CN102242134B - 大豆GmSGT基因和其5’UTR的克隆及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个大豆酶学抗病基因，其编码蛋白及其5’UTR序列。其目的是提供一个大豆酶学抗病基因及其编码蛋白在培育高抗病性植物中的应用。该基因是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；5)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。其编码蛋白是下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO：2；2)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物抗病性的蛋白质。本发明将在植物病害的防治领域及抗病品种的繁育工作中发挥重要作用。

Description

大豆GmSGT基因和其5’UTR的克隆及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因及其编码蛋白和基因的5’UTR，特别是涉及一个来源于大豆的具有氨基转移酶功能的抗病基因及其编码蛋白与其在培育抗病性提高的植物中的应用。 

背景技术

细菌及真菌是危害农作物的主要病原菌。虽然目前对某些病害已找到有效的防治方法，但对大多数严重危害农作物生长的病害尚无切实有效的防治措施。培育抗病品种是防治植物病害的根本措施。但由于病原菌变异迅速，可供利用的抗原匮乏，常规育种的作用受到很大程度的限制。随着分子生物学、植物病理学及基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性为抗病育种开辟了一条崭新途径。 

Taler等对印度野生、高抗霜霉病甜瓜品种P1进行遗传学研究发现，P45蛋白与抗病性紧密连锁(PlanteR Genes That Encode Photorespiratory Enzymes Confer Resistance against Disease The Plant Cell，Vol.16，172-184，January 2004)。根据P45蛋白部分氨基酸测序结果，设计简并引物，利用RT-PCR的方法克隆得到两个编码P45蛋白的eR基因，分别命名为At1和At2。At1和At2核苷酸序列的同源性为88％，氨基酸序列同源性为93％。研究发现At1和At2不属于任何一类已知的eR基因，其编码蛋白与丝氨酸乙醛酸氨基转移酶(Ser glyoxylate aminotransferase，SGT)、丙氨酸乙醛酸氨基转移酶(Ala glyoxylate aminotransferase，AGT)氨基酸序列同源性均大于80％。酶学活性分析实验发现，植物抗、感病性与SGT、AGT的酶活有直接相关性，高抗品种中SGT、AGT酶活最高，接近100％，中抗品种中酶活大约70％，感病品种中酶活则低于25％。 

Taler等将At1或At2基因转入感病品种，感病品种即获得抗病性，同时，SGT、AGT和乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase，GO)的酶活性均显著提高(Plant eR Genes That Encode Photorespiratory Enzymes ConferResistance against Disease The Plant Cell，Vol.16，172-184，January 2004)。推测SGT和AGT可能具有提高GO活性的功能。经检测，抗病植株中GO的活性是感病植株中GO活性的10-20倍。SGT、AGT和GO是植物光呼吸中的关键酶，它们都在植物的过氧化物体中起作用。在过氧化物体中，GO催化乙醇酸向乙醛酸转化并产生H₂O₂，而SGT、AGT分别以丝氨酸和丙氨酸作为氨基供体，催化乙醛酸向苷氨酸转化。SGT、AGT、GO协同作用导致植物体内H₂O₂的产生和积累。已知H₂O₂在植物抗病过程中起很重要的作用，H₂O₂不仅能够直接杀死病原菌(Peng & Kuc，Phytopathol.82：696-699，1992)，还可通过诱导细胞壁结构蛋白的氧化交联阻止病菌的侵入(Bradley et al.，Cell70：21-30，1992；Brisson et al.，Plant Cell 6：1703-1712，1994)及通过激活水杨酸合成以诱导防卫基因的表达，使植物产生系统获得性抗性(Leon et al.，PlantPhysiol.108：1673-1678，1995；Chen et al.，Science 162：1883-1886，1993)。悬浮细胞试验证明H₂O₂能激活植保素的合成(Apostol et al.，Plant Physiol.90：109-116，1989；Davis et al.，Phytochem.32：607-611，1993； Degousee et al.，Plant Physiol.104：945-952，1994)。在近来的研究中还发现在不亲和的植物—病原互作中氧化激增产生的H₂O₂不仅可作为区域信号导致细胞死亡，而且还可作为扩散信号诱导周围未侵染细胞中防卫基因如谷胱甘肽S转移酶基因的表达(Levine et al.，Cell 79：583-593，1994)。 

上述研究表明，eR基因对病原菌没有种属专化性，是具有氨基转移酶活性的酶学抗病基因。 

霜霉病是农业生产上的重要病害，霜霉菌寄生谱广，能引起葫芦科等多种作物的霜霉病，尤其是黄瓜，大豆等作物上损失惨重。霜霉菌主要引起叶片枯萎，在有利的环境条件下，菌丝的生长和病害的传播都很迅速。19世纪后期the oomycete Plasmopara viticola引起的葡萄霜霉病几乎摧毁了法国的酿酒业，直到1885年波尔多液的发现才使得病害得以控制。最近由Sclerospora graminicola引起的霜霉病的流行导致了印度和西部非洲重要的原料作物—珍珠栗的严重损失。 

发明内容

本发明的目的是提供一个来源于大豆的具有氨基转移酶功能的酶学抗病基因及编码蛋白和该基因的5’UTR序列。 

本发明所提供的酶学抗病基因，名称为GmSGT(Glycine max serine glyoxylate aminotransferase)，来源于大豆属大豆(Glycine max L.Merril)，是下述核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列； 

2)编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列； 

3)序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列 

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。 

序列表中的SEQ ID NO：1由1260个碱基组成，其编码序列为自5’端第146位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质。 

5)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。 

本发明酶学抗病基因所编码的蛋白(GmSGT)，具有下述氨基酸残基序列之一： 

1)序列表中的SEQ ID NO：2； 

2)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物抗病性的蛋白质。 

序列表中的SEQ ID NO：2由401个氨基酸残基组成。 

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。 

扩增GmSGT中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。 

本发明的另一个目的是提供提供一种提高植物抗病性的方法。 

6)序列表中SEQ NO：4的DNA序列； 

7)在高严谨条件下可与序列表中SEQ NO：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为在0.1×SSEP(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。 

8)序列表中SEQ NO：4由928个核苷酸组成，具有起始基因转录的功能，其中包括有有3个TATA-box(-17bp、-57bp和-196bp)，3个CAAT-box(-23bp、-291bp、-341bp)和有3个G-box(-139bp、-214bp、-547bp) 

9)序列表中SEQ NO：4通过分析发现，包含有与生物抗病相关的顺式作用元件as-1(激活序列1)顺式调控元件。该元件位于转录起始位点下游有+236bp和+272bp处，它们的共有序列为：TGACGTAC。 

本发明所提供的提高植物抗病性的方法，是将所述大豆酶学抗病基因导入植物组织或细胞，得到抗病性提高的植物。 

所述大豆酶学抗病基因可通过含有所述大豆酶学抗病基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。 

用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。 

使用GmSGT构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 

具体来讲，用于构建所述植物表达载体的出发载体可为pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300等，优选为pCAMBIA2301。 

以pCAMBIA2301为出发载体，构建的植物表达载体为pGmSGT2301。 

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 

携带有本发明GmSGT的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是玉米、小麦、等单子叶植物，也可以是烟草、拟南芥、菜豆等双子叶植物。 

本发明从大豆品种“早丰5号”中克隆得到GmSGT，该基因与具有氨基转移酶功能的甜瓜eR基因的核苷酸序列同源性为79.52％，氨基酸序列同源性为96.76％。将该基因转入烟草，转基因烟草高抗烟草 青枯病和烟草黑胫病，表明GmSGT转基因植物可高抗霜霉、灰霉病等真菌病害。本发明将在植物病害的防治领域及抗病品种的繁育工作中发挥重要作用。 

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。 

附图说明

图1为GmSGT5’Race PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果 

图2为质粒pGsR的限制性内切酶EcoRI和PstI酶切鉴定结果 

图3为GmSGT全基因PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果 

图4为pGmSGTa的限制性内切酶PstI酶切鉴定结果 

图5为GmSGT植物表达载体pGmSGT2301的酶切鉴定结果 

图6GmSGT转基因烟草抗青枯病检测 

图7为构建GmSGT基因启动子的克隆步移文库的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果 

图8为GmSGT基因启动子序列分析图 

图9为GmSGTP植物表达载体的酶切检测图 

图10为转基因烟草的GUS染色结果 

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物均由上海生工合成，测序工作均由中国农业科学院重大工程楼实验室协助完成。 

实施例1、GmSGT的克隆 

植物材料：大豆品种“早丰5号”，苗龄4周时，整株喷2.0mM水杨酸，诱导48h。 

一、GmSGT5’Race的引物设计 

根据gene bank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中公布的甜瓜eR基因序列，网上进行比对，发现大豆受2.0mM水杨酸诱导48小时的EST序列中有1个465bp的DNA片段，与甜瓜eR基因3’端序列同源性高达83％，推测该序列可能是大豆中同源基因的3’端基因序列，将大豆中的该同源基因命名为GmSGT，据此设计用于GmSGT5’Race的3’端PCR引物P1和P2，5’端引物P3和P4由Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒(Cat.No.L1502-01)提供，上述引物序列如下： 

P1：5’-CTGGTTGCTTTGCCTAAACGACTGTG-3’ 

P2：5’-AAGAGCAGCTCTCAGACCATACAGC-3’ 

P3：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’ 

P4：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’ 

二 GmSGT2全基因的克隆 

用下述方法进行GmSGT全基因的克隆，具体过程包括以下步骤： 

1、大豆RNA提取 

使用Invitrogen公司的TRIZOL^R Reagent试剂盒(Cat.No.15596-026)并参照试剂盒说明书提取上述经水杨酸诱导的大豆品种“早丰”5号的叶片RNA，具体过程如下： 

1)取50-100mg大豆叶片在液氮中磨成粉末，转入1.5mL离心管中。 

2)加入1mL TRIZOL Reagent充分混匀，室温放置5min。 

3)加200μL氯仿，振荡15s，室温放置2-3min，4℃、12000g离心10min。 

4)取上清，加入500μL异丙醇，室温放置10min，4℃、12000g离心5min，在离心管底部可见白色片状的RNA沉淀。 

5)弃上清，小心加入1mL 70％乙醇，不要破坏RNA片状沉淀，5s后用加样器将液体全部吸出。 

6)室温放置5-10min，使乙醇挥发(不要让其完全干，否则影响溶解性)，加入20μL DEPC水溶解沉淀，得到经水杨酸诱导后的大豆叶片RNA。 

2、RNA去磷酸化 

本实验中所用10μL CIP缓冲液、RNaseOUTTM、CIP、DEPC水、氯仿/苯酚、10mg/mL贝糖原(musselglycogen)，3M醋酸钠(pH5.2)均由Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒提供。 

对步骤1提取的大豆叶片RNA用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书进行去磷酸化处理，具体方法如下： 

1)取提取的RNA 2μL(5-10g)置于1.5mL离心管中，放置冰上，再顺次加入10×CIP缓冲液1μL、RNaseOUT^TM 1μL、CIP 1μL和DEPC水5μL至总体积为10μL。 

2)轻柔混匀，4℃稍加离心，收集液体，50℃温浴1h。 

3)4℃稍加离心，置于冰上，加90μL DEPC水和100μL氯仿/苯酚，振荡30秒，12000g室温离心5min。 

4)取上层液相，置于1个新的1.5mL离心管中，加入2ul 10mg/mL贝糖原(mussel glycogen)，10μL 3M醋酸钠(pH 5.2)，混匀后，加入220μL95％乙醇，稍加混合。 

5)-70℃冰箱中放置10min，4℃、12000g离心20min，用移液器小心吸去上清，不要碰到RNA沉淀。 

6)加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀几次，4℃、12000g离心2min。用移液器小心吸去上清，稍加离心，将乙醇吸出。 

7)室温下风干1-2min，立即加入7μL DEPC水将RNA沉淀溶解，得到经去磷酸化处理的大豆RNA。 

3、去掉RNA 5’端帽状结构 

本实验中所用TAP缓冲液、RNaseOUT^TM、TAP、DEPC水、氯仿/苯酚、10mg/mL贝糖原(musselglycogen)，3M醋酸钠(pH5.2)均由Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒提供。 

对步骤2经去磷酸化处理的大豆叶片RNA用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书进行5’端脱帽处理，具体方法如下： 

1)取步骤2经去磷酸化的RNA 7μL置冰上，再依次加入1μL TAP缓冲液、1μL RNaseOUT^TM和1μLTAP，至总体积为10μL，轻柔混匀，4℃短暂离心收集液体。 

2)37℃温浴1h，4℃短暂离心收集液体，置冰上。 

3)加入90μL DEPC水和100μL氯仿/苯酚，振荡混匀30秒。 

4)12000g室温离心5min，取上层液相，放入1个新的1.5mL离心管中。 

5)加入2μL 10mg/mL贝糖原(mussel glycogen)，10μL 3M醋酸钠(pH5.2)，混匀，加入220μL 95％乙醇，稍加混合。 

6)-70℃冰箱中放置10min，4℃、12000g离心20min。用移液器小心吸去上清，不要碰到RNA沉淀。 

7)加入500μL 70％乙醇，颠倒混匀几次，4℃、12000g离心2min。用移液器小心吸去上清，稍加离心，将乙醇尽可能吸出。室温下风干1-2min，立即加入7μL DEPC水将RNA沉淀溶解。 

4、将RNA Oligo与经5’端脱帽处理的大豆RNA连接 

本实验中所用装有0.25μg GeneRacer^TM RNA Oligo冻干粉的离心管、10×连接缓冲液、10mM ATP、RnaseOut^TM、T4 RNA连接酶、DEPC水、氯仿/苯酚、10mg/mL贝糖原(mussel glycogen)，3M醋酸钠(pH 5.2)均由Invitrogen公司GeneRacer kit提供。 

对上述经去磷酸化、脱帽处理的大豆叶片RNA用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书将其与RNA Oligo进行连接，具体方法如下： 

1)取7μL上述经去磷酸、脱帽处理的大豆RNA，加入装有0.25μg GeneRacer^TM RNA Oligo冻干粉的离心管中，用移液器混匀，短暂离心。 

2)65℃温浴5min，去掉RNA二级结构(由于挥发作用，体积会减小到6μL)。冰上放置2min，短暂离心。 

3)加入1μL 10x连接缓冲液、1μL 10mM ATP、1μL RnaseOut^TM，1μL T₄ RNA连接酶，用移液器混匀，37℃温浴1h，短暂离心，置于冰上。 

4)加入90μL DEPC水和100μL氯仿/苯酚，振荡混匀30s。 

5)12000g室温离心5min，取上层液相，放入1个新的1.5mL离心管中。加入2μL 10mg/mL贝糖原(mussel glycogen)，10μL 3M醋酸钠(pH5.2)，混匀，加入220μL 95％乙醇，稍加混合，-70℃冰箱中放置10min。 

6)4℃、12000g离心20min，用移液器小心吸去上清。 

7)加入500μL 70％乙醇，颠倒混匀，4℃、12000g离心2min。用移液器小心吸去上清。稍加离心，将乙醇尽可能吸出。室温风干1-2min。立即加入10μL DEPC水溶解RNA沉淀。 

5、反转录合成cDNA 

本实验中所用Gene Racer Oligo dT Primer，dNTP Mix，无菌蒸馏水、5×第一链缓冲液，0.1M DTT，RNaseOut^TM，SuperScript^TM III RT缓冲液和RnaseH均由Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒提供。 

以步骤5获得的大豆叶片RNA为模板，用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书将其反转录合成cDNA，具体方法如下： 

1)取步骤5经处理的大豆叶片RNA 10μL，加入1μL Gene Racer Oligo dT Primer，1μL dNTP Mix，1μL无菌蒸馏水。 

2)65℃温浴5min，去掉RNA二级结构，冰浴5min，短暂离心。 

3)依次加入4μL 5×第一链缓冲液，1μL 0.1M DTT，1μL RNaseOut^TM，1μL SuperScript^TM III RT缓冲液，至总体积20μL，用移液器混匀。 

4)离心，50℃温浴50min。 

5)70℃温浴15min，停止反应，冰上放置2min，离心。 

6)加入1μL RnaseH，37℃温浴20min。 

7)短暂离心，反转录获得的cDNA可立即用于PCR扩增或置-20℃保存。 

6、目的基因的PCR扩增 

以上述获得的cDNA为模板，首先在引物P1和P3的引导下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：先95℃5min；再94℃ 30s，67℃ 1min，72℃ 2min，共30个循环；最后72℃ 10min。再取1μl上述PCR产物，并以之为模板，在引物P2和P4的引导下，进行第二次PCR扩增，PCR反应条件为：先95℃ 5min；再94℃ 30s，64℃ 1min，72℃ 2min，共30个循环；最后72℃ 10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，在944bp处有一明显的扩增条带。 

7、冻融法回收PCR产物 

1)将上述扩增的长度约960bp的目的基因片段从琼脂糖凝胶上切下，置于一新的离心管中。 

2)加入TE缓冲液200μL，在振荡器上振荡5min，再放入液氮中冷冻5min。 

3)取出，在65℃下水浴5min。 

4)按步骤2-3所述方法重复冷冻、融化两次。 

5)依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿抽提，用无水乙醇沉淀DNA，然后加入4μL无菌水溶解沉淀，沉淀即为回收的目的片段。 

8、PCR产物的克隆 

使用载体pMD18-T(TaKaRa，Cat.No.D504A)试剂盒进行PCR产物的克隆。具体方法为：取步骤7获得PCR回收产物2μL，依次加入0.5μL载体pMD18-T、2.5μL Ligase Solution I，然后16℃连接8h。将连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性重组克隆，将阳性克隆质粒命名为pGsR，用限制性内切酶EcoRI和PstI进行酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，表明944bp的目的片段已正确连接入载体pMD18-T中，对pMeR做进一步的测序鉴定，测序结果表明插入片段具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列。 

9、GmSGT全基因的克隆 

根据pGsR的测序结果，设计引物P5和P6PCR扩增GmSGT的全基因序列，引物序列如下： 

P5：5’-CTGCAGATGGATTATTTCAATGCACCAGGAAG-3’ 

P6：5’-CTGCAGGTCGACGAATGACTTGTGACTCAAATCCTGG-3’ 

以大豆cDNA为模板，P5和P6为引物，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1.5min，共35个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图 3所示，回收约1.2bp的PCR产物，将其与载体pMD18-T Simple(TaKaRa，Cat.no.D506A)进行连接，将连接产物用TSS法转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性重组克隆，将阳性克隆质粒命名为pSGT3，对其用限制性内切酶PstI进行酶切鉴定，酶切鉴定结果表明约1.2bp的目的片段已正确连接入载体pMD18-TSimple中，测序结果表明插入片段具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO：1由1260个碱基组成，其编码序列为自5’端第146位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质。进行核苷酸及氨基酸序列比对，比对结果表明该基因与甜瓜eR基因DNA序列的同源性为79.52％；其编码的氨基酸序列与甜瓜eR基因所编码的氨基酸序列同源性为88.03％。 

实施例2、GmSGT植物表达载体pGmSGT2301的构建 

一、中间载体pSGT3a构建 

本实施例所构建的基因GmSGT的表达盒中包括以下基因表达调控元件：5’端的35S启动子、基因GmSGT和3’端的NOS终止子。首先利用限制性内切酶PstI单切克隆载体pSGT3，回收1.2bp的目标片段，连接入载体pTΩ4A。酶切验证1.2bp的目标片段已连接入pTΩ4A(如图4)。 

二、GmSGT植物表达载体pGmSGT2301的获得 

GmSGT植物表达载体pGmSGT2301的具体方法为：对质粒载体pSGT3a用限制性内切酶HindIII和EcoRI进行酶切，回收约2100bp的含GmSGT目的表达盒，将其与经相同酶酶切的植物表达载体pCAMBIA2301进行连接，得到GmeR植物表达载体，命名为pGmSGT2301。对其用限制性内切酶PstI进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图5所示，酶切产物片段大小为2100bp，与预期结果相符。 

实施例3、GmSGT转基因烟草的抗病性鉴定 

将实施例2构建的植物表达载体pGmSGT2301用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404。再用叶盘法将整合有pGmSGT2301的根癌农杆菌LBA4404转化子转化烟草NC89，获得GmSGT转基因烟草20株。采用整株叶片接种法，以非转基因烟草为对照，进行转基因烟草进行青枯病的抗病性鉴定，具体方法如下： 

测定烟草品种抗青枯病的程度，一般在病区的连作田块自然发病，也可以经过人工接种观察对青枯病的抗性。 

青枯病菌接种体的制备：将20℃下保存于无菌水中的青枯菌，在PAD培养基平板上划线，培养于28-30℃下，24h后挑取典型单菌落移置于PAD培养基斜面，在28℃下再培养24h后用无菌水稀释，稀释成所需要的接菌浓度(3×10⁸个细菌/mL)。 

将苗龄40天的转基因烟苗，移栽至营养钵中，待烟苗成活后，用根灌菌液的方法，每株灌20mL的细菌悬浮液，接种后置于28-30℃恒温室中，并将营养钵中放在盛水的瓷盘中保湿，观察发病情况，并于接种后第7、10、15、21、30天进行调查，计算发病率和病情指数，病情指数的计算方法为： 

根据病情指数可将烟草的青枯抗性划分4级：病情指数25以下为高抗，25.1-50为中抗，50.1-75为中感，75以上为高感。对步骤1获得的7株抗黑胫病的烟草用上述方法进行青枯病的抗性鉴定，结果有5株青枯病抗性指数分别为20，23、27、27、35，对青枯病具有显著抗性，如图6所示1，2，3为非转基因烟草，4，5，6为GmSGT转基因烟草。 

实施例4、GmSGT基因5’UTR的克隆 

植物材料：大豆品种早丰5号，苗龄4周 

一、GmSGT 5’UTR引物的设计 

参照我们克隆Gm SGT基因的cDNA序列和GenomeWalker^TM Universal Kit的要求，设计2个特异引物，引物序列如下 

PGSP 1：5’-AAGAGATGGTTTCTTCCTGGTGCATTG-3’ 

PGSP2：5’-TTCCCTGCCTTCAAATTTCAAACCTC-3’ 

二、GmSGT基因5’UTR的克隆 

用下述方法进行GmSGT基因5’UTR的克隆，具体过程包括以下步骤： 

1、大豆DNA提取 

取25～100mg新鲜大豆叶片，加液氮碾成粉末，转入1.5mL离心管中。加450μL提取缓冲液(100mmol·L^-1 Tris-Cl，pH 8.0，500mmol·L^-1 NaCl，10mmol·L^-1 β-巯基乙醇，50mmol·L^-1 EDTA，pH 8.0)及100μL10％SDS，剧烈振荡。65℃水浴30min，加160μL 3mol·L^-1 NaAc(pH 5.2)，置冰上20min。12000g 4℃离心15min，取上清。加2倍体积的预冷的无水乙醇，颠倒混匀以利于DNA析出。用玻棒挑出丝状DNA，置于1.5mL小离心管中，70％乙醇漂洗数次后晾干备用。 

2、基因组DNA步移文库的构建 

参照GenomeWalker^TM Universal Kit中的说明书进行。基因组DNA分别采用DraI、EcoRV、PvuI和StuI平末端酶消化，酶切产物与接头连接，构建了4个基因组步移文库(DL1、DL2、DL3和DL4)3 GmSGT基因5’UTR的克隆 

GmSGT基因5’UTR的克隆通过两轮PCR完成。 

1)第一轮PCR反应：在4个0.5mL的EP管(C1～C4)中分别以构建好的DNA文库(DL1、DL2、DL3和DL4)为模板，以基因特异引物PGSP1和接头引物(GenomeWalker^TM Universal Kit提供)AP1(5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)在热循环仪(BIO-RAD)上进行PCR反应。反应程序为：95℃预变性5min；随后紧接着7个循环为94℃ 25s，72℃ 3min；然后接着32个循环，94℃ 25s，67℃ 3 min；最后67℃延伸7min。反应完成后，将上述4管PCR产物稀释50倍(D1～D4)用作第二轮PCR扩增的模板。 

2)第二轮PCR反应：以基因特异引物PGSP2和接头引物AP2(5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’)进行PCR扩增，反应程序为：首先94℃ 25s，72℃ 3min扩增5个循环；紧接着94℃ 25s，67℃ 3min扩增20个循环，最后67℃延伸7min。 

3)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图7所示1：λDNA EcoRI/HindIII Marker2：DarI酶切文库3：EcoRV酶切文库4：PvuII酶切文库5：StuI酶切文库6：阴性对照7：试剂盒阳性对照8：试剂盒阴性对照9：试剂盒中提供构建好的文库)，通过胶回收纯化后与pMD18-T Vector连接，转化E.coli DH5α，筛选重组子酶切鉴定，测序验证。 

4、GmSGT基因5’UTR序列的分析 

采用PLACE网站(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)和Neural Network Promoter Prediction软件以及植物顺式调控元件数据库PlantCARE对克隆的大豆GmSGT 5’UTR序列进行了分析，结果显示在+1处C为可能的转录起始密码子。预测转录起始位点上游含有3个TATA-box(-17bp、-57bp和-196bp)，3个CAAT-box(-23bp、-291bp、-341bp)和有3个G-box(-139bp、-214bp、-547bp)。并且克隆的片断内AT碱基含量较高，占67.5％。通过分析发现，与生物抗病相关的顺式作用元件as-1(激活序列1)顺式调控元件。该元件位于转录起始位点下游有+236bp和+272bp处(图8，方框表示)，它们的共有序列为：TGACGTAC(如图8)，我们预测其具有启动子的功能。 

实施例5、pGmSP121植物表达载体的构建及分子验证 

根据测序结果，将克隆的GmSGT基因5’UTR序列用HindIII/BamHI双酶切消化，与植物表达载体pBI121连接，取代其35S启动子，如图2所示。利用TSS法，将重组载体转化E.coli JM109感受态细胞中，涂布于含Kan(卡那霉素)固体培养基上，37度培养12小时。转化方法如下： 

1)取10μL过夜连接产物加到一管感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30min； 

2)将离心管置于42℃水浴中热激90s，不要晃动离心管； 

3)迅速将离心管置于冰上，冷却2min； 

4)加入800μL LB液体培养基，37℃，150rpm摇床培养45min；挑取单菌落碱裂解法提取质粒DNA筛选不同的重组子，HindIII/BamHI双酶切及测序验证，获得植物表达载体pGmSP121(如图9)。 

实施例6、GmSGT基因5’UTR功能的验证 

将构建好的植物表达载体pGmSP121通过热激法转化根癌农杆菌LBA4404。具体方法如下： 

1)采用Promega公司的WizardTM plus minipreps DNA purification system，提取质粒DNA加入到100μLLBA4404感受态细胞中，混匀，冰浴5min。 

2)将离心管置液氮中冷冻5min，迅速转至37℃水浴中温浴5min。 

3)加入1mL YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm复苏4-5h。 

4)取适量菌液涂布到含利福平50mg/L和Kan(卡那霉素)100mg/L的YEB固体培养基上，置28℃培养24-48h。 

挑取单菌落碱裂解法提取质粒DNA筛选不同的重组子，转化E.coli JM109，(具体方法同上)，HindIII/BamHI双酶切验证将pGmP121转化到根癌农杆菌LBA4404中。 

通过叶盘法将整合有pGmSP121的根癌农杆菌LBA4404转化烟草NC89，获得转基因烟草。 

1)农杆菌的活化 

从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5mL YEB液体培养基中(Kan 100mg/L+Rif50mg/L)，振荡培养过夜，取1mL菌液接种到50mL YEB液体培养基(Kan 100mg/L+Rif50mg/L)中，剧烈振荡培养至OD600为0.4-0.5(约3-4h)，2100g离心5min，菌体MS0培养基洗一次，重悬，使OD600为0.1-0.2。 

2)烟草的遗传转化 

将烟草外植体置于菌液中浸泡10min，取出叶片，用无菌滤纸吸干菌液，转入共培养基，在温度24±1℃、黑暗条件下培养3d，然后将上述材料转入选择分化培养基(6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L+Kan100mg/L+Cef400mg/L)，培养1～2个月，其间继代培养3～4次。当筛选培养基上愈伤组织长出1.5cm左右的新芽时，切取小芽将其转移至生根培养基上进行生根培养和筛选，获取完整的Kan抗性植株。 

3)烟草的GUS染色 

取转基因烟草的种子，于黑暗下萌发，取萌发的小苗放入1.5mL的Eppendorf离心管中，加X-gluc溶液20μL，37℃避光放置12h，弃上清，加入100μL FAA固定液，固定15min，弃上清，用20％乙醇浸泡样品20min，再以50％乙醇浸泡30min。体视镜镜检发现在烟草叶片中有GUS的表达，表明我们克隆的GmSGT基因的5’UTR序列具有启动子的功能(如图10所示，A转基因烟草B：非转基因烟草)。

核苷酸或氨基酸序列表

<160>4

<210>1

<211>1260

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max L.Merril)

<400>1

1    ATGGATTATT TCAATGCACC AGGAAGAACC CATCTCTTTG TTCCGGGGCC GGTTAACATC

61   CCGGACCAGA TCATTCGGGC CATGAACAGA AACAATGAGG ACTACCGTTC TCCAGCAATT

121  CCAGCTATGA CCAAAACACT GCTTGAGGAT GTCAAGAAGA TTTTCAAGAC CATAACTGGA

181  ATCCCATTTC TCATCCCTAC AACTGGTACT GGTGCTTGGG AGAGTGCTCT CACAAACACA

241  CTGTCTCCTG GGGATCGAAT TGTATCTTTC CTGATTGGCC AATTCAGCTT GCTTTGGATT

301  GATCAGCAGC AACGCCTGAA ATTCAATGTT GATGTTGTAG AGAGTGAATG GGGCCAGGGT

361  GCTAAGCTTG ATGTTCTGGA ATCAAAGATT GCTTCAGATA CTTCACACAC TATTAAGGCA

421  ATTTGCATTG CCCACAATGA GACTGCAACT GGGGTCACCA ATGACTTGGC CAAAGTGAGA

481  CAAATTCTCG ATTCCTACCG GCATCCAGCC CTCCTTATTG TTGATGGAGT GTCCTCTATT

541  TGTGCTCTTG ATTTCCGCAT GGATGAATGG GGAGTTGATG TGGCAATAAC TGGCTCTCAG

601  AAGGCCCTTT CCCTTCCCAC TGGGATAGGT ATTGTGGTTG CAGGACCTAA AGCTATTGAG

661  GCCTCAAAAC ATGCTAAATC ACTTCGGGTT TTCTTTGACT GGAAAGACTA CCTGAAATTC

721  TACCAGCTAG GAACGTATTG GCCATACACT CCTTCCATAC ATTTGCTGTA TGGTCTGAGA

781  GCTGCTCTTG ATCTGATTTT TGAGGAAGGA CTTGAAAATG TAATTGCAAG ACACAGTCGT

841  TTAGGCAAAG CAACCAGACT TGCTGTAGAG GCATGGGGTT TGAAGAATTG CACCCAAAAG

901  GAAGAGTGGT ACAGTGACAC TGTGACTGCT GTTCTTGTTC CTGCTTACAT TGATAGTACT

961  GAAATAGTTA GGAGGGCATG GAAGAGATAC AATTTGAGCT TAGGTCTTGG ACTGAACAAA

1021 GTTGCTGGGA AGGTTTTCAG AATTGGACAT CTTGGCCACT TGAATGAGTT GCAACTGTTG

1081 GGATGTCTAG CTGGTGTAGA GATGATACTC AAAGATGTGG GTTATCCTGT AAAGCTTGGA

1141 AGTGGAGTTG CTGCTGCCAG TGCATACTTA CAGAACACTA TTCCTATGAT CCCTTCCAGG

1201 ATTTGAGTCA CAAGTCATTC TTGTCTTTAC TTCCTTTTTT CTGCTCNTTT CGGAAATTCT

<210>2

<211>401

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max L.Merril)

<400>2

1    M  D  Y  F  N  A  P  G  R  N  H  W  F  V  P  G  P  V  N  I

21   P  D  Q  I  I  R  A  M  N  R  N  N  E  D  Y  R  S  P  A  I

41   P  A  M  T  K  T  L  L  E  D  V  K  K  I  F  K  T  I  T  G

61   I  P  F  L  I  P  T  T  G  T  G  A  W  E  S  A  L  T  N  T

81   L  S  P  G  D  R  I  V  S  F  L  I  G  Q  F  S  L  L  W  I

101  D  Q  Q  Q  R  L  K  F  N  V  D  V  V  E  S  E  W  G  Q  G

121  A  K  L  D  V  L  E  S  K  I  A  S  D  T  S  H  T  I  K  A

141  I  C  I  A  H  N  E  T  A  T  G  V  T  N  D  L  A  K  V  R

161  Q  I  L  D  S  Y  R  H  P  A  L  L  I  V  D  G  V  S  S  I

181  C  A  L  D  F  R  M  D  E  W  G  V  D  V  A  I  T  G  S  Q

201  K  A  L  S  L  P  T  G  I  G  I  V  V  A  G  P  k  A  I  E

221  A  S  K  H  A  K  S  L  R  V  F  F  D  W  K  D  Y  L  K  F

241  Y  Q  L  G  T  Y  W  P  Y  T  P  S  I  H  L  L  Y  G  L  R

261  A  A  L  D  L  I  F  E  E  G  L  E  N  V  I  A  R  H  S  R

281  L  G  K  A  T  R  L  A  V  E  A  W  G  L  K  N  C  T  Q  K

301  E  E  W  Y  S  D  T  V  T  A  V  L  V  P  A  Y  I  D  S  T

321  E  I  V  R  R  A  W  K  R  Y  N  L  S  L  G  L  G  L  N  K

341  V  A  G  K  V  F  R  I  G  H  L  G  H  L  N  E  L  Q  L  L

361  G  C  L  A  G  V  E  M  I  L  K  D  V  G  Y  P  V  K  L  G

381  S  G  V  A  A  A  S  A  Y  L  Q  N  T  I  P  M  I  P  S  R

401  I

<210>3

<211>944

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max L.Merril)

<400>3

1    GATTGGACAC TGACATGGAC TGAAGGAGTA GAAAAGCTCT TACTTTCTTC CGCCATATTC

61   CACAAGAACT CTCCAAGGAT CCTCCTTCCC ACGAGATTCT TTGGTGGGAA AAATCCAAGA

121  GGTTTGAAAT TTGAAGGCAG GGAAGATGGA TATGGATTAT TTCAATGCAC CAGGAAGAAC

181  CCATCTCTTT GTTCCGGGGC CGGTTAACAT CCCGGACCAG ATCATTCGGG CCATGAACAG

241  AAACAATGAG GACTACCGTT CTCCAGCAAT TCCAGCTATG ACCAAAACAC TGCTTGAGGA

301  TGTCAAGAAG ATTTTCAAGA CCATAACTGG AATCCCATTT CTCATCCCTA CAACTGGTAC

361  TGGTGCTTGG GAGAGTGCTC TCACAAACAC ACTGTCTCCT GGGGATCGAA TTGTATCTTT

421  CCTGATTGGC CAATTCAGCT TGCTTTGGAT TGATCAGCAG CAACGCCTGA AATTCAATGT

481  TGATGTTGTA GAGAGTGAAT GGGGCCAGGG TGCTAAGCTT GATGTTCTGG AATCAAAGAT

541  TGCTTCAGAT ACTTCACACA CTATTAAGGC AATTTGCATT GCCCACAATG AGACTGCAAC

601  TGGGGTCACC AATGACTTGG CCAAAGTGAG ACAAATTCTC GATTCCTACC GGCATCCAGC

661  CCTCCTTATT GTTGATGGAG TGTCCTCTAT TTGTGCTCTT GATTTCCGCA TGGATGAATG

721  GGGAGTTGAT GTGGCAATAA CTGGCTCTCA GAAGGCCCTT TCCCTTCCCA CTGGGATAGG

781  TATTGTGGTT GCAGGACCTA AAGCTATTGA GGCCTCAAAA CATGCTAAAT CACTTCGGGT

841  TTTCTTTGAC TGGAAAGACT ACCTGAAATT CTACCAGCTA GGAACGTATT GGCCATACAC

901  TCCTTCCATA CATTTGCTGT ATGGTCTGAG AGCTGCTCTT GATC

<210>4

<211>832

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max L.Merril)

1    ACTATAGGGC ACGCGTGGTC GACGGCCCGG GCTGGTGCGC TCGAGTTAGG CATTGACATC

61   TTGAGTCTTC TCGGTATCAG GTTGGGGAAC CGACAAAGTG GGGTCCTTGG CACCGACATC

121  ATCCGCTTCT CCTCCAATCA TTCTAGACGA CCCGGGGATG CAGATGAAGA CTGACAAGAC

181  AGAAGACGCA CAGATGACGG CTCCCATGAT GATGAAAGCA TCTTTGTAGT CCAACTGACG

241  GAATCCCATT CCAAAAGCGA CGGCTCCAGT GTTTCCTCCA ACTCCAATGA TACCGGCAAT

301  GGCCCCAGTG GCGGGTGGGT CAACGTAGGG GACGATTCCA TAAGAGGACC CTTCGGCGGC

361  TTGGACGAAT AGAGAAAAGA AGACCATAAC GACAATGGCT CCCGTCAACG ATCCTGTGTT

421  GGCAAAAACC AAGACAAGAG CACCCTCACA AGCCAGCAAG ATGGTCTGAG TCCAAAGGCG

481  TCCACGCATT CCCATCCTGG CGTTGGCCTT GTCACTAAGG AATCCACCAG CGCCACGGGC

541  GAAAAGATTC ATCCATCCGA AGATGGAGGC AATGGCGGCC GCTTCTTCAG TGGTCAGCGA

601  GAACTTCTCC TTGAAGTACA GAGCGGCGGC GTTGTTCATG GTCAGTTCCA CACCGAAGCA

661  GCATGCGTAT TGAATGAACA AAAACCAAGT ATTGAGGTTG AGTGCTCCGG TGCGGAAGGA

721  AGCGGCGGCG GAAACATCGG CCATGGCCCC ATTCTTCTTC ATCTCGTTGT AGTTTCCCTT

781  GGGCGCATCG TCGGAATAGA AGAAAATTAG GAGACCACGC GTGCCCTATA GT

Claims (4)

1.一种提高植物抗病性的方法，是将大豆酶学抗病基因导入植物组织或细胞，得到抗病性提高的植物；所述大豆酶学抗病基因为编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA分子；

所述植物为烟草，所述抗病性为抗青枯病。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA分子为序列表中SEQ ID NO：1的DNA分子。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述大豆酶学抗病基因通过含有所述大豆酶学抗病基因的植物表达载体导入植物组织或细胞；用于构建所述植物表达载体的出发载体为pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。

4.一种与抗病性相关基因GmSGT的启动子序列，其DNA序列如SEQ ID NO：4所示。

Images