CN103468740A - 水稻OsDRAP1基因在增强植物抗旱性中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻OsDRAP1基因在增强植物抗旱性中应用。本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白在增强植物抗旱性中的应用、序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在增强植物抗旱性中的应用。本发明的实验结果表明，OsDRAP1基因在受到高盐和干旱胁迫时表达量迅速增加，但受到低温胁迫时增加幅度较小；OsDRAP1转录因子可以通过结合下游基因启动子区域的GCC box和DRE来调控下游基因的表达，参与植物胁迫应答反应；在水稻中超表达OsDRAP1基因能够在一定程度上改善水稻抗旱胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。

Description

水稻OsDRAP1基因在增强植物抗旱性中应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中水稻AP2/EREBP转录因子家族基因OsDRAP1在增强植物抗旱性中应用。

背景技术

各种生物和非生物胁迫是影响水稻生长和产量的重要因素，发掘能够改善水稻抵抗逆境胁迫能力的基因将为基因工程改良水稻新品种打下基础。在长期进化过程中，植物在分子、细胞、生理和生物化学水平上发展出多种机制应对逆境胁迫，转录因子作为上游调控基因在植物的胁迫应答途径中扮演重要的角色。植物中参与胁迫应答反应的主要有AP2/EREBP、bZIP、NAC、MYB和WRKY转录因子家族。其中AP2/EREBP转录因子家族基因广泛参与植物的发育、激素信号转导、病原反应与干旱、高盐及低温等胁迫应答反应。该家族转录因子的共同特点是含有一个60个氨基酸左右的AP2结构域，它在与DNA结合中具有重要的作用。根据AP2结构域的特点，AP2/EREBP转录因子家族被分为：AP2、EREBP、RAV和其它共4个亚类。AP2成员含有2个重复的AP2结构域，而RAV成员含一个AP2结构域和一个类似B3结构域；EREBP亚家族成员含有一个AP2结构域，且有ERF和DREB/CBF两个分支。

研究表明，EREBPs转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫应答反应。ERFs类转录因子主要参与植物的生物胁迫应答反应，如病原反应、伤害反应、乙烯信号途径。最早发现的ERF转录因子是从烟草中分离得到的4个乙烯诱导病程相关(pathegenesis-related，PR)蛋白EREBP1-4，它们通过结合下游基因启动子区域的乙烯应答元件GCC box调控下游基因的表达。GCC box广泛存在于烟草和其他植物PR蛋白基因的5′UTR区域，核心序列是AGCCGCC。1997年，Zhou等在番茄中发现3个ERF蛋白(Pti-4、Pti-5和Pti-6)能够和疾病防御蛋白Pto相互作用，进一步验证了ERFs转录因子在植物的病原反应中具有重要作用。在植物中超表达一些ERFs基因亦能够提高植物的抗病能力，如ERF1、Pti4、ATERF1基因。最近的研究表明水稻中的ERF转录因子在乙烯应答、淹水胁迫应答、干旱胁迫应答等多种生物途径中起着正向调节作用。

DREBs转录因子在植物的冷、干旱、高盐、过氧化物等胁迫应答途径中具有重要的作用，参与不依赖于ABA的胁迫应答反应。DREBs转录因子通过结合下游基因启动子区的干旱应答顺式作用元件DRE/CRT而调控下游基因的表达。干旱应答顺式作用元件DRE(dehydration-responsive element)最早在逆境胁迫诱导基因rd29A的启动子区域被发现，核心序列为A/GCCGAC。与DRE相似的顺式作用元件CRT(C-repeat)则是在一个冷诱导基因cor15a的启动子区被发现，其核心序列是TGGCCGA。DRE/CRT被发现存在于多个受干旱和低温诱导的基因的启动子区域。在拟南芥、水稻等植物中超表达DREB家族的基因大多能提高植株应对非生物胁迫的能力。迄今为止，越来越多的DREBs基因从不同植物中被克隆。在水稻中发现的DREB基因有OsDREB1A-G、OsDREB2A、OsDREB2B，其中OsDREB1A、OsDREB1E、OsDREB1G、OsDREB2A、OsDREB2B能够特异性地结合DRE。研究发现在拟南芥中超表达OsDREB1A能够提高拟南芥植株耐受低温、高盐和干旱的能力(Dubouzet J G，Sakuma Y，Ito Y，Kasuga M，Dubouzet E G，Miura S，Seki M，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.OsDREB genesin rice，Oryza sativa L.，encode transcription activators that function in drought-，high-salt-andcold-responsive gene expression.Plant J，2003，33：751-763)；在水稻中超表达OsDREB1G和OsDREB2B也能够明显地提高转基因水稻的抗旱性，而超表达OsDREB1E仅仅能够轻微地提高水稻抵抗干旱的能力(Chen J Q，Meng X P，Zhang Y，Xia M，Wang X P.Over-expression ofOsDREB genes lead to enhanced drought tolerance in rice.Biotechnol Lett，2008，30(12)：2191-2198)。

ERFs和DREBs转录因子功能的差异主要体现在它们能够结合的顺式作用元件和调节的下游基因不同。有些EREBPs转录因子既能结合DRE，也能结合GCCbox，如TINY、TINY2、BnDREBIII、AtERF1、AtERF4、AtEBP和CBF1；而部分只能结合DRE，如CBF2/DREB1C和CBF3/DREB1A等。ERFs转录因子倾向于结合GCC box，DREBs转录因子则倾向于结合DRE。为了发掘影响两类转录因子结合的关键氨基酸，Sakuma等(Sakuma Y，Liu Q，Joseph G.DNA-binding specificity of the ERF/AP2domain of Arabidopsis DREB，transcription factorsinvolved in dehydration-and cold-inducible gene expression.Biochem Biophy Res Commun，2002，290：998-1009)通过多序列比对分析发现拟南芥中的DREBs转录因子的AP2结构域第15和第20个氨基酸分别是缬氨酸(Val，V)和谷氨酸(Glu，E)，而ERFs转录因子的AP2结构域第15和20个氨基酸是丙氨酸(Ala，A)和天冬氨酸(Asp，D)，进一步研究表明Val-15和Glu-20特别是Val-15对于结合DRE有重要的作用，但不影响对GCC box的结合，这可能是造成ERFs和DREBs转录因子功能不同的原因。为了发掘影响GCC box结合的关键氨基酸，孙山等(SunS，Yu J P，Chen F，Zhao T J，Fang X H，Li Y Q，Sui S F.TINY，a dehydration-responsive element(DRE)-binding protein-like transcription factor connecting the DRE-and ethylene-responsiveelement-mediated signaling pathways in Arabidopsis.Biol Chem，2006，283：6261-6271)比较能够结合两种顺式作用元件的蛋白序列和只能结合DRE的蛋白序列发现两类蛋白的AP2保守区的第16个氨基酸不同，进一步研究表明Ser-16对于拟南芥中的DREB转录因子TINY结合GCC box是必不可少的。TINY既参与生物胁迫反应途径，也参与非生物胁迫途径，说明DRE介导的调控途径和GCC box介导的调控途径存在一定的重叠。

水稻中有些AP2/EREBP转录因子基因在受到非生物胁迫时表达量明显升高，其中大部分基因为DREBs和ERFs，这些基因很有可能与水稻的非生物胁迫应答反应相关。虽然近年来对于EREBPs转录因子参与非生物胁迫应答反应的机制有了较全面的研究，但是水稻中还有很多的EREBPs基因的功能未知。

发明内容

本发明的目的是提供序列表中序列1所示的蛋白及其编码基因(OsDRAP1)。

本发明提供了序列表中序列1所示的蛋白及其编码基因在增强植物抗旱性中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因；

1)序列表中序列2、3的自5′末端第505位-1347位所示的DNA分子；

2)序列表中序列2、3所示的DNA和RNA分子；

3)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)所述的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物抗旱性中的应用也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体的构建过程中，在其转录起始核苷酸前加上4个Myc蛋白标签，在pCUbi1390的多克隆位点间，即Ubiquitin启动子后插入所述序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

所述植物为单子叶植物-水稻，包括双子叶植物。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将序列表中序列1所示的蛋白的编码基因导入植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与目的植物相比抗旱性增强。

本发明通过干旱、高盐、低温胁迫下OsDRAP1基因在不同水稻品种中的表达差异，结合凝胶阻滞实验中其对顺式元件GCC box和DRE的结合情况，以及超表达和RNAi抑制表达水稻植株的表型变化，开展其基因克隆与功能分析，分析候选基因与水稻非生物胁迫应答的关系。结果表明，OsDRAP1基因在受到高盐和干旱胁迫时表达量迅速增加，但受到低温胁迫时增加幅度较小；OsDRAP1转录因子可以通过结合下游基因启动子区域的GCC box和DRE来调控下游基因的表达，参与植物胁迫应答反应；在水稻中超表达OsDRAP1基因能够显著改善水稻抵御干旱胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为以实时定量PCR分析OsDRAP1在非生物胁迫下的表达量差异。

图2为以实时定量PCR分析OsDRAP1在典型抗逆水稻品种中胁迫前后的表达量差异。

图3为以实时定量PCR分析OsDRAP1在不同组织中的表达模式。

图4为OsDRAP1的AP2结构域结合GCC box和DRE元件的EMSA分析图谱。

图5为PCR检测转基因T-DNA插入及qPCR、Westren blot检测目的基因表达水平。

图6为超表达OsDRAP1和RNAi转基因植株抗旱相关表型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、不同胁迫处理条件下OsDRAP1基因在不同水稻品种中的时空表达差异

日本晴(Nipponbare，Oryza sativa ssp.japonica)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Yongqing Jiao，Yonghong Wang，Dawei Xue，Jing Wang，Meixian Yan，Guifu Liu，Guojun Dong，Dali Zeng，Zefu Lu，Xudong Zhu，Qian Qian and JiayangLi(2010)Regulation of OsSPL14by OsmiR156defines ideal plant architecture in rice.NatureGenetics，42，541-544)；

典型耐旱旱稻品种IRAT109(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：San-Hong Liu，Bin-Ying Fu，Hua-Xue Xu，Ling-Hua Zhu，Hu-Qu Zhai，Zhi-Kang Li(2007)Cell death in response to osmotic and salt stresses in two rice(Oryza sativa L.)ecotypes，Plant Science，172，897-902)；

耐盐水稻FL478(请说明FL478的来源)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Harkamal Walia，Clyde Wilson*，Pascal Condamine，XuanLiu，Abdelbagi M.Ismail，Linghe Zeng，Steve I.Wanamaker，Jayati Mandal，Jin Xu，Xinping Cui，and Timothy J.Close(2005)Comparative Transcriptional Profiling of Two Contrasting RiceGenotypes under Salinity Stress during the Vegetative Growth Stage.Plant Physiology，139，822-835)；

耐冷水稻云南地方品种丽江新团黑谷(LTH)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：凌忠专，雷财林，王久林(2004)稻瘟病菌生理小种研究的回顾与展望，中国农业科学，37(12)：1849-1859)。

1、水稻的低温、高盐和干旱胁迫

水稻日本晴、典型耐旱旱稻品种IRAT109、抗旱水稻品种FL478和耐冷水稻云南地方品种丽江新团黑谷(LTH)种子经消毒处理，室温浸种2d，37℃催芽1d，萌发后选发芽一致的种子播于塑料盒泡沫架上，每孔2粒，二叶前水培，二叶后用Yoshida营养液培养。于五叶期开始低温(4℃)、高盐(150mmol L^-1NaCl)和渗透胁迫(20％PEG)处理，日本晴于胁迫处理0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h后取叶片；IRAT109、FL478、LTH处理两天后分别取根和叶片；取正常生长条件下日本晴的幼穗、成熟叶片、茎、茎节、基座、老根、幼叶、幼根、愈伤组织，液氮速冻，-70℃低温保存，用于RNA提取。

2、实时定量PCR分析

采用TRIZOL试剂提取实验样品总RNA，并进行RNA纯度的分析：用1％琼脂糖凝胶电泳快速检测提取的总RNA的完整性，DNase I消化RNA中的基因组DNA，具体方法和步骤参照说明书。

反转录：

第一链cDNA的合成用反转录用试剂盒(Promega公司，Code no：A3500)。

Real Time PCR分析：

Real Time PCR分析，所用OsDRAP1的PCR引物如下：F：5′-TGGTCTGATTTGGTAGCC-3′；R：5′-TCCAA GAACTGGCAGACGA-3′；内参基因Actin1引物序列为F：5′-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3′；R：5′-GG CTGGAAGAGGACCTCAGG-3′。Real TimePCR的分析使用TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Code no：DRR041A)，应用的RealTime PCR扩增仪为ABI7300，方法见说明书。

数据分析：

用相对定量法计算目的基因相对表达量Rel.Exp＝2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝[(待测样品目的基因的Ct-待测样品看家基因的Ct)-(对照组目的基因的Ct-对照组看家基因的Ct)]。

标准方差的计算用Excel完成，先用统计函数STDEV算出样品和对照的S值，再将两个S值算平方，算出(S₁ ²+S₂ ²)/3的值，进而算出X＝Power((S₁ ²+S₂ ²)/3，0.5)，最后算出方差＝(2^(-ddct-x)-2^(-ddct+x))/2。

结果表明日本晴中OsDRAP1在低温、高盐、PEG和旱胁迫下的表达量变化谱：结果如图1所示(图1中，cold：4℃处理(低温胁迫)；NaCl：150mM NaCl处理(盐胁迫)；PEG：20％PEG处理(渗透胁迫)，从图中可见，在3种胁迫下OsDRAP1表达量都有增高，但是表达模式存在差异。在低温和PEG胁迫下，OsDRAP1表达量均呈逐渐上升趋势，并在胁迫处理3h达最高水平。然而相比于低温胁迫，在PEG胁迫下OsDRAP1表达量增加幅度较大，并且在胁迫后期仍能保持较高水平。在盐胁迫下OsDRAP1呈逐步升高的趋势，并且表达量变化幅度较大，最高点到达20倍以上。以上结果表明OsDRAP1参与水稻对低温、盐和干旱胁迫的早期应答，并在应答模式上存在差别。

OsDRAP1在典型抗逆水稻品种中胁迫前后的表达差异：结果如图2所示(N：日本晴；L：丽江新团黑谷；F：FL478；I：IRAT109)，图2A：冷胁迫下OsDRAP1在日本晴(N)和丽江新团黑谷(L)中的表达量差异；图2B：盐胁迫下OsDRAP1在日本晴和FL478(F)中的表达量差异；图2C：干旱胁迫下OsDRAP1在日本晴和IRAT109(I)中的表达量差异。结果表明无论是在叶片中还是在根系中，OsDRAP1在典型抗逆水稻品种中的表达模式与日本晴基本相同，而且在胁迫前后的表达量和日本晴相比差异也不太显著。然而，在胁迫前后OsDRAP1在叶和根中的表达量变化稍有差异，在低温和干旱胁迫下，OsDRAP1在根中的表达量增幅高于叶片；在盐胁迫下，OsDRAP1在叶片中的表达量增幅高于根系。

OsDRAP1组织表达模式(1为幼穗；2为成熟叶片；3为叶鞘；4为茎节；5为节间；6为基座；7为成熟根；8为幼叶；9为幼根；10为愈伤组织)：从图3可以看出，OsDRAP1在水稻所有组织中均表达，但在成熟组织(成熟叶片、成熟根)表达水平高于幼嫩组织。

实施例2、OsDRAP1可以结合GCC box和DRE顺式元件以调节下游基因的表达

1、原核表达蛋白的制备

以PCR扩增出OsDRAP1的AP2保守域(67～193aa)的基因编码序列(即序列表中序列1第703位-1083位所示的核苷酸序列)，并构建到质粒pET-32a(Novagen，USA，69015-3)中，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(TransGen Biotech，China，Cat.No：DR101)中进行蛋白表达，产物经His-trap柱子纯化(GE)，Miliproe超滤管浓缩和脱盐后，采用Bradford法测定蛋白浓度。具体方法如下：

(1)PCR扩增目的基因AP2结构域编码区：

所用引物分别为：OsDRAP1-AP2-F：5′-GCACTGCAGCAACTCCACATGCAGCGG-3′(下划线部分为Pst I酶切位点)；OsDRAP1-AP2-R：5′-TAAGGATCCCCTGGATGAGGCGTTCTTGG-3′(下划线部分为BamH I酶切位点)。

目的基因的扩增采用高保真酶KOD-Plus(TOYOBO Code no：KOD-201)，PCR扩增反应程序为：95℃变性30s，退火30s，72℃延伸(1Kb/min)；34个循环后72℃延伸10min，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

采用TIANGEN公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型，Code no：DP209)，具体操作步骤见产品说明书。利用Pst I和BamH I双酶切并连接插入pET-32a载体中，

测序结果表明该PCR产物与Gramene数据库中OsDRAP1基因(Os08g31580)序列AP2结构域相同(即序列表中序列1第703位-1083位所示的核苷酸序列)，将重组质粒命名为pET-32a-DRAP1(AP2)。

(2)目的蛋白的制备：

原核表达目的蛋白的步骤参照分子克隆实验指南，将上述重组质粒pET-32a-DRAP1(AP2)转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(TransGen Biotech，China，Cat.No：DR101)。25度，低温诱导表达目的蛋白。

使用AKTA purifier仪器和1ml的His-trap HP柱子(GE，Code No.17-5247-01)纯化目的蛋白，具体实验步骤按照蛋白纯化系统进行。然后用Miliproe4000超滤管脱盐和浓缩蛋白。Bradford法测定蛋白质浓度：测定得到目的蛋白浓度约为1μg/μl。

2、目的DNA序列及突变序列的制备

将顺式作用元件GCC box(CATAAGAGCCGCCACT)和突变序列(CATAAGATCCTCCACT)，DRE序列(ATACTACCGACATGAG)和突变序列(ATACTACTGATATGAG)串联重复3次。以化学合成法分别合成双链后，将其等量混合(单链浓度100nmol L^-1)，95℃温育10min后慢慢冷却，复性为双链。

EMSA实验使用invitrogen的EMSA试剂盒(Code no：E33075)。具体方法和步骤如下：结合反应体系的配制：

1)在把EMSA试剂盒的组分E(Componentn E)、目的蛋白及目的DNA放置在冰上使之完全融化。按下列组分配制目的蛋白和目的DNA的结合反应体系：

2)对照体系是把目的蛋白和突变DNA序列孵育在一起，按下列组分配制反应体系，把配制好的结合反应体系轻柔的混匀，在室温下孵育20min。

非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，具体方法和步骤如下：

1)配制6.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶，在小烧杯中混合以下组分(以下用量可以制备两片凝胶板)

将配置好的凝胶灌制至两块玻璃板中间，立即插入1块干净的梳子，室温至少凝固1h。

2)制备0.25×TBE1200ml，4℃保存。

3)预电泳：在上用预冷的0.25×TBE在80V冰上预电泳1h。上样前用电泳缓冲液把加样空冲洗干净。

4)样品的准备：在结合反应体系孵育20min后，加入2μL组分D(Component D，6×EMSA gel-loading solution)，轻柔混匀。

5)电泳：将所有样品(12μL)加入加样空中，100V低温电泳90min。

用SYBR Green使凝胶核酸染色，具体方法如下：

1)溶解SYBR Green EMSA凝胶染色浓缩液组分A(SYBR Green EMSA gel stainconcentrate，Component A)，待其到室温时后，涡旋使之混匀，然后稍微离心收集溶液至管底。

2)稀释SYBR Green EMSA凝胶染色浓缩液：每一块凝胶取5μL组分A(10000×)用1×TBE Buffer稀释至50ml，剩余的组分A重新放入-20℃保存。

3)染色：把凝胶放在聚丙烯酰胺(PP)材质的塑料容器里，每块凝胶加入50ml稀释好的1×SYBR Green EMSA染色液，使染色液充分覆盖凝胶；把染色容器放在震荡器上轻微震荡(50rpm)，使凝胶在染色液中孵育约20min，整个染色过程避光进行。

4)洗胶：倒掉染色液，用150ml的去离子水洗涤凝胶两次，每次约10秒以去除多余的染色液。

凝胶成像：

使用蓝盾502可见光凝胶投射仪进行凝胶的观察并照相。结果如图4所示，图4A：OsDRAP1的AP2结构域可以结合GCC box(泳道1为自由DNA；泳道2～泳道5为80ng GCCbox加入0.25、0.5、1.0、1.5μg目的蛋白；泳道6为mGCC Box加入1.5μg目的蛋白)。图4B：OsDRAP1的AP2结构域可以结合DRE顺式元件(泳道1为自由DNA；泳道2～泳道4为80ng DRE加入0.5、1.0、1.5μg目的蛋白；泳道5为mDRE加入1.5μg目的蛋白)。

结果表明OsDRAP1蛋白的AP2结构域能够结合GCC box和DRE序列，但是无法结合其突变序列。推测OsDRAP1通过特异结合GCC box和DRE顺式元件以调节下游基因的表达，参与相关生物胁迫和非生物胁迫反应。

实施例3、过表达OsDRAP1基因增强转基因水稻的抗旱性

1、过表达和RNAi表达载体构建

根据日本晴序列全长设计引物，以日本晴cDNA为模板，扩增获得OsDRAP1的基因全长，同时在5′和3′端加上Pst I、BamH I酶切位点，扩增引物为：

F：5′-GCACTGCAGATGGCAGCTGCTATAGAAGG-3′(下划线部分为Pst I酶切位点)；

R：5′-TAAGGATCCGTTATTGTTGTTGAGCAGC-3′(下划线部分为BamH I酶切位点)，扩增产物经Pst I和BamH I酶切纯化后，回收目的DNA片段(845bp)；同时，用Pst I和BamH I酶切表达载体pCUbi1390(含有Ubiquitin1启动子)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Hao Peng，Qian Zhang，Yadong Li，Cailin Lei，Ying Zhai，Xuehui Sun，Daye Sun，Ying Sun，Tiegang Lu(2009)A putative leucine-rich repeat receptor kinase，OsBRR1，is involved in rice blast resistance Planta，230：377-385)，T4连接酶连接，得到目的质粒，然后Pst I单酶切将人工合成的4×Myc蛋白标签核酸序列(CTGCAGATGAGCGGGTTAATTAACGGTGAACAAAAGCTAATCTCCGAGGAAGACTTGAACGGTGAACAAAAATTAATCTCAGAAGAAGACTTGAACGGACTCGACGGTGAACAAAAGTTGATTTCTGAAGAAGATTTGAACGGTGAACAAAAGCTAATCTCCGAGGAAGACTTGAACGGTAGCCTGC AG)插入到起始密码子前(OsDRAP1蛋白第一个氨基酸前面)，阳性克隆质粒进行PCR和测序验证，测序结果表明在载体pCUbi1390的Pst I和BamH I酶切位点间插入了序列表中序列2第505位-1340位所示的OsDRAP1基因片段，该序列所编码的OsDRAP1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。将重组载体命名为pCUbi1390-MDRAP1。

根据OsDRAP1基因cDNA特异序列设计RNAi区段，扩增引物为：DRAP1R-F：5′-CCGCGTCCAAGAACGCCTCA-3′，DRAP1R-R：5′-GAGCAGCGAGTCCCAGTCG-3′，并分别在引物两端引入attB1：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT/attB2：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTT接头序列；利用高保真酶进行PCR扩增RNAi区段(275bp)，利用Gateway技术重组入pH7GWIWG2(II)，完成OsDRAP1基因RNAi载体构建，测序表明在载体pH7GWIWG2(II)的35S启动子后和Intro后分别正反向插入了序列表中序列2第1058位-1332位所示的干扰片段，，将重组载体命名为pH7GWIWG2(II)-DRAP1i。

冻融法将表达载体pCUbi1390-MDRAP1和pH7GWIWG2(II)-DRAP1i转入农杆菌EHA105感受态细胞中(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Ruifang Yang，Qicai Tang，HuimeiWang，Xiaobo Zhang，Gang Pan，HongWang and JuminTu(2011)Analyses of two rice(Oryza sativa)cyclin-dependent kinase inhibitors and effects oftransgenic expression of OsiICK6on plant growth and development，Annals of Botany，107：1087-1101)，方法参照分子克隆实验指南。

2遗传转化

用农杆菌介导的遗传转化法，以日本晴为受体材料，进行遗传转化(培养基配方见表1)，具体方法如下：

1)愈伤诱导

取适量成熟的水稻种子，脱壳后，先用70％酒精清洗消毒1min，期间不断地摇荡，再用15％的次氯酸钠消毒处理30min(可置于摇床上振荡)；最后用无菌蒸馏水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种。将消毒处理后的种子接种于含有2.0mg/L的2，4-D的诱导培养基中，28℃暗培养30-40天。培养获得的愈伤在继代培养基上扩大培养，每2周继代一次，直至胚性愈伤形成。

2)农杆菌侵染

a)将携带有表达质粒载体pCUbi1390-MDRAP1、pH7GWIWG2(II)-DRAP1i的农杆菌划线于含有抗生素(50mg/L卡那霉素或壮观霉素、25mg/l利福平)的LB固体培养基表面，28℃，200r/min培养过夜。

b)用灭过菌的牙签挑取单克隆菌落，接种到5ml含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃震荡培养到OD600＝0.5。

c)取活化好的的新鲜菌液按1：100的比例接种到25ml相同的YEB液体培养基中，在相同条件下培养至OD600＝0.5。

d)菌液在5000g，4℃下离心10min收集菌体，弃去上清液；加入25ml10mM的MgSO₄悬浮菌体，并用移液枪轻轻吸打使其充分悬浮，在5000g，4℃下离心10min重新收集菌体，弃去上清液。

e)用25ml含有200μM乙酰丁香酮(AS)的AA-AS浸染培养基重新悬浮。

f)将生长状态良好的胚性愈伤从继代培养基中转移至表面覆有无菌滤纸的培养皿中(愈伤切成0.3-0.4mm大小)，在超净工作台上风干10-20min。

g)将干燥的胚性愈伤浸入含有上述菌液的50ml离心管中20min，期间每隔5min摇荡一次；之后倒掉菌液，将愈伤取出置于无菌滤纸上风干10-20min，然后转移至表面铺有无菌滤纸的含有200μM乙酰丁香酮(AS)的CC培养基中，25℃黑暗条件下共培养3d。

h)收集表面没有明显农杆菌的愈伤组织，用含600mg/l头孢霉素的无菌水冲洗3次，吸取多余水分。

i)将愈伤组织转入筛选培养基(含500mg/l头孢霉素和50mg/l潮霉素的N6培养基)上继续筛选2-3次，每次两周。最终得到生长良好的鲜黄色潮霉素抗性愈伤组织。

3、转化体植株再生

取新鲜潮霉素抗性的愈伤，将愈伤组织分割成2mm的小块，接于预分化培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养8-9天后将已分化出不定芽的愈伤组织后转入再生培养基(250mL组培瓶)上，继续光照培养。等到不定芽长成4-6cm高的小苗后再转移到生根培养基中，在28℃，光照培养间(12h光照/12h黑暗)条件下培养约15天，得到转化体植株，移到温室种植(T0代)，一月后取叶片进行PCR阳性鉴定(Hpt-F：5’-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3’，Hpt-R：5’-CCTGACCTATTGCATCTCCC-3’)，并收获其阳性植株种子(T₁代)。图5A为：转基因(过表达和RNAi)和野生型植株PCR阳性鉴定，转基因植株都获得Hpt特异条带，而野生型对照没有扩增条带。

表1遗传转化所用培养基及其配方

4、转基因植株分子鉴定和抗旱性鉴定

选用T₃代转基因超表达、RNAi和野生型日本晴的种子，催芽后播种于盛有草炭土的盒子内，培养条件为光照/黑暗为16/8h，光照条件25℃，黑暗条件23℃，光强30000lx。利用荧光定量PCR(方法同上)和Westren Blot(方法参照分子克隆实验指南，一抗使用Myc标签抗体)检测转基因水稻在RNA水平和蛋白水平的表达量。图5B为利用Myc标签抗体Western Blot检测目的基因蛋白表达，从图中可见，OsDRAP1蛋白水平都获得了不同程度的表达。图5C、D为转基因植株中OsDRAP1在RNA水平的表达量；从图中可见，大部分过表达转基因植株中OsDRAP1的表达量高于野生型日本晴，RNAi转基因植株OsDRAP1水平降低。

在水稻生长至分蘖盛期进行自然干旱胁迫(背阴处自然干旱)，每胁迫处理进行6次随机重复，实验设3次重复。图6A依次为处理前过表达、WT、RNAi植株，干旱7天后(土壤含水量约为14.2％)，RNAi转基因(R2)最先卷叶(图6B)，干旱9天后(土壤含水量约为11.3％)，野生型WT植株卷叶(图6C)，干旱10天后(土壤含水量约为8.5％)，所有植株都卷叶，干旱12天后(土壤含水量为7.6％)复水处理，一周后观察发现过表达OsDRAP1(OE7)植株恢复最好(图6D)，因此，与野生型植株相比，OsDRAP1超表达转基因植株最耐旱，而RNAi转基因植株对旱敏感，水稻中超表达OsDRAP1基因能够显著改善水稻抵御干旱胁迫的能力，在水稻抗逆育种中具有重要价值。

Claims (8)

1.序列表中序列1所示的蛋白在增强植物抗旱性中的应用。

2.序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在增强植物抗旱性中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因；

1)序列表中序列2、3的自5′末端第505位-1347位所示的DNA分子；

2)序列表中序列2、3所示的DNA和RNA分子；

3)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)所述的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

3.含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物抗旱性中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体为在pCUbi1390的多克隆位点间插入所述序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

5.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。

6.含有权利要求2、3或4所述编码基因的表达载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述序列表中序列1所示的蛋白的编码基因或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物抗旱性获得提高。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体的构建过程中，在其转录起始核苷酸前加上增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

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