-RNAi的SpeI和KpnI的位点间插入了序列表序列4所示的DNA片段，其中，自序列表序列4的第1-430位为SEQ正向片段，第431-908为间隔片段，第909-1338位为SEQ正向的反向互补片段（命名为SEQ反向片段）。
序列表序列4所示的DNA片段编码序列表序列3所示的具有茎环结构的发夹RNA（其中，自序列表序列3的第1-430位（序列A）与第909-1338位（序列B）的序列互补，第431-908为茎环序列），可产生20bp左右的小干扰RNA，该小干扰RNA再与目的基因OsPAR1的mRNA结合，最终沉默OsPAR1的表达。
实施例4、利用重组载体培育转基因水稻
1、转基因水稻的获得
按照文献HiroakiSaika,WataruSakamoto,MasahikoMaekawa,SeiichiToki,Highlyefficientvisualselectionoftransgenicriceplantsusinggreenfluorescentproteinoranthocyaninsyntheticgenes.PlantBiotechnology.2011,28,107–110.的方法，将pTCK303、实施例2的得到重组载体pTCK303-OsPAR1和实施例3的得到重组载体pTCK303-OsPAR1-RNAi分别利用根癌农杆菌EHA105（BiovectorCo.,LTD,Biovector-375）介导转化野生型水稻日本晴成熟胚来源的愈伤组织，经过共培养、筛选、分化和生根培养，分别获得T0代转空载体pTCK303的转基因水稻（命名为转空载体对照株系）3株，T0代转pTCK303-OsPAR1的转基因水稻（命名为过表达株系）2株，T0代转pTCK303-OsPAR1-RNAi的转基因水稻（命名为干扰株系）8株。
T0代表示转基因当代植株，T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
2、转基因水稻植株的PCR鉴定
取步骤1的转空载体对照植株、过表达株系植株和干扰株系植株的叶片基因组DNA，用引物5’-TTTCTATCGCGTATTAAA-3'和5’-TGGCAATAAAGTTTCTTA-3'PCR扩增NOS终止子序列，预测产物大小为175bp，扩增的靶序列DNA序列如下序列：
5'-TTTCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGACCGGCAACAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCA-3'，结果全部为阳性，部分扩增结果如图1所示。
通过对转基因株系后代的PCR鉴定，将得到的上述株系中纯合阳性转基因后代进行下述步骤3和4的检测。
3、转基因水稻植株的荧光实时定量RT-PCR检测
取按步骤2的PCR鉴定为阳性的T2代纯合转空载体对照株系植株、过表达株系植株（株系编号为OX1、OX2）和干扰株系植株（株系编号为L1、L2和L3），以野生型水稻日本晴（WT）为对照，提取总RNA，反转录获得cDNA，用引物qF和qB进行荧光实时定量RT-PCR，以Actin11为内参，每个株系30株，实验重复三次，结果如图2所示。
上述引物qF和qB的序列如下：
引物qF：5’-CCGAATCGAACCCTCAAGATG-3’（对应序列表序列2的第919-939位）；
引物qB：5’-CGTCCAGAACTCCCGAACAACT-3’（对应序列表序列2的第1144-1165位）；
上述Actin11的引物序列如下：
ACTIN2F:5’-TACTGTGTCTGGATAGGAGGGTC-3’；
ACTIN2B:5’-ACCAACAATCCCAAACAGAGTAG-3’。
图2的结果表明，过表达株系中目的基因OsPAR1的表达量明显高于野生型对照植株，分别为野生型的40倍和80倍；干扰株系中目的基因OsPAR1的表达量明显低于野生型对照植株，为野生型的1/10；转空载体对照株系植株与野生型对照结果无显著差异。
4、转基因水稻植株的百草枯抗性鉴定
取按步骤2的PCR鉴定为阳性的T3代纯合转空载体对照株系种子、过表达株系OX1和OX2种子和干扰株系L1、L2和L3种子，以野生型水稻日本晴（WT）为对照，按照如下方法进行处理（每个处理每个株系25株，实验重复三次）：
1）芽期对百草枯敏感性分析
42℃催芽2天，然后30℃、16小时光照条件下，置于不同浓度百草枯水溶液（百草枯浓度分别为0μM、0.5μM、1μM、2μM和5μM）中培养15天后，拍照，同时进行叶绿素含量测定，结果图3和图4所示。
上述叶绿素含量测定参考文献“LichtenthalerHK.Chlorophyllsandcarotenoids–pigmentsofphotosyntheticbiomembranes.MethodsEnzymol.1987,148:350-382”进行，具体如下：
选择种苗部分，称量鲜重并记录，再使用钢珠打碎小苗，加入100%的乙醇抽提3小时，取上清液，以100%的乙醇为参比溶液，利用BECKMANCOULTER公司的DU800分光光度计测定645nm和663nm下萃取液的吸光值，用以下公式进行计算叶绿素含量：叶绿素含量(mg/L)=(20.2×A645nm＋8.02×A663nm)×稀释倍数。
结果表明：过表达株系在0.5μM百草枯浓度下就有白化的表型且叶绿素含量明显下降，野生型在5μM百草枯浓度下会出现白化表型且叶绿素含量明显下降，干扰株系无白化表型且叶绿素含量无明显变化；转空载体对照株系植株与野生型对照结果无显著差异。
2）两叶一心期对百草枯的抗性分析
水培至两叶一心期，使用200μM百草枯水溶液对水稻叶片进行喷洒，喷洒量为每200cm2面积内喷洒15mL，2天后，观察植株叶片表型，结果如图5所示。
结果表明：干扰株系植株叶片大部分都保持绿色，叶绿素分解较少；野生型植株部分叶片发白枯死；过表达株系植株叶片全部发白枯死；转空载体对照株系植株与野生型对照结果无显著差异。
3）离体叶片对百草枯的抗性分析
大田种植至分蘖期，取同一时期的第一片新叶，剪成2cm小段，分别用水和100μM百草枯水溶液浸泡48小时，拍照，结果如图6所示。
结果表明：与野生型植株叶片相比，干扰株系植株离体叶片叶绿素降解较少，而过表达株系植株离体叶片中的叶绿素降解较多，说明过表达株系更敏感，转空载体对照株系植株与野生型对照结果无显著差异。
实施例4的结果表明，水稻OsPAR1蛋白及其编码基因具有调控植株百草枯抗性的功能。过表达OsPAR1，可降低转基因植物的百草枯抗性；抑制OsPAR1的表达可提高转基因植物的百草枯抗性。
Claims (5)
1.一种沉默百草枯抗性相关蛋白表达的发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及位于所述茎环序列两侧的序列A和序列B组成，所述序列A和序列B反向互补；所述序列A为序列表序列1所示蛋白的编码基因中200-500bpDNA转录得到的RNA序列；
所述蛋白的编码基因中的200-500bp的DNA中含有所述蛋白的编码基因的5’UTR区或3’UTR区的部分或全部；
所述蛋白的编码基因具体为序列表序列2所示的DNA分子；
所述序列A为序列表中序列3的自5’末端第1位至第430位核苷酸序列；
所述茎环序列为序列表中序列3的自5’末端第431位至第908位核苷酸序列。
2.权利要求1所述发夹RNA的编码基因；
所述RNA的编码基因具体为式I所示的DNA分子：
(I)SEQ正向-X-SEQ反向，
所述SEQ正向是序列表序列2中第1763位至第2192位的核苷酸段，
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补，
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正 向及所述SEQ反向均不互补。
3.含有权利要求2所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
4.一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中序列表序列1所示蛋白的表达，得到百草枯抗性高于所述目的植物的转基因植物；
所述抑制目的植物中序列表序列1所示蛋白的表达具体是通过将权利要求2所述编码基因导入目的植物中表达权利要求1所述发夹RNA实现的；所述植物为水稻。
5.一种培育转基因植物的方法，是将序列表序列1所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到百草枯抗性低于所述目的植物的转基因植物；
所述序列表序列1所示蛋白的编码基因可为如下1)-3)中任一所述基因：
1)序列表序列5所示的DNA分子；
2)序列表序列2中第128位至1780位所示的DNA分子；
3)序列表序列2所示的DNA分子；
所述目的植物可为水稻。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210282421.9A CN103571842B (zh) | 2012-08-09 | 2012-08-09 | 水稻OsPAR1蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210282421.9A CN103571842B (zh) | 2012-08-09 | 2012-08-09 | 水稻OsPAR1蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103571842A CN103571842A (zh) | 2014-02-12 |
| CN103571842B true CN103571842B (zh) | 2016-01-20 |
Family
ID=50044553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210282421.9A Active CN103571842B (zh) | 2012-08-09 | 2012-08-09 | 水稻OsPAR1蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103571842B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111560055B (zh) * | 2020-05-12 | 2021-06-25 | 华南农业大学 | 水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用 |
| CN111574605B (zh) * | 2020-06-10 | 2022-06-28 | 华南农业大学 | 水稻基因OsLAT5在调节敌草快的吸收积累中的应用 |
| CN114480482B (zh) * | 2021-12-23 | 2023-10-20 | 浙江大学 | OsPUT家族基因在调控水稻百草枯抗性中的应用 |
| CN114807176B (zh) * | 2022-06-15 | 2023-07-11 | 湖南科技学院 | 一种OsPUT 5基因在调控水稻低温抗性中的应用 |
-
2012
- 2012-08-09 CN CN201210282421.9A patent/CN103571842B/zh active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CD147基因发夹结构干扰RNA表达载体的构建及鉴定;王立国等;《山东医药》;20081231;第48卷(第46期);全文 * |
| Mechanism of paraquat resistance – from the antioxidant enzymes to the transporters;Zoltán Szigeti;《Acta Biologica Szegediensis》;20051231;第49卷(第1-2期);第178页左栏第5段 * |
| NM_001057073;Tanaka等;《NCBI:GenBank》;20100608 * |
| 小发夹RNA 介导的基因沉默及其应用;王丹青等;《肿瘤防治研究》;20061231;第33卷(第7期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103571842A (zh) | 2014-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2465933B1 (en) | Disease-inducible promoters | |
| Qin et al. | Transgenic strawberry: state of the art for improved traits | |
| Narayan et al. | Overexpression of expansin EaEXPA1, a cell wall loosening protein enhances drought tolerance in sugarcane | |
| EP2635104B1 (en) | Stress-resistant plants and their production | |
| Raza et al. | miRNAs for crop improvement | |
| CN103571842B (zh) | 水稻OsPAR1蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用 | |
| EP3696188A1 (en) | Gene for resistance to plant disease | |
| CN104611304B (zh) | 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途 | |
| JP7375028B2 (ja) | 植物病害に対する抵抗性の遺伝子 | |
| CN113337521B (zh) | 敲除OsNAC78基因在降低水稻抗氧化酶活性中的应用 | |
| Yu et al. | Cloning and functional identification of PeWRKY41 from Populus× euramericana | |
| CN108588041B (zh) | 海岛棉细胞色素p450基因、其编码蛋白和应用 | |
| CN110358772A (zh) | 提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用 | |
| CN109468333A (zh) | 柑橘漆酶家族基因CsiLAC4及其应用 | |
| CN107881172A (zh) | 一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子植物表达载体及诱导目标基因表达方法 | |
| WO2022037967A1 (en) | Plant resistance gene and means for its identification | |
| CN106749580B (zh) | 植物耐盐相关蛋白TaPUB15-D及其编码基因与应用 | |
| CN107304422A (zh) | 控制水稻纹枯病抗性的OsSBR1基因及其RNA干扰片段的应用 | |
| CN106554964B (zh) | 棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用 | |
| CN104945492B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用 | |
| CN109943579A (zh) | 一种岷江百合LrCCoAOMT基因及其应用 | |
| CN105132428B (zh) | 一种与植物根系性状相关的ZmLRT基因及其相关生物材料与应用 | |
| CN113637678A (zh) | 基因GhSWEET42在防治棉花黄萎病中的应用 | |
| Khan et al. | Genetic engineering of sugarcane with the rice tonoplast H+-ppase (OVP2) gene to improve sucrose content and salt tolerance | |
| CN104059931A (zh) | 桔小实蝇细胞色素p450基因的rna干扰载体及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |