CN113637678A - 基因GhSWEET42在防治棉花黄萎病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及棉花病害防治技术领域，具体而言，涉及基因GhSWEET42在防治棉花黄萎病中的应用，所述基因GhSWEET42的核酸序列如SEQ IDNO:1所示。发明人经多方面验证发现，基因GhSWEET42的表达情况与棉花黄萎病的侵染过程密切相关。大丽轮枝菌侵染棉花根部时，在大丽轮枝菌定殖过程中，葡萄糖含量明显增加，而基因GhSWEET42在大丽轮枝菌入侵时，表达量显著上调；通过亚细胞定位和酵母异源互补实验，证明基因GhSWEET42编码蛋白是定位于质膜的葡萄糖转运蛋白。进一步通过超表达基因GhSWEET42以及沉默基因GhSWEET42，得到基因GhSWEET42是大丽轮枝菌侵染棉花的关键基因。

Description

基因GhSWEET42在防治棉花黄萎病中的应用

技术领域

本发明涉及棉花病害防治技术领域，具体而言，涉及基因GhSWEET42在防治棉花黄萎病中的应用。

背景技术

黄萎病是由大丽轮枝菌引起的一种土传真菌病害，可感染许多重要的经济作物。大丽轮枝菌的生长周期开始于孢子萌发，产生的菌丝直接穿透植物的根部并定居在的木质部维管束中，它们可以在植物木质部中存活较长时间而不会引起明显的病害症状。当症状出现时，通常包括叶片的枯萎、萎蔫、黄化和脱落，植物的生长发育迟缓，光合作用减弱和维管组织变色，发病症状的类型会因宿主植物的不同而发生变化。叶片枯萎和黄化等症状的发生与真菌的分生孢子和孢子产生的菌丝体堵塞植物木质部影响水分运输密切相关，也与大丽轮枝菌释放的毒素蛋白引起植物防御反应紧密相关。最终，随着黄萎病对植物的侵染，植物叶片组织也被定殖病菌。伴随着植物的衰老和死亡，在植株组织内会产生微菌核或休眠菌丝体，从而为下一个生长季节的土壤提供主要的接种物。目前，还没有有效的手段可以治愈发病之后的植株。

了解抗黄萎病的分子机理，鉴定抗黄萎病的关键基因，进而培育抗黄萎病的植物，是抑制黄萎病的有效途径。研究发现在海岛棉中GbCYP86A1-1基因通过细胞壁修饰和激活免疫通路正向调控对黄萎病的防御。类受体激酶(RLKs)是植物天然免疫力的重要组成部分。最近的研究表明，RLK的抑制剂SOBIR1可以与多种类受体蛋白相互作用，是抵抗真菌病原菌所必需的。研究发现GbSOBIR1基因的表达在棉花植株中普遍表达，并且接种黄萎病菌可诱导表达。病毒诱导基因沉默创制的GbSOBIR1敲除导致棉花植物对大丽轮枝菌的抗性减弱，而拟南芥中GbSOBIR1的异源超表达则提高了抗性。进一步蛋白互作分析表明，类受体激酶GbSOBIR1的磷酸化区域与转录因子GbbHLH171相互作用。并且在海岛棉中沉默GbSOBIR1，可以减弱棉花对大丽轮枝菌的抗性。磷酸化实验表明GbbHLH171可与GbSOBIR1相互作用并被GbSOBIR1磷酸化，来控制对下游基因的激活和转录，对棉花对大丽轮枝菌的抗性具有积极作用。

棉花是世界上重要的经济作物，对抗病基因的挖掘和功能分析，对棉花生产的提高和改善有十分重要的意义。近年来，棉产区黄萎病常年流行，发病面积约占全国植棉面积的一半，导致棉花生产严重受损，现已成为棉花高产稳产的主要障碍。然而目前对于黄萎病的防治手段十分有限，缺乏对黄萎病具有高抗性的棉花种质资源。所以通过对棉花黄萎病致病机制和抗病基因的功能分析的研究，寻找抗性基因，培育抗性品种，对棉花生产非常重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明通过对黄萎病菌定殖棉花的观察和葡萄糖含量检测，发现葡萄糖含量在大丽轮枝菌定殖过程中明显上调。结合进化分析、关联分析和表达分析，发现葡萄糖的变化可能是由于真菌侵染棉花植株诱导GhSWEET42基因的表达引起的。通过超表达和病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)等手段，验证了GhSWEET42在大丽轮枝菌侵染过程中的关键作用，为揭示大丽轮枝菌侵染棉花的机制奠定了基础，而且为糖饥饿策略防治黄萎病侵染棉花提供了靶基因。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了以下技术方案：

基因GhSWEET42在防治棉花黄萎病中的应用，所述基因GhSWEET42的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本申请的发明人经多方面验证发现，基因GhSWEET42的表达情况与棉花黄萎病的侵染过程密切相关。大丽轮枝菌侵染棉花根部时，在大丽轮枝菌定殖过程中，葡萄糖含量明显增加，而基因GhSWEET42在大丽轮枝菌入侵时，表达量显著上调；通过亚细胞定位和酵母异源互补实验，证明基因GhSWEET42编码蛋白是定位于质膜的葡萄糖转运蛋白。进一步通过在拟南芥中超表达基因GhSWEET42以及在棉花中沉默基因GhSWEET42，得到基因GhSWEET42是大丽轮枝菌侵染棉花的关键基因。

本发明还提供了基因GhSWEET42在棉花抗黄萎病遗传改良或分子育种方面的应用，所述基因GhSWEET42的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明研究表明基因GhSWEET42是大丽轮枝菌侵染棉花的关键基因，超表达基因GhSWEET42的拟南芥对黄萎病抗性明显降低，而沉默基因GhSWEET42之后可以显著降低棉花植株的葡萄糖含量，并且明显提高对黄萎病的抗性。因此，基因GhSWEET42可用于棉花抗黄萎病遗传改良或分子育种方面。

如上所述，沉默或敲除棉花材料中的所述基因GhSWEET42，棉花对黄萎病的抗性提高。

本发明中，基因沉默(Gene silencing)是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段，指的是真核生物中由双链RNA诱导的识别和清除细胞非正常RNA的一种机制。基因沉默发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默(Tran-scriptional gene silencing,TGS)，另一种是转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silen-cing,PTGS)，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性降解而使基因失活，如常见的RNAi技术等。

基因敲除(Knockout)是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。

进一步地，所述棉花材料包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料。

具体地，所述棉花材料包括以下中的任一种：叶、根、茎、胚根、胚芽、种子。

上述内容中，棉花材料中的基因GhSWEET42沉默或敲除，该处的棉花材料可以是种植或生长中的棉花组织，也可以是离体的用于棉花繁殖的材料。

本发明沉默或敲除棉花材料中的基因GhSWEET42采用生物学手段达到。如一般先分析基因GhSWEET42，选取合适的目标核酸片段，然后设计引物序列，扩增特定的基因序列，然后构建载体，再将载体转入受体细胞中。常见的载体介导转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中。另外，还可以通过其他途径，如种质系统法，包括花粉管通道法、生殖细胞侵染法、胚囊和子房注射法；又如基因直接导入法，通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等，化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。

在一些可能的实施方式中，所述棉花材料中基因GhSWEET42沉默的目标片段如SEQID NO:2所示。

进一步地，所述基因GhSWEET42沉默所用的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种防治棉花黄萎病的方法，沉默或敲除棉花材料中的基因GhSWEET42，所述基因GhSWEET42的序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述棉花材料包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料。

进一步地，所述棉花材料包括以下中的任一种：叶、根、茎、胚根、胚芽、种子。

进一步地，棉花中基因GhSWEET42沉默的目标片段如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种抗黄萎病棉花品种培育的方法，制备含有基因GhSWEET42沉默或敲除的棉花材料；

所述基因GhSWEET42的序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述棉花材料包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料。

进一步地，所述棉花材料包括以下中的任一种：叶、根、茎、胚根、胚芽、种子。

进一步地，棉花中基因GhSWEET42沉默的目标片段如SEQ ID NO:2所示。

另外，需要说明的是，本发明中的棉花可包括各种种植棉，如陆地棉(Gossypiumhirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、亚洲棉(Gossypium arboreum)和草棉(Gossypium herbaceum)以及这些棉花品种的变种。也就是说，存在与本发明基因GhSWEET42相同或类似基因的棉花品种均在本发明的保护范围内。类似基因如可以与本发明基因GhSWEET42序列相似度达80％以上，也可以是相似度达85％以上或90％以上或95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上等等。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括如下方面：

(1)本发明首次发现棉花黄萎病的侵染与基因GhSWEET42的表达情况密切相关，为揭示大丽轮枝菌侵染棉花的机制奠定了基础，而且为糖饥饿策略防治黄萎病侵染棉花提供了靶基因。

(2)本发明通过多方面试验得到基因GhSWEET42是大丽轮枝菌侵染棉花的关键基因。具体为超表达基因GhSWEET42的拟南芥植物对大丽轮枝菌抗性明显降低，而沉默基因GhSWEET42之后可以显著降低植株的葡萄糖含量，并且明显提高对大丽轮枝菌的抗性。

(3)本发明发现的基因GhSWEET42功能可应用于防治棉花黄萎病，也可用于棉花抗黄萎病遗传改良或分子育种方面。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中V592-GFP对棉花根部定殖初期的共聚焦显微镜图像；

图2为本发明实施例1中大丽轮枝菌侵染棉花根后病菌含量和葡萄糖变化情况柱形图；

图3为本发明实施例2中SWEET蛋白的系统进化和表达分析图；

图4为本发明实施例2中GhSWEET42多序列比对及GhSWEET42跨膜结构分析图；

图5为本发明实施例2中GhSWEET42的亚细胞定位图；

图6为本发明实施例2中利用酵母糖转运缺陷菌株SUSY7/ura3和EBY.VW4000对GhSWEET42的功能验证结果图；

图7为本发明实施例3中35S启动子驱动GhSWEET42在转基因拟南芥中的超表达情况图；

图8为本发明实施例3中GhSWEET42超表达(OE)和野生型(WT)植物可溶性糖含量的测定图；

图9为本发明实施例3中超表达GhSWEET42的拟南芥植物对大丽轮枝菌的抗性情况图；

图10为本发明实施例4中GhSWEET42基因沉默情况图；

图11为本发明实施例4中GhSWEET42基因沉默植株与对照植株对大丽轮枝菌的抗性图；

图12为本发明实施例4中病菌恢复实验和病菌定殖观察图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一、材料

1、实验材料和菌株

实验所需植物材料：棉花为陆地棉中植棉2号自交种子；实验所需菌株：带GFP的大丽轮枝菌株V592、本实验室保存的大丽轮枝菌株V592。

2、V592的培养和V592的侵染

为了确定大丽轮枝菌菌株V592在棉花中的定殖过程，利用带有绿色荧光蛋白(GFP)的大丽轮枝菌，侵染棉花并在共聚焦显微镜下观察荧光情况。具体如下：

取-80℃保存的带GFP的大丽轮枝菌V592的孢子液100μL，接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃恒温暗培养一周后，取拇指大小菌丝块剪碎后接种到察氏培养基中，于25℃，150r/min的恒温摇床中避光振荡培养5天。用三层纱布滤去菌丝，通过血球计数板计数调整孢子的浓度至10⁷个/mL备用。

将中植棉2号的种子放入发芽袋，在发芽袋中加入无菌水，然后放到光照培养箱，培养箱设置：26℃，光照16小时/黑暗8小时，湿度60％。发芽后五天，将生长相似的棉花幼苗浸入V592-GFP分生孢子悬浮液(10⁷/mL)中90秒。在0、12、24、48和96小时将根纵向切开，然后用共聚焦显微镜观察。

结果如图1所示。从图1中可以看到，在0到12小时之间棉花根的纵切面上并没有观察到荧光，说明0小时到12小时之间大丽轮枝菌并未入侵到棉花根的内部(图1A-C)。然而，在24小时可以观察到纵切根的外侧出现了明显的荧光(图1D)，说明在侵染24小时以后大丽轮枝菌开始入侵棉花根部。在侵染48小时以后，在共聚焦显微镜下可以看到细胞间隙的绿色荧光明显变多，并且看到菌丝开始入侵细胞(图1E-F)。在侵染96小时以后，在棉花根的纵切面可以清晰地看到菌丝，已经完全覆盖细胞，并且形成了菌丝网(图1G-H)。综上所述，本研究可以确定大丽轮枝菌从接种到入侵到棉花根细胞内经历了48个小时，所以在侵染后48小时是大丽轮枝菌入侵棉花根的关键时间点。

3、病菌含量测定和葡萄糖含量测定

为了确定在大丽轮枝菌侵染棉花根的过程中葡萄糖的变化量。对棉花根部进行取样，样品取自中植棉2号，棉花用盆栽在温室中培养1个月，用钢尺伤根后，每盆棉花苗用10毫升的分生孢子悬浮液(用蒸馏水稀释悬浮液到浓度为孢子数约为10⁷个/毫升。)注射到棉花幼苗的根部。每个样品取样的重量至少为3g，并且每个时期的样品至少三个生物学重复。将植物样品在液氮中冷冻并保存在-80℃。

将冷冻的样品(0.2g)研磨成粉末，然后加入500μL甲醇、异丙醇和水(3:3:2，V/V/V)的混合物。将混合物涡旋3分钟，并超声处理30分钟，并在4℃以14,000rpm离心3分钟。收集上清液并与内标混合，然后在氮气流下蒸发。将蒸发的样品转移到冷冻干燥机中进行冷冻干燥。将每个干燥的样品在37℃下用100μL甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液(15mg/mL)孵育2小时。将混合物加至100μL BSTFA(含1％TMSC)中，涡旋混合后在37℃保持30分钟。所有混合物均进行GC-MS分析，以获得葡萄糖含量的变化。

为了验证大丽轮枝菌在棉花定殖过程的共聚焦图像，对V592侵染的棉花进行取样，取0、6、12、24、48、96小时的根，提取真菌的DNA，运用实时荧光定量PCR技术对病菌含量进行测定。

对真菌含量测定的方法是将不同样本提取的基因组DNA作为模板，利用真菌特异引物ITS1-F和大丽轮枝菌特异反向引物STVe1-R，以GhHIS3作为内参，对基因组DNA进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测大丽轮枝菌的病菌含量。qRT-PCR反应在LightCycler480II系统上进行，结果采用2^-△CT法进行结果分析。

结果如图2所示。根据图2可以确定，0、6、12小时并没有检测到大丽轮枝菌的特异序列，所以说明在12小时以内大丽轮枝菌并未入侵到棉花的根部(图2A)。在24小时后可以看到有很少的特异序列被检测到，在48小时和96小时可以看到病菌的DNA含量显著增加(图2A)。因此，验证了共聚焦显微镜观察到的图像，进一步确定了大丽轮枝菌V592入侵棉花的进程。

葡萄糖即是主要营养物质又是信号分子，参与很多生物学过程，所以对取得样品进行了葡萄糖含量的测定。如图2B，发现在大丽轮枝菌入侵的48小时，葡萄糖含量明显上升，推测葡糖糖可能参与大丽轮枝菌侵染棉花的过程。

黄萎病菌是一种土传的真菌病害，可以感染多种植物，包括许多具有重要经济意义的作物，导致毁灭性疾病。在感染过程中，大丽轮枝菌菌丝穿透表皮细胞并在导管组织中定殖。菌丝随后会产生毒素并阻塞植物导管，从而破坏水的运输，最终导致植物死亡。由于表达GFP的真菌菌株可以作为真菌定殖过程中的重要标志物，带GFP的真菌已成为分析植物中各种真菌定殖过程的常用工具。为了确定大丽轮枝菌侵染棉花根的具体步骤，本研究使用带GFP的大丽轮枝菌V592观察了大丽轮枝菌对棉花根的定殖过程，发现侵染后48小时是大丽轮枝菌侵染的关键时期。

蔗糖是大多数植物中长距离转运的主要糖，它有可能是被真菌可以利用的糖。然而，研究表明，葡萄糖是真菌菌丝体在宿主中利用的主要碳源。在以前的研究中，玉米在被黑穗病菌感染的过程中，被感染的部分的葡萄糖含量是未感染部分的20倍。受到白粉病危害的小麦叶片中的蔗糖和己糖积累显著增加。黑穗病菌对糖获取和代谢的研究显示，黑穗病菌丝中存在葡萄糖浓度梯度，在高度活跃的菌丝尖端处存在高浓度葡萄糖。受感染组织中糖含量的增加可能是由于从相邻未受感染组织和健康叶片进口的增加。这种糖的运输对真菌的致病性至关重要。大量研究发现，糖在宿主与病原菌的相互作用中起着核心作用。本研究发现大丽轮枝菌侵染棉花会引起葡萄糖含量的上升，推测葡萄糖在黄萎病菌侵染过程可能发挥重要作用。

实施例2

1、基因的关联分析

葡萄SWEET基因家族得蛋白序列下载自Grape Genome网站，此外，拟南芥SWEET基因家族蛋白序列下载自TAIR数据库。棉花(陆地棉)的蛋白序列下载自CottonGen网站。使用SWEET陆地棉、葡萄以及拟南芥的蛋白序列的同源性进行比对，然后采用邻接法建立进化树，以MEGA(7.0版)构建系统进化树。

利用陆地棉SWEET家族成员和拟南芥的SWEET家族成员以及葡萄的SWEET家族成员的蛋白序列，使用MEGA7软件进行进化分析，结合以前文献的研究，把进化树划分为4个亚组(图3A)。因为大丽轮枝菌侵染会引起葡萄糖含量的显著上调，所以对转运葡萄糖的第二分支进行重点的研究，并且发现在转运葡萄糖的第二分支中存在已经报道的与病菌侵染有关的AtSWEET4、AtSWEET7、AtSWEET8和VvSWEET4。

为了研究陆地棉SWEET家族的第二分支与大丽轮枝菌抗性之间的联系，本研究进行了候选基因关联分析，以确定陆地棉SWEET家族的第二分支的遗传变异是否与大丽轮枝菌的抗性表型差异有关。早期的研究表明，重要SNP上游和下游的200kb区域可以定义为陆地棉中的QTL。因此，从先前的已发表文章中鉴定出的1,871,401个高质量SNP(MAF>0.05)中，筛选出以每个SWEET基因为中心的400kb区间内的SNP标记，而且从该文章中获得相应棉花品种的大丽轮枝菌抗性表型数据。然后，使用三种统计模型，即一般线型模型GLM、GLM+PCA和混合线性模型MLM，进行基因型和表型的关联分析。使用三种模型进行分析的结果表明，陆地棉第二分支SWEET基因(包括GhSWEET9、GhSWEET15/16、GhSWEET21、GhSWEET40和GhSWEET42)内或附近的遗传变异与大丽轮枝菌显著相关，具体结果如表1所示。

表1关联分析的结果

注：*基因定位于同一QTL区间

2、基因表达模式的分析

为了进一步确定大丽轮枝菌入侵棉花的关键基因，本研究用实时荧光定量PCR技术对第二亚族的基因进行了表达模式的分析。结果表明，在侵染48小时之后，GhSWEET42的表达量显著上调(图3B和3C)，说明在第二分支中，GhSWEET42是大丽轮枝菌入侵棉花的关键基因。

3、GhSWEET42的序列分析和基因结构

为了确定GhSWEET42基因在细胞中的作用，通过与在以前研究中报道过的与拟南芥抗病相关的SWEET基因进行了多重序列对比和跨膜结构预测(图4A-B)。结果表明，GhSWEET42是含有7个跨膜结构域的糖转运蛋白。

4、GhSWEET42的亚细胞定位

SWEET蛋白是一类膜上的糖转运蛋白，它们会在细胞膜上行使功能，为了确定GhSWEET42糖转运蛋白行使功能的位置。使用GhSWEET42的蛋白序列，在蛋白作用位置预测网站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)预测GhSWEET42蛋白是位于细胞膜上。为了进一步验证预测结果，将含有pCambia2300空载体和GhSWEET42-pCambia2300的农杆菌菌液通过瞬时转化注射长势正常烟草的伸展的叶片，两天后剪取针孔部位的烟草叶片反向放置于载玻片上使用激光共聚焦显微镜观察和采集图像。结果表明，pCambia2300空载体的荧光分布在细胞核，细胞膜以及细胞的各个部位，而GhSWEET42-pCambia2300的荧光只在细胞膜上被观察到(图5A)。并且将pCambia2300空载体和GhSWEET42-pCambia2300的重组质粒转化进拟南芥的原生质体，孵育12小时后，在激光共聚焦下观察和采集图像。结果表明，GhSWEET42-pCambia2300的荧光只在拟南芥原生质体的细胞膜上被观察到(图5B)。总之，这些结果均证明了GhSWEET42糖转运蛋白定位在细胞膜上。

5、GhSWEET42的糖转运活性

在目前的研究中已经证明SWEET基因有转运糖类的活性，多个SWEET被报道可以介导己糖和蔗糖的转运。为了确定GhSWEET42蛋白的糖转运活性，本研究在酵母己糖转运缺失突变体EBY.VW.4000和蔗糖转运缺陷突变体SUSY7/Ura3中异源表达了GhSWEET42基因。EBY.VW.4000突变株缺乏内源性己糖转运蛋白HXTI-HXT17和GAL2，它可以在含有麦芽糖的培养基上生长，在含有半乳糖的培养基上缓慢生长，但是不能在含有葡萄糖、果糖、甘露糖或蔗糖的培养基上生长。蔗糖转运缺陷突变体SUSY7/Ura3，能在葡萄糖的培养基上正常生长，但在蔗糖的培养基上不能正常生长。如图6A结果表明，在只含有葡萄糖的培养基上SUSY7/Ura3含有阳性对照AtSUT4和空载以及目标基因的载体都能正常生长，说明载体和目标基因都已经成功转化。在只含有蔗糖的培养基上，阳性对照明显比目标基因GhSWEET42和空载长势好，说明GhSWEET42并不转运蔗糖。如图6B所示，发现EBY.VW.4000己糖突变体在只含麦芽糖的培养基上，阳性对照HXT7、目标基因GhSWEET42和空载长势相同，说明载体和目标基因都已经成功转化。在只含有果糖的培养基上只有阳性对照可以恢复突变体的生长，说明GhSWEET42蛋白不能转运果糖，然而在只含有葡萄糖的培养基上，阳性对照和目标基因GhSWEET42均可以恢复突变体的生长。所以说明，GhSWEET42蛋白可以转运葡萄糖。

本研究发现大丽轮枝菌的感染诱导了SWEET基因第二分支GhSWEET42基因的表达。GhSWEET42转运蛋白可能是大丽轮枝菌的靶基因，并促进葡萄糖在感染部位的积累，这将促进大丽轮枝菌的生长。据报道，病原菌通常通过转录激活因子效应物(TALE)的分泌来攻击宿主，该效应子进入宿主细胞核并模拟转录因子，导致SWEET基因的表达。例如，水稻白叶枯病菌株PXO99^A分泌的PthXo1是一种TALE，它直接与OsSWEET11启动子相互作用，特异性激活水稻OsSWEET11的转录。另一项研究表明，Avrb6是的棉花角斑病的一种TALE，是棉花角斑病菌致病性的重要条件，Avrb6可以棉花中特异性的诱导GhSWEET10的表达。在病原菌的侵染的刺激下，糖转运蛋白的表达增加会使宿主的营养转移到感染部位。证明真菌操纵SWEET转运蛋白的表达对于病原真菌的致病性是必不可少的。

实施例3

超表达GhSWEET42的拟南芥降低对黄萎病的抗性

1、拟南芥异源超表达

(1)将含有重组质粒(GhSWEET42-pCambia2300)农杆菌液从-80℃取出，活化菌液，使用重悬液将菌液的OD₆₀₀调整至1.2，将含有0.02％silwet-77的表面活性剂加入到菌液中，混匀。

(2)在拟南芥盛花期的前两天，剪去果荚，将剪去果荚的拟南芥放在配制好的菌液中浸泡60s，然后黑暗处理24小时，之后放在植物温室正常生长。

(3)等拟南芥恢复正常生长之后，进行二次侵染。

(4)等拟南芥果荚成熟之后，收获种子，放在加入干燥剂的离心管，将离心管放在37℃的培养箱中后熟1周。1周后取出种子，按照上述同样的方法将收获的T₀代种子播种在含有卡那霉素的培养基上进行筛选，4℃冰箱春化2天后放置植物温室。一直筛选到T₃种子，然后用于后续实验。

2、拟南芥表达量的半定量分析

(1)拟南芥RNA提取。

(2)拟南芥RNA反转录cDNA。

(3)以超表达拟南芥的cDNA为模板，进行半定量PCR，涉及引物如下：

表2引物信息

引物名	序列(5’-3’)
		QGhSWEET42-F	AGTTTTCATGGCCCTTGTCGCT
QGhSWEET42-R	ATTGGCAAAGGAAGCCAGGGAG
		AtUBQ5-F	GACGCTTCATCTCGTCC
AtUBQ5-R	CCACAGGTTGCGTTAG

如图7A可以看到，半定量PCR结果显示三个超表达拟南芥株系中目的基因均有表达，野生型没有条带，并且可以看到作为对照的AtUBQ5在四个株系包括野生型中都有明亮的条带，说明GhSWEET42在拟南芥中可以稳定且高效的表达。然后，本研究对这三个株系进行了实时荧光定量PCR来进一步验证目的基因在拟南芥中的表达。如图7B可以看到，三个超表达株系的相对表达量，都是显著高于野生型，并且野生型拟南芥中没该基因的表达。半定量PCR和实时荧光定量PCR相互验证，都说明了GhSWEET42在拟南芥的三个株系中稳定且高效的表达。

3、超表达拟南芥的葡萄糖含量变化

GhSWEET42是定位在细胞膜上的葡萄糖转运蛋白。为了了解超表达GhSWEET42之后会对拟南芥葡萄糖含量的含量的影响，本研究对开花之前的超表达拟南芥株系取样测定了葡萄糖含量的变化。如图8，发现超表达GhSWEET42会导致葡萄糖含量的显著上升。

4、超表达拟南芥对大丽轮枝菌的抗性降低

拟南芥接种大丽轮枝菌的方法浸根法具体步骤如下；

(1)将4周龄未抽薹的拟南芥幼苗从土里挖出用水把根冲洗干净，用吸水纸吸干。

(2)浸入大丽轮枝菌分生孢子悬浮液(1×10⁷个/mL)中90秒。

(3)将幼苗重新种植在新的培养土中。

(4)黑暗处理24小时，转至植物温室继续培养。

当大丽轮枝菌侵染棉花根时，会引起棉花根的葡萄糖上升。为了了解在拟南芥中超表达GhSWEET42对大丽轮枝菌侵染的影响，本研究用浸根法对未抽薹的拟南芥进行侵染。经过2周的培养和观察。如图发现超表达株系与野生型相比黄化和落叶更加严重，发育严重受阻，说明超表达株系对大丽轮枝菌的抗性明显减弱(图9A)。为了确定拟南芥的表型是由大丽轮枝菌侵染引起的，本研究使用大丽轮枝菌的特异引物对提取的叶片DNA进行实时荧光定量PCR分析，发现超表达株系中大丽轮枝菌的含量明显高于野生型(图9B)，说明拟南芥的病害表型是由大丽轮枝菌侵染引起的，超表达株系中含有更多的大丽轮枝菌，对拟南芥的伤害更严重。进一步对超表达株系和野生型的表型进行量化说明，本研究计算了四个株系的病情指数。如图，发现三个超表达株系的病情指数分别为58、54、51，显著高于野生型32，说明超表达株系对大丽轮枝菌的侵染更加敏感(图9C)。

其中，拟南芥病情指数计算如下：

表3拟南芥黄萎病病级划分

为了验证GhSWEET42的在拟南芥中的功能，本研究拟南芥中超表达GhSWEET42，发现超表达拟南芥中的葡萄糖含量明显上升。由于大丽轮枝菌的侵染会导致GhSWEET42的被诱导上调表达，然后对超表达拟南芥进行了大丽轮枝菌的侵染实验，发现超表达株系对大丽轮枝菌的抗性减弱。

实施例4

沉默表达GhSWEET42提高棉花对黄萎病的抗性

1、VIGS沉默效率和葡萄糖含量分析

为了进一步阐明GhSWEET42在棉花对抵抗大丽轮枝菌的入侵中发挥的功能，本研究通过基于病毒介导的基因沉默技术沉默了棉花中的GhSWEET42基因。

步骤如下：

1、选取GhSWEET42序列中的297bp作为沉默片段，进行分析和功能验证，引物如表4。

表4 VIGS扩增引物

2、以T载体为模板，扩增带有烟草花叶病毒载体TRV2同源臂的目的基因。

3、使用

Quick Gel Extraction Kit试剂盒对目的条带的PCR扩增产物进行胶回收。

4、线性化载体(烟草花叶病毒TRV2载体使用限制性核酸内切酶EcoRI和KpnI)，并进行验证。

5、用

II One Step Cloning Kit试剂盒将目的基因与载体TRV2使用同源重组的方法连接起来，然后转入大肠杆菌，进行重组产物提取和验证，得到的重组产物进行农杆菌转化，获得农杆菌阳性菌。

5、选取课题组保存的自交龄的中植棉2号的种子，将种子放入配置好的3％的过氧化氢溶液中浸泡10分钟后转移至无菌水浸泡，37℃过夜，挑选发芽的种子，胚根朝下种入1:1混合的营养土和蛭石中盖上透明的盖子，每天喷洒清水，促进幼苗脱落种皮，待子叶完全展开后，并且真叶尚未长出的时期对幼苗进行农杆菌注射。

在注射农杆菌后两周左右，阳性对照TRV:CLA1开始在真叶中显示出强烈的白化表型(图10A)，说明本次实验基因沉默成功，并且实验操作无误。提取TRV:00和TRV:GhSWEET42根的RNA，反转录后进行实时荧光定量PCR检测GhSWEET42基因的表达量，结果如(图10B)所示，沉默株系GhSWEET42的表达量明显下调，达到显著差异水平，并且使用半定量PCR的方法验证了实时荧光定量PCR的结果(图10C)。因此，表明TRV:GhSWEET42植株中的GhSWEET42基因被成功沉默。对VIGS沉默成功的植株取样进行GC-MS分析，如图(图10D)，发现在沉默GhSWEET42后，TRV:GhSWEET42植株的根中葡萄糖含量显著下调，说明在沉默GhSWEET42基因之后可以显著降低植株的葡萄糖含量。

2、GhSWEET42基因沉默后抗病性检测

在接种大丽轮枝菌后10天左右，对照植株TRV:00和沉默植株TRV:GhSWEET42均开始产生初步的病症，比如叶片开始干枯，生长减缓。接大丽轮枝菌20天后(图11)，在TRV:GhSWEET42的植株上只有轻微的发黄和萎蔫，可以正常生长，病害症状不明显，而在TRV:00植株上，观察到生长严重受阻，叶片大量的变黄，萎蔫，甚至脱落和枯死，出现典型的大丽轮枝菌危害的病症，说明受到大丽轮枝菌的侵害更加严重。

3、病菌恢复实验和病菌定殖观察

为了研究棉花的病害是由大丽轮枝菌引起的并且确定大丽轮枝菌在棉花中的定殖程度，随机取TRV:00和TRV:GhSWEET42的植株各8株，进行真菌恢复试验，结果表明TRV:00植株的茎部定殖有更多的大丽轮枝菌，真菌数量显著高于TRV:GhSWEET42(图12A)。用实时荧光定量PCR对棉花植株的病菌含量进行测定，如图(图12B)，结果表明TRV:00植株中大丽轮枝菌含量显著高于TRV:GhSWEET42,说明沉默植株TRV:GhSWEET42对大丽轮枝菌的抗性显著提高。

同时，取TRV:00和TRV:GhSWEET42的植株得茎部进行纵切，观察大丽轮枝菌对棉花茎的危害程度，放置在体视显微镜下可以看到，沉默株系与对照株系相比，对照TRV:00植株中的维管束损害更加严重，维管束褐变程度更加严重(图12C)，说明大丽轮枝菌对TRV:00植株的危害更加严重。在接种后20天，对两个株系进行病情调查，结果表明TRV:GhSWEET42植株的病情指数显著低于对照(图12D)。上述结果证实，棉花中GhSWEET42基因通过VIGS方法被成功沉默后，沉默植株TRV:GhSWEET42对大丽轮枝菌的抗性显著提高。

其中，棉花病情指数计算如下：

表5棉花黄萎病病级划分

在本研究对GhSWEET42功能的研究中，发现沉默GhSWEET42可以降低根部的葡萄糖含量，并且明显提高对大丽轮枝菌的抗性。因此，GhSWEET42基因可以作为糖饥饿机制防止大丽轮枝菌侵染棉花的靶基因，通过调控GhSWEET42基因的表达控制侵染部位的葡萄糖含量，减缓大丽轮枝菌侵染棉花的进程。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 基因GhSWEET42在防治棉花黄萎病中的应用

<130> 2021

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 765

<212> DNA

<213> G．hirsutum

<400> 1

atggtgtctc acctagtcag cactatccga aatgtagttg ggatcacagg gaacgttatc 60

tctctcttcc tcttcttgtc tcctgtgcca acttttgttc ggatttggaa gaaagggtca 120

gtggaacagt actccccagt cccgtacctg gcaactttaa tcaattgcat ggtttgggtc 180

atttatggcc tgcctatggt tcatcccgac agcaccctgg ttatcaccat caatggtgca 240

gggaccgcca ttgagctcgt ctatttaacc ctcttcttga tcttttgcca tgacaagaaa 300

aagagactca aagtgctgct gatcgcgttg gtcgaggtag ttttcatggc ccttgtcgct 360

gctctggttc tcacattagc tcacaccact gaacgccggt ccatggtcgt cggaattatc 420

gcaattttgt tcaatatcat gatgtatgct tcgcctttat ccgtcatgaa actggtgatc 480

tcaacaaaaa gcgtagagta tatgcccttt tttctctccc tggcttcctt tgccaatggt 540

gttgcatgga ctacttacgc tttcctccct tttgacccat tcattgctgt tccaaatgga 600

ttgggcacat tgtttagctt agcgcagctg ttgttgtacg ccacatacta tgagtccaca 660

aagagaataa tagcagcaag gaaagagacg aaggtggaag tgaacctatc tgaggtggtc 720

gttaatggca accatgatcc caagaagacc accagagcaa cttaa 765

<210> 2

<211> 297

<212> DNA

<213> G．hirsutum

<400> 2

ccgccattga gctcgtctat ttaaccctct tcttgatctt ttgccatgac aagaaaaaga 60

gactcaaagt gctgctgatc gcgttggtcg aggtagtttt catggccctt gtcgctgctc 120

tggttctcac attagctcac accactgaac gccggtccat ggtcgtcgga attatcgcaa 180

ttttgttcaa tatcatgatg tatgcttcgc ctttatccgt catgaaactg gtgatctcaa 240

caaaaagcgt agagtatatg cccttttttc tctccctggc ttcctttgcc aatggtg 297

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gggccccccc tcgaggtcga cttaagttgc tctggtggtc ttcttg 46

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gtgagtaagg ttaccgaatt catggtgtct cacctagtca gcacta 46

Claims (10)

1.基因GhSWEET42在防治棉花黄萎病中的应用，所述基因GhSWEET42的核酸序列如SEQID NO:1所示。

2.基因GhSWEET42在棉花抗黄萎病遗传改良或分子育种方面的应用，所述基因GhSWEET42的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，沉默或敲除棉花材料中的所述基因GhSWEET42，棉花对黄萎病的抗性提高。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述棉花材料包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述棉花材料包括以下中的任一种：叶、根、茎、胚根、胚芽、种子。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述棉花材料中基因GhSWEET42沉默的目标片段如SEQ ID NO:2所示。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因GhSWEET42沉默所用的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

8.一种防治棉花黄萎病的方法，其特征在于，沉默或敲除棉花材料中的基因GhSWEET42，所述基因GhSWEET42的序列如SEQ ID NO:1所示。

9.一种抗黄萎病棉花品种培育的方法，其特征在于，制备含有基因GhSWEET42沉默或敲除的棉花材料；

所述基因GhSWEET42的序列如SEQ ID NO:1所示。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述棉花材料包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料；

进一步地，所述棉花材料包括以下中的任一种：叶、根、茎、胚根、胚芽、种子；

进一步地，棉花中基因GhSWEET42沉默的目标片段如SEQ ID NO:2所示。

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